JP2002535656A

JP2002535656A - コロイド固定化種と非コロイド構造上の種との相互作用

Info

Publication number: JP2002535656A
Application number: JP2000595153A
Authority: JP
Inventors: バムダッド，シンシア・キャロル; バムダッド，アール・ショシャナ
Original assignee: ミナーヴァ・バイオテクノロジーズ・コーポレーション
Priority date: 1999-01-23
Filing date: 2000-01-21
Publication date: 2002-10-22
Also published as: EP2320231A3; EP1147416A2; WO2000043783A3; CA2360927C; WO2000043783A2; EP2320231A2; JP2011095265A; CA2360927A1; AU3347900A; EP1147416B1; JP5524812B2

Abstract

(57)【要約】本発明は、自己会合単層でのコロイド誘導のための新しい技術を提供する。本発明は、化学的もしくは生化学的薬剤／薬剤相互作用研究を含む、広範囲のアッセイの可能性を提供する。シグナル物質を伴うもしくは伴わない生物誘導コロイドは、非コロイド構造体での種間相互作用プローブとして使用した。本発明は、多種の非コロイド構造体でのコロイド粒子を固定化する技術を提供する。集合体は、ビーズを含む非コロイド構造体の種を修飾することができ、コロイドとともに検出可能である。このことにより、多くの場合、ヒトの眼で検出可能なアッセイ、コロイドでの、例えば吸収や光散乱などの電磁気放射の相互作用変化を自動的に検出するアッセイが可能となる。

Description

【発明の詳細な説明】

【０００１】発明の分野本発明は、概して、化学物質および生化学的物質および検出方法、より詳しく
は、コロイドが、電極、ビーズまたは細胞のような非コロイド構造に結合する技
術、および多重シグナルが単一の結合結果を示す技術に関する。薬物スクリーニ
ングを含めた技術は、本発明によって容易にされる。

【０００２】発明の背景薬物発見は、生理学的条件下における標的受容体との相互作用に関して多数の
候補化合物をスクリーニングすることによって容易にされる。特に重要なのは、
細胞表面受容体である。腫瘍発生を促進する生体分子相互作用の多くは、細胞内
および細胞間両方のシグナリングを媒介する細胞表面タンパク質を必要とする。
“腫瘍マーカー”は、悪性状態への形質転換の結果として独占的に発現されるか
または過発現される細胞の表面上の分子である。これらマーカーのいくつかは、
組織に浸潤し且つ転移を特徴とする攻撃的な成長経過を示す腫瘍の能力と相関し
ている（これら腫瘍は、概して、患者にとって思わしくない結果と関係している
）。例えば、細胞表面受容体αＶβ３と細胞接着分子ビトロネクチンとの相互作
用は、血管形成に関係している。J.Varner ら，“Integrins and cancer.”Curr
Opin Cell Biol. 8:724(1996)；B.Vailhe ら，“In vitro angiogenesis is mo
dulated by the mechanical properties of fibrin gels and is related to a
αＶβ３ integrin localization,”In Vitro Cell Dev Biol Anim., 33:763(19
77)；M.Horton,“The αＶβ３ integrin 'vitronctin receptor',”Int J Bioc
hem Cell Biol, 29:721(1997) を参照されたい。実際に、黒色腫細胞上のこの受
容体の増加した濃度は、思わしくない予後と相関している。もう一つの例は、Ｍ
ＵＣ−１抗原であり、この抗原は、乳癌、前立腺癌、肺癌および卵巣癌で過発現
される。

【０００３】生きているそのままの細胞の表面上の標的受容体とリガンドとの相互作用を検
出する性能は、これら相互作用を破壊する候補化合物のスクリーニングを可能に
すると考えられる。細胞表面受容体の作用を阻止する薬物に関して化合物ライブ
ラリーをスクリーニングすることは、薬物スクリーニング工程の間中、それらの
天然のコンホメーションおよびマルチマー化状態にある受容体に臨界的に依存す
る。現在の技術によれば、細胞表面受容体とそれらの天然のリガンドとの相互作
用を検出することは難しいしまたは不可能である。

【０００４】現在の技術は、細胞へのリガンド相互作用を検定する性能が限られている。一
つのこのような技術は、ＥＬＩＳＡ検定である。ＥＬＩＳＡの場合、最初に、細
胞を９６ウェルプラスチックプレートに、抗体、コラーゲンによってかまたは、
プラスチックプレートとの非特異的相互作用によって接着させる。次に、同族抗
体を目的の細胞表面タンパク質に結合させる。相互作用する複合体を検出するた
めに、最初の抗体に結合するように設計された、および酵素（通常は、西洋ワサ
ビペルオキシダーゼまたはアルカリ性ホスファターゼ）に結合している第二の種
間抗体を加える。洗浄工程では、非結合抗体を除去する。次に、酵素の基質を加
えるが、その結果、酵素が存在する場合、比色変化が生じるであろう。その技術
の変法では、第二抗体を蛍光標識に結合させた後、それを蛍光読み取り機で検出
する。この技術の有用性を制限する固有の問題がいくつかあり、（１）プラスチ
ックへの高率の非特異的抗体吸着がある；（２）弱いリガンド−受容体相互作用
は、この技術に必要とされる多数の洗浄工程によって破壊される；（３）頻繁な
洗浄工程、更には、酵素基質としての過酸化物の使用は、細胞に毒性でありうる
；そして（４）検定には多数の細胞が必要とされる。具体的には、この検定は、
次の理由で、薬物候補をスクリーニングするのに理想的に好適ではない。（１）
抗体−受容体相互作用は、高親和性相互作用でありうるが、小分子またはタンパ
ク質の薬物候補によって破壊されるとは考えられない；（２）抗体は、標的受容
体を、その受容体の正常な機能を破壊しない部位で結合することがありうる；そ
して（３）検定は、薬物の存在下における細胞生存能力に関する情報を与えない
。

【０００５】要求されるのは、広範囲の特異的相互作用において多用性を増加させるおよび
感度を増加させうる化学的または生物学的種間の結合結果を監視するまたは制御
するアプローチである。例えば、細胞受容体およびそれらのリガンドの特異的相
互作用（（αＶβ３受容体）の相互作用が含まれるが、これに制限されるわけで
はない）に対して薬物をスクリーニングするアプローチは、好都合であると考え
られる。この例の場合、検定は、広範囲の腫瘍種類、特に、浸潤性腫瘍に対して
スクリーニングを可能にするように柔軟であるべきである。特に、そのスクリー
ニングアプローチは、多数の候補薬物の迅速なスクリーニングを可能にすべきで
ある。

【０００６】発明の要旨本発明は、薬物スクリーニングに有用な技術を含めた、化学的または生物学的
種間相互作用を監視する（検出する）種々の新規な方法、組成物および種、およ
び製品を提供する。

【０００７】一つの態様において、本発明は、コロイド粒子に、非コロイド構造に固定する
能力を与えた後、そのコロイド粒子が非コロイド構造に固定しているかどうか確
認する方法を提供する。この態様は、コロイド粒子、または好ましくは、種々の
構造を有する多数のコロイド粒子を必要とする広範囲の相互作用を包含する。磁
気ビーズのようなビーズを含めた非コロイド構造は、ビーズに関して固定される
種と、コロイド粒子に関して固定される種との相互作用の確認を助けるものとし
てコロイド粒子と相互作用しうる。それらコロイド粒子は、ビーズを“装飾し”
、特定の種／種相互作用の指標としてそれらを目視によって確認可能にすること
ができ、粒子の確認が電子または他の手段等によって行われうる場合の表面にコ
ロイド粒子を補充するのに用いることができる。電極のような非コロイド構造は
、コロイド粒子またはコロイド粒子上に固定される種と作用して、具体的な検定
結果を示すことができる。細胞のような非コロイド構造は、コロイド構造と相互
作用して、コロイド粒子が有する種への細胞の結合を示すことができる。コロイ
ド粒子および非コロイド構造を必要とするこれらおよび他の技術の利点は、次の
説明からなお一層明らかになるであろう。

【０００８】もう一つの態様において、本発明は、ビーズ、コロイド粒子等のような製品に
、金属結合標識／金属キレート結合によって化学的または生物学的物質を結合す
る技術を提供する。この方法で化学的または生化学的種に結合した製品は、本発
明に包含される。

【０００９】本発明のもう一つの態様は、リガンド／タンパク質相互作用の検出技術であっ
て、電気活性物質と一定の近位関係にあるリガンドを提供し、そのリガンドとタ
ンパク質との相互作用を、電気活性物質によって与えられる電気活性シグナルを
監視することによって確認することを含み、またはそのシグナルは、電気活性物
質がそのタンパク質に接近していることによる技術を包含する。この技術は、表
面、およびその表面にも固定される電気活性物質と一緒に表面に固定されるタン
パク質と相互作用すると考えられるリガンドを規定する本発明の製品によって容
易にされうる。本発明のこの態様は、タンパク質／リガンド相互作用を、表面プ
ラスモン共鳴の不存在下においてタンパク質かまたはリガンドを標識することな
く確認する方法である本発明のもう一つの特徴を容易にする。

【００１０】本発明は、更に、第一の生物学的または化学的物質の、多数のシグナリング因
子を含む第二の生物学的または化学的物質への単結合をシグナル化する方法を可
能にする技術および成分を提供する。本発明によって提供される製品は、この技
術を容易にし、しかも多数のシグナリング因子に結合した第二物質に生物学的に
または化学的に結合することができる第一の生物学的または化学的物質を規定す
る。多数のシグナリング因子は、多数のシグナリング因子を有し且つ物質への結
合に適合している樹状体（dendrimeor）の重合体によってその物質に結合するこ
とができる。その技術は、多数のシグナリング因子も固定されるコロイド粒子に
物質を固定することによっても容易にされうる。好ましい実施態様において、４
以上のシグナリング因子が、化学的または生物学的単結合結果のシグナルを同時
に与える。より好ましくは、少なくとも１０、より好ましくは、少なくとも５０
、より好ましくは、少なくとも１０００または１０，０００のシグナリング因子
が、本発明のこの態様により、化学的または生物学的単結合結果のシグナルを同
時に与える。

【００１１】本発明のもう一つの態様は、シグナリング因子およびそこに固定されるタンパ
ク質両方を有するコロイド粒子によって規定される。この成分の使用技術も、本
発明に包含される。

【００１２】本発明は、更に、表面に自己集合した単層を越える電子透過性を制御する技術
を提供する。その技術において、自己集合した単層は、表面上に形成され、少な
くとも第一分子種および第二分子種の混合物によって規定される。第一分子種は
、表面での自己集合を、表面が暴露される流体がその表面と電気的に連通するの
を妨げる密充填方式で促進する構造を有する。すなわち、第一種は、流体に対し
て表面を密封する比較的密充填した自己集合単層（ＳＡＭ）を形成するが、それ
は、ＳＡＭが第一種だけから構成されているからである。本発明のこの態様によ
るＳＡＭは、分子構造が、密充填した自己集合構造の破壊を引き起こし、それに
よって、表面が暴露される流体を表面と電気的に連通させる密充填構造の欠点を
規定する場合、その第一種と、異なった分子構造を有する第二種とから構成され
る。この場合、その流体は、トンネル等による電子的連通が起こりうる表面に接
触することによってまたはその表面に充分に近接した状態になることによってそ
の表面と電気的に連通する。次の説明から分かるように、本発明のこの態様は、
本発明の他の技術と一緒に、極めて有用でありうる。

【００１３】記述されたように、本発明の一つの特徴は、薬物スクリーニングのための一連
の成分および技術を提供することである。そのアプローチは、（１）普遍的シグ
ナリング要素への天然リガンドの結合のための調節システム；（２）複数のシグ
ナリング要素のそれぞれのリガンドへの結合によって増大した検出感度；（３）
より簡単なフォーマット（洗浄工程、酵素切断および毒性物質を必要としない）
；（４）好都合な電子出力；および（５）多様化性能を提供する。

【００１４】検定の一つの実施態様において、本発明は、導電性固体支持体上に生きている
そのままの成長細胞を固定することを包含する。表面分子（例えば、受容体）お
よび細胞内シグナリングタンパク質両方を有するこのような細胞を、天然におい
て表面かまたは粒子様でありうる固体支持体に結合させる。これら細胞由来分子
へのリガンド（または“結合パートナー”）は、既知および未知両方のリガンド
、更には、推定上の薬物候補を含むことができ、それらを他の固体支持体に結合
させないかまたは、表面または粒子様構造に結合させ、二つの結合パートナー間
の結合が起こり且つ検出することができるような方法で、他の細胞由来分子と相
互作用させる。結合パートナーの一方またはその結合支持体は、更に、検出装置
によって認識され且つ定量されうる物質を用いて誘導体化されうる。次に、この
複合体（相互作用による）を、非結合パートナーと結合複合体を区別するその結
合複合体の特徴を用いて検出装置の存在下に置く。

【００１５】一つの実施態様において、細胞は、金属支持体の導電性を保存するように処理
された（例えば、細胞成長と両立しうる分子を用いてコーティングされた）金属
支持体（例えば、金）上で成長させる。一つの実施態様において、均一導電性分
子層を、絶縁分子種（飽和アルキルチオラートなど）を用いて均一にコーティン
グされた金属より高い速度で電子の伝導を可能にする金属表面に結合させる。も
う一つの実施態様において、まず第二種の混合物を含めた不均一分子層は、表面
に暴露される流体を、上記の表面と電気的に連通させる。もう一つの実施態様に
おいて、不均一導電性分子層を金属表面に結合させるが、その不均一層は、導電
性または高導電性分子（または菌叢の“不足”）によって中断される低または非
導電性種（例えば、一つのこのような種または複数のこのような種）の菌叢と考
えられうる。不均質導電層、または流体／表面電気連絡を促進する欠陥をもちうる不均質層
の好ましい態様において、２タイプの分子を金属表面に付着させる：１）アルキ
ルチオールスペーサー分子（非特異的吸着を阻止するために、エチレングリコー
ル単位またはメチルを末端基とする）を用いてローン（ｌａｗｎ）を形成する；
および２）導電種または欠陥形成種。導電種は後記の実験で容易に同定できる。
１態様において、導電種は少なくとも１つの環構造を含む（たとえばベンゼン環
、ピリミジン環など）。他の態様においては、導電種は環構造を含まず、−Ｏ−
、−ＯＨ−、−ＮＨ₂−およびＳＨから選択される基を含む。

【００１６】均質導電層の好ましい態様においては、１タイプの分子のみ、すなわち導電種
を金属表面に付着させる。複数の導電種を用いる他の態様も考慮される。この様
式の欠陥形成分子および他の観点を以下にさらに記載する。

【００１７】前記のように、１種類以上の細胞由来分子に対するリガンド（すなわち”結合
パートナー”）を粒子様構造体に付着させて、アッセイに使用できる。１態様に
おいては、リガンドをコロイドに付着させる。それらのコロイドは電気活性分子
（たとえばフェロセン）を含む。そのようなアッセイにおいては、リガンドと細
胞由来分子（たとえば細胞表面受容体）の相互作用によりコロイド−−および電
気活性分子−−は金属表面近くへ運ばれ、このリガンド相互作用を電気検出する
ことができる。

【００１８】前記のように、本発明は方法および組成物の両方を考慮する。１態様において
本発明は、固体支持体に付着した第１分子および１種類以上のシグナリング素子
（すなわち光伝達の変化、溶液の色の変化、電荷の変化などによる検出（これら
に限定されない）を含めた任意の手段で検出できる信号を発する分子または分子
クラスター）を含む組成物であって、第１分子はリガンドであり、細胞表面受容
体と相互作用することができるものである組成物を考慮する。他の態様において
本発明は、固体支持体に付着した第１分子、第２分子および第３分子を含む組成
物であって、第１分子は細胞表面受容体と相互作用しうるリガンドを含み、第２
分子は固体支持体上に単層を形成し、第３分子は電気活性である組成物を考慮す
る。

【００１９】本発明は固体支持体の性質により限定されないものとする。１態様において、
固体支持体はコロイド（たとえば金コロイド）である。本発明は、固体へのリガ
ンドの付着の性質によっても限定されないものとする。１態様において、リガン
ドは固体支持体に共有結合する（直接に、または他のリガンドもしくは結合性部
分を介して）。他の態様において、リガンドは非共有結合または静電相互作用に
より付着する。

【００２０】本発明は多様なシグナリング素子を考慮する。これには蛍光分子、および比色
基質に作用しうる酵素が含まれるが、これらに限定されない。好ましい態様にお
いて本発明は、電気活性分子、すなわち適切な一般的電気集成装置の作用電極付
近で電子的に測定できる酸化／還元電位をもつ分子を、シグナリング素子として
考慮する。好ましい電気活性分子はメタロセンである。本発明により電気活性シ
グナリング素子として作動しうるメタロセンは既知である。特に好ましい電気活
性分子の一例は、フェロセン基を含むもの、たとえばフェロセニルチオール（Ｃ ₃₅ Ｈ₂₄ＦｅＳ）である；しかし他の遷移金属有機錯体もシグナリング素子として
考慮される。

【００２１】本発明は化学物質または生化学物質の性質により限定されないものとする。多
様な物質およびこれらの物質の結合相手、たとえば抗体／抗原、抗体／ハプテン
、酵素／基質、酵素／阻害物質、酵素／補因子、結合性タンパク質／基質、キャ
リヤータンパク質／基質、レクチン／炭水化物、受容体／ホルモン、受容体／エ
フェクター、核酸の相補鎖、タンパク質／核酸、リプレッサー／インデューサー
、リガンド／細胞表面受容体、ウイルス／リガンドなどを、本発明の結合相互作
用として採用できる。１態様において、この物質はリガンド、具体的にはペプチ
ドである。好ましい態様においてペプチドは、金属キレートに結合しうる部分（
たとえばヒスチジンタグ）で誘導体化される。この態様においては、固体支持体
が金属キレートを含むことが好都合であり、ペプチドは金属キレートへのこの部
分の結合により固体支持体に付着する。

【００２２】ある態様においては、細胞由来の分子（細胞表面受容体および細胞内シグナリ
ングタンパク質が共に含まれる）が固体支持体上に存在するか、またはそれに付
着している。これらの細胞由来タンパク質の結合パートナー（既知および未知の
リガンド、ならびに推定候補がいずれも含まれる）は表面および／または粒子様
構造体に付着し、２つの結合パートナー間で結合が起きるように、細胞由来タン
パク質と相互作用することができる。結合パートナーの一方またはそれが付着す
る支持体を、検出可能な物質でさらに誘導体化することができる。相互作用複合
体は、結合した複合を結合していない結合パートナーから識別する特徴を利用し
て同定される。検出可能部分（結合パートナーの一方と共に共通の固体支持上に
固定化されるか、または結合パートナーの一方に直接に付着している）の存在ま
たはその変化を検出する。その相互作用を撹乱する分子は、この信号の損失を検
出することにより同定できる。結合パートナーの一方を検出領域に閉じ込めて他
方の結合パートナーを捕獲させることにより、あるいは結合した複合体を結合し
ていない結合パートナーから識別する特徴を利用することにより、あるいは捕獲
可能な要素を結合パートナーまたはそれが結合している固体支持体の一方に付着
させることにより、相互作用パートナーを検出装置に導入する。本発明の他の利
点、新規性および目的は、以下の本発明の詳細な説明を添付の図面と合わせて考
慮すると明らかになるであろう。図面は模式図であり、現尺で描いたものではな
い。図面中、各種図面に描いた同一またはほぼ同一の構成要素は単一数字で表さ
れる。明確にするために、各図にすべての構成要素を表示したわけでなく、各態
様において当業者に本発明を理解させるために説明が必要ではない構成要素は表
示しなかった。

【００２３】

【詳細な説明】

一つの側面において、本発明は分析、薬物スクリーニング又はそれに類似した
行為に際して、化学物質又は生物薬剤の間の相互作用を意図している。本発明に
は、そのままの細胞（電極又は溶液又は懸濁液中に成長した）へのリガンドを含
むがそれに限らないリガンド相互作用の分析及び／又は阻害を含むが、それに限
らない。本発明は、薬物候補物、既知又は推定の配位子及び小分子薬物ライブラ
リーの利用を含んでなる種々の態様を意図している。

【００２４】一つの態様では、自己組立単層（ＳＡＭｓ）で誘導体化された又はされていな
い電極に細胞は成長する。推定リガンド（例えば、特定の細胞表面受容体への）
は信号伝達要素（例えば電気活性複合体）と共に固体担体（例えば金コロイド）
に固定化されている。これら誘導体化固体担体は検出電極上（金属担体）に固定
化した細胞と培養する。標的受容体と固体担体（例えばコロイド結合リガンド）
上のリガンドとの相互作用は、検出電極の近くに固定化信号伝達要素を繋ぎ止め
る。この相互作用はインピーダンスの変化として検出可能である。なにか特定な
メカニズムに限定されないが、電極に電位が負荷されると近在の酸化還元活性金
属複合体がその特徴的酸化電位が働き電位を放出する。振動成分を電圧傾斜の頂
上に加えると、多数の電子が各金属複合体から放出され、電流出力として検出で
きる。この種の電気化学的分析の様式を交流ボルタンメトリー（ＡＣＶ）と称す
。

【００２５】本発明は、細胞が直接的に金属担体へ結合する態様に限るつもりはない。態様
では、金属担体に結び付いたリガンドの相互作用を通じて間接的に細胞が結合す
ることを意図している。これは即ち、特定又は不特定の相互作用で直接的又は間
接的に細胞に結合している分子により表面を被覆することで細胞が表面に補充で
きるといえる。例えば、末端メチル化自己組立単層（ＳＡＭｓ）は非特異的にコ
ラーゲンと結合するが、順に細胞へ非特異的に結合する。その代わりとして、ア
ルギニン、グリシン、アスパラギン酸（ＲＧＤ）モチーフを含有するペプチドは
ビトロネクチンを模倣し、内皮細胞のような特異な細胞型に結合する。同様に、
ポリリジン、正荷電、クリングルドメイン、インテグリン及びペプチド又はこれ
らの分子模倣物は、細胞の付着の際に表面に結合できる。これらのリガンドはＳ
ＡＭｓに組み入れられることにより表面において展示できる。リガンドそれ自身
が直接的にＳＡＭに組み入れられる必要はない。リガンドに付着したアフィニテ
ィータグに対する結合相手を展示するＳＡＭｓが用いられる。例えば、ヒスチジ
ンタグで修飾されたペプチドは簡単に、ニトリロ三酢酸‐ニッケルチオールを含
有するＳＡＭｓに付着できる。その代替として、グルタチオンＳ‐トランスフェ
ラーゼ融合タンパク質は、グルタチオン又はその誘導体を組み入れたＳＡＭに付
着できる。金属電極を用いる利点の一つは、表面でＳＡＭを形成する分子の末端
に多くの既知官能基を提供できることである。

【００２６】例えば、溶液中の細胞は電気泳動で検出用電極へ引き寄せることができる。細
胞由来分子は特異的に、フェロセン誘導体のような電気活性化合物を展示するコ
ロイドに付着したリガンドに結合でき、結合した複合体を検出において補助をす
る。しかし、使用した検出用要素は簡単に検出ができるいかなる荷電、電気活性
な種又は蛍光タグに成り得る。

【００２７】リガンド誘導体化コロイドは、自己組立単層（ＳＡＭ）で修飾した又は修飾し
ていない電極の近くに繋ぎ止めることができ、結合で誘起した電極電流における
摂動で結合した細胞を検出できる。細胞由来のタンパク質は、磁気ビーズに付着
したリガンドにも結合できる。その代替として、細胞由来タンパク質は、電気活
性な樹状体上のリガンドにも結合できる。加えて、細胞由来タンパク質は、電気
活性又は酸化還元複合体を提示する高分子に付着したリガンドと結合できる。ま
た細胞由来タンパク質は、電気活性又は酸化還元複合体を展示する伝導性高分子
に付着したリガンドと結合することもできる。

【００２８】代替スキームでは、前述の系は２つの異なるリガンドを利用できる。一つ目の
リガンドは構成要素的に発現した細胞表面受容体に結合していて、磁気ビーズ上
に固定化でき、細胞を検出電極に補充するのに使用できる。二つ目のリガンドは
目的の細胞表面受容体を認識するが、信号伝達コロイドに付着している。

【００２９】他の代替スキームでは、前述の系は異なる電位で酸化する２つのフェロセン誘
導体のような２つの区別できる電気活性複合体を利用できる。一番目のフェロセ
ン誘導体は、目的の細胞表面受容体用のリガンドに直接的又は間接的に付着でき
る。二つ目のフェロセン誘導体は、構造的に発現した細胞表面受容体に結合する
二つ目のリガンドに直接的又は間接的に付着する。このようにして、発現が生理
的、環境的又は疾病関連変化で誘起した細胞由来分子（例えば、タンパク質）の
誘導レベルを測定するのに２つの信号の比率が使用できた。この発現比率の比較
は、同一の金属複合体を担持する両方のリガンドを有する別々の電極パッドに試
料の別々の量を培養することによりできる。

【００３０】本発明は、リガンド（推定の薬物候補物を含むが、これに限らない）を、粒子
様である表面と付着させ、担体に付着又は細胞の上にそのまま存在する細胞表面
タンパク質と相互作用させ、結合相手を同定したり、それらの存在の有無を測定
し、それらのレベルの定量を行なうことを意図するものである。特に、細胞表面
受容体を呈するもとのままの細胞は第一の結合相手として使用できる。電気活性
複合体に直接的又は間接的に付着した既知又は推定のリガンドは第二の結合相手
として行動する。しかし、これらリガンドに直接的又は間接的に付着した検出可
能部分は、使いやすい荷電、電気活性又は蛍光タグになりうる。その代替として
、第一の結合相手は、ニッケルのような金属を配位したニトリロ三酢酸（ＮＴＡ
）の如きキレートの複合体を担持したコロイドに結合したヒスチジンタグタンパ
ク質（Ｈｉｓ‐タグ）、ペプチド、小分子又はＤＮＡのように金属が結合したタ
グ種でありうる。コロイドは自己組立単層により誘導体化されているものか、さ
れていないものである。検出相手として働く第二の結合相手は、ＳＡＭで修飾さ
れるようなコロイド、金表面又は金被覆磁石ビーズでありうる。

【００３１】種々な病的状態に関与する細胞由来タンパク質(cell-derived protein)のアッ
プレギュレーションを阻害する薬物をスクリーニングするために、この系を用い
ることもできる。結合パートナー（薬物、抗体、又は細胞由来タンパク質に対す
るタンパク質／ペプチドリガンドを包含しうる）がひと度同定されたならば、こ
の結合パートナーを検出部分に結合させて、疾患状態又は治療に応じた細胞由来
タンパク質の発現レベルを定量することができる。これは、細胞表面と細胞内区
画の両方に対する細胞由来タンパク質の発現及びトランスロケーションに関して
薬物候補の間接的影響を試験する任意のアッセイでありうる。

【００３２】薬物候補の同定は競合的阻害アッセイを用いて達成することもできる。詳しく
は、溶液中で遊離している(free in solution)薬物候補を別々に該組成物と共に
インキュベートすることができる。受容体又はリガンドへの薬物結合によって生
じる標的細胞由来タンパク質に対する競合的阻害は、検出シグナルの時間又は用
量依存損失として観察することができる。

【００３３】これを実施することは、既知リガンドにシグナリング(signaling)部分を直接
又は間接的に結合させる方法を必要とし、次にセンシング表面(sensing surface
)に複合体(complex)結合パートナーを結合させる又は補充する方法を提供した。
前者は上述したが、後者は以下で述べる。

【００３４】用いられるセンシング表面は種々な形態をとることができる。しかし、例示の
ために、誘導ＳＡＭ(conducting SAM)によって改変される電極を用いる、結合パ
ートナー複合体の補充方法を述べる。誘導ＳＡＭは金属表面に取り付けられた分
子層であり、例えば飽和アルキルチオラートのような絶縁種(insulating specie
s)によって均一に被覆された金属よりも高い速度での電子の誘導を可能にする。
電子誘導の好ましい経路は、分子ワイヤ(molecular wires)（芳香環化合物のポ
リマー）が組み込まれている単層によって与えられうる。このためには、非限定
的にポリ（エチニルフェニルチオール）（即ち、Ｃ₁₆Ｈ₁₀Ｓ）、本明細書ではＭ
ＦＩと呼ぶ、を包含する、多様な分子を用いることができる：

【００３５】

【化１】

【００３６】本明細書で用いる限り、“分子ワイヤ”は、ＳＡＭコーディングされた(SAM-c
oded)電極を電極と電気的に連通させる流体の能力を強化するワイヤを意味する
。これは導電性分子を包含するか、又は上述し、以下でさらに詳述するように、
ＳＡＭ中の欠陥(defects)を電極と流体接触させることができる分子を包含する
。他の分子ワイヤの非限定的リストは２−メルカプトピリジン、２−メルカプト
ベンゾチアゾール、ジチオスレイトール、１，２−ベンゼンジチオール、１，２
−ベンゼンジメタンチオール、ベンゼン−エタンチオール、及び２−メルカプト
エチルエーテルを包含する。単層の導電性はまた、電極面の導電性を促進する分
子の添加によっても強化することができる。誘導ＳＡＭは、非限定的に、（１）
Ｓを末端に有するポリ（エチニルフェニル）鎖；（２）ベンゼン環を末端に有す
るアルキルチオール；（３）ＤＮＡ塩基を末端に有するアルキルチオール；（４
）単層中に充分にパックされない、任意の硫黄末端種；（５）特異的吸着を阻害
しないエチレングリコール単位又はメチル基のいずれかを末端に有する上記プラ
ス又はマイナスアルキルチオール・スペーサー分子の総てから構成されうる。チ
オール類は、金に対するそれらのアフィニティのために、ＳＡＭのすばやい形成
のために挙げられる。米国特許第５，６２０，８２０号及び他の参考文献から当
該技術分野に知られるように、チオールの代わりに他の分子を用いることもでき
る。相互作用ＳＡＭの下流には、チャージリーダー(charge reader)（例えば、
アンメーター、チャージカウンター）又は光学的リーダー（例えば、表面プラス
モン・レゾナンス・デテクター又は蛍光リーダー）が存在する。

【００３７】シグナリングコロイド上の既知リガンドがそれらの同種の(cognate)細胞由来
タンパク質と相互作用するときに、薬物候補を溶液中に加えて、特異な(differe
ntial)効果をモニターすることができる。直接又は間接的に細胞に結合するヘッ
ド基(head groups)（例えば、メチル基、ポリＫ、正電荷、ＲＧＤ配列、Ｋｒｉ
ｎｇｌｅモチーフ、インテグリン、及び同種(the same)のペプチド模倣体(mimic
s)）を末端に有する、例えばアルキルチオールのような分子をも提示する誘導Ｓ
ＡＭで被覆された電極に、細胞を補充することができる。或いは、アルキルチオ
ール又は金属結合タグを介してＳＡＭに連結される、誘導ＳＡＭ上に提示される
同種リガンドと相互作用する細胞表面受容体を有することによって、特異な相互
作用(differential interactions)を定量することができる。この状況において
、構成的に発現される受容体に対するリガンドによって電子シグナルが発生され
る。流動力(flow force)下で、電子シグナルは、ＳＡＭ固定リガンドと相互作用
する細胞表面受容体の数に比例すべきである。流動速度の関数としての細胞移動
速度は、細胞表面上の細胞接着分子に対する受容体の密度を示す。

【００３８】細胞は、ＡＣ電圧ランプにやや正のバイアスが与えられる場合には、負に荷電
するという事実のために、センシング電極に引き付けられる筈である。リガンド
が結合するデンドリマー(dendrimers)又はポリマーに付加的な負に荷電した基を
加えると、センシング表面への補充がさらに促進される。当業者はデンドリマー
)又はポリマーに複数のシグナリング実体(signaling entities)を容易に固定す
ることができる。或いは、金属結合タグを介して認識リガンドを取り付けること
は、アルキルチオールＮＴＡに対するそれらの結合（及びその結果として関連細
胞の結合）を促進する。金被覆磁気ビーズ上に例えばフェロセンのような金属含
有化合物を有するＳＡＭは、センシング表面電極に複合体を補充するために、電
磁界又は固定磁石の使用を可能にする。さらに、直接に又はアルキルチオール−
ヒスチンジン・タグを介してリガンドを組み込むセンシング電極を用いて、例え
ば細胞接着分子とのような特異的相互作用又は非特異的相互作用を介して細胞を
引き付けることができる。

【００３９】しかし、結合パートナーの１つが分析溶液よりも高密度である結果として複合
体が重力によって沈降するならば、簡単に重力によっても検出系への補充を行う
ことができる。インキュベーション段階中に早期沈降を避けるために機械的混合
を行うことができる。

【００４０】細胞由来タンパク質発生器として電極を用いるバリエーションでは、電極パッ
ド上のポイントを用いて、細胞を溶解する(lyses)電圧スパイクを生じることが
できる。次に、細胞の内容物をシグナリングリガンドと共にインキュベートして
、相互作用を検出する。

【００４１】さらに、導電性分子によってチャンネルをラインして、系の検出能力を強化す
るために、ＳＡＭを用いて流動チャンネルの底部に沿った一定のトポロジーにお
いて細胞結合分子をパターン化することができる。したがって、ＳＡＭは、細胞
結合能力をセンシング能力（光学的又は電子的）と交替するパターンで結合部分
を提示することができる。例として、メチル末端アルキルチオールのストリップ
をＳＡＭ中の導電性ポリピロール基と交替させる。細胞の側面に沿った受容体が
評価されうるように細胞が溝中に存在するように、ＳＡＭのトポロジーを操作す
ることもできる。例えばこれらのような交替機能ＳＡＭのストリップの形成は、
米国特許第５，５１２，１３１号及び国際特許公開第ＷＯ９６／２９６２９号（
両方とも本明細書に援用される）に記載されるように行うことができる。

【００４２】これらの複合体は電子的に検出されることができる。好ましい検出方法は交流
ボルタンメトリー（ＡＣＶ）と呼ばれる電気化学的方法である。この検出方法を
例えば高次調和分析のような付加的な分析方法を用いて補足することができる。
これらの複合体は例えばＳＰＲのような光学的手段を用いて検出することもでき
る。後者の方法を用いると、センシング表面への複合体の補充によって光学的性
質の大きなシフトが生じる。また、リガンドがヒドロゲルに結合する場合には、
結合パートナーとのそれらの相互作用が、光学的に検出されうる、ヒドロゲルの
密度の変化をもたらしうる。

【００４３】これらの方法を用いて、血液及び針バイオプシーを包含する多様なソースに由
来する遊離細胞(free cell)上の細胞表面マーカーを検出することができる。さ
らに、これらを用いて、直接のｉｎｖｉｔｒｏ結合アッセイにおいて、脈管形
成又は癌転移を促進すると知られた又は疑われるような特異的相互作用を阻害す
る薬物をスクリーニングすることもできる。特に重要な細胞表面受容体は腫瘍発
生と相関づけられている受容体であり、この理由はこれらの受容体のブロックが
腫瘍を殺すことができるからである。恐らく、他の細胞の接着分子に結合する細
胞表面受容体の過度発現(over-expression)がさらにいっそう広範囲に重要であ
ると思われる。これらの細胞相互作用は転移及び脈管形成の仲介者であるように
思われる。

【００４４】さらに、これらの方法を用いて、関与する特異的な受容体−接着分子相互作用
を予め知ることなく、侵襲又は転移に特徴的であることが知られた細胞表現型を
阻害する薬物をスクリーニングすることもできる。生理的に関連する相互作用を
模倣する薬物のスクリーニングも、この系を用いて、溶液中で遊離する薬物候補
を加えて、検出シグナルの損失を探すことによって、又は溶液中で遊離する既知
リガンドを固体担体上の薬物候補と共に加えて、検出シグナルの発生を求めるこ
とによって、達成することができる。

【００４５】１つの実施態様では、細胞表面タンパク質を次のように検出して、定量するこ
とができる：細胞表面受容体を認識するヒスチジン−タグ付きリガンドを、ＮＴ
Ａ（Ｈｉｓタグ付きタンパク質を捕捉するため）とフェロセン部分（電子シグナ
リングのため）の両方を提示するＳＡＭを有するコロイドに取り付ける。これら
のバイオスペシフィック(biospecific)、電子シグナリング・コロイドを次に、
標的受容体を提示する細胞と共にインキュベートする。次に、細胞を沈降させ、
接着させる、又はＳＡＭ被覆電極上に引き付けて、ＡＣＶ（図３）によって分析
する。シグナリングコロイド上に固定されたリガンドが細胞表面上のそれらの同
種受容体に結合したならば、フェロセン部分の特徴的な酸化電位における電流ピ
ークが生じる。細胞表面受容体を認識する抗体を、Ｈｉｓタグ付きタンパク質Ａ
又はＣと最初に結合したＮＴＡ−フェロセン含有コロイド(NTA-ferrocene beari
ng colloids)に取り付けることができる。或いは、金属結合タグ／金属／キレー
ト結合を介してコロイドに抗体を直接取り付けることもでき、この場合には、金
属結合タグが抗体に結合する。ヒスチジン・タグを抗体に結合させる方法は“卵
巣癌関連抗原ＣＡ１２５に対する１９６−１４抗体からの単鎖Ｆｖの構築”，Ｈ
ａｓｈｉｍｏｔｏ，Ｙ．，Ｔａｎｉｇａｗａ，Ｋ．，Ｎａｋａｓｈｉｍａ，Ｍ．
，Ｓｏｎｏｄａ，Ｋ．，Ｕｅｄａ，Ｔ．，Ｗａｔａｎａｂｅ，Ｔ．，及びＩｍｏ
ｔｏ，Ｔ．：１９９９、ＢｉｏｌｏｇｉｃａｌａｎｄＰｈａｒｎａｃｅｕｔ
ｉｃａｌＢｕｌｌｅｔｉｎ，２２巻；（１０）１０６８−１０７２；“大きい
非免疫化ファージ・ディスプレイ・ライブラリーから単離されたナノモル未満の
アフィニティを有するヒト抗体”，Ｖａｕｇｈａｎ，Ｔ．Ｊ．，Ｗｉｌｌｉａｍ
ｓ，Ａ．Ｊ．，Ｐｒｉｔｃｈａｒｄ，Ｋ．，Ｏｓｂｏｕｒｎ，Ｊ．Ｋ．，Ｐｏｐ
ｅ，Ａ．Ｒ．，Ｅａｒｎｓｈａｗ，Ｊ．Ｃ．等，１９９６，ＮａｔｕｒｅＢｉ
ｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ１４巻（３）２６７頁；“Ｅｃｏｌｉにおける単鎖
抗−ＨＢｘ抗体の単離と精製” ，ＺｈｏｕＧ．，ＩｕｉＫＤ．，ＳｕｎＨＣ，ＣｈｅｎＹＨ，ＴａｎｇＺＹ及びＳｃｈｒｏｄｅｒＣＨ，１９９７，１２３巻（１１−１２）６０９
−１３に見出すことができる。

【００４６】本発明の方法の１例として、図４を参照して、細胞にコロイド粒子を固定する
ことを含む有用な方法の１例を説明する。腫瘍マーカー、ＭＵＣ−１は腫瘍細胞
(neoplastic cells)に異常に(aberrantly)発現される。ＡＴＣＣから入手可能な
、ヒト組織培養胸部癌細胞系、ＭＣＦ−７はＭＵＣ−１を過度発現する。Ｄａｎ
ａ−ＦａｒｂｅｒＣａｎｃｅｒＩｎｓｔｉｔｕｔｅから入手可能な、抗体５
０、ＤＦ３又は、及びＤＦ３−ｐをヒスチジン−タグ付きタンパク質Ｇ５６を介
して電子シグナリングコロイド５２（ＮＴＡ−ＳＡＭｓ５４を有する）に取り付
ける。標的細胞５８を抗体含有シグナリングコロイド５２と共にインキュベート
し、次に分子ワイヤ５８を含有するＳＡＭによって被覆された電極４０に対して
電気泳動させて、ＡＣＶによって分析する。電極４０上のＳＡＭは、より慣用的
な気密パッキング(tight-packing)ＳＡＭ形成種内で混合された分子ワイヤ５８
を包含する。総ての図において例示の簡単さのために、分子ワイヤのみを概略的
に示す。抗体含有シグナリングコロイドをＭＵＣ−１６０含有細胞と共にインキ
ュベートする場合には、電流ピークが生じる。或いは、ＭＵＣ−１に対する推定
上の同種リガンド、Ｉ−ＣＡＭをＨｉｓ−タグ付きにして、ＮＴＡ基をも有する
シグナリングコロイドに取り付けることができる。

【００４７】他のアッセイを図５に示す。薬物ライブラリーを例えばＭＵＣ−１／Ｉ−ＣＡ
Ｍ相互作用のような、細胞表面タンパク質との特異的な相互作用を中断させるそ
れらの能力に関してスクリーニングすることができる。Ｉ−ＣＡＭ６４を上述し
たようにシグナリングコロイド６２に結合させて、次にＭＵＣ−１６６を提示す
る細胞７０及び対照細胞と共にインキュベートする。薬物候補６８を、細胞とコ
ロイドとが懸濁している溶液に加えると、次に細胞が電極に付着し、ＡＣＶによ
って分析される。シグナルの損失は薬物候補との相互作用を意味する。図６はこ
のスキームを容易に多重系にして、マイクロ電極の接合可能な(interfacable)ア
レイ７４を含む使い捨て式マイクロウェル(microwells)のアレイ７２を用いて、
数千の薬物候補を同時にスクリーニングする方法を例示する。各ウェルは図５に
示すようなアッセイ又は他のアッセイを含有する。

【００４８】次に、図７を参照すると、シグナルアッセイを増加させるために、又は同種リ
ガンドが知られていない細胞表面受容体８０に結合する薬物をスクリーニングす
るために、電子シグナリング部分３４をも有するコロイド又は粒子７８上で小分
子薬物ライブラリーを合成することができる又は同コロイド又は粒子７８に共有
結合させることができる配置が示される。シグナリング粒子に取り付けられた薬
物候補７６を重要な受容体８０を提示する細胞８２又は対照細胞８４と共にイン
キュベートすることができる。このアッセイにおける薬物−標的相互作用はシグ
ナルの増加を生じる（図７）。

【００４９】細胞表面受容体、αＶβ３は、細胞接着分子ビトロネクチン(vitronectin)と
の相互作用によって脈管形成の促進に関係づけられている。αＶβ３細胞表面受
容体を提示するヒト臍静脈内皮細胞（ＨＵＶＥＣ）はＣｌｏｎｅｔｉｃｓから商
業的に入手可能である。αＶβ３の作用を阻害する薬物をスクリーニングするた
めに、ビトロネクチンに由来する、ＲＧＤ含有配列を提示するＨｉｓ−タグ付き
ペプチドを、ＮＴＡ基とフェロセン部分の両方を提示するＳＡＭを有するコロイ
ドに取り付ける。このバイオスペシフィック・シグナリングコロイドを次にＨＵ
ＶＥＣ細胞及び薬物候補と共にインキュベートする。ＨＵＶＥＣ細胞は電極上で
増殖することができる。しかし、細胞が溶液中又は懸濁液中にある場合には、細
胞をセンシング電極に対して電気泳動させるか又は磁気的に引き付けて、ＡＣＶ
によって分析することができる。バイオスペシフィック・コロイドを対照細胞と
ではなくＨＵＶＥＣ細胞とインキュベートする場合には、電流ピークが生じる。
薬物候補がαＶβ３−ＲＧＤ配列相互作用を妨害する場合には、シグナル損失が
生じる。

【００５０】或いは、電子シグナリング部分をも提示するビーズ、コロイド又は担体上で薬
物候補を合成するか、又は同ビーズ、コロイド又は担体に取り付けるができる。
これらの“粒子”を標的細胞と共にインキュベートし、センシング電極に取り付
けて、ＡＣＶによって分析することができる。アトラクティブ・フィールド(att
ractive field)を次に逆転させて、ＲＧＤ配列含有ペプチドを溶液中に滴定する
(titrated into the solutions)。細胞を再びセンシング電極に対して電気泳動
して、再分析する。シグナルの損失は、薬物−細胞相互作用がαＶβ３受容体に
対して特異的であり、ＲＧＤペプチドのＩＣ₅₀を薬物に対する結合アフィニティ
に相関づけることができることを意味する。

【００５１】或いは、αＶβ３にやはり結合する４９アミノ酸ペプチド、エキスタチンをＨ
ｉｓ−タグ付きにして、上記アッセイにおけるＲＧＤ含有ペプチドと置換させる
ことができる。

【００５２】第1結合パートナーは、金被覆された磁気ビーズであってもよい。これにより
、アルキルチオールSAMがその上に形成されることができ、そして、細胞由来タ
ンパク質のヒスチジン−タグされた可溶性断片を捕捉することが可能である。こ
の場合、第2結合パートナーは、擬陽性を避けるために、非磁気固体上にその金
属−含有アルキルチオールSAMを有するべきである。よって、第2結合パートナー
は、同じ表面上にリガンド及び電気活性を提示する、コロイド、リポソーム、又
はポリスチレンビーズであってもよい。

【００５３】本発明の一つの一般的な技術は、電気シグナル実体（entity）を電極の表面に
補充する（結合パートナーによる結合部分（生物学的剤又は化学剤）の捕捉を示
す）ために磁気粒子を使用することを含む。図27を参照すると、最初の種30はコ
ロイド状粒子32に結合しており、これはメタロセンフェロセンなどのシグナル実
体を運搬するシグナル能力を有している。30の結合パートナーと予測される第2
の種36は、信号を送ることはできないが、電極40に磁気的に引きつけらうる、磁
気粒子38に結合している。種30および第2種36の一つの特に有用な技術はタンパ
ク質であり、よって、本発明はプロテオミクスの分野で特に有用性を見出す。上
記技術は、コロイド粒子32に、非コロイド状構造の磁気ビーズ38に結びつく（fa
sten）能力を与えることを含む、本発明の側面の一例である。コロイド粒子の非
コロイド構造への結びつきの決定は、磁気ビーズを電極へ引き寄せ、コロイド粒
子も電極の近くに存在するか、あるいは結合していないかを決定することによっ
て行う。具体的には、2種の成分を共に溶液中でインキュベートし、得られた複
合体を電極に磁気的に誘引させる。次いで、電極をAlternating Current Volt
ammetry（ACV）（Laviron E：J．Electro Anal Chem．，1979，10：35）によ
って分析する。電流を、実時間でボルト数の関数としてプロットする。第1成分
状の電気シグナル部分が電極の非常に近くまで引かれる場合、特徴のある電位に
おいて特有の電流ピークが生じるであろう。2種のタンパク質が互いに相互作用
する場合、磁気粒子が検出電極に誘引されると、それはシグナル能力を伴うコロ
イド粒子も運ぶであろう。第1の成分は小さな金のコロイドであるので、コロイ
ド粒子上の第1種及び磁気粒子に結合した第2種の相互作用を介して検出電極に特
異的に補充されない限り、懸濁（液）中に留まるであろう。第1種と第2種間の相
互作用を介してシグナル粒子が磁気粒子に結合された場合にのみ、電気シグナル
が発生するであろう。この態様において、コロイド粒子はフェロセンによって例
示されるような、補助的なシグナル実体を含む。後述される他の態様において、
コロイド粒子自体がシグナル実体であり、補充的実体は要求されない。

【００５４】このストラテジーは、アレイ形式中のタンパク質−タンパク質相互作用につい
て迅速にスクリーニングするために用いることができる。可能性のある臨床標的
を探索する場合、研究者は、特定のタンパク質に対する結合パートナーの同定を
必要とすることが多い。この既知タンパク質はマグネチックビーズに接着しうる
。このことは、化学的な官能基を表する商業的に入手可能なマグネチックビーズ
への既知タンパク質の直接的な化学カップリングにより、同源の抗体を介したプ
ロテインAコート化マグネチックビーズへの接着により、または金でコートされ
たマグネチックビーズ（NTA-SAMを用いて誘導されたもの（例えば、米国特許5,6
20,850を参照のこと。これは、引用により本願明細書に援用される。））への既
知タンパク質ヒスチジンタグ付バージョンの接着により、達成されうる。可能性
のある結合パートナーは、ヒスチジンタグ付タンパク質として明示され得、そし
て、フェロセン部分を表してもいるNTA-SAMコート化コロイドへ独立して接着し
うる。マルチウェルアレイの各々のウェルは、電極アレイと連結されるが、マグ
ネチックビーズ上の既知タンパク質を含有するものである。シグナリングコロイ
ドへ接着する明白に推定される結合パートナーは、各々のウェルへ独立して添加
されることが可能である。そして、結果として得られる複合体は電磁的に電極へ
接着し、候補であるタンパク質のいずれが既知タンパク質へ結合したかが決定さ
れる。既知種は、必ずしもタンパク質であることを要さない。

【００５５】代わりに、生物学的な又は化学的な試薬30が薬物候補であり、その結合パート
ナー（可能性のある結合パートナー）36が薬物候補の標的である。またその逆も
ある。詳細には、薬物候補はマグネチック粒子及びシグナリングコロイドへ接着
する既知標的種へ接着することができ、医学的に意味のある標的種へ結合する薬
物候補を同定することができる。あるいは、種30及び36は、順に標的及び標的の
リガンドとなり得、この技術はリガンドの標的への結合を阻害するための候補薬
物の存在下、30を36へしっかり結びつけることができるよう、コロイド32及びマ
グネチックビーズ38を近接するようにもたらすことを含みうる。以下に見られる
ように、この技術は種々の非コロイド状構造とコロイドの相互作用に適用するこ
とができる。

【００５６】本技術の先行技術例えばELISA、蛍光ラベリングおよびSPRに対する利点は次の
ものを含む：本システムではタンパク質標識の必要がない；タンパク質は標識成
分に付着している。金のコロイドは、a）シグナル部分；およびb）タンパク質付
着のための官能基の両者で予め標識できる。ヒスチジン−タグを有するタンパク
質を捕捉するためのNTA／Ni²⁺および電子シグナルのためのフェロセン誘導体の
両者を提示する自己アッセンブルモノレヤーは、コロイド上に形成される。未修
飾タンパク質の化学的カップリング( 標準的EDC/NHS 化学) のために、カルボキ
シル基を取り込むSAMSもまた使用できる。この技術はモジュラーである。現実に
、任意の生物学的な成分を、シグナル体を有するコロイド上に不動化できる。容
易に微小電極列上に複合体化できるので、この技術は、経済的な複合体化技術で
ある。

【００５７】リポソームもまた第一結合パートナー30として使用できる。上記のとおり、シ
グナル蛋白質自体リポソーム中へ取り込むことができ、またはHis−タグを有す
る可溶性レセプターを捕捉するためリポソーム形成後にアルキルチオール−含有
脂質をリポソームに取り込んでもよい。第二の結合パートナー36は、アルキルチ
オール鎖に結合した金属化合物またはその中に取り込んだ脂質を有するリポソー
ムでありうる。加えて、リポソームは、安定性を高めるために、リポソーム形成
後に紫外線活性化架橋を可能にする、光活性化可能な基を有してもよい。組織スライスを細胞由来の蛋白質として用いてもよい。組織スライスは、透析
膜に付着させ、次いで、細胞由来蛋白質に結合する金属含有化合物を有するコロ
イド、デンドリマーまたはポリマーに結合するリガンドとインキュベートする。
次いで組織スライスを裏返し、組織が付着した側を電極に近づけて、電気的また
は電気化学的に分析する。その代わりに、組織スライスは、透析膜に付着した結
合パートナーとの相互作用により透析膜に付着させるか、またはSAMコート電極
中の結合リガンドとの相互作用により電極に結合させることもできる。組織スラ
イスは、結合リガンドを特殊なパターンで透析膜に埋め込むことにより、透析膜
に繋ぎ止めることもできる。

【００５８】第1結合パートナーは、金被覆された磁気ビーズであってもよい。これにより
、アルキルチオールSAMがその上に形成されることができ、そして、細胞由来タ
ンパク質のヒスチジン−タグされた可溶性断片を捕捉することが可能である。こ
の場合、第2結合パートナーは、擬陽性を避けるために、非磁気固体上にその金
属−含有アルキルチオールSAMを有するべきである。よって、第2結合パートナー
は、同じ表面上にリガンド及び電気活性を提示する、コロイド、リポソーム、又
はポリスチレンビーズであってもよい。

【００５９】本発明の一つの一般的な技術は、電気シグナル実体（entity）を電極の表面に
補充する（結合パートナーによる結合部分（生物学的剤又は化学剤）の捕捉を示
す）ために磁気粒子を使用することを含む。図27を参照すると、最初の種30はコ
ロイド状粒子32に結合しており、これはメタロセンフェロセンなどのシグナル実
体を運搬するシグナル能力を有している。30の結合パートナーと予測される第2
の種36は、信号を送ることはできないが、電極40に磁気的に引きつけらうる、磁
気粒子38に結合している。種30および第2種36の一つの特に有用な技術はタンパ
ク質であり、よって、本発明はプロテオミクスの分野で特に有用性を見出す。上
記技術は、コロイド粒子32に、非コロイド状構造の磁気ビーズ38に結びつく（fa
sten）能力を与えることを含む、本発明の側面の一例である。コロイド粒子の非
コロイド構造への結びつきの決定は、磁気ビーズを電極へ引き寄せ、コロイド粒
子も電極の近くに存在するか、あるいは結合していないかを決定することによっ
て行う。具体的には、2種の成分を共に溶液中でインキュベートし、得られた複
合体を電極に磁気的に誘引させる。次いで、電極をAlternating Current Volt
ammetry（ACV）（Laviron E：J．Electro Anal Chem．，1979，10：35）によ
って分析する。電流を、実時間でボルト数の関数としてプロットする。第1成分
状の電気シグナル部分が電極の非常に近くまで引かれる場合、特徴のある電位に
おいて特有の電流ピークが生じるであろう。2種のタンパク質が互いに相互作用
する場合、磁気粒子が検出電極に誘引されると、それはシグナル能力を伴うコロ
イド粒子も運ぶであろう。第1の成分は小さな金のコロイドであるので、コロイ
ド粒子上の第1種及び磁気粒子に結合した第2種の相互作用を介して検出電極に特
異的に補充されない限り、懸濁（液）中に留まるであろう。第1種と第2種間の相
互作用を介してシグナル粒子が磁気粒子に結合された場合にのみ、電気シグナル
が発生するであろう。この態様において、コロイド粒子はフェロセンによって例
示されるような、補助的なシグナル実体を含む。後述される他の態様において、
コロイド粒子自体がシグナル実体であり、補充的実体は要求されない。

【００６０】このストラテジーは、アレイ形式中のタンパク質−タンパク質相互作用につい
て迅速にスクリーニングするために用いることができる。可能性のある臨床標的
を探索する場合、研究者は、特定のタンパク質に対する結合パートナーの同定を
必要とすることが多い。この既知タンパク質はマグネチックビーズに接着しうる
。このことは、化学的な官能基を表する商業的に入手可能なマグネチックビーズ
への既知タンパク質の直接的な化学カップリングにより、同源の抗体を介したプ
ロテインAコート化マグネチックビーズへの接着により、または金でコートされ
たマグネチックビーズ（NTA-SAMを用いて誘導されたもの（例えば、米国特許5,6
20,850を参照のこと。これは、引用により本願明細書に援用される。））への既
知タンパク質ヒスチジンタグ付バージョンの接着により、達成されうる。可能性
のある結合パートナーは、ヒスチジンタグ付タンパク質として明示され得、そし
て、フェロセン部分を表してもいるNTA-SAMコート化コロイドへ独立して接着し
うる。マルチウェルアレイの各々のウェルは、電極アレイと連結されるが、マグ
ネチックビーズ上の既知タンパク質を含有するものである。シグナリングコロイ
ドへ接着する明白に推定される結合パートナーは、各々のウェルへ独立して添加
されることが可能である。そして、結果として得られる複合体は電磁的に電極へ
接着し、候補であるタンパク質のいずれが既知タンパク質へ結合したかが決定さ
れる。既知種は、必ずしもタンパク質であることを要さない。

【００６１】代わりに、生物学的な又は化学的な試薬30が薬物候補であり、その結合パート
ナー（可能性のある結合パートナー）36が薬物候補の標的である。またその逆も
ある。詳細には、薬物候補はマグネチック粒子及びシグナリングコロイドへ接着
する既知標的種へ接着することができ、医学的に意味のある標的種へ結合する薬
物候補を同定することができる。あるいは、種30及び36は、順に標的及び標的の
リガンドとなり得、この技術はリガンドの標的への結合を阻害するための候補薬
物の存在下、30を36へしっかり結びつけることができるよう、コロイド32及びマ
グネチックビーズ38を近接するようにもたらすことを含みうる。以下に見られる
ように、この技術は種々の非コロイド状構造とコロイドの相互作用に適用するこ
とができる。

【００６２】本技術の先行技術例えばELISA、蛍光ラベリングおよびSPRに対する利点は次の
ものを含む：本システムではタンパク質標識の必要がない；タンパク質は標識成
分に付着している。金のコロイドは、a）シグナル部分；およびb）タンパク質付
着のための官能基の両者で予め標識できる。ヒスチジン−タグを有するタンパク
質を捕捉するためのNTA／Ni²⁺および電子シグナルのためのフェロセン誘導体の
両者を提示する自己アッセンブルモノレヤーは、コロイド上に形成される。未修
飾タンパク質の化学的カップリング( 標準的EDC/NHS 化学) のために、カルボキ
シル基を取り込むSAMSもまた使用できる。この技術はモジュラーである。現実に
、任意の生物学的な成分を、シグナル体を有するコロイド上に不動化できる。容
易に微小電極列上に複合体化できるので、この技術は、経済的な複合体化技術で
ある。

【００６３】リポソームもまた第一結合パートナー30として使用できる。上記のとおり、シ
グナル蛋白質自体リポソーム中へ取り込むことができ、またはHis−タグを有す
る可溶性レセプターを捕捉するためリポソーム形成後にアルキルチオール−含有
脂質をリポソームに取り込んでもよい。第二の結合パートナー36は、アルキルチ
オール鎖に結合した金属化合物またはその中に取り込んだ脂質を有するリポソー
ムでありうる。加えて、リポソームは、安定性を高めるために、リポソーム形成
後に紫外線活性化架橋を可能にする、光活性化可能な基を有してもよい。組織スライスを細胞由来の蛋白質として用いてもよい。組織スライスは、透析
膜に付着させ、次いで、細胞由来蛋白質に結合する金属含有化合物を有するコロ
イド、デンドリマーまたはポリマーに結合するリガンドとインキュベートする。
次いで組織スライスを裏返し、組織が付着した側を電極に近づけて、電気的また
は電気化学的に分析する。その代わりに、組織スライスは、透析膜に付着した結
合パートナーとの相互作用により透析膜に付着させるか、またはSAMコート電極
中の結合リガンドとの相互作用により電極に結合させることもできる。組織スラ
イスは、結合リガンドを特殊なパターンで透析膜に埋め込むことにより、透析膜
に繋ぎ止めることもできる。

【００６４】種々な病的状態に関与する細胞由来タンパク質(cell-derived protein)のアッ
プレギュレーションを阻害する薬物をスクリーニングするために、この系を用い
ることもできる。結合パートナー（薬物、抗体、又は細胞由来タンパク質に対す
るタンパク質／ペプチドリガンドを包含しうる）がひと度同定されたならば、こ
の結合パートナーを検出部分に結合させて、疾患状態又は治療に応じた細胞由来
タンパク質の発現レベルを定量することができる。これは、細胞表面と細胞内区
画の両方に対する細胞由来タンパク質の発現及びトランスロケーションに関して
薬物候補の間接的影響を試験する任意のアッセイでありうる。

【００６５】薬物候補の同定は競合的阻害アッセイを用いて達成することもできる。詳しく
は、溶液中で遊離している(free in solution)薬物候補を別々に該組成物と共に
インキュベートすることができる。受容体又はリガンドへの薬物結合によって生
じる標的細胞由来タンパク質に対する競合的阻害は、検出シグナルの時間又は用
量依存損失として観察することができる。

【００６６】これを実施することは、既知リガンドにシグナリング(signaling)部分を直接
又は間接的に結合させる方法を必要とし、次にセンシング表面(sensing surface
)に複合体(complex)結合パートナーを結合させる又は補充する方法を提供した。
前者は上述したが、後者は以下で述べる。

【００６７】用いられるセンシング表面は種々な形態をとることができる。しかし、例示の
ために、誘導SAM(conducting SAM)によって改変される電極を用いる、結合パー
トナー複合体の補充方法を述べる。誘導SAMは金属表面に取り付けられた分子層
であり、例えば飽和アルキルチオラートのような絶縁種(insulating species)に
よって均一に被覆された金属よりも高い速度での電子の誘導を可能にする。電子
誘導の好ましい経路は、分子ワイヤ(molecular wires)（芳香環化合物のポリマ
ー）が組み込まれている単層によって与えられうる。このためには、非限定的に
ポリ（エチニルフェニルチオール）（即ち、C₁₆H₁₀S）、本明細書ではMFIと呼ぶ
、を包含する、多様な分子を用いることができる：

【００６８】本明細書で用いる限り、“分子ワイヤ”は、SAMコーディングされた(SAM-code
d)電極を電極と電気的に連通させる流体の能力を強化するワイヤを意味する。こ
れは導電性分子を包含するか、又は上述し、以下でさらに詳述するように、SAM
中の欠陥(defects)を電極と流体接触させることができる分子を包含する。他の
分子ワイヤの非限定的リストは2−メルカプトピリジン、2−メルカプトベンゾチ
アゾール、ジチオスレイトール、1，2−ベンゼンジチオール、1，2−ベンゼンジ
メタンチオール、ベンゼン−エタンチオール、及び2−メルカプトエチルエーテ
ルを包含する。単層の導電性はまた、電極面の導電性を促進する分子の添加によ
っても強化することができる。誘導SAMは、非限定的に、（1）Sを末端に有する
ポリ（エチニルフェニル）鎖；（2）ベンゼン環を末端に有するアルキルチオー
ル；（3）DNA塩基を末端に有するアルキルチオール；（4）単層中に充分にパッ
クされない、任意の硫黄末端種；（5）特異的吸着を阻害しないエチレングリコ
ール単位又はメチル基のいずれかを末端に有する上記プラス又はマイナスアルキ
ルチオール・スペーサー分子の総てから構成されうる。チオール類は、金に対す
るそれらのアフィニティのために、SAMのすばやい形成のために挙げられる。米
国特許第5，620，820号及び他の参考文献から当該技術分野に知られるように、
チオールの代わりに他の分子を用いることもできる。相互作用SAMの下流には、
チャージリーダー(charge reader)（例えば、アンメーター、チャージカウンタ
ー）又は光学的リーダー（例えば、表面プラスモン・レゾナンス・デテクター又
は蛍光リーダー）が存在する。

【００６９】シグナリングコロイド上の既知リガンドがそれらの同種の(cognate)細胞由来
タンパク質と相互作用するときに、薬物候補を溶液中に加えて、特異な(differe
ntial)効果をモニターすることができる。直接又は間接的に細胞に結合するヘッ
ド基(head groups)（例えば、メチル基、ポリK、正電荷、RGD配列、Kringleモチ
ーフ、インテグリン、及び同種(the same)のペプチド模倣体(mimics)）を末端に
有する、例えばアルキルチオールのような分子をも提示する誘導SAMで被覆され
た電極に、細胞を補充することができる。或いは、アルキルチオール又は金属結
合タグを介してSAMに連結される、誘導SAM上に提示される同種リガンドと相互作
用する細胞表面受容体を有することによって、特異な相互作用(differential in
teractions)を定量することができる。この状況において、構成的に発現される
受容体に対するリガンドによって電子シグナルが発生される。流動力(flow forc
e)下で、電子シグナルは、SAM固定リガンドと相互作用する細胞表面受容体の数
に比例すべきである。流動速度の関数としての細胞移動速度は、細胞表面上の細
胞接着分子に対する受容体の密度を示す。

【００７０】細胞は、AC電圧ランプにやや正のバイアスが与えられる場合には、負に荷電す
るという事実のために、センシング電極に引き付けられる筈である。リガンドが
結合するデンドリマー(dendrimers)又はポリマーに付加的な負に荷電した基を加
えると、センシング表面への補充がさらに促進される。当業者はデンドリマー)
又はポリマーに複数のシグナリング実体(signaling entities)を容易に固定する
ことができる。或いは、金属結合タグを介して認識リガンドを取り付けることは
、アルキルチオールNTAに対するそれらの結合（及びその結果として関連細胞の
結合）を促進する。金被覆磁気ビーズ上に例えばフェロセンのような金属含有化
合物を有するSAMは、センシング表面電極に複合体を補充するために、電磁界又
は固定磁石の使用を可能にする。さらに、直接に又はアルキルチオール−ヒスチ
ンジン・タグを介してリガンドを組み込むセンシング電極を用いて、例えば細胞
接着分子とのような特異的相互作用又は非特異的相互作用を介して細胞を引き付
けることができる。

【００７１】しかし、結合パートナーの1つが分析溶液よりも高密度である結果として複合
体が重力によって沈降するならば、簡単に重力によっても検出系への補充を行う
ことができる。インキュベーション段階中に早期沈降を避けるために機械的混合
を行うことができる。

【００７２】細胞由来タンパク質発生器として電極を用いるバリエーションでは、電極パッ
ド上のポイントを用いて、細胞を溶解する(lyses)電圧スパイクを生じることが
できる。次に、細胞の内容物をシグナリングリガンドと共にインキュベートして
、相互作用を検出する。

【００７３】さらに、導電性分子によってチャンネルをラインして、系の検出能力を強化す
るために、SAMを用いて流動チャンネルの底部に沿った一定のトポロジーにおい
て細胞結合分子をパターン化することができる。したがって、SAMは、細胞結合
能力をセンシング能力（光学的又は電子的）と交替するパターンで結合部分を提
示することができる。例として、メチル末端アルキルチオールのストリップをSA
M中の導電性ポリピロール基と交替させる。細胞の側面に沿った受容体が評価さ
れうるように細胞が溝中に存在するように、SAMのトポロジーを操作することも
できる。例えばこれらのような交替機能SAMのストリップの形成は、米国特許第5
，512，131号及び国際特許公開第WO96／29629号（両方とも本明細書に援用され
る）に記載されるように行うことができる。

【００７４】これらの複合体は電子的に検出されることができる。好ましい検出方法は交流
ボルタンメトリー（ACV）と呼ばれる電気化学的方法である。この検出方法を例
えば高次調和分析のような付加的な分析方法を用いて補足することができる。こ
れらの複合体は例えばSPRのような光学的手段を用いて検出することもできる。
後者の方法を用いると、センシング表面への複合体の補充によって光学的性質の
大きなシフトが生じる。また、リガンドがヒドロゲルに結合する場合には、結合
パートナーとのそれらの相互作用が、光学的に検出されうる、ヒドロゲルの密度
の変化をもたらしうる。

【００７５】これらの方法を用いて、血液及び針バイオプシーを包含する多様なソースに由
来する遊離細胞(free cell)上の細胞表面マーカーを検出することができる。さ
らに、これらを用いて、直接のin vitro結合アッセイにおいて、脈管形成又は
癌転移を促進すると知られた又は疑われるような特異的相互作用を阻害する薬物
をスクリーニングすることもできる。特に重要な細胞表面受容体は腫瘍発生と相
関づけられている受容体であり、この理由はこれらの受容体のブロックが腫瘍を
殺すことができるからである。恐らく、他の細胞の接着分子に結合する細胞表面
受容体の過度発現(over-expression)がさらにいっそう広範囲に重要であると思
われる。これらの細胞相互作用は転移及び脈管形成の仲介者であるように思われ
る。

【００７６】さらに、これらの方法を用いて、関与する特異的な受容体−接着分子相互作用
を予め知ることなく、侵襲又は転移に特徴的であることが知られた細胞表現型を
阻害する薬物をスクリーニングすることもできる。生理的に関連する相互作用を
模倣する薬物のスクリーニングも、この系を用いて、溶液中で遊離する薬物候補
を加えて、検出シグナルの損失を探すことによって、又は溶液中で遊離する既知
リガンドを固体担体上の薬物候補と共に加えて、検出シグナルの発生を求めるこ
とによって、達成することができる。

【００７７】 1つの実施態様では、細胞表面タンパク質を次のように検出して、定量するこ
とができる：細胞表面受容体を認識するヒスチジン−タグ付きリガンドを、NTA
（Hisタグ付きタンパク質を捕捉するため）とフェロセン部分（電子シグナリン
グのため）の両方を提示するSAMを有するコロイドに取り付ける。これらのバイ
オスペシフィック(biospecific)、電子シグナリング・コロイドを次に、標的受
容体を提示する細胞と共にインキュベートする。次に、細胞を沈降させ、接着さ
せる、又はSAM被覆電極上に引き付けて、ACV（図3）によって分析する。シグナ
リングコロイド上に固定されたリガンドが細胞表面上のそれらの同種受容体に結
合したならば、フェロセン部分の特徴的な酸化電位における電流ピークが生じる
。細胞表面受容体を認識する抗体を、Hisタグ付きタンパク質A又はCと最初に結
合したNTA−フェロセン含有コロイド(NTA-ferrocene bearing colloids)に取り
付けることができる。或いは、金属結合タグ／金属／キレート結合を介してコロ
イドに抗体を直接取り付けることもでき、この場合には、金属結合タグが抗体に
結合する。ヒスチジン・タグを抗体に結合させる方法は“卵巣癌関連抗原CA125
に対する196−14抗体からの単鎖Fvの構築”，Hashimoto，Y．，Tanigawa，K．，
Nakashima，M．，Sonoda，K．，Ueda，T．，Watanabe，T．，及びImoto，T．：1
999、Biological and Pharnaceutical Bulletin，22巻；（10）1068−1072；
“大きい非免疫化ファージ・ディスプレイ・ライブラリーから単離されたナノモ
ル未満のアフィニティを有するヒト抗体”，Vaughan，T．J．，Williams，A．J
．，Pritchard，K．，Osbourn，J．K．，Pope，A．R．，Earnshaw，J．C．等，1
996，Nature Biotechnology 14巻（3）267頁；“E coliにおける単鎖抗−HBx
抗体の単離と精製” ，Zhou G．，Iui KD．，Sun HC，Chen YH，Tang ZY及びSchroder CH，199
7，123巻（11−12）609−13に見出すことができる。

【００７８】本発明の方法の1例として、図4を参照して、細胞にコロイド粒子を固定するこ
とを含む有用な方法の1例を説明する。腫瘍マーカー、MUC−1は腫瘍細胞(neopla
stic cells)に異常に(aberrantly)発現される。ATCCから入手可能な、ヒト組織
培養胸部癌細胞系、MCF−7はMUC−1を過度発現する。Dana−Farber Cancer In
stituteから入手可能な、抗体50、DF3又は、及びDF3−pをヒスチジン−タグ付き
タンパク質G56を介して電子シグナリングコロイド52（NTA−SAMs54を有する）に
取り付ける。標的細胞58を抗体含有シグナリングコロイド52と共にインキュベー
トし、次に分子ワイヤ58を含有するSAMによって被覆された電極40に対して電気
泳動させて、ACVによって分析する。電極40上のSAMは、より慣用的な気密パッキ
ング(tight-packing)SAM形成種内で混合された分子ワイヤ58を包含する。総ての
図において例示の簡単さのために、分子ワイヤのみを概略的に示す。抗体含有シ
グナリングコロイドをMUC−160含有細胞と共にインキュベートする場合には、電
流ピークが生じる。或いは、MUC−1に対する推定上の同種リガンド、I−CAMをHi
s−タグ付きにして、NTA基をも有するシグナリングコロイドに取り付けることが
できる。

【００７９】他のアッセイを図5に示す。薬物ライブラリーを例えばMUC−1／I−CAM相互作
用のような、細胞表面タンパク質との特異的な相互作用を中断させるそれらの能
力に関してスクリーニングすることができる。I−CAM64を上述したようにシグナ
リングコロイド62に結合させて、次にMUC−166を提示する細胞70及び対照細胞と
共にインキュベートする。薬物候補68を、細胞とコロイドとが懸濁している溶液
に加えると、次に細胞が電極に付着し、ACVによって分析される。シグナルの損
失は薬物候補との相互作用を意味する。図6はこのスキームを容易に多重系にし
て、マイクロ電極の接合可能な(interfacable)アレイ74を含む使い捨て式マイク
ロウェル(microwells)のアレイ72を用いて、数千の薬物候補を同時にスクリーニ
ングする方法を例示する。各ウェルは図5に示すようなアッセイ又は他のアッセ
イを含有する。

【００８０】次に、図7を参照すると、シグナルアッセイを増加させるために、又は同種リ
ガンドが知られていない細胞表面受容体80に結合する薬物をスクリーニングする
ために、電子シグナリング部分34をも有するコロイド又は粒子78上で小分子薬物
ライブラリーを合成することができる又は同コロイド又は粒子78に共有結合させ
ることができる配置が示される。シグナリング粒子に取り付けられた薬物候補76
を重要な受容体80を提示する細胞82又は対照細胞84と共にインキュベートするこ
とができる。このアッセイにおける薬物−標的相互作用はシグナルの増加を生じ
る（図7）。

【００８１】細胞表面受容体、αVβ3は、細胞接着分子ビトロネクチン(vitronectin)との
相互作用によって脈管形成の促進に関係づけられている。αVβ3細胞表面受容体
を提示するヒト臍静脈内皮細胞（HUVEC）はCloneticsから商業的に入手可能であ
る。αVβ3の作用を阻害する薬物をスクリーニングするために、ビトロネクチン
に由来する、RGD含有配列を提示するHis−タグ付きペプチドを、NTA基とフェロ
セン部分の両方を提示するSAMを有するコロイドに取り付ける。このバイオスペ
シフィック・シグナリングコロイドを次にHUVEC細胞及び薬物候補と共にインキ
ュベートする。HUVEC細胞は電極上で増殖することができる。しかし、細胞が溶
液中又は懸濁液中にある場合には、細胞をセンシング電極に対して電気泳動させ
るか又は磁気的に引き付けて、ACVによって分析することができる。バイオスペ
シフィック・コロイドを対照細胞とではなくHUVEC細胞とインキュベートする場
合には、電流ピークが生じる。薬物候補がαVβ3−RGD配列相互作用を妨害する
場合には、シグナル損失が生じる。

【００８２】或いは、電子シグナリング部分をも提示するビーズ、コロイド又は担体上で薬
物候補を合成するか、又は同ビーズ、コロイド又は担体に取り付けるができる。
これらの“粒子”を標的細胞と共にインキュベートし、センシング電極に取り付
けて、ACVによって分析することができる。アトラクティブ・フィールド(attrac
tive field)を次に逆転させて、RGD配列含有ペプチドを溶液中に滴定する(titra
ted into the solutions)。細胞を再びセンシング電極に対して電気泳動して、
再分析する。シグナルの損失は、薬物−細胞相互作用がαVβ3受容体に対して特
異的であり、RGDペプチドのIC₅₀を薬物に対する結合アフィニティに相関づける
ことができることを意味する。

【００８３】或いは、αVβ3にやはり結合する49アミノ酸ペプチド、エキスタチンをHis−
タグ付きにして、上記アッセイにおけるRGD含有ペプチドと置換させることがで
きる。

【００８４】次の理由から、メタロセン類はシグナル伝達構成要素として特に有用である。
各種フェロセン誘導体があり、100mVから800mVの独自の電圧で各個に酸化するた
めの選択が可能である。各酸化電位は、シグナル伝達コロイドにより認識された
細胞表面受容体の数に比例する独自の標識を表す。

【００８５】図8に示すように、細胞表面分子は、懸濁状態の細胞または組織試料中に埋込
まれた細胞上に検出可能である。凍結腫瘍標本86は冷凍切片化し、RGD含有ペプ
チドまたはメチル終端基のような細胞結合基90で誘導化されたフレキシブルな半
透膜サポート上へ直接置く。次いで当該標本は、興味ある細胞表面受容体のため
のリガンド94も提供する電子シグナル伝達コロイド92とともにインキュベートす
る。インキュベーション後、未結合のコロイドは洗い流す。次に前記サポート膜
を、細胞サイズに匹敵する電極ディメンジョンをもつ微小電極アレー96と物理的
に接触させ、ACVにより分析する。組織標本の各セクターは、タンパク質含量お
よび発現レベルを分析し、次いで組織病理と相関させる。この能力により単細胞
分析の適切が保証されるが、それは本法により、癌細胞と特異的に関連するタン
パク質パターンを同定し、ランダムで異常なタンパク質発現を放棄することが可
能だからである。懸濁状態の細胞も同様にサポート膜に付着させることが可能で
ある。

【００８６】上記の生体特異性コロイドは、in vivoイメージング（生体内画像法）を容易
にするのにも利用可能である。使用するコロイドは、比較的不活性な金である。
腫瘍マ−カ−用の抗体または他のリガンドを提示するように誘導化された金コロ
イドは、内服または注射により投与が可能である。同種腫瘍マーカーを提示する
腫瘍塊は、濃縮装置として働くコロイドで覆われるようになる。当該腫瘍は、X
線またはX線コンピュータ断層撮影（CT）のような画像技術により検出可能であ
るが、腫瘍塊は金属で包まれているので、良好な結果が得られる。溶液状態の個
々のコロイドは可視化されず、検出にはかからない。生体特異性コロイドでその
ように標識された腫瘍は、MRI（磁気共鳴画像）によっても検出可能である。画
像は、Fe，GdまたはCrのような常磁性金属および他のコントラスト剤を組入れる
ことにより、鮮明にできる。コントラスト剤は、コロイド上に形成されるSAMs中
へ金属キレートチオールを取込むことにより、コロイドへの付着が可能である。
あるいは、腫瘍上に発現される標的タンパク質に対する同族リガンドを提示する
だけのSAMsは、コントラスト剤物質より成る粒子上に形成可能である。鉄または
磁鉄鉱コアをもつコロイドは、金コート後、生体特異性SAMsで誘導化してもよい
。あるいは、リポソーム様粒子は、金属コントラスト剤が「コア」を形成し、生
体特異性リガンドが溶剤へ露呈するように、キレート基で終端する脂質鎖から形
成されてもよい。あるいは、当該コロイドは、ラマン分光分析を含むエネルギー
吸収または分散技術により検出できる特定の分光特徴を持つ部分を、前記生体特
異性リガンドのほかに、備えてもよい。画像装置は、体外に置かれていてもよく
、あるいはスコープまたは光ファイバー上で体内へ導入してもよい。別の、ラジ
オ周波数を伝える部分を備えたコロイドは、腫瘍塊上へ濃縮されれば、検出可能
なシグナルを発生することがある。個々のコロイドからのシグナルは、腫瘍塊に
結合したコロイドの濃縮物から発生するシグナルに比べれば、無視できるか、検
出不能である。

【００８７】この技術は、シグナル伝達および候補薬剤標的の発見に重要なタンパク質／タ
ンパク質相互作用または薬剤／タンパク質相互作用の研究に利用できる普遍的な
タンパク質相互作用ツールキットへ、開発可能である。本技術は経済的である。
何故なら、当該システムのエレクトロニックスは安価で常備成分を使用しており
、当該生体電子「粒子」は、オフラインで合成される普通成分から自己集合する
からである。ある実施態様での本システムは、どこにでもあるシグナル伝達コロ
イドと補給粒子とに基づいている。NTAを提示するSAMsは、いかなる金基質上に
も迅速に形成可能である。ニッケル原子と配位した場合、NTA基はヒスチジン標
識タンパク質を特異的に捕捉する。NTAチオール類およびトリエチレングリコー
ル終端チオール類を提示するSAMsは、ヒスチジン標識タンパク質を選択的に捕捉
するが、その他のものの非特異的吸着には抵抗することが明らかにされた（米国
特許第5,620,850号）。このことは、ヒスチジン標識タンパク質が、金コート磁
性ビーズあるいはフェロセン／チオールシグナル伝達部分も提示する金コロイド
上に形成可能なことを、意味している。これらの前形成粒子は、生体的に特異的
認識粒子を生じさせるために、所望のヒスチジン標識タンパク質と短時間だけイ
ンキュベートが必要である。

【００８８】図9に関して、2つのタンパク質が相互に作用するかどうかを決めるには、第1
のタンパク質104を、NTA54およびフェロセンリガンド34を提示するコロイド106
に結合させ、第2のタンパク質100を、NTAリガンド54のみを提示するSAMコート磁
性ビーズ102に結合させる。それら2つの粒子型を混合し、磁石108が下にある検
知電極40へ磁性的に補給する。当該磁性ビーズが、それら2つのタンパク質分子
種の相互作用を介して、シグナル伝達コロイドヘ接続された場合のみ、電子シグ
ナルが発生する。非ヒスチジン標識タンパク質も、カルボキシ終端チオールを取
込むSAMsをそれらの上に形成することにより、シグナル伝達または磁性（補給可
能）粒子へ付着させることが可能である。次いで標準EDC／NHS共役化学を使って
、1級アミンを提示するすべての分子を付着させることができる。この電子標識
ステップはタンパク質調製ステップから分離しているので、当該システムは、普
遍的電子シグナル伝達コロイドおよび磁性粒子を用いて、効率的に多重化が可能
である。これによって、タンパク質相互作用データベースの構築が容易になり、
研究者が癌の分子プロフィールを解読するのに役立つ。

【００８９】相互作用タンパク質パートナーは、シグナルの消失を検知することにより明ら
かにされた小分子ドラッグライブラリーおよびドラッグリードとインキュベート
が可能である。あるいは、既知の標的タンパク質へ結合する候補薬剤を直接スク
リーニングするため、小分子ドラッグライブラリーを磁性ビーズ上で購入するこ
とも可能である。

【００９０】上記の基本技術は、酵素活性を調整する薬剤の探索にも利用可能である。ある
種の酵素は、疾患の進行に非常に重要なことが明らかにされている。活性化する
ために、特定の部位で切断されなければならない分子もあり、それを行う酵素の
活性を阻害する薬剤のスクリーニングも考えられる。上記の技術は、その目的の
ために下記のように使用することも可能である。

【００９１】本技術の実施に当り有用なものとして下記がある：EdelsteinおよびDistefano
は、光活性化架橋分子で修飾されたファルネシルピロリン酸基は、酵母FPTによ
るRAS由来のペプチドモチーフへ添加が可能である（Edelstein R．and Distef
ano M．（1997）。酵母ファルネシルプロテイントランスフェラーゼの光親和性
標識および光活性イソプレノイドを取込むRASタンパク質の酵素的合成。Biochem
．and Biophys．Res．Comm．235，377−382）。彼等の目的は、このアッセイ法
を用いて、上記2つを架橋によって、ファルネシル誘導体がFPTにより認識される
ことを、示すことである。この知見は、ファルネシルまたはガレニル部分が、酵
素活性または特異性を妨げずに、ピロリン酸から遠位末端でビオチンにより修飾
されることがある、という考えと符合している。

【００９２】図10に関して、酵素切断部位（ECS）110は、1端112で、既知結合パートナー（
BP1）がある分子122に結合できる。他端114で、SAM（HS−R−X）中へ取込み可能
な分子116へ結合できる。ここで、Sは硫黄、RはSAM中へ取込める分子種、Xはリ
ンカーである。得られた分子は、コロイド116上のSAMsへ、電子シグナル（HS−R
−XM）を送達できる基118とともに、取込める。ここで、Mは酸化還元活性金属ま
たは遷移金属（または電極に近付けたとき、電子シグナルを伝達できる別の基）
である。磁性ビーズまたは粒子120は誘導化して、相互標的分子（BP3）へ同時結
合を介して直接あるいは間接的にBP1 122に結合する分子124（例えばストレプ
タビジン）（BP2）を、提示する。

【００９３】例えば、電子シグナル伝達コロイド116は、酵素切断部位（ECS）をもち、ビオ
チンで終端するチオール類で誘導化可能である。磁性ビーズは、ストレプタビジ
ンで誘導化できる。磁性ビーズおよびシグナル伝達コロイドは、興味ある酵素お
よび候補薬剤とインキュベート可能である。ある候補薬剤が当該酵素の作用を調
整または阻害するならば、当該部位（例えば、タンパク質またはペプチドの）は
切断されず、シグナル伝達コロイドは、ビオチン／ストレプタビジン相互作用に
より、磁性ビーズへ結合するはずである。その複合体が磁性的に検知電極に結合
する場合には、電流ピークが生じ、シグナル検出アッセイの感度が得られる。す
なわち、タンパク質を、1端でSAM形成分子種を介するコロイド116およびビーズ1
20、およびビーズ120上の固定化結合パートナー124ヘ付けられる結合パートナー
122への連結を行い、それについて、切断または調整をモニターする。当該タン
パク質はさまざまな方法でコロイドおよびビーズに連結可能であるが、上記のほ
かに、コロイドは金属を配位するキレートを提示する、タンパク質は金属結合標
識をつける、などが含まれる。本発明はさらに次のように一般化される、すなわ
ち、コロイド粒子116およびビーズ120のような何らかの非コロイド構造への連結
に適応されるすべての構成要素は、当該コロイドおよび非コロイド構造に提示さ
れ、前記構成要素を切断する能力をもつ酵素および当該酵素の活性の調整用の候
補薬剤の存在下で、それに連結が可能である。非コロイド構造は、図示のように
、ビーズまたは電極そのものでもよい。

【００９４】 BP1はBP2および／またはBP3と同じであってよい。例えば、ECSおよびBP1（ビ
オチン）をもつチオールは、磁性ビーズ上で遊離ストレプタビジン（BP3）に、
次いでビオチン（BP2）に結合可能である。

【００９５】あるいは、標的分子に分子基を付加する酵素を阻害するか、加速することを探
してもよい。例えば、コロイド粒子および非コロイド構造を、当該非コロイド構
造への連結に適応された酵素の基質、当該粒子の連結に適応された酵素活性を介
して当該基質へ連結可能な分子種、および当該酵素の基質へ、接触させてもよい
。それはさらに、当該酵素の調整用の候補薬剤の存在下で、行うことが可能で、
当該非コロイド構造は、当該非コロイド構造への連結に適応された酵素の基質、
当該粒子の連結に適応された酵素活性を介して当該基質へ連結可能な分子種、お
よび当該基質の酵素、に対する非コロイド構造をもつ磁性ビーズであってもよい
。それはさらに、当該酵素の調整用の候補薬剤の存在下で実施可能で、当該非コ
ロイド構造は、固定化電極活性構成要素を備えたコロイド粒子をもつ磁性ビーズ
でもよい。あるいは、当該非コロイド構造は、電極表面であってもよい。

【００９６】特異的には、図11に関しての場合で、電子シグナル伝達コロイド126は、当該
基が付加されるキレート／金属／金属結合標識連結を介して、分子128で誘導化
される。付加されるピースである付加分子130は、第1結合パートナー（BP1）132
（ビオチンであってもよい）が終端になっている。磁性ビーズ12は、BP1の結合
パートナー（BP2）134（ストレプタビジンでもよい）。コロイド、磁性ビーズ、
付加分子、興味ある酵素、および候補薬剤をインキュベートし、次いで電極に引
付けて、分析する。対照に比較して、シグナルのロスから、当該薬剤は酵素活性
を阻害し、一方シグナルのゲインから、薬剤は当該酵素活性を高進したことが、
明らかになった。

【００９７】本発明に従って、多種のSAMsを、多種の表面で使用し、電極、コロイド粒子、
などのような物の表面で、結合パートナー、シグナル伝達構成要素、などのよう
な所望の分子種を提供する。当該分野の通常技術は、多種の表面、官能基、分子
部分のスペースなどから選択可能である。例示記載は米国特許第5,620,850号に
みられる。この米国特許は、ニトリロトリ酢酸、2,2'-ビス（サリシリデンアミ
ノ）-6.6'-デメチルジフェニル、および1,8-ビス（a-ピリジル）-3,6-ジチアオ
クタンなどを含む使用可能なさまざまな金属結合標識も記載している。

【００９８】ビーズを含むさまざまな非コロイド構造は、上記のとおりである。ビーズは重
合性材料、アガロース、テンタゲルおよび／または磁性材料を含むことが可能で
ある。ポリスチレンビーズはきわめて有用である。本発明のこれらおよび他の実
施態様は、下記の実施例からさらによく理解できよう。下記の実施例は、本発明
の長所を例示することを意図しているが、本発明の全容を例示するものではない
。

【００９９】

【実施例】

以下の実施例と実験は、本発明の特定の態様を示したものであり、特定の態様
によって本発明を制限するものではない。

【０１００】以下の記載した幾つかの態様において、実施例では、SAM形成、コラーゲンコ
ーティング、細胞増殖、コロイド形成、および交流ボルタンメトリー（ACV）を
含む。SAM形成では、ガラス顕微鏡スライドにチタン層をスパッタし、更に金層
を付着させる。それぞれの電極は、10％メチル末端チオール（HS―（CH₂）₁₅CH₃ ）、40％トリエチレングリコール末端チオール、HS（CH₂）₁₁（CH₂CH₂）₃OH（化
学式）、および50％MF−1を含むDMF溶液300ul中で室温にて0．5時間インキュベ
ートした。次ぎに、400uMのトリエチレングリコール末端チオール2mlをチップを
含むシンチレーションバイアルに加え、それからバイアルを水浴中で以下のサイ
クルで加熱した：55℃2分、37℃2分、55℃1分、37℃2分、それから室温10分。次
ぎに電極をエタノールにつけ、それから滅菌PBSで洗浄した。滅菌を確実にする
ために、それらをバイオ安全キャビネット内のLTV殺菌灯の下に1時間置いた。

【０１０１】コラーゲンコーティングでは、PBS中0．005mg/mlのコラーゲンの200ul小滴を
それぞれの電極に加え、4℃で2時間インキュベートした。細胞増殖では、電極は細胞増殖フラスコ内に置き、培養液と特定の細胞表面レ
セプターであるαVβ3が存在するヒト内皮細胞（HUVECs）を加えた。電極と液を
含む細胞をCO2インキュベーター内で37℃にて24時間培養した。100倍での観察結
果では、細胞は電極に付着していて、成長表現型である蜘蛛の巣状に広がった形
態を示していた。

【０１０２】コロイド調製では、市販の金コロイド（Auro Dye）1．5mlを10分間マイクロフ
ュージ（microfuge）にて遠心によりペレット化した。ペレットを100ul貯蔵バッ
ファー（クエン酸ナトリウムとTween-20）中に再懸濁した。90uMニトリロ三酢酸
（NTA）―チオール、90uMフェロセンーチオール、および500uMカルボキシ末端チ
オールを含む100ulジメチルホルムアミド（DMF）溶液。チオール溶液中での3時
間の培養の後、コロイドをペレット化し、上澄を捨てた。それらを400uMのトリ
エチレングリコール末端チオール100ulを含むDMF中で55℃2分、37℃2分、55℃1
分、37℃2分培養した。a）αVβ3レセプターに結合するようにデザインしたペプ
チド、HHHHHH（S₄G₁）₃GRGDSGRGDS：もしくはb）無関係なペプチド、HHHHHH―ゲ
ルタチオンS―トランスフェラーゼ（GST）のいずれか。RGDモチーフを含むペプ
チドは、内皮細胞のαVβ3レセプターに結合することが示された。ビトロネクチ
ン（αVβ3の天然リガンド）中のRGDモチーフが相互作用に関係していると考え
られる。

【０１０３】 ACV分析は、CH Instruments electrochemical analyzer を使用して行った。3
つの電極系を使用した。銀対塩化銀参照電極をプラチナ補助電極とともに使用し
た。誘導金コートチップは実行電極として使用した。25mV過電圧を周波数10Hzで
電極に供給した。実施例1 この実施例では、ファルネシル・プロテイン・トランスフェラーゼ（FPT）お
よびゲラニルゲラニル・プロテイン・トランスフェラーゼ（GGPT）の阻害剤をス
クリーニングするためのアッセイについて記載する。

【０１０４】 RASタンパク質は小型のGTP結合タンパク質であり、シグナル変換、分化、およ
び増殖に影響を及ぼす。RASにおける変異はGTPアーゼ活性を低下させるが、これ
はヒト癌の40％で見られており、構成的（constitutive）RAS活性を引き起こす
（Bos. JL (1989) Cancer Res. 49, 4682-4689）。しかしながら、RASが活性化
されるためには、細胞膜に局在しなければならない。RASが細胞膜に結合する前
に、酵素、ファルネシル・プロテイン・トランスフェラーゼ（FPT）がRASのC末
端に脂質様基を付加して膜への結合が促進される必要がある（Zhang FL, Kirsch
meier P, Carr D, James L, Bond R, Wang L, Patton R, Windsor W, Syto R, Z
hang R,およびBishop WR（1997）, Ha-ras、N-ras、Ki-ras4A、およびKi-ras4B
の、in vitroにおけるファルネシル・プロテイン・トランスフェラーゼおよびゲ
ラニルゲラニル・プロテイン・トランスフェラーゼI型の基質としてのキャラク
タリゼーション, J Biol. Chem. 272:15, 10232-9）。FPTはファルネシル基（図
12の1）をそのプレニル・ドナーであるファルネシルピロリン酸（2）から、C末
端モチーフCAAX（式中、Cはシステインであり、Aは脂肪族であり、そしてXはメ
チオニンまたはセリンである）を含有するタンパク質上のシステインの硫黄に移
動させる。関連酵素であるゲラニルゲラニル・プロテイン・トランスフェラーゼ
（GGTP）の基質は一般にC末端ロイシンを有するが、この酵素はゲラニル基（3）
をCAAXモチーフを有するRASタンパク質に結合させる。ただしその速度はFPTによ
って触媒されるファルネシル化過程よりかなり緩慢である。これらの酵素の調節
は癌治療の研究の重要な分野となっているが、これはFPTおよびGGPT活性の阻害
剤によってRASの細胞を転換させる能力が失われるためである。FPTおよびGGPT活
性を阻害するための戦略で現在開発中のものには以下がある：1）天然のタンパ
ク質基質と競合させるための短鎖ペプチド・モチーフおよびペプチド・ミミック
の使用；2）酵素には結合するがタンパク質基質に転移されないファルネシル／
ゲラニル類似体の使用（Holstein S, Cermak D, Wiemer D, Lewis K, およびHoh
l R（1998）, ファルネシル・プロテイン・トランスフェラーゼの阻害剤である
可能性があるものとしてのファルネシルピロリン酸のホスホネートおよびビスホ
スホネート類似体, Bioorg Med Chem 6:6 687-94）；および3）酵素活性を阻害
する天然産物の使用（Jayasuriya H, Silverman K, Zink D, Jenkins R, Sanche
z M, Pelaez F, Vilella D, Lingham R, およびSingh S（1998）,クラバリン酸
（Clavaric acid）：Clavariadelphus truncatus由来のファルネシル・プロテイ
ン・トランスフェラーゼのトリテルペノイド阻害剤, J Nat Prod 61:12, 1568-7
0）。しかしその機構は明らかでない。ペプチド阻害剤はin vitroの酵素アッセ
イで非常に有効であるが細胞アッセイでは効果がなく、これはプロテアーゼによ
って迅速に分解されるためであり、従って治療にはほとんど価値がない。合理的
な薬剤設計の使用によってFPT／GGPT活性を阻害するためのファルネシル／ゲラ
ニル類似体が生成されてきた。in vitroにおいて、類似体は酵素活性を阻害する
と考えられるが、FPT、または選択的に標的とされるべきRASの特定の変異型への
特異性は高くない。更に、アッセイの設計によってこれらの類似体群がRASに結
合されるかどうか、そして類似体での修飾によって膜への結合が促進されるかど
うかを確認することが不可能となる。天然の産物を阻害のフェノタイプによって
ランダムにスクリーニングする。いくつかの天然の産物がFPTまたはGGPTの阻害
剤であることが同定されているが、スクリーニングには時間がかかり、標的酵素
の活性および特異性がどのように変更されたかを確認するための莫大な連続的な
アッセイを必要とする。製薬会社が約10年を費やしてFPTの阻害剤を同定するた
めに徹底的な研究と開発を行い、最終的にはその阻害剤がRASの変異型に非特異
的であることを見出しただけであった、ということは珍しくない。

【０１０５】理想的には、構成的に活性なRAS変異体のファルネシル化を特異的に阻害する
が、細胞の生存に必要な野生型基質の修飾には影響を与えないような薬剤の迅速
な同定が望まれる。ある戦略は、RASの特定の型に関係するアッセイにおける未
標識の薬剤候補のマス・スクリーニングを可能にすることによってこれらの問題
を解決する。

【０１０６】出願人は容易に複合できる以下のようなアッセイを設計した：1）野生型の標
的タンパク質および変異体を最初のスクリーニング過程に導入し；2）目的の酵
素による標的タンパク質へのファルネシル／ゲラニル基およびその類似体の結合
を直接検出および定量し；そして3）酵素活性に対する薬剤候補の影響の差異を
検出できる。

【０１０７】ある戦略は以下のようなものである：1）ヒスチジンで標識したRASタンパク質
（または種々の変異体から誘導したペプチド・モチーフもしくはフラグメント）
を、コロイドを有するSAM（NTA／Ni（II）群（ヒスチジン標識タンパク質を捕捉
するため）および電子シグナリングのためのフェロセンのような遷移金属の両方
を呈する）に結合させる；2）ファルネシルピロリン酸誘導体をビオチンで修飾
する（図13）；3）酵素を付加する；4）阻害剤の候補を付加する；5）磁気ビー
ズを含有するストレプトアビジンを付加する；6）感知する（sensing）電極に磁
気的に誘引して電子的に分析する。酵素FPTはビオチニル化したファルネシル（
またはゲラニル）部分を、シグナリング・コロイドに固定化したRASに結合させ
る。磁気ビーズを有するストレプトアビジンはビオチンに結合し、複合体はrecr
uitableかつ検出可能である。アッセイはマイクロウェル中で平行して実施する
が、このウェルは微小電極アレイ、種々のRAS変異体をシグナリング・コロイド
に固定化させたもの、そして薬剤候補を積層した（interfaced）ものである。微
小電極アレイ全体を電子的に分析し、特定の標的タンパク質について、酵素活性
に対する薬剤候補の影響の差異を測定する。酵素がファルネシル基を標的変異体
タンパク質に結合させるのに薬剤候補が干渉すると、電子シグナルの低下が起こ
る。

【０１０８】この戦略を使用して酵素の活性のモニタリング、あるいはその活性を調節する
薬剤のスクリーニングを行うことができる。非ヒスチジン標識タンパク質を標準
的なカップリング化学によってシグナリング・コロイドに結合させることもでき
る。あるいはまたファルネシル誘導体を、磁気ビーズに固定させた群の結合パー
トナーであるビオチン以外の認識群で修飾することもできる。

【０１０９】 EdelsteinおよびDistefanoの報告によれば、感光化可能な架橋結合部分で修飾
したファルネシルピロリン酸基を酵母FPTによってRASから誘導したペプチド・モ
チーフに結合させることができる（Edelstein RおよびDistefano M（1997）,酵
母ファルネシル・プロテイン・トランスフェラーゼのフォトアフィニティー標識
および感光性イソプレノイドを導入するRASタンパク質の酵素的合成, Biochem.
and Biophys. Res. Comm. 235, 377-382）。その目的はこのアッセイを使用して
、2つの架橋結合によってファルネシル誘導体がFPTに認識されることを示すこと
であった。この発見は、酵素活性または特異性に影響を与えることなくファルネ
シルまたはゲラニル（garenyl）部分をピロホスフェートからの末端においてビ
オチン修飾できるという考えと矛盾しない。実施例2 この実施例では、既知のリガンドまたは既知の治療薬の未知の標的を同定する
ためのアッセイについて記載する。

【０１１０】本発明を使用して既知の生体分子の標的を同定することができる。例えば、癌
を治療するためのある種の血管形成阻害剤が同定されている；ほとんどの場合、
それらがどのように血管形成を阻害するのかは理解されていない。同定されてい
る血管形成阻害剤の多くは抗体またはタンパク質であり、製造および投与が小型
分子の薬剤に比べてはるかに困難である。これらの場合、小型分子剤のライブラ
リーを標的分子との相互作用について直接試験できるように、これらの治療の分
子標的を同定することにかなりの労力が向けられる。

【０１１１】以下は血管形成阻害剤Ai1（これはタンパク質である）の生理学的標的を同定
し、ヒスチジン標識（His標識）タンパク質としてAi1を発現させ、そしてHis標
識の捕捉のためにニトリロ3酢酸基を有する磁気ビーズ（または粒子）に結合さ
せるための戦略である。この時点では、システムは未知の標的分子のための生体
特異的リガンドを有するrecruitable粒子から成る。その後、誘導体化した磁気
ビーズを細胞抽出物または細胞溶解物と共にインキュベートし、その後磁気的に
濃縮する（磁気ビーズは固定または可変の電磁場を使用して、あるいは溶液を磁
気カラムまたはポリマーを通過させることによって、大量の中から容易に回収で
きる）。この時点で、Ai1を呈する磁気ビーズは標的分子を捕捉したものである
。次いでイミダゾールを磁気ビーズに結合させてNTA／NiII複合体を生成してキ
レートとし、Ai1およびその標的を遊離させることができる。次いでタンパク質
について、タンパク質シーケンシング、ゲル電気泳動などのような既知の分析を
行う。消化酵素をこの過程に使用して表面に結合した標的を遊離させてもよい。

【０１１２】治療薬がAi2（抗体）の場合、上記のように進行させるが、ただしタンパク質A
またはG（またはその活性フラグメント）を磁気ビーズに結合させ、これがその
後Ai2捕捉する。あるいはまた、非特異的相互作用を低減するために、SAM提示NT
Aを使用してHis標識したタンパク質AまたはGを捕捉することができる。実施例3 この実施例では、細胞をSAMで被覆した金コーティング電極に結合させた。電
極に結合したままの細胞を、細胞表面のレセプターに特異的なリガンドと、電極
に電子シグナルを運搬する能力のあるレドックス活性な金属の両方を呈するよう
に誘導された金コロイドを含有する溶液と共にインキュベートした。一定のイン
キュベーション時間の後、電極を交流ボルタンメトリー（ACV）でスキャンした
。コロイド結合リガンドと細胞表面レセプター間の正の相互作用により、レドッ
クス活性な金属がもたらされ、またコロイド上で電子シグナルを変換するのに十
分近接する。

【０１１３】より明確には、電極をSAMで被覆し、50％ビス（エチニルフェニルチオール
）（すなわちC₁₆H₁₀S）のバックグラウンドで10％メチル・ヘッド基とし、電
極への電子の流れを促進した。40％トリエチレングリコール末端チオール（HS
（CH）₂）₁₁（CH₂CH₂）₃OH）を、単層充填を促進するために含有させる。既に報
告したように、細胞増殖は、コラーゲンをコーティングしたHSC15-メチル-末端S
AM上で維持できる。HSCH₂C₁₅CH₃およびコラーゲンは共に分子を絶縁させ、電極
への電子の流れを阻害する。この理由により、この実施例では、飽和炭素鎖-コ
ラーゲン被覆を減少させて、より伝導性の高い分子網に隣接する増殖細胞の島を
生成した。ヒト内皮細胞（HUVEC）は血管形成に重要な細胞表面レセプター、αV
β3を呈するが、これを電極上に増殖させた。レセプターのためのリガンドを有
するSAMコーティングした金コロイドおよび電子シグナングのためのフェロセン
部分を細胞提示電極と共にしばらくインキュベートした後、ACVで分析した。

【０１１４】 ACV分析には、1ml容量のシリコン・ガスケットを細胞提示電極に固定した。Hi
s標識RGDモチーフ・ペプチドとあらかじめ結合させたNTA-Niコロイド100μlとPB
S100μlをガスケットに添加して細胞提示電極と共にインキュベートした。15分
後、最初のACVスキャニングを行った。2回の連続したスキャニングを15分間隔で
行った。発生した電流をプロットした（−−−）（図17）。正の1.6μAmpのピー
クとは全く対照的に、ネガティブ・コントロールでは明瞭なピークは得られなか
った。実施例4：伝導性表面上の細胞増殖この実施例ではコラーゲンでコーティングしていない“伝導性の”表面上での
細胞増殖の電子的検出について記載する。細胞を硫黄含有分子で修飾した金電極
上で増殖させ、いくつかの場合には単層としたがコラーゲンではコーティングし
なかった。電極の修飾を、実施例3の電極の調製の部分に記載したようにして実
施したが、100％候補分子と共にインキュベートした電極はトリエチレングリコ
ール末端チオール中での熱サイクルは行わなかった。いくつかの電極を同一の細
胞増殖フラスコ内で組み立て、HUVEC細胞を含有する培地を添加した。電極およ
び細胞をCO₂インキュベーター内で24時間インキュベートした。100Xの倍率で表
面を視覚的に分析した。表1に表面の修飾およびそれに次ぐ細胞接着／増殖特性
を記載する。表面の非特異的結合は低かった。しかしながら、一度細胞が結合す
れば、細胞増殖は良好であった。細胞は、SAMを介して金属を配位して金属キレ
ートをなし、タンパク質上の金属結合タグを介してタンパク質をSAMに結合させ
、タンパク質が細胞に結合することによって、SAMに容易に固定できる。結果を
証明するために写真を撮影した（未掲載）。細胞をコロイド（上記）と共にイン
キュベートしたが、これはフェロセン部分とペプチドHHHHHH（S₄G₁）₃GRGDSGRGD
S（これは細胞表面上のアルファVベータ3レセプターに特異的である）；または
ネガティブ・コントロールとして無関係のペプチドHHHHHH-グルタチオン-S-トラ
ンスフェラーゼ（GST）を示した。図18が示すところによれば、100％エチニルフ
ェニルチオール（MF1）SAMコーティングした電極上での細胞増殖は、アルファV
ベータ3レセプターに特異的なリガンドを有するコロイドと共にインキュベート
した場合にのみ電流のピークを生成し（図18、実線）、無関係のペプチドGSTで
被覆したコロイドとインキュベートした場合にはピークを生成しなかった（図18
、点線）。

【０１１５】図19は絶縁性トリエチレングリコール末端チオールのバックグラウンドにおけ
る25％ 2-メルカプトエチルエーテルで被覆した電極の電気化学的スキャニング
である。RGD配列ペプチドを呈するコロイドから誘導された細胞は小さなピーク
を生成し（図19、実線）、GSTペプチドを呈するコロイドと共にインキュベート
した細胞は生成しなかった（図19、点線）。

【０１１６】

【表１】

【０１１７】実施例5：グルタチオン−S−トランスフェラーゼ／グルタチオン結合によるコロイド粒子を持つポリマービーズの装飾図20および21を参照されたい。以下の実施例は、標的蛋白を提供するコロイド
が、標的蛋白の結合パートナーである小分子、または薬物候補を提供する非コロ
イド粒子上にどのように凝集するかを記載する。多数のコンビナトリアル薬物ラ
イブラリーは非コロイド粒子またはビーズ上で合成し、医学的に適切な標的化学
種を示すコロイド粒子と混合することができる。標的化学種の結合パートナーで
ある薬物を示すビーズはたやすく確認することができる。なぜならコロイド粒子
はビーズ上に凝集し、それを赤く着色するからである。

【０１１８】標的蛋白、グルタチオン−S−トランスフェラーゼ（GST）はヒスチジン標識し
、NTA−Niを提供するSAM被覆コロイド上に固定した（ヒスタミン標識はNTA−Ni
に結合する）。表面上に40uM NTA−Niを提供するコロイド30ulを21．5uM GST
65ulに添加し、溶液中のGST最終濃度を14uMにした。GSTに結合する小分子であ
る、グルタチオンはアガロースビーズに結合した形状でSigma−Aldrichから市販
されている。グルタチオン被覆ビーズはGST結合コロイド溶液とインキュベート
した。すぐ後でGSTはグルタチオンビーズに結合し、溶液中から着色コロイドを
引き寄せ、ビーズを赤く着色した（図20）。GSTに結合しない、小分子を示すビ
ーズはGST結合コロイドとインキュベートしたとき、無色のままであった（図21
）。第2の陰性対照は、グルタチオン被覆ビーズをGST非存在下でNTA−Ni 30u
lとインキュベートしたものであるが、NTA−Ni−コロイドがビーズ表面またはグ
ルタチオンに非特異的に結合しないことを示した。

【０１１９】実施例6：電子に対するSAM透過性制御の証明本実施例は電子伝達の促進を含むSAMを形成する能力について記載する。SAMは
第一のしっかり充填された化学種と、第2の電子伝達に対するSAMの透過性を増強
する、異なる分子構造の化学種との混合物を含む表面上で形成する。欠陥、また
は抜け穴をSAM中に形成し、表面がさらされる溶液が表面と電気的に伝達できる
ようにする。具体的には、全体としてSAMに関連した破壊的な構造を持つイオウ
含有小化合物をSAMに取り込ませ、電子に対するより高い透過性を示した。本実
施例は、表面を電気的に相対的に伝導性にし、細胞成長を支持できることを示し
ている。

【０１２０】水溶性フェロセン誘導体は電解液：NaClO₄ 500uM中にフェロセンジカルボン
酸 100mMを含む溶液中に溶解した。作用電極は異なる量の2−単位分子ワイヤ（
MFI）を含むSAMで誘導体化した金被覆電極であった。特徴的なフェロセン電位の
ピークの高さは分子ワイヤ密度の関数としてプロットした。陰性対照として、金
被覆電極をトリエチレングリコール末端チオール100％を含む絶縁SAMで誘導体化
した。図22はSAMの‘伝導性’、または溶液中の電子がSAMに浸透する能力はSAM
に統合された2−単位分子ワイヤの密度の関数であることを示す。このシステム
はイオウ含有化合物のパネルで修整した電極の伝導性を試験するために使用した
。化合物は候補化合物50％およびトリエチレングリコール末端チオール50％で、
DMF中に溶解した。電極は実施例1に記載したように誘導体化した。表2は候補化
合物と、ACVにより分析したときに生じた電流ピークの高さを記載した。図22は
ポリ（エチニルフェニルチオール）による単層破壊の関数として単層伝導度試験
の2つの実験結果を示す。

【０１２１】 SAMはDMF中で500uM トリエチレエングリコール末端チオールおよび500uMのメ
ルカプトベンゾチアゾールまたは2−メルカプトエチルエーテルのどちらかとか
ら金チップ上で形成した。チップはフラットな基質と1ml許容量のシリコンガス
ケットの間に固定した。フェロセンジカルボン酸溶液は500uM NaClO₄中に溶解
し、Ag／AgCl参照電極およびPt補助電極を持つシリコンガスケットに置いた。金
チップは作用電極として連結した。上記システムはACVにより分析した。電極と
通じ合う溶液中のフェロセンから生じた電流のピークの程度は、SAM中に欠陥を
作製することにより、SAMの電子の透過性を向上させる試験化合物の能力の指標
となった。図23は、単に絶縁種、トリエチレエングリコール末端（CH2）II−SH
（＋＋＋線）および報告によるとより伝導性のポリエチニルフェニルチオール種
（MF1）（実線）からなるSAMのオーバーレイである。伝導性のポリエチニルフェ
ニルチオール種は同じ分子としてはより伝導性であると期待されるが、別の反復
単位を持つものはより伝導性であると報告されている（Science 1997Bumm et
al．，）。予測したように、アルキルチオールSAMはフェロセンジカルボン酸溶
液中の電流ピークを生じないが、50％ポリエチニルフェニルチオールからなる
SAMはピークを生じる。図24は2−メルカプトエチルエーテル（実線）およびメル
カプトベンゾチアゾール（＋＋＋線）を含むより伝導性のSAMに対する図23（点
はTEG末端チオール、星印はポリエチニルフェニルチオールである）のプロット
を示し、ポリエチニルフェニルSAMの電流ピークは50％ 2−メルカプトエチルエ
ーテルからなるSAMまたは50％メルカプトベンゾチアゾールからなるSAMにより
発生したピークより程度が低いことを示している。このことはSAMに伝導性化学
種を取り込むか、またはSAMに‘欠陥’または‘オープナー’を挿入することの
いずれかにより、SAMが電子透過性になれるという概念と一致する。

【０１２２】表2．トリエチレエングリコール末端チオールのバックグラウンド中で以下の化
合物により電極を誘導体化した。電極の準備は実施例1に記載したように行った
。表面の‘伝導性’または透過性は電解液（0．5M NaClO₄）中のフェロセン
ジカルボン酸の酸化／還元により生じた電流ピークの程度を測定することにより
試験した。非特異的結合に抵抗する各化合物の能力は測定前にBSA（ウシ血清ア
ルブミン）に各表面を浸すことにより試験した。非特異的に吸着した蛋白は単層
から電極への電子の伝導を遮断するであろう。

【０１２３】

【表２】

【０１２４】実施例7：蛋白−蛋白相互作用の検出本実施例は固定化したシグナル伝達をする実体と固定化蛋白を持つコロイド粒
子の有効性を記載する（図27を参照されたい）。

【０１２５】ヒスチジン標識グルタチオン−S−トランスフェラーゼ（GST−His）は40uM N
TA−Niおよび100uM フェロセン−チオールを示す、NTA−SAM−被覆コロイドに
付着させた。蛋白Aを提供する市販の磁気ビーズは1／10結合能において抗GST抗
体で被覆し、1：5の比でGSTコロイドに添加し、磁石の頂上にすえた50％ MF−1
SAM被覆電極上で測定した。磁石は磁気ビーズを電極表面に引き寄せ、厚い、可
視の沈殿物を形成した。GSTコロイドは磁気ビーズ上のGST抗体との相互作用によ
り電極表面に引き寄せられ、約280mVの電流ピークを生じた。GSTがコロイド表面
に付着しないものと、GST抗体が磁気ビーズに付着しない2種の陰性対照を使用し
た。いずれの陰性対照も電流ピークを生じなかった。図25は上記の説明の結果を
プロットしている。実線は磁気ビーズ上のGST−His提供コロイドおよび抗GST／A
bとの相互作用を示す。白丸はGSTを提供しないコロイドとインキュベートした、
抗体を提供する磁気ビーズを示す。黒丸は、GSTを提供するコロイドとインキュ
ベートした、抗体を提供しないビーズを示す。

【０１２６】実施例8：細胞検出本実施例は、表面と電子的に連絡するために露出されている表面への流れを許
すSAM内の欠落を形成することで、SAMを横切る電子的連絡を高める分子種を含む
混合体を包含する表面上にSMAを形成することの利点、及び蛋白質に結合したシ
グナル実体を持つコロイドを接着させることの有用性について示す。続いて蛋白
質は、SAMを表す電極の表面に結合された細胞に固定化される。この場合の欠落
は、フェニル環を含むSAM−取り込み分子のかさにより誘導される。

【０１２７】 HUVEC細胞は培地中に懸濁され、フラスコ中の金表面上にコーティングされたS
AMの上に置かれる。SAMは50％の直鎖型チオール、及び50％の2単位のポリ（エチ
ニルフェニル）チオール（MF1）を含んだ。8．4mMのRGD−Hisペプチド溶液、5μ
lを培地に加え、細胞を37℃で一晩インキュベーションし、電極表面に接着させ
た。約16時間後、、RGD−Hisペプチドを捕捉するためのNTA及びシグナル発生の
ためのフェロセンを提示しているSMAコーティングコロイド100μlを細胞に加え
、室温にて20分間インキュベーションした。次に電極を緩衝液で濯ぎ、未結合の
コロイドを洗い落とし、測定した。最高電流は220−250mVに記録された。陰性コ
ントロールは細胞に結合できないHis−GSTとインキュベーションされた細胞であ
る。コロイドを陰性コントロールに加え、電極を緩衝液中に濯いでから測定した
。陰性コントロールに関しては最大電流は観察されなかった。図26は、細胞／表
面相互作用により、細胞表面のフェロセンシグナル発生実体を表すコロイドとhi
sタグの付いたリガンドを電極表面に運搬した時生じたピーク（実線）を示す。
菱形はコロイドが細胞表面受容体に結合しない様に選択された無関係の蛋白質を
表す陰性コントロールを示している。

【０１２８】実施例9：蛋白質／リガンド相互作用の検出本実施例は、蛋白質又はリガンドのいずれかを標識しない場合の、SPRなしの
状態に於ける蛋白質／リガンド相互作用決定能を示している。具体的には、電子
反応性実体、即ちフェロセンと固定した近位関係にあり、その電子シグナルが蛋
白質に対する近接度に依存しているリガンドを、電極表面上にリガンドとフェロ
センを含むSMAを形成することで、リガンドと相互作用すると思われる蛋白質に
対し曝す。

【０１２９】実施例10：未修飾リガンドに関するリガンド−受容体相互作用の検出我々はフェロセン誘導体の特徴的酸化電位を、フェロセン誘導体の局所環境の
化学的性質に基づきシフトできることを見いだした。蛋白質をフェロセン誘導体
近位部に近づけると、別のポテンシャル位置に第2電流が現れる。この変化した
ピークの大きさは、システム内の蛋白質密度に比例する。金コーティングした電
極のパネルを、トリエチレングリコール末端チオールのバックグランドの中に一
定密度の伝導性分子ワイヤーチオール及び各種密度のメチル末端チオールを含ん
でいる異質SAMsで誘導化した。これまでに；1）トリエチレングリコール末端SAM
は蛋白質の非特異的吸着に抵抗すること；そして2）メチル末端SAMは蛋白質、特
にコラーゲンに結合することが示されている。従って我々は電極をコラーゲン溶
液とインキュベーションすれば、非特異的に吸着したコラーゲンの密度が、増加
したメチル末端チオール密度より高くなると推測した。2％、4％、10％及び15％
のメチル末端チオールを含むSAMsを金コーティング電極上に形成した。電極の半
数を2時間、4℃で0．005mg／mlのコラーゲンPBSとインキュベーションし、残り
半数はPBS単独とインキュベーションした。電極は、電極液（0，5MのNaClO4）に
溶解された水溶性フェロセン誘導体であるフェロセンジカルボン酸を使った交流
ボルタメトリー（ACV）により解析された。特有電位でフェロセンの酸化／還元
を交互に行うと最大電流が作られる。この最大電流の大きさとそれが発生した時
の電位を記録した。低密度のメチル末端チオールでは、蛋白質コラーゲンが存在
したときのみ約300mVで10％以上の第2最大電流が作られた。図28は、フェロセン
ジカルボン酸存在時の高密度メチル末端チオール電極について示している。実線
はメチルチオールに結合したコラーゲン存在時の電極を表している。電極表面に
あるコラーゲンによりもたらされた疎水環境はフェロセンの酸化電位をシフトさ
せ、2つのピークが見られる。黒丸はコラーゲンに結合していない、即ちフェロ
センの酸化に影響しない高密度メチル末端チオール電極を表している。

【０１３０】この戦略を利用することで、次の様にして非修飾型蛋白質、ペプチド、細胞の
存在を検出することができる：アルキルチオールに結合したフェロセンジカルボ
ン酸、電子の流れを通過できるSAM形成のためのチオール、及び標的ペプチドの
結合相手で終止するチオール（結合相手はヒスチジンタグも持ち、SAM中のNTA−
Ni成分との結合により電極に結合できる）より混合SAMを形成する。サンプル液
中に標的種が存在する場合には、続いてそれはSAM上に存在するその結合相手に
結合する。SMA表面近くの蛋白質の存在は、フェロセンジカルボン酸付近の化学
的環境を変化させ、その酸化電位を低電位にシフトする。固定化された酸化還元
−活性金属の特有酸化電位のシフトは、標的種の存在を示す。これら実験を環
上に極性置換基を持たないフェロセン誘導体を使い実施した場合には、この効果
は観察されなかった。従って、この作業戦略に関しては、固定化酸化還元−活性
金属が極性環境中にあること、そして固定化された結合相手（チオールを介しSA
Mに接続されている）が可能な限り小さいことが必須である。

【０１３１】実施例11： ELISA 分子又は細胞生物学当業者にとって一般的な技術は酵素結合免疫吸着アッセイ
（ELISA）である（Current Protocols in Molcecular Biology、Volume2、I
mmunology11，2、1996。著作権保有者Wiley and Sons Inc、1994−1998）。E
LISAsの主要な問題点は感度である。酵素シグナルの発生は1；1である；1抗体結
合酵素は1抗原の存在を伝達する。従って、効果的なELISAにはマイクログラム量
の抗原が必要であり、この量は全ての例で実行可能というものではない。この問
題が低レベルで発現されている、又は存在している細胞表面上の抗原の検出に関
しELISAsを無効にしている。ELISAに関する別の問題点は低抗原濃度の場合、ア
ッセイに非常に時間がかかることである。酵素による加水分解量は加水分解時間
に直接比例する。通常ELISAを実施する場合、標的種はプラスチック基質に直接
又は間接に結合されている。続いて固定化された種の存在は、シグナル発生能も
持つ二次抗体がそれに結合することで検出される；二次抗体には通常酵素、典型
的には西洋ワサビパーオキシダーゼ（HRPO）、アルカリホスファターゼ（AP）、
又は添加された基質と反応して色変化（分光光度計により検出される）を生ずる
蛍光タグ、又は蛍光光度計により検出できる蛍光標識タグで標識されている（例
えば”インビボに於ける感染神経繊維及び感覚神経に受動的に移動させられた、
単純ヘルペスウイルス糖タンパク質Dに対するヒト組換え体モノクローナル抗体
の局在（Localization of a passively transferred human recombinat monoclo
nal antibody to herpes simplex virus glycoprotein D to infected nerve fi
bers and sensory neurons in vivo”）、Sanna PP、Deerinck TJとEilisman
MH、1999、Journal of Virology Oct．73巻、（108817−23）を参照せよ）
。多くの場合、その都合により、全ての抗体に酵素を標識する必要はなく、マウ
ス抗体が特異的抗体として利用され、次に酵素標識されたウサギ抗マウス抗体が
加えられる。

【０１３２】ここに記載された技術を使うことでELISAsの感度を大きく上げ、そして天然リ
ガンド（蛋白質又はペプチド）、あるいは薬物候補をプローブ分子として使うこ
とで固定された標的種の存在を検出することができる。固定された種の存在は、
多数の西洋ワサビパーオキシダーゼ（HRPO）又はアルカリホスファターゼ（AP）
も存在しているコロイドに結合されたリガンドにそれを結合させることで検出さ
れる。酵素は酵素に直接結合したヒスチジンタグを含む各種方法、又はヒスチジ
ンタグ付き蛋白質Gを介しコロイドに結合されているヤギ抗体にマウス抗ヤギ酵
素標識抗体を結合させることで、より好都合にコロイドに結合される（Akerstom
、B．，Nielson，E．，Bjorck，L．Journal of Biological Chemistry、1987
、Oct．5、262巻（28）；1388−91ページ、及びFahnestock，S．R．，Alexander
、P．，Nagle、JとFilpula、D．（1986）Journal of Bacteriology167巻、870
−880）。多数の酵素を持つコロイド上に共固定されたリガンドを二次抗体の代
わりに標的種と結合させることで、結合分子に対するシグナル発生分子の割合が
大きく増加する。コロイド状の1抗体又はリガンドがELISAプレート上に提示され
た抗原に結合すると、数千または数百万の酵素の結合が生じる。あるいは、既知
種は目的にあわせ96ウエル型プレートのウエルに結合できることから、それぞれ
が選択された薬物候補を表すコロイドを持つ1種類のプローブを、シグナル発生
酵素と共に利用することができる。現在これを既存ELISA技術を使い実行するこ
とは不可能であり、各薬物候補を1種類の酵素に結合させることはできない。あ
るいは、固定標識に関する天然リガンドを、シグナル発生酵素や、相互作用を破
壊するためにプレートの各ウエルに加えられる薬物候補と共にコロイド上に提示
させることができる。未結合コロイドは洗浄段階で消失するため、そのシグナル
も同時に消失する。抗体−又はリガンド提示コロイドの標的はELISAプレートに
直接又は間接的に結合された（別の抗体又はリガンドを介して）細胞又は蛋白質
でもよい。ELISAに関するこの改良の利点は感度だけではなく、効率にもある。
数千のシグナル発生酵素がコロイドを介し1抗原に対し結合し続けるため、基質
の加水分解がより迅速に起こり、適当な測定に要する時間は短くなるだろう。当
業者は、ここに掲載された全パラメータが例示であり、実際のパラメータは本発
明の方法及び装置が使用される具体的応用に依存することを容易に理解するだろ
う。従って、上記実施態様は例示的にのみ表されており、具体的に記述された以
外に、添付されたクレームの範囲内にあり、そしてそれに等しい発明が別に実施
できることが理解される。

【図面の簡単な説明】

【図１】無傷の細胞上にあるそれらのコグネイト細胞表面受容体と相互作用するデンド
リマーまたはポリマーを介して、金属含有化合物、たとえばフェロセンに付着し
たリガンドを示す。

【図２】無傷の細胞上にあるそれらのコグネイト細胞表面受容体と相互作用する粒子に
付着したリガンドおよび金属含有化合物、たとえばフェロセンを示す。

【図３】電気的または電気化学的シグナリングのためのレドックス活性金属をも提示す
るコロイド上の自己形成単層（self−assembled monolayer）に付着したタンパ
ク質を示す。ターゲット受容体をもつ細胞を、目的受容体に対するコグネイトリ
ガンドを保有するコロイドと共にインキュベートし、次いで電気泳動または磁気
により検出電極に付着させる。この図は現尺で描かれたものではなく、コロイド
は金原子20個から直径数ナノメーターまでの範囲のさまざまなサイズで調製しう
ることを留意されたい。

【図４】 MUC−1特異性抗体DF−3を提示する電気シグナリングコロイドと共にインキュ
ベートした、腫瘍マーカーMUC−1をもつ細胞を示す。抗体は、コロイド上の自己
形成単層中に取り込まれたNTA／Ni（II）基に結合したHisタグ付きプロテインG
を介してコロイドに付着している。

【図５】薬物ライブラリーをそれらの各メンバーが細胞表面タンパク質との相互作用を
撹乱する能力についてスクリーニングするために使用できるアッセイ法の1態様
を示す。

【図６】マイクロウェル（使い捨て）を微小電極アレイおよびロボチックと界面接触さ
せることにより薬物スクリーニングアッセイを容易にマルチ化しうることを示す
。電極アレイの分析は、複数の電極を同時に分析できる改良型電気化学分析装置
を用いて実施できる。電極は、マイクロウェルに挿入しうるように（矢印参照）
構成できる。

【図７】薬物候補を、電気活性シグナリング部分をも保有する粒子上で合成するか、ま
たはそれらの粒子に共有結合させうることを示す。シグナリング粒子に付着した
薬物候補を、目的受容体を提示する細胞および目的受容体を発現しなかった対照
細胞と共にインキュベートすることができる。このアッセイにおいて薬物−ター
ゲット相互作用の結果、信号が増加するであろう。

【図８】 RGDモチーフを含むペプチドとの相互作用によって柔軟な半透過性支持体に付
着した組織検体を示す。次いで、目的とする細胞表面受容体に対するリガンドを
保有する電気活性シグナリングコロイドと共に、検体をインキュベートする。検
体をすすぎ、次いで微小電極アレイと界面接触させる。電極アレイは、電極寸法
が細胞寸法に適合するように作成できる。次いで検体をACVにより解析し、次い
でこれを組織病理と関連づけることができる。

【図９】容易にマルチ化しうる、ユニバーサル捕獲およびシグナリング粒子に基づくタ
ンパク質−タンパク質相互作用アッセイ法を示す。Hisタグ付きタンパク質を選
択的に捕獲するNTA／Ni（II）リガンドを保有する自己形成単層を、シグナリン
グコロイドおよび金被覆した磁性ビーズ上に形成する。次いでそれぞれのタイプ
の粒子を種々のHisタグ付きタンパク質と共に短時間インキュベートする。次い
で磁界により磁性ビーズを検出電極に引き付ける。コロイド上の電気活性標識（
レドックス活性部分であってもよい）が第1タンパク質と第2タンパク質の相互作
用により電極へ運ばれた場合にのみ、信号が伝達される。Hisタグを含まないタ
ンパク質がカルボキシ末端基付きチオールを提示する自己形成単層を保有するユ
ニバーサル粒子に付着する可能性があることも留意されたい。

【図１０】酵素開裂部位（enzyme cleavage site，ECS）をもち、かつビオチンを末端
とするチオールで誘導体化された、電気活性シグナリングコロイドを示す。磁性
ビーズをストレプトアビジンで誘導体化し、次いで磁性ビーズおよびシグナリン
グコロイドを、目的とする酵素および薬物候補と共にインキュベートする。薬物
候補が目的酵素の作用を阻害すれば、その部位は開裂せず、シグナリングコロイ
ドはビオチン−ストレプトアビジン相互作用により磁性ビーズに付着したままで
あろう。生じた複合体が検出電極に磁気的に付着すると、電流ピークが生じ、こ
のアッセイ法の信号検出アッセイを増大するであろう。

【図１１】酵素活性を変調させる薬物のスクリーニング方法を示す。このスキームでは、
酵素修飾のターゲットであるタンパク質を、電気活性部分をも保有するコロイド
に付着させる。酵素がターゲットタンパク質に付加する基を、ビオチンで標識し
ておく。酵素が適正に機能すると、ビオチン標識化合物はシグナリングコロイド
上のタンパク質に付加する。次いでこの生成複合体をストレプトアビジン被覆し
た磁性ビーズに結合させる。次いで複合体を検出電極に電磁気的に付着させる。
薬物候補をこのアッセイに添加することができる。対照と比較した信号損失はそ
の薬物候補が酵素を阻害したことを指示し、一方、信号増加はその薬物が酵素活
性を高めたことを指示するであろう。

【図１２】ファルネシル基、ファルネシルピロホスフェートおよびゲラニル−ゲラニルピ
ロホスフェートの化学構造を示す。

【図１３】ビオチンのような認識基によるファルネシル様またはゲラニル様部分の修飾を
示す。

【図１４】ビオチン部分をもつファルネシルピロホスフェート誘導体を示す。ファルネシ
ルプロテイントランスフェラーゼ（FPT）酵素は、RASタンパク質変異体へのファ
ルネシル誘導体の付加を触媒する。ストレプトアビジンを保有する磁性ビーズを
用いて複合体を検出電極に捕獲させると、電流出力の測定によりこの酵素の活性
または薬物候補が酵素活性を変化させる能力を定量できる。

【図１５】薬物候補が酵素活性を変調させる能力を評価しうることを示す。それぞれ空間
的にアクセスできるマイクロウェルに、RASタンパク質（野生型または変異体）
、FPT酵素、ビオチン修飾した付加基（ファルネシル誘導体）、ストレプトアビ
ジンを保有する磁性ビーズ、およびプラスまたはマイナスの薬物候補を入れる。
次いで交流ボルタメトリー（ACV）を含めた多様な電気的および電気化学的方法
で電極を分析することができる。

【図１６】 RGD含有リガンドとコラーゲン被覆電極上で増殖させた細胞との相互作用のACV
分析のプロットを示す。

【図１７】（陰性）対照リガンドとコラーゲン被覆電極上で増殖させた細胞との相互作用
のACV分析のプロットを示す。

【図１８】単一タイプの導電性分子のみを含む金属支持体上で増殖させた細胞のACV分析
のプロットを示す。

【図１９】 RGD含有リガンドと絶縁性分子および導電性分子の不均質単層を含む金属支持
体上で増殖させた細胞との相互作用のACV分析のプロットを示す。

【図２０】コロイド装飾ビーズ、詳細にはタンパク質／タンパク質相互作用によりビーズ
に結合したコロイドの写真のフォトスコピーである。

【図２１】図20に示した実験の陰性対照の写真のフォトスコピーである。

【図２２】導電性分子の％（絶縁種のローン中における）としての単層の導電率上昇が増
大することを証明するプロットを示す。

【図２３】 2単位分子ワイヤ、ポリ（エチニルフェニル）チオール、MFIを含有する自己形
成単層の導電率を、陰性対照（非導電性の自己形成単層）に対比して示した、AC
V分析（フェロセン溶液を用いて測定）のプロットを示す。

【図２４】図23の2つの自己形成単層の単層導電率を、より導電率の高い単層に対比して
測定したACV分析（フェロセン溶液を用いて測定）のプロットを示す。

【図２５】磁性ビーズへのコロイドの結合により測定したタンパク質／タンパク質相互作
用のACV分析を示す。

【図２６】図26は、フェロセンシグナル体およびHis−タグを有するリガンドを細胞表面
レセプターへ提示するコロイドが、細胞／電極表面相互作用で電極表面へ運ばれ
たとき生じるピーク（実線）を示す。

【図２７】プロットを図25に示した、磁性ビーズへのコロイドの結合により測定したタン
パク質／タンパク質相互作用のアッセイ法の模式図である。

【図２８】表面結合タンパク質を含む電極のACV分析のプロット、ならびにそれらがフェ
ロセン酸化電位に与える影響（実線）および陰性対照（点線）を示す。

───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (51)Int.Cl.⁷ 識別記号ＦＩテーマコート゛(参考）Ｇ０１Ｎ 33/15 Ｇ０１Ｎ 33/50 Ｚ 33/50 33/53 Ｕ 33/53 33/545 Ａ 33/545 33/548 Ａ 33/548 33/553 33/553 37/00 １０２ 37/00 １０２１０３１０３ 33/543 ５９３ // Ｇ０１Ｎ 33/543 ５９３ 27/30 ３５１ (31)優先権主張番号６０／１３３，１４８ (32)優先日平成11年５月７日(1999．5．7) (33)優先権主張国米国（ＵＳ） (31)優先権主張番号６０／１３３，７７２ (32)優先日平成11年５月12日(1999．5．12) (33)優先権主張国米国（ＵＳ） (81)指定国ＥＰ(ＡＴ，ＢＥ，ＣＨ，ＣＹ，ＤＥ，ＤＫ，ＥＳ，ＦＩ，ＦＲ，ＧＢ，ＧＲ，ＩＥ，ＩＴ，ＬＵ，ＭＣ，ＮＬ，ＰＴ，ＳＥ)，ＯＡ(ＢＦ，ＢＪ，ＣＦ，ＣＧ，ＣＩ，ＣＭ，ＧＡ，ＧＮ，ＧＷ，ＭＬ，ＭＲ，ＮＥ，ＳＮ，ＴＤ，ＴＧ)，ＡＰ(ＧＨ，ＧＭ，ＫＥ，ＬＳ，ＭＷ，ＳＤ，ＳＬ，ＳＺ，ＴＺ，ＵＧ，ＺＷ )，ＥＡ(ＡＭ，ＡＺ，ＢＹ，ＫＧ，ＫＺ，ＭＤ，ＲＵ，ＴＪ，ＴＭ)，ＡＥ，ＡＬ，ＡＭ，ＡＴ，ＡＵ，ＡＺ，ＢＡ，ＢＢ，ＢＧ，ＢＲ，ＢＹ，ＣＡ，ＣＨ，ＣＮ，ＣＲ，ＣＵ，ＣＺ，ＤＥ，ＤＫ，ＤＭ，ＥＥ，ＥＳ，ＦＩ，ＧＢ，ＧＤ，ＧＥ，ＧＨ，ＧＭ，ＨＲ，ＨＵ，ＩＤ，ＩＬ，ＩＮ，ＩＳ，ＪＰ，ＫＥ，ＫＧ，ＫＰ，ＫＲ，ＫＺ，ＬＣ，ＬＫ，ＬＲ，ＬＳ，ＬＴ，ＬＵ，ＬＶ，ＭＡ，ＭＤ，ＭＧ，ＭＫ，ＭＮ，ＭＷ，ＭＸ，ＮＯ，ＮＺ，ＰＬ，ＰＴ，ＲＯ，ＲＵ，ＳＤ，ＳＥ，ＳＧ，ＳＩ，ＳＫ，ＳＬ，ＴＪ，ＴＭ，ＴＲ，ＴＴ，ＴＺ，ＵＡ，ＵＧ，ＵＳ，ＵＺ，ＶＮ，ＹＵ，ＺＡ，ＺＷＦターム(参考） 2G045 AA40 CB01 DA12 DA13 DA14 DA36 FB01 FB02 FB03 FB07 2G046 AA30 BC01 EB09 2G054 AA06 EA03 GB02 GB04 4B063 QA01 QQ08 QR90 QS03 QS24 QS36 QS39 QX04

Claims

【特許請求の範囲】

【請求項１】コロイド粒子の非コロイド構造に固定される能力を可能に
し；そして該コロイド粒子の該非コロイド構造に対する固定を測定することを含む方法。
【請求項２】コロイド粒子が、補助的シグナル実体を含む、請求項１記
載の方法。
【請求項３】補助的シグナル実体が、色素、ピグメント、電気的活性（
ｅｌｅｃｔｒｏａｃｔｉｖｅ）分子、蛍光部分、上方制御燐光、または西洋ワサ
ビペルオキシダーゼおよびアルカリホスファターゼを含む酵素連結シグナル部分
を含む、請求項２記載の方法。
【請求項４】シグナル実体がメタロセンを含む、請求項３記載の方法。
【請求項５】シグナル実体がフェロセンを含む、請求項４記載の方法。
【請求項６】複数のコロイド粒子が、非コロイド構造に固定されること
を可能にし、そして複数の粒子の非コロイド構造に対する固定を測定することを
含む、請求項１記載の方法。
【請求項７】複数のコロイド粒子が補助的シグナル実体を含む、請求項
６記載の方法。
【請求項８】補助的シグナル実体が色素、ピグメントまたは電気的活性
分子を含む、請求項７記載の方法。
【請求項９】さらに、非コロイド構造に連結しているまたは連結に適応
している生物学的または化学的剤、および粒子に連結しているまたは連結に適応
している生物学的または化学的剤の結合パートナーを提供することを含み、可能
にする工程が、剤および結合パートナーを介し、粒子が非コロイド構造に連結す
ることを可能にすることを含む、請求項１記載の方法。
【請求項１０】非コロイド構造がビーズである、請求項１記載の方法。
【請求項１１】ビーズがポリマー素材、アガロース、テンタゲル（ｔｅ
ｎｔａｇｅｌ）、および／または磁気素材を含む、請求項１０記載の方法。
【請求項１２】ビーズがポリスチレンビーズである、請求項１１記載の
方法。
【請求項１３】剤が非コロイド構造に連結し、結合パートナーが粒子に
連結し、そして剤および結合パートナーが互いに結合するのを可能にすることを
含む、請求項９記載の方法。
【請求項１４】剤および結合パートナーが互いに生物学的に結合するの
を可能にすることを含む、請求項１３記載の方法。
【請求項１５】生物学的または化学的剤が薬剤候補であり、そして結合
パートナーが該薬剤候補の標的である、請求項９記載の方法。
【請求項１６】非コロイド構造がビーズである、請求項１５記載の方法
。
【請求項１７】生物学的または化学的剤が核酸配列である、請求項９記
載の方法。
【請求項１８】生物学的または化学的剤がペプチドであり、そして結合
パートナーが該ペプチドの結合パートナーである、請求項９記載の方法。
【請求項１９】生物学的または化学的剤がタンパク質であり、そして結
合パートナーが該タンパク質の結合パートナーである、請求項９記載の方法。
【請求項２０】コロイド粒子が固定化標的を保持し、そして非コロイド
構造が該標的に対するリガンドを保持し、該標的に対する該リガンドの結合を妨
げる候補薬剤の存在下で、コロイド粒子が非コロイド構造に固定される能力を可
能にすることを含む、請求項１記載の方法。
【請求項２１】非コロイド構造がビーズであり、さらに、複数のビーズ
、ビーズに対する連結に適応している複数の生物学的または化学的剤、複数の粒
子、および粒子に対する連結に適応している生物学的または化学的剤の複数の結
合パートナーを含む、ここで剤および結合パートナーの少なくともいくつかは、
互いに結合する能力を有すると推測される、請求項１記載の方法であって、ビー
ズの少なくともいくつかを粒子の少なくともいくつかに曝露し、そしてビーズに
対する粒子の固定を測定する、前記方法。
【請求項２２】生物学的または化学的剤が薬剤候補であり、そして結合
パートナーが該薬剤候補の標的である、請求項２１記載の方法であって、２つの
別個の位置にあり、各々異なる固定薬剤候補を保持する、少なくとも第一および
第二のビーズを提供し、複数の粒子を少なくとも２つのビーズに曝露し、そして
第一のビーズ対第二のビーズに対する粒子の連結を区別することを含む、前記方
法。
【請求項２３】少なくとも２つのビーズがマルチウェルプレートの少な
くとも２つの異なるウェルに別個に位置する、請求項２２記載の方法。
【請求項２４】生物学的または化学的剤が薬剤候補であり、そして結合
パートナーが該薬剤候補の標的である、請求項２１記載の方法であって、２つの
別個の位置にある薬剤候補を保持する、少なくとも２つビーズを提供し、該薬剤
候補の第一の標的を保持するコロイド粒子の第一の組に、第一のビーズを曝露し
、そして該薬剤候補の第二の標的を保持するコロイド粒子の第二の組に、第二の
ビーズを曝露し、そして第一のビーズに対する粒子の第一の組対第二のビーズに
対する粒子の第二の組の連結を区別することを含む、前記方法。
【請求項２５】粒子と相互作用する、吸収または透過電磁放射のスペク
トルの変化を測定することにより、非コロイド構造に対する粒子の固定を測定す
ることを含む、請求項９記載の方法。
【請求項２６】視覚的検査により、非コロイド構造に対する粒子の固定
を測定することを含む、請求項２６記載の方法。
【請求項２７】複数のビーズおよび該ビーズに連結している剤、複数の
粒子および該粒子に連結している結合パートナーを提供し、そしてビーズに粒子
を曝露し、そしてビーズに対する粒子の固定を測定することを含む、請求項２１
記載の方法。
【請求項２８】剤または結合パートナーの少なくとも１つが、金属結合
タグ／金属／キレート連結を介し、それぞれ、非コロイド構造または粒子に対す
る連結に適応している、請求項９記載のキット。
【請求項２９】剤または結合パートナーの少なくとも１つが、それに固
定されている、金属調整キレートを保持し、そして剤または結合パートナーの少
なくとも１つが、ポリアミノ酸タグで誘導体化されている、請求項２８記載の方
法。
【請求項３０】剤または結合パートナーの少なくとも１つが、相補的核
酸配列対を介し、それぞれ、ビーズまたは粒子に対する連結に適応している、請
求項９記載の方法。
【請求項３１】結合パートナーが、グルタチオン／グルタチオン−ｓ−
トランスフェラーゼリガンド相互作用を介し、粒子に対する連結に適応している
、請求項９記載の方法。
【請求項３２】ポリマービーズ並びに第一および第二のビーズに連結し
ている少なくとも第一および第二の剤をそれぞれ含む、少なくとも第一および第
二の非コロイド構造を提供し；各々、それに固定されている第一および／または第二の剤の推測上の結合パート
ナーを保持する、複数のコロイド粒子を提供し；粒子にビーズを曝露し；そして第一のビーズ対第二のビーズに対する粒子の連結を区別することを含む、請求項９記載の方法。
【請求項３３】第一および第二のポリマービーズに連結されている第一
および第二の剤が、結合パートナーと生物学的または化学的相互作用を有すると
推測され、そして区別する工程が、第一の剤および結合パートナー対第二の剤お
よび結合パートナーの間の生物学的相互作用を区別することを含む、請求項３２
記載の方法。
【請求項３４】各々、それに固定されている剤を保持するビーズを含む
、複数の非コロイド構造を提供し；コロイド粒子の第一の組および第二の組を提供し、第一の組は、各々、それに固
定されている、剤の第一の推測上の結合パートナーを保持し、そして第二の組は
、各々、それに固定されている、剤の第二の推測上の結合パートナーを保持し；
粒子の第一の組に少なくとも第一のビーズを、そして粒子の第二の組に少なくと
も第二のビーズを曝露し；第一のビーズに対する粒子の第一の組対ビーズに対する第二の組の連結を区別す
ることを含む、請求項９記載の方法。
【請求項３５】第一および第二の推定上の結合パートナーが、剤と生物
学的または化学的相互作用を有すると推測され、そして区別する工程が、剤およ
び第一の推測上の結合パートナー対剤および第二の推測上の結合パートナーの間
の生物学的相互作用を区別することを含む、請求項３４記載の方法。
【請求項３６】非コロイド構造が細胞である、請求項１の方法。
【請求項３７】さらに、粒子に対する連結に適応している、細胞の表面
の受容体に対するリガンドを提供することを含み、可能にする工程が、受容体と
相互作用するリガンドを介し、粒子が細胞に連結することを可能にすることを含
む、請求項３６記載の方法。
【請求項３８】リガンドがペプチド、タンパク質、抗体、酵素、または
小分子である、請求項３７記載の方法。
【請求項３９】リガンドが、金属結合タグ／金属／キレート連結を介し
、粒子に対する連結に適応している、請求項３７記載の方法。
【請求項４０】リガンドがポリアミノ酸タグを保持し、そして粒子が固
定された金属調整キレートを保持する、請求項３８記載の方法。
【請求項４１】キレートがニトリロ三酢酸である、請求項４０記載の方
法。
【請求項４２】粒子が、ニトリロ三酢酸を含む、自己集合単層を保持す
る、請求項４０記載の方法。
【請求項４３】粒子が、固定キレートを含む、自己集合単層を保持する
、請求項４０記載の方法。
【請求項４４】リガンドおよび粒子を細胞に曝露し、リガンドが粒子に
連結するのを可能にし、そして受容体に対するリガンドの固定を測定することを
含む、請求項３７記載の方法。
【請求項４５】粒子と相互作用する、吸収または透過電磁放射のスペク
トルの変化を測定することにより、細胞に対する粒子の固定を測定することを含
む、請求項３６記載の方法。
【請求項４６】細胞に対する粒子の固定を、電子的に測定することを含
む、請求項３６記載の方法。
【請求項４７】改変電流電圧測定（ｃｕｒｒｅｎｔｖｏｌｔａｍｅｔ
ｒｙ）を介し、細胞に対する粒子の固定を測定することを含む、請求項４６記載
の方法。
【請求項４８】視覚的検査を介し、細胞に対する粒子の固定を測定する
ことを含む、請求項４５記載の方法。
【請求項４９】表面に受容体を提示する細胞を提供し；コロイド粒子を提供し；そしてコロイド粒子が受容体に固定されるのを可能にすることを含む、請求項３６記載の方法。
【請求項５０】コロイド粒子が補助的シグナル実体を含む、請求項４９
記載の方法。
【請求項５１】第一の剤が生物学的または化学的リガンドであり、そし
て第二の剤が表面に受容体を提示する細胞である、請求項１１６記載の方法であ
って、リガンドが受容体に固定されるのを可能にすることを含む、前記方法。
【請求項５２】複数のシグナル実体が、第一の剤に連結されているポリ
マーに連結されている、複数のシグナル実体を含む、請求項１１６記載の方法。
【請求項５３】複数のシグナル実体が、第一の剤に連結されているデン
ドリマーに連結されている、複数のシグナル実体を含む、請求項１１６記載の方
法。
【請求項５４】第一の剤が、複数の固定化シグナル実体を含むコロイド
粒子に固定される、請求項１１６記載の方法。
【請求項５５】複数のシグナル実体が複数の電気的活性分子を含む、請
求項２５０記載の方法。
【請求項５６】複数の電気的活性分子が複数のメタロセンを含む、請求
項５５記載の方法。
【請求項５７】複数の電気的活性分子が複数のフェロセンを含む、請求
項５５記載の方法。
【請求項５８】ポリマーが、結合タグ／金属／キレート連結を介し、第
一の剤に連結している、請求項５２記載の方法。
【請求項５９】第一の剤が、ポリアミノ酸タグを保持し、そしてポリマ
ーが金属調整キレートを保持する、請求項５８記載の方法。
【請求項６０】デンドリマーが、結合タグ／金属／キレート連結を介し
、第一の剤に連結している、請求項５３記載の方法。
【請求項６１】第一の剤がポリアミノ酸タグを保持し、そしてデンドリ
マーが金属調整キレートを保持する、請求項６０記載の方法。
【請求項６２】シグナル実体の少なくとも１つが、色素、ピグメント、
電気的活性分子、蛍光部分、上方制御燐光、または西洋ワサビペルオキシダーゼ
およびアルカリホスファターゼを含む酵素連結シグナル部分を含む、請求項１１
４記載の方法。
【請求項６３】非コロイド構造が、表面に受容体を曝露する細胞であり
、さらに、粒子に対する連結に適応している、受容体に対するリガンドを提供し
、そしてリガンドおよび受容体の間の相互作用を破壊する候補薬剤の存在下で、
リガンドおよび粒子を細胞に曝露し；そして細胞に対する粒子の固定を測定することを含む、請求項１記載の方法。
【請求項６４】測定する工程が、候補薬剤が受容体／標的タンパク質相
互作用を破壊する有効性を示す、細胞に対する粒子の固定の阻害を測定すること
を含む、請求項６３記載の方法。
【請求項６５】別個の位置にある、少なくとも第一および第二の細胞を
提供し、第一の細胞の細胞受容体に対するリガンドおよびコロイド粒子、ここで
該リガンドは粒子に対する連結に適応している、並びにリガンドおよび受容体の
間の相互作用を破壊する第一の候補薬剤に、第一の細胞を曝露し、そして第二の
細胞に、リガンドおよびコロイド並びにリガンドおよび受容体の間の相互作用を
破壊する第二の候補薬剤を添加し、そして第一の細胞対第二の細胞に対する粒子
の連結を区別することを含む、請求項６３記載の方法。
【請求項６６】非コロイド構造が表面に受容体を曝露する細胞である、
請求項１記載の方法であって、さらに：別個の位置にある、少なくとも２つの細胞を提供し；細胞受容体に対する異なる標的タンパク質および各標的タンパク質に対する連結
に適応しているコロイド粒子に各細胞を曝露し；そして細胞受容体への異なる標的タンパク質の結合を示す、細胞に対する粒子の固定を
測定することを含む、前記方法。
【請求項６７】表面上に固定化グルタチオンおよび固定化シグナル実体
を保持する、コロイド粒子を含む、物品。
【請求項６８】表面上に、グルタチオンを含む自己集合単層を保持する
、コロイド粒子を含む、物品。
【請求項６９】非コロイド構造が磁気ビーズであり、そしてコロイド粒
子が補助的シグナル実体を含む、請求項９記載の方法。
【請求項７０】シグナル実体がメタロセンである、請求項６９記載の方
法。
【請求項７１】シグナル実体がフェロセンである、請求項６９記載の方
法。
【請求項７２】剤および結合パートナーの存在下で、さらに、剤または
結合パートナーを切断する能力を有する酵素の存在下で、ビーズに粒子を曝露す
ることを含む、請求項６９記載の方法。
【請求項７３】剤、結合パートナー、および酵素の存在下で、さらに、
酵素活性を穏やかにする候補薬剤の存在下で、ビーズに粒子を曝露することを含
む、請求項７２記載の方法。
【請求項７４】結合パートナーが、酵素により切断されることが可能な
タンパク質またはペプチドを含む、請求項７３記載の方法。
【請求項７５】タンパク質が、コロイドに対する、そしてビーズに対す
る連結に適応している、請求項７４記載の方法。
【請求項７６】タンパク質が金属結合タグおよびビオチンを含み、コロ
イドまたはビーズの１つが金属調整キレートを含み、そしてコロイドまたはビー
ズのもう一方がストレプトアビジンを含む、請求項７５記載の方法。
【請求項７７】タンパク質が金属結合タグおよびビオチンを含み、コロ
イドが金属調整キレートを含み、そしてビーズがストレプトアビジンを含む、請
求項７５記載の方法。
【請求項７８】シグナル実体がメタロセンであり、そして結合パートナ
ーが酵素により切断されることが可能なタンパク質を含む、請求項６９記載の方
法であって、剤、結合パートナー、および酵素の存在下で、さらに酵素活性を穏
やかにする候補薬剤の存在下で、ビーズに粒子を曝露し、ビーズを磁気的に電極
の近くに引き寄せ、そして電極を活性化させることにより、電極に対するメタロ
センの近接度を測定し、それにより、酵素の切断活性を阻害する薬剤候補の有効
性を測定することを含む、前記方法。
【請求項７９】コロイド粒子および非コロイド構造を、コロイド粒子に
対する、そして非コロイド構造に対する連結両方に適応している実体に、該実体
を切断する能力を有する酵素および酵素活性を穏やかにする候補薬剤両方の存在
下で曝露することを含む、請求項１記載の方法。
【請求項８０】非コロイド構造が磁気ビーズであり、そしてコロイド粒
子が固定化電気的活性種を含む、請求項７９記載の方法であって、ビーズを磁気
的に電極の近くに引き寄せ、そして電極を活性化させることにより、電極に対す
る該電気的活性種の近接度を測定し、それにより、酵素の切断活性を阻害する薬
剤候補の有効性を測定することを含む、前記方法。
【請求項８１】非コロイド構造が電極表面であり、そしてコロイド粒子
が固定化電気的活性種を含む、請求項７９記載の方法であって、コロイド粒子、
コロイド粒子に対する、そして電極に対する連結両方に適応している実体、酵素
、および候補薬剤に電極を曝露し、そして電極を活性化させることにより、電極
に対する該電気的活性種の近接度を測定し、それにより、酵素の切断活性を阻害
する薬剤候補の有効性を測定することを含む、前記方法。
【請求項８２】非コロイド構造が磁気ビーズである、請求項８９記載の
方法。
【請求項８３】コロイド粒子が補助的シグナル実体を含む、請求項８２
記載の方法。
【請求項８４】シグナル実体がメタロセンである、請求項８２記載の方
法。
【請求項８５】シグナル実体がフェロセンである、請求項８４記載の方
法。
【請求項８６】基質および結合パートナーの存在下で、さらに、酵素活
性を穏やかにする候補薬剤の存在下で、ビーズに粒子を曝露することを含む、請
求項８２記載の方法。
【請求項８７】結合パートナーが、金属結合タグ／金属／キレート連結
を介し、粒子に対する連結に適応しており、そして基質が、ビオチン／ストレプ
トアビジン連結を介し、ビーズに対する連結に適応している、請求項８６記載の
方法。
【請求項８８】シグナル実体がメタロセンであり、さらに、ビーズを磁
気的に電極の近くに引き寄せ、そして電極を活性化させることにより、電極に対
するメタロセンの近接度を測定し、それにより、酵素活性を穏やかにする薬剤候
補の有効性を測定することを含む、請求項８６記載の方法。
【請求項８９】コロイド粒子および非コロイド構造を、非コロイド構造
に対する連結に適応している酵素基質、粒子に対する連結に適応している、酵素
活性を介し、基質に連結可能な分子種、および基質に対する酵素に曝露すること
を含む、請求項１記載の方法。
【請求項９０】さらに、コロイド粒子および非コロイド構造を、酵素活
性を穏やかにする候補薬剤に曝露することを含む、請求項８９記載の方法。
【請求項９１】非コロイド構造が磁気ビーズであり、そしてコロイド粒
子が固定化電気的活性実体を保持する、請求項８９記載の方法であって、ビーズ
を磁気的に電極の近くに引き寄せ、そして電極を活性化させることにより、電極
に対する電気的活性実体の近接度を測定し、それにより、酵素活性を穏やかにす
る薬剤候補の有効性を測定することを含む、前記方法。
【請求項９２】非コロイド構造が電極表面であり、そしてコロイド粒子
が固定化電気的活性実体を保持する、請求項８９記載の方法であって、電極表面
を、コロイド粒子、基質、酵素、および候補薬剤に曝露し、そして電極を活性化
させることにより、電極に対する電気的活性実体の近接度を測定し、それにより
、酵素活性を穏やかにする薬剤候補の有効性を測定することを含む、請求項８９
記載の方法。
【請求項９３】ＳＰＲの非存在下で、タンパク質またはリガンドのいず
れも標識することなく、タンパク質／リガンド相互作用を測定することを含む方法。
【請求項９４】リガンドを、リガンドと相互作用すると推定されるタン
パク質に曝露する、ここで該リガンドはタンパク質に対する近接度に応じた電気
的活性シグナルを有する電気的活性実体と固定された近接関係にある、ことを含
む、請求項９３記載の方法。
【請求項９５】電気的活性実体が、該電気的活性実体およびタンパク質
の間の近接度の改変に応じて改変可能な電気的活性シグナルを有する、請求項９
３記載の方法。
【請求項９６】リガンドおよび電気的活性実体両方が固定されている表
面に、タンパク質を曝露することを含む、請求項９３記載の方法。
【請求項９７】表面が電極表面である、請求項９６記載の方法。
【請求項９８】リガンドおよび電気的活性実体が、各々、表面で自己集
合単層の一部を形成する、請求項９６記載の方法。
【請求項９９】自己集合単層が、該自己集合単層の電子に対する透過性
を亢進する種を含む、請求項９８記載の方法。
【請求項１００】電子に対する透過性を亢進する種が、伝導性自己集合
単層形成種を含む、請求項９９記載の方法。
【請求項１０１】電子に対する透過性を亢進する種が、自己集合単層中
に不全部位を引き起こす種を含む、請求項９９記載の方法。
【請求項１０２】電気的活性実体がメタロセンを含む、請求項９３記載
の方法。
【請求項１０３】電気的活性実体がフェロセンを含む、請求項９３記載
の方法。
【請求項１０４】電気的活性実体がフェロセンジカルボン酸を含む、請
求項９３記載の方法。
【請求項１０５】リガンドが、金属結合タグ／金属／キレート連結を介
し、自己集合単層形成種に連結している、請求項９８記載の方法。
【請求項１０６】表面、並びに、各々、表面に固定されている、タンパ
ク質と相互作用すると推定されるリガンドおよび電気的活性実体を明示する物品
。
【請求項１０７】さらに、表面に固定されている電子に対する表面の透
過性を亢進させる種を含む、請求項１０６記載の物品。
【請求項１０８】生物学的または化学的剤に対する連結に適応している
、複数のシグナル実体を保持するポリマーまたはデンドリマーを含む種。
【請求項１０９】ポリマーまたはデンドリマーが、金属結合タグ／金属
／キレート連結を介し、化学的または生物学的剤に対する連結に適応している、
請求項１０８記載の種。
【請求項１１０】ポリマーまたはデンドリマーが、金属を調整すること
が可能なキレートを保持する、請求項１０８記載の種。
【請求項１１１】ポリマーまたはデンドリマーが、複数の電気的活性種
を保持する、請求項１０８記載の種。
【請求項１１２】ポリマーまたはデンドリマーが、複数のメタロセンを
保持する、請求項１０８記載の種。
【請求項１１３】ポリマーまたはデンドリマーが、複数のフェロセンを
保持する、請求項１８０記載の種。
【請求項１１４】複数のシグナル実体を用い、第一の生物学的または化
学的剤の、第二の生物学的または化学的剤への単一の結合をシグナル形成することを含む方法。
【請求項１１５】複数のシグナル実体を用い、単一の結合を同時にシグ
ナル形成することを含む、請求項１１４記載の方法。
【請求項１１６】複数のシグナル実体を保持する第一の剤を提供し、第
一の剤が第二の剤に結合することを可能にし、そしてシグナル実体を介し、結合
を測定することを含む、請求項１１４記載の方法。
【請求項１１７】第一の剤が、シグナル実体が固定されている粒子に連
結される、請求項１１６記載の方法。
【請求項１１８】第一の剤が、ポリマーを介し、シグナル実体に連結さ
れる、請求項１１６記載の方法。
【請求項１１９】第一の剤が、デンドリマーを介し、シグナル実体に連
結される、請求項１１６記載の方法。
【請求項１２０】複数のシグナル実体に連結されている、第二の剤に生
物学的または化学的に結合することが可能な、第一の生物学的または化学的剤を含む物品。
【請求項１２１】第一の剤が、シグナル実体が固定されている粒子に連
結される、請求項１２０記載の物品。
【請求項１２２】第一の剤が、ポリマーを介し、シグナル実体に連結さ
れる、請求項１２０記載の方法。
【請求項１２３】第一の剤が、デンドリマーを介し、シグナル実体に連
結される、請求項１２０記載の方法。
【請求項１２４】コロイド粒子該コロイド粒子に固定されているシグナル実体；および該コロイド粒子に固定されているタンパク質を含む組成物。
【請求項１２５】表面を明示する物品、および該物品の表面上に形成さ
れる自己集合単層であって、該表面が曝露されている流体が該表面と電気的に伝
達しあうことを妨げる、緊密充填方式で、他の第一の種と表面で自己集合するこ
とを促進する分子構造を有する第一の分子種、および緊密充填自己集合構造の破
壊を引き起こし、それにより緊密充填構造中に不全を明示し、該表面が曝露され
ている流体が該表面と電気的に伝達しあうのを可能にする方式で、第一の種と異
なる分子構造を有する第二の分子種の混合物を含む、前記単層。
【請求項１２６】第一の種が、本質的に直線であり、そして第二の種が
、少なくとも１つ、非直線部分を含む、請求項１２５記載の物品。
【請求項１２７】第一の分子および固体支持体に結合している１つまた
はそれ以上のシグナル要素を含み、前記の第一の分子が、細胞表面受容体と相互
作用することが可能なリガンドである、組成物。
【請求項１２８】前記固体支持体がコロイドである、請求項１２７の組
成物。
【請求項１２９】前記コロイドが金コロイドである、請求項１２８の組
成物。
【請求項１３０】前記リガンドが、前記コロイドに直接共有結合してい
る、請求項１２８の組成物。
【請求項１３１】前記シグナル要素が電気的活性分子である、請求項１
２８の組成物。
【請求項１３２】前記電気的活性分子がフェロセンを含む、請求項１３
１の組成物。
【請求項１３３】前記リガンドがペプチドである、請求項１２７の組成
物。
【請求項１３４】前記ペプチドが金属キレートに結合することが可能な
部分で誘導体化されている、請求項１３３の組成物。
【請求項１３５】前記部分がヒスチジンタグを含む、請求項１３４の組
成物。
【請求項１３６】前記ヒスチジンタグが前記ペプチドのＮ−末端にある
、請求項１３５の組成物。
【請求項１３７】前記固体支持体が金属キレートを含み、そして前記ペ
プチドが、前記金属キレートへの前記部分の結合を介し、前記固体支持体に結合
している、請求項１３４の組成物。
【請求項１３８】固体支持体が第二の分子の単層を含む、請求項１２７
の組成物。
【請求項１３９】前記単層が自己集合単層である、請求項１３８の組成
物。
【請求項１４０】前記の第二の分子がチオールである、請求項１３８の
組成物。
【請求項１４１】固体支持体に結合している、第一の分子、第二の分子
および第三の分子を含む、ここで前記の第一の分子は、細胞表面受容体と相互作
用することが可能なリガンドを含み、前記の第二の分子は、前記固体支持体上に
単層を形成し、そして前記の第三の分子は電気的に活性である、組成物。
【請求項１４２】前記固体支持体がコロイドである、請求項１４１の組
成物。
【請求項１４３】前記コロイドが金コロイドである、請求項１４２の組
成物。
【請求項１４４】前記リガンドが、前記コロイドに直接共有結合してい
る、請求項１４２の組成物。
【請求項１４５】前記電気的活性分子がフェロセンを含む、請求項１４
４の組成物。
【請求項１４６】前記リガンドがペプチドである、請求項１４４の組成
物。
【請求項１４７】前記ペプチドが金属キレートに結合することが可能な
部分で誘導体化されている、請求項１４６の組成物。
【請求項１４８】前記部分がヒスチジンタグを含む、請求項１４７の組
成物。
【請求項１４９】前記ヒスチジンタグが前記ペプチドのＮ−末端にある
、請求項１４８の組成物。
【請求項１５０】前記固体支持体が金属キレートを含み、そして前記ペ
プチドが、前記金属キレートに対する前記部分の結合を介し、前記固体支持体に
結合している、請求項１４７の組成物。
【請求項１５１】前記の第二の分子がである、請求項１４１の組成物。
【請求項１５２】前記固体支持体がリポソームである、請求項１２７の
組成物。
【請求項１５３】前記リポソームが、反応基を含む、少なくとも１つの
脂質を含む、請求項１３８の組成物。
【請求項１５４】少なくとも１つの分子種の単層を含む金属支持体であ
って、前記単層が金属支持体を電極として使用することが可能であるように配置
されている、前記支持体上に増殖している細胞を含む、組成物。
【請求項１５５】ａ）ｉ）細胞表面分子と相互作用することが可能なリ
ガンドを含むコロイドを含む溶液およびｉｉ）前記リガンドと相互作用すること
が可能な細胞表面分子を少なくとも１つ含む、増殖細胞を含む電極を含む組成物
を提供し、ｂ）前記組成物に前記コロイドの少なくとも部分を添加することを含む方法。
【請求項１５６】さらに：ｃ）前記細胞表面分子と前記リガンドの相互作用の測定値として、前記コロイド
の凝集を検出することを含む、請求項１５５の方法。
【請求項１５７】前記コロイドが金コロイドである、請求項１５５の方
法。
【請求項１５８】前記金コロイドを、工程（ａ）の前に、チオール基を
取り込むように処理する、請求項１５７の方法。
【請求項１５９】工程（ａ）の前に、結合パートナーを有する部分で前
記リガンドを誘導体化する、請求項１５５の方法。
【請求項１６０】工程（ａ）の前に、金属キレートに結合することが可
能な部分で前記リガンドを誘導体化する、請求項１５９の方法。
【請求項１６１】前記部分がヒスチジンタグを含む、請求項１６０の方
法。
【請求項１６２】ａ）ｉ）細胞表面分子と相互作用することが可能なリ
ガンドを含むコロイドを含む溶液、ｉｉ）候補薬剤、およびｉｉ）前記リガンド
と相互作用することが可能な細胞表面分子を少なくとも１つ含む、増殖細胞を含
む電極を含む組成物を提供し、ｂ）前記薬剤および前記組成物と、前記コロイドの少なくとも部分を混合することを含む方法。
【請求項１６３】磁気素材を用い、電極に対し、電子的シグナル物体を
突出させることを含む方法。