JPH07301635A - Hcv関連抗体測定法 - Google Patents
Hcv関連抗体測定法Info
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- JPH07301635A JPH07301635A JP11755094A JP11755094A JPH07301635A JP H07301635 A JPH07301635 A JP H07301635A JP 11755094 A JP11755094 A JP 11755094A JP 11755094 A JP11755094 A JP 11755094A JP H07301635 A JPH07301635 A JP H07301635A
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Abstract
抗原を用い、その検出感度、さらにはその特異性におい
て優れ、そのうえ非特異的な反応がない、より感度、特
異性に優れたHCV関連抗体測定法の開発をなす。特
に、融合タンパク質としてリコビナント抗原を製造し、
それを用いた測定系で非特異的反応抑制し、偽陽性を生
ずるという問題のない方法及び試薬の開発を行う。 【構成】 遺伝子組換え法で産生された抗原、特に融合
タンパク質として製造されたリコビナント抗原を用い
た、試料中のHCV抗原と免疫学的に反応性の抗体の測
定法において、偽陽性を抑制するため、CKS又はそれ
と実質的に同等の作用を有するものを用いることを特徴
とするHCV関連抗体の測定法及びそれに用いる試薬が
提供される。CKSに加えてSOD又はそれと実質的に
同等の作用を有するものを用いることで、より優れた効
果が得られる。
Description
遺伝子組換え法で産生された抗原を用いたところの試料
中のHCV抗原と免疫学的に反応性の抗体(以下、「H
CV関連抗体」ともいう)の測定法において用いられる
試薬で、偽陽性を抑制するため、CKS又はそれと同等
の作用を有するものを含有していることを特徴とするH
CV関連抗体の測定用試薬及びそれを用いた測定法に関
する。
の臨床における検査や病気の診断に広く利用される他、
動物においてもその臨床検査や病気の診断、さらにはそ
の他の広い範囲の測定対象物の分析、測定、定量、検出
などの分野において応用されている。この免疫学的測定
法は、抗原とその抗原に対する抗体との間の抗原抗体反
応を利用するものであるが、通常この抗原抗体反応の生
起していることの検出は可視的に判別したり、あるいは
検知することは困難であるので、その検知、検出を容易
にするため様々な手法が開発されてきている。こうして
免疫学的測定法として、例えば、ラジオイムノアッセ
イ、酵素免疫測定法、螢光免疫測定法、凝集反応免疫測
定法などが開発されてきて、現在広く利用されている。
るいは抗原は、必要に応じて、例えば、寒天、アガロー
ス、セルロース、紙、ニトロセルロース、デキストラ
ン、ゼラチン、キチン、コラーゲン、綿などの生体由来
高分子あるいは天然物由来高分子、ポリスチレン、ポリ
エチレン、ポリビニルアルコール、ポリアクリルアミド
などのアクリル樹脂、イオン交換樹脂、光架橋樹脂、テ
フロン、ポリアセタールなどの合成高分子、ガラスビー
ズ、シリカゲル、アルミナ、セラミック、カーボン、硫
酸マグネシウムなどの無機質材料などからなる、微粒
子、ビーズ、マイクロプレート、マイクロタイターウェ
ル、マイクロチューブ、ストリップ、メンブレン、ゲル
など、さらには赤血球、ラテックス粒子、乳剤などの固
定担体に固定しておき、この固定担体を、分析対象とし
ての抗体、抗原等を含有する試料と接触させ、こうして
固定担体に固定された抗原または抗体と、分析試料中の
抗体、抗原等とを特異的に結合反応せしめ、この特異的
に結合した分析対象物を検知することがなされる。
発光又は螢光免疫測定法などでは、125I、 3Hなどの
放射性物質、西洋わさびペルオキシダーゼ、β−D−ガ
ラクトシダーゼ、アルカリフォスファターゼなどの酵
素、フルオレッセインなどの螢光色素、金コロイド、セ
レンコロイドなどの発光又は発色物質などで標識された
抗原あるいは抗体が試薬として用いられ、分析試料中の
抗体、抗原等と特異的に結合反応させて、その放射活
性、酵素活性あるいは螢光を測定して、試料中の抗体、
抗原等が存在していたか否かを判別している。
定法は、一般には赤血球や細菌などの粒子状抗原と、そ
れに対する抗体とが特異的に結合反応して観察できるよ
うな凝集塊をつくる反応を利用するもので、この反応を
凝集反応といっている。例えば、試料中の抗体を検知す
るためには、上記したような粒子状抗原を試料と混合し
て反応させたとき、例えば、水性媒質の中で抗原抗体反
応により生じた凝集反応が観察されるか否かにより、試
料中に測定対象の抗体が存在しているか否かが判別され
る。この凝集反応を用いた測定法にあっては、一定量の
抗原に対し、一定の希釈列にあるところの既知濃度ある
いは量の抗体を加え、反応の結果得られる溶液の凝集反
応の程度を希釈倍数の逆数で表して評価されることもな
される。逆に一定量の抗体に対し、一定の希釈列にある
ところの既知濃度あるいは量の抗原を加え、反応の結果
得られる溶液の凝集反応の程度を希釈倍数の逆数で表し
て評価されることもなされるし、更に抗体に対する抗
体、すなわち二次抗体を用いて間接的な凝集反応を観察
することもなされる。
粒子そのものでなく、可溶性抗原を粒子状担体、例え
ば、赤血球、ポリスチレン粒子などのラテックス粒子な
どに結合させたいわゆる感作粒子抗原を用いることがな
される。このような感作粒子抗原を用いる凝集反応を用
いた測定法は、受身凝集反応免疫測定法とよばれる。
課題となっているものに、C型肝炎ウイルスと名付けら
れた非A非B型肝炎ウイルス感染の試験法と診断が挙げ
られる。1970年代初めにはB型肝炎ウイルス(HB
V)の試験法の開発が成されたが、そのような試験法に
よってもなお、感染性の肝炎の発生が抑止できないこと
から、そのB型肝炎ウイルス以外の肝炎ウイルスの存在
が検討された。このような肝炎は、輸血により伝播する
ことからその後広範な研究が成され、問題となる血液を
判別することが、大きな課題となった。
(HAV)、HBV、サイトメガロウイルス、エプスタ
イン−バール ウイルスに対する抗体が検出されないに
もかかわらず、他の潜在的な肝炎を誘発するような病歴
もない患者がみつかることから、このような患者を、非
A非B型肝炎という総称で呼んだ。そしてHBVに対し
ては優れた試験法の開発が成功していることから、現在
では輸血後肝炎の大部分が非A非B型肝炎であるという
状況になっており、この意味でも非A非B型肝炎の有効
な試験法の開発が求められた。このような中にあって、
慢性非A非B型肝炎感染チンパンジーの血液から遺伝子
組換え法によりクローニングされた非A非B型肝炎の因
子はC型肝炎ウイルス(HCV)と名付けられた。
るための試験方法の開発が進められ、現在供血者のスク
リーニングやC型肝炎の診断の補助となる試験法が提供
されるに至っている。しかしながら、これまでの方法
は、依然として急性期の診断においてとか、その検出感
度、さらにはその特異性が必ずしも充分なものでなく、
そのうえ非特異的な反応が観察されるなどの問題を有し
ており、より感度、特異性に優れた測定法の開発が求め
られている。より早い時期でのHCV関連抗体の検出
は、有効な治療を進める上でも、医療の現場での安全性
を確保する上でも重要であり、また非A非B型肝疾患に
おける検出率を高めたり、供血者のスクリーニングを確
実に行ないうるようにすることが強く求められている。
を検出するための試験方法において用いられる抗原を、
遺伝子組換え法によりより効率よく製造するための方法
が開発されてきた。そして最近では、さらに遺伝子組換
え法により産生された複数のリコビナント抗原が用いら
れてくるようになると共に、その遺伝子組換え法でのリ
コビナント抗原の製造に、特定の制御領域、例えば、l
acオペロンのようなプロモーターを使用して製造する
試みがなされているが、多くは特に宿主細胞と導入遺伝
子とがその種において異なるような外来性の遺伝子を導
入していることから必ずしもその製造は容易ではない。
このような問題を解決するため、融合タンパク質として
リコビナント抗原を製造することが一般的に行なわれる
ようになってきた。
合部位と試料中の分析対象物とが非特異的に結合し、こ
れが測定誤差の原因となるため、種々の対策が試みられ
てきた。このようなものの一つに、遊離結合部位をブロ
ックするようなブロッキング剤を使うことが提案されて
いる。また、上記のように遺伝子組換え法で得られたリ
コビナント抗原を用いてHCVに対する抗体などを検出
する免疫学的測定法を行なう場合、非特異的反応を示す
ことが見出され、偽陽性を生ずるという問題が指摘され
ている。その対策の一つとして、例えば、HBc抗原を
用いた測定系では、遺伝子組換え操作の施されていない
細菌の口径0.8ミクロンのフィルターを通過せしめて
得られた細菌成分抽出物を使用することも提案されてい
る(特公平3─59382号公報)。
リコビナント抗原を用いてHCVに対する抗体、すなわ
ちHCV関連抗体を検出する免疫学的測定法において
は、依然として非特異的反応を防ぐことが出来ないとい
う問題がある。上記したように正確にHCV関連抗体を
検出したり、非A非B型肝疾患における検出率を高めた
り、供血者のスクリーニングを確実に行なうためには、
この非特異的反応に起因する偽陽性を無くすことが緊急
的かつ強く求められている。
原と免疫学的に反応性の抗体(HCV関連抗体)を遺伝
子組換え法で得られたリコビナント抗原を用いて正確に
測定する方法を見いだすべく、鋭意研究を行った結果、
簡単な方法により、再現性のあるかつより感度が高く、
そして非特異的反応を抑えて、その非特異的反応に起因
する偽陽性を無くすことのできる方法及び試薬の開発に
成功し、本発明を完成した。
た抗原を用いた試料中のHCV関連抗体の測定法におい
て、CKS(CTP:CMP−3−デオキシ−マンノオ
クチュロソネート・シチジル・トランスフェラーゼ又は
CMP−KDOシンセターゼ)又はそれと実質的に同等
の作用を有するものを用いることにより、急性期の診断
において優れ、その検出感度が高く、さらにはそのC型
肝炎、特にHCV関連抗体に対して特異性が高く、その
うえ非特異的な反応が観察されることのない結果の得ら
れることを見出した。
ク質に加え、SOD(スーパーオキサイド・ディスムタ
ーゼ)又はそれと実質的に同等の作用を有するものを用
いることにより、さらに急性期の診断において優れ、そ
の検出感度が高く、さらにはそのC型肝炎、特にHCV
関連抗体に対して特異性が高く、そのうえより有効に非
特異的な反応を抑制できることを見出した。こうした遺
伝子組換え法で抗原を産生するにあたっては、抗原は融
合タンパク質として効率よく得られるものであり、通常
産生された融合タンパク質は開裂などにより遊離タンパ
ク質の形態にされているが、融合部分はその全部または
一部が抗原に結合したままであることもできる。
で産生された抗原を用いたところの試料中のHCV関連
抗体の測定試薬において、偽陽性を抑制するため、CK
S又はそれと実質的に同等の作用を有するものが配合さ
れていることを特徴とするHCV関連抗体の測定試薬及
びそれを用いた試料中のHCV関連抗体の測定法が提供
される。また本発明によれば、遺伝子組換え法で産生さ
れた抗原を用いたところの試料中のHCV関連抗体の測
定試薬において、偽陽性を抑制するため、CKS又はそ
れと実質的に同等の作用を有するもの、及びSOD又は
それと実質的に同等の作用を有するものが、配合されて
いることを特徴とするHCV関連抗体の測定試薬及びそ
れを用いた試料中のHCV関連抗体の測定法が提供され
る。
HCV c100−3リコビナント抗原,pHCV−3
1リコビナント抗原(HCVの非構造タンパク質部分の
抗原:266個のアミノ酸部分を含有)及びpHCV−
34リコビナント抗原(HCVの構造タンパク質部分の
コア領域の抗原:150個のアミノ酸部分を含有)を用
いた試料中のHCV関連抗体の免疫測定法において、偽
陽性を抑制するため、CKS又はそれと実質的に同等の
作用を有するものを配合してあることを特徴とするHC
V関連抗体の測定試薬及びそれを用いた試料中のHCV
関連抗体の測定法が提供される。
S融合タンパク質として得られたHCVリコビナント抗
原を用いた試料中のHCV関連抗体の免疫測定法におい
て、偽陽性を抑制するため、CKS又はそれと実質的に
同等の作用を有するものを配合してあることを特徴とす
るHCV関連抗体の測定試薬及びそれを用いた試料中の
HCV関連抗体の測定法が提供される。より好ましい態
様においては、本発明は、HCV c100−3リコビ
ナント抗原,pHCV−31リコビナント抗原及びpH
CV−34リコビナント抗原を用いた試料中のHCV関
連抗体の受身凝集反応免疫測定法において、偽陽性を抑
制するため、CKS又はそれと実質的に同等の作用を有
するものが配合されていることを特徴とするHCV関連
抗体の測定試薬及びそれを用いた試料中のHCV関連抗
体の測定法が提供される。
CKS融合タンパク質として得られたHCVリコビナン
ト抗原を用いた試料中のHCV関連抗体の受身凝集反応
免疫測定法において、偽陽性を抑制するため、CKS又
はそれと実質的に同等の作用を有するものが配合されて
いることを特徴とするHCV関連抗体の測定試薬及びそ
れを用いた試料中のHCV関連抗体の測定法が提供され
る。
的に同等の作用を有するものは、CKSの全アミノ酸配
列からなるもの、CKSのアミノ酸配列の一部からなる
ものであって遺伝子組換え法で産生されたものであるこ
とができ、遺伝子組換え法で融合タンパク質の産生に用
いられるプラスミドにより産生されるCKS相当タンパ
ク質と実質的に同等の作用を有するものが挙げられる。
本発明で用いられるCKSと実質的に同等の作用を有す
るものは、例えばCKSの全248個のアミノ酸配列の
うち最初の239個のアミノ酸配列をもつものあるいは
そのタンパク質を菌体から分離精製処理する際生ずる断
片タンパク質、遺伝子組換え法で融合タンパク質の産生
に用いられるCKS遺伝子によりコードされたCKS由
来ペプチド断片などが挙げられる。
的に同等の作用を有するものは、例えば次のようにして
得られる。大腸菌lacプロモーター部位を修飾した配
列とCKSをコードしているkdsB遺伝子とを含有す
るプラスミドpTB201を構築する。先ず、プラスミ
ドpWM111 からプラスミドpWM145 を構築する。
Gene 43: 131, 1986) により開示されたようにプラスミ
ドpWM111 を大腸菌JM83(ara,(lac−,
proAB),rpsl,o8O,laczM15)か
ら標準アルカリ抽出法、次にセシウムクロライド濃度勾
配法による精製そして約70%のエタノールによる沈殿
処理後、遠心処理して単離する。単離されたプラスミド
pWM111 を次に制限酵素EcoRI及びBamHIで
開裂せしめ、単離して得たEcoRI−BamHIベク
ター断片と、単離して得たEcoRI−BamHIプロ
モーター断片に代えて図1の配列のオリゴヌクレオチド
とをT4リガーゼによりライゲーション処理し、ついで
大腸菌JM103(supE,thi,(lac−,p
roAB),enda,rpsl,sbcB15,[F',
traD36,proAB,laciqZM15)のコ
ンペテント細胞を形質転換せしめ、形質転換大腸菌から
プラスミドpWM145 が得られる。
G1を単離し、それから大腸菌酵素CKS(CTP:C
MP−3−デオキシ−マンノオクチュロソネート・シチ
ジル・トランスフェラーゼ又はCMP−KDOシンセタ
ーゼ)をコードしているkdsB遺伝子を分離し、プラ
スミドpTB201を構築する。例えば、プラスミドp
RG1をHpaIIで消化処理し、次にバクテリアル・
アルカリフォスファターゼ(BRL)でもって脱燐酸化
処理し、約1.7kbのkdsB遺伝子断片を得る。次
に図2の合成オリゴヌクレオチドをBRL T4キナー
ゼを用い標識し、HpaIIkdsB遺伝子断片とライ
ゲーション処理し、BRL T4キナーゼを用い燐酸化
処理する。ついでHindIII及びBamHIでもっ
て同時に消化処理し、約1kbの断片を得る。
スミドpWM145 をHindIII及びBamHIでも
って同時に消化処理し、つぎに脱燐酸化処理して得られ
た断片と、ライゲーション処理する。大腸菌JM103
のコンペテント細胞を形質転換せしめ、形質転換大腸菌
からプラスミドpTB201を得る。次にこのプラスミ
ドpTB201で形質転換された大腸菌は、例えばアン
ピシリンを含有するLB培地中で培養され、IPTG
(イソプロピル−β−D −チオガラクトシド)で誘導処
理され、得られた菌体から産生CKSが、精製処理して
得られる。
I及びHindIIIでもって消化処理され、約3.6
kbのベクター断片を与える。この約3.6kbのベク
ター断片を図3の二つの合成オリゴヌクレオチドから成
るリンカーとライゲーション処理する。大腸菌JM10
9(recA1,endA96,thi,hsdR1
7,supE44,relA1,−,(lac−,pr
oAB),[F',traD36,proAB,laciq
ZM15)のコンペテント細胞を形質転換せしめ、形質
転換大腸菌からプラスミドpTB210を得る。このプ
ラスミドpTB210で形質転換された大腸菌は、例え
ばアンピシリンを含有するLB培地中で培養され、IP
TG(イソプロピル−チオ−β−ガラクトシド)で誘導
処理され、得られた菌体から産生CKSが、精製処理し
て得られる。
L−1 Blue(ストラタジーン社:Stratagene)の
コンペテント細胞中に導入され形質転換せしめられ、形
質転換された細胞を培養して大量に得ることができる。
同様にプラスミドpTB201及びプラスミドpTB2
10から外来遺伝子の発現に適するように、制限酵素、
合成オリゴヌクレオチドリンカー、リガーゼなどを用い
て誘導されたCKS融合タンパク質発現系プラスミドを
作製することが可能であり、そのプラスミドを用いて遺
伝子組換え法によりCKS又はそれと実質的に同等の作
用を有するものが得られる。
パク質は、大腸菌などの細胞をホモジュナイザー、ワー
リングブレンダー、フレンチプレス、超音波破砕機など
の機械的方法、リゾチームなどの酵素による方法、凍結
融解や浸透圧による物理的方法あるいはドデシル硫酸ナ
トリウム(SDS)、トウィーン(Tween:商品
名)、トライトンX(Triton X:商品名)など
の界面活性剤、アセトン、ブタノールなどの有機溶媒、
EDTAなどのキレート化剤などを用いる化学的方法な
どにより破砕して得られる。細胞を破砕する際、懸濁液
中にプロテアーゼ阻害剤などを添加しておくこともでき
る。
0〜60kHzの音波(超音波)を出すことのできる超
音波振動子に適用することにより細胞を破壊することの
できる装置にかけて行うことができ、そのような装置と
しては棒状の超音波振動子を試料に浸す型のものや、超
音波振動子を取り付けたカップ状の容器に試料をいれ処
理する型のものや、連続処理が可能なように循環式にさ
れた型のもの、さらにはビーズなどと共に試料を処理で
きるようにしたもの等が挙げられる。こういった超音波
破砕装置は、大岳製作所(株)、セントラル科学貿易
(株)、セイコー電子工業(株)などから市販されてい
る。超音波処理は、細胞を破砕するに十分な時間処理す
ることにより行われ、使用試料の量や使用出力に応じて
適宜適当に選ぶことができ、通常約1分間から約2時間
の範囲で選ぶことができる。
ンモニウムなどのタンパク質沈殿剤などを用いての塩
析、エタノールなどの有機溶媒による沈殿法、界面活性
剤などを用いての抽出、透析、密度勾配遠心などの遠心
分離法、限外濾過法、イオン交換樹脂、イオン交換セル
ロース、イオン交換セファデックス、アルミナ、ハイド
ロキシアパタイトなどによる吸着、カラムクロマトグラ
フィー、電気泳動法、デキストランゲル、ポリアクリル
アミドゲル、ポリエチレングリコールジメタクリル酸ゲ
ル、アガロースゲル、多孔質シリカガラス、分子ふるい
法、モノクローナル抗体などを利用したアフィニティク
ロマトグラフィーにより分離、精製することができる。
これらの分離、精製処理は、測定時の非特異的反応を抑
制して、偽陽性を排除しうるように選ぶことができ、任
意に適した方法を選んで組み合わせて行うことができ
る。
的に同等の作用を有するものは、宿主細胞として大腸菌
を用いて得られるものであることができ、例えば、リコ
ビナントCKSタンパク質の発現ベクターであるプラス
ミドを、大腸菌に導入し、形質転換処理され、こうして
形質転換された大腸菌を培養し、リコビナントCKSタ
ンパク質を発現させ、得られた培養液より単離精製処理
して得られたものが好ましい。また、このCKS又はそ
れと実質的に同等の作用を有するものは、リコビナント
CKSタンパク質の発現ベクターで形質転換された大腸
菌を培養し、リコビナントCKSタンパク質を発現させ
て得られた培養液よりの菌体を、プロテアーゼ阻害剤存
在下破砕し、得られたリコビナントCKSタンパク質を
含む液から、蛋白質沈殿剤によりタンパク質を沈殿させ
たものを透析したものを精製処理して得られたものであ
ることができる。
作用を有するものは、リコビナントCKSタンパク質の
発現ベクターで形質転換された大腸菌を培養し、リコビ
ナントCKSタンパク質を発現させて得られた培養液よ
りの菌体をプロテアーゼ阻害剤存在下破砕し、得られた
リコビナントCKSタンパク質を含む液から蛋白質沈殿
剤によりタンパク質を沈殿させたものを透析し、それを
イオン交換クロマトグラフィーにより、次いでゲル濾過
クロマトグラフィーにより精製処理して得られたもので
あってよい。このリコビナントCKSタンパク質の発現
ベクターは、好ましくはpTB201,pTB210、
pTB260,pTB270又はそれらから制限酵素及
び/又は合成オリゴヌクレオチドを用いて遺伝子組換え
法で修飾されて誘導されたプラスミドであることができ
る。
的に同等の作用を有するものは、具体的な例では、例え
ば、リコビナントCKSタンパク質の発現ベクターであ
るプラスミドpTB210などを、大腸菌XL−1 B
lue(ストラタジーン社:Stratagene)などの宿主細
胞に導入し、形質転換処理され、こうして形質転換され
た大腸菌pTB210/XL−1などを適切な培地中で
培養し、リコビナントCKSタンパク質を発現させる。
この得られた培養液より、発現させたリコビナントCK
Sタンパク質を含む菌体を遠心分離により集め、集めた
菌体をEDTA、トライトンX−100及びプロテアー
ゼ阻害剤などを含むトリス緩衝液などの緩衝液に懸濁
し、機械的に破砕する。この菌体破砕液より、遠心分離
及び約0.2μmのフィルターを用いた濾過により不溶
物を除き、リコビナントCKSタンパク質を含む水抽出
液を得る。
パク質を含む水抽出液から、約4.8M又はそれ以上の
濃度の硫酸アンモニアなどの蛋白質沈殿剤により、リコ
ビナントCKSタンパク質を含むタンパク質を沈殿さ
せ、この沈殿させたタンパク質を、0.5mMジチオス
レイトール(DTT)水溶液などの媒質に懸濁し、この
懸濁液を0.1Mトリス緩衝液(pH7.6)などの緩
衝液中で透析し、粗精製リコビナントCKSタンパク質
を得る。
Sタンパク質を、TSKgel DEAE−5PW(東
ソー)などを用いたイオン交換クロマトグラフィーによ
り分画精製し、次いでTSKgel G3000 SW
XL(東ソー)などを用いたゲル濾過クロマトグラフィ
ーにより分画し、精製リコビナントCKSタンパク質を
得ることができる。本発明においては、CKS又はそれ
と実質的に同等の作用を有するものは、希釈剤に添加さ
れて用いることもでき、その場合の使用量は約0.00
01mg/ml〜約1mg/ml、好ましくは約0.0
01mg/ml〜約0.5mg/ml、さらに好ましく
は約0.005mg/ml〜約0.1mg/ml、最も
好ましくは約0.01mg/ml〜約0.1mg/ml
の濃度となるようにして用いることができる。
的に同等の作用を有するものは、SODの全アミノ酸配
列からなるもの、SODのアミノ酸配列の一部からなる
ものであって遺伝子組換え法で産生されたものであるこ
とができ、遺伝子組換え法で融合タンパク質の産生に用
いられるプラスミドにより産生されるSOD相当タンパ
ク質と実質的に同等の作用を有するものが挙げられる。
本発明で用いられるSODと実質的に同等の作用を有す
るものは、例えばSODの全アミノ酸配列のうちの一部
のアミノ酸配列をもつものあるいはそのタンパク質を酵
母などの菌体から分離精製処理する際生ずる断片タンパ
ク質、遺伝子組換え法で融合タンパク質の産生に用いら
れるSOD遺伝子によりコードされたSOD由来ペプチ
ド断片などが挙げられる。
的に同等の作用を有するものは、例えば次のようにして
得られる。PNAS,80:5465−69及びNuc
leic Acid Res.,12:9349−63
に開示のDNA配列を、Gene(1988)68:1
01−107に開示の方法で修飾し、こうして得られた
SODアミノ酸配列をコードする遺伝子を酵母のソルビ
トール・デヒドロゲナーゼ遺伝子の制御遺伝子に結合
し、酵母プラスミドに組み込む。得られたSODをコー
ドする遺伝子を持つプラスミド、例えばSOD8−3を
炭素源としてソルビトールを用いて生育する酵母変異株
に導入して、形質転換体を得る。この形質転換体酵母を
培地中で培養し、得られた菌体から産生SODを、精製
処理して得られる。
載のSOD融合タンパク質発現系プラスミドを用いて酵
母を形質転換せしめ、得られた形質転換体酵母を培地中
で培養し、得られた菌体から産生SOD断片タンパク質
を、精製処理して得られる。同様にEP−A1−31
8,216号に記載のSOD融合タンパク質発現系プラ
スミドから外来遺伝子の発現に適するように、制限酵
素、合成オリゴヌクレオチドリンカー、リガーゼなどを
用いて誘導されたSOD融合タンパク質発現系プラスミ
ドを作製することが可能であり、そのプラスミドを用い
て遺伝子組換え法によりSOD又はそれと実質的に同等
の作用を有するものが得られる。
パク質を取得するには、先ず酵母などの細胞を、例えば
上記CKSに関して記載したようにして破砕する。次に
得られた粗タンパク質液を、例えば上記CKSに関して
記載したようにして塩析、沈殿法、抽出、透析、遠心分
離法、限外濾過法、カラムクロマトグラフィーなどによ
り分離、精製して目的SODが得られる。これらの分
離、精製処理は、測定時の非特異的反応を抑制して、偽
陽性を排除しうるように選ぶことができ、任意に適した
方法を選んで組み合わせて行うことができる。
的に同等の作用を有するものは、宿主細胞として酵母を
用いて得られるものであることができ、例えば、リコビ
ナントSODタンパク質の発現ベクターであるプラスミ
ドを、酵母に導入し、形質転換処理され、こうして形質
転換された酵母を培養し、リコビナントSODタンパク
質を発現させ、得られた培養液より単離精製処理して得
られたものが好ましい。また、このSOD又はそれと実
質的に同等の作用を有するものは、リコビナントSOD
タンパク質の発現ベクターで形質転換された酵母を培養
し、リコビナントSODタンパク質を発現させて得られ
た培養液よりの菌体をプロテアーゼ阻害剤存在下破砕
し、得られたリコビナントSODタンパク質を含む液か
ら、加熱処理によりタンパク質を沈殿させたタンパク質
抽出液を精製処理して得られたものであることができ
る。
作用を有するものは、リコビナントSODタンパク質の
発現ベクターで形質転換された酵母を培養し、リコビナ
ントSODタンパク質を発現させて得られた培養液より
の菌体を、プロテアーゼ阻害剤存在下破砕し、得られた
リコビナントSODタンパク質を含む液から、加熱処理
によりタンパク質を沈殿させたタンパク質抽出液をイオ
ン交換クロマトグラフィーによりにより精製処理して得
られたものであってよい。このリコビナントSODタン
パク質の発現ベクターは、SOD8−3又はそれらから
制限酵素及び/又は合成オリゴヌクレオチドを用いて遺
伝子組換え法で修飾されて誘導されたプラスミドである
ことができる。また、本発明においては、その目的に合
致するならSOD又はそれと実質的に同等の作用を有す
るものとして、ヒト胎盤由来のSODタンパク質及びウ
シ赤血球由来のSODタンパク質、またはそれらの誘導
体から成る群から選ばれたものであることもできよう。
的に同等の作用を有するものは、具体的な例では、例え
ば、リコビナントSODタンパク質の発現ベクターであ
るプラスミドSOD8−3などを、ソルビトール要求性
の酵母変異株などの宿主細胞に導入し、形質転換処理
し、この形質転換酵母などの宿主細胞を適切な培地中で
培養し、リコビナントSODタンパク質を発現させる。
この培養液より、発現させたリコビナントSODタンパ
ク質を含む菌体を遠心分離により集め、集めた菌体をE
DTA及びプロテアーゼ阻害剤を含むトリス緩衝液など
の緩衝液に懸濁し、機械的に破砕する。この菌体破砕液
より、遠心分離により不溶物を除いた上清液を、例え
ば、攪拌しながら約85〜95℃で約5分間というよう
な条件下熱処理し、約45〜65℃まで冷やした後、遠
心分離及び約0.2μm又はそれ以下のフィルターを用
いた濾過により不溶物を除き、リコビナントSODタン
パク質を含む抽出液を得る。
む20mMトリス緩衝液(pH8.5)などの適切な緩
衝液で希釈した後、陰イオン交換クロマトグラフィー
(例えば、Q セファロース(Sepharose)、
ファルマシア(Pharmacia)社)などにかけ
る。このカラムは、例えば、60mM塩化ナトリウム液
などで洗浄し、酵母菌体由来の不純物を除いた後、35
0mM塩化ナトリウムなどによりリコビナントSODタ
ンパク質を溶出することができる。この溶出液を、必要
に応じ限外濾過などにより濃縮し、約0.2μm又はそ
れ以下のフィルターを用いて濾過して、粗精製リコビナ
ントSODタンパク質が得られる。必要に応じさらに、
イオン交換クロマトグラフィー、ゲル濾過クロマトグラ
フィーなどにより精製できる。
的に同等の作用を有するものは、希釈剤に添加されて用
いることもでき、その場合の使用量は約0.0001m
g/ml〜約1mg/ml、好ましくは約0.001m
g/ml〜約0.5mg/ml、さらに好ましくは約
0.005mg/ml〜約0.1mg/ml、最も好ま
しくは約0.01mg/ml〜約0.1mg/mlの濃
度となるようにして用いることができる。
された抗原は、例えば遺伝子組換え技術を適用し、天然
HCVから分子クローニングにより得られたDNA配列
あるいは既に知られたHCVゲノム配列から、酵素など
を用いたり、化学合成により得られたDNA配列を、微
生物あるいは動物、植物、昆虫などで発現させて得られ
たリコビナント抗原である。このリコビナント抗原とし
ては、HCVゲノムの別々の抗原領域を発現させた組換
えタンパク質(リコビナントタンパク質)の少なくとも
1種であることができる。本発明で用いられる遺伝子組
換え法で産生された抗原としては、好ましくは融合タン
パク質として得られるものである。
CKS又はSODあるいはそれらの関連タンパク質の融
合タンパク質として得られるものである。例えば、宿主
細胞として大腸菌を用いてCKS融合タンパク質発現系
の遺伝子産物として得られるもの及び宿主細胞として酵
母を用いてSOD融合タンパク質発現系の遺伝子産物と
して得られるものが挙げられる。
98公報や特開平4─281792公報に記載のものが
挙げられ、さらには例えばpHCV−23リコビナント
抗原、pHCV−29リコビナント抗原、pHCV−3
1リコビナント抗原、pHCV−34リコビナント抗
原、pHCV−45リコビナント抗原、pHCV−48
リコビナント抗原、pHCV−49リコビナント抗原、
pHCV−50リコビナント抗原、pHCV−51リコ
ビナント抗原、pHCV−57リコビナント抗原、pH
CV−58リコビナント抗原、pHCV−101リコビ
ナント抗原、pHCV−102リコビナント抗原、pH
CV−103リコビナント抗原、pHCV−104リコ
ビナント抗原、pHCV−105リコビナント抗原、p
HCV−107リコビナント抗原、あるいはそれらをペ
プチダーゼや化学的開裂試薬で処理などし、プロセッシ
ングして得られたペプチド、例えばCKS遺伝子由来ペ
プチド部分の切断してあるものなどが挙げられる。
としては、EP−A1−318,216号に記載のHC
V c100−3、あるいはそれらをペプチダーゼや化
学的開裂試薬で処理などし、プロセッシングして得られ
たペプチド、例えばSOD遺伝子由来ペプチド部分の切
断してあるものなどが挙げられる。また、本発明では好
適に複数のリコビナント抗原を混合して用いることがで
きる。好ましくは、本発明で用いられる抗原は、HCV
c100−3リコビナント抗原、pHCV−31リコ
ビナント抗原及びpHCV−34リコビナント抗原から
なるものが使用できる。
学的に反応性の抗体を測定するにあたっては、ラジオイ
ムノアッセイ、酵素免疫測定法、螢光免疫測定法、化学
又は生物発光免疫測定法、及び凝集反応免疫測定法など
の方法によることができる。特に凝集反応免疫測定法、
例えば受身凝集反応免疫測定法は好ましい方法である。
学的に反応性の抗体を測定するにあたっては、抗原抗体
反応にあずかる抗原は、必要に応じて、例えば、寒天、
アガロース、セルロース、紙、ニトロセルロース、デキ
ストラン、ゼラチン、キチン、コラーゲン、綿などの生
体由来高分子あるいは天然物由来高分子、ポリスチレ
ン、ポリエチレン、ポリビニルアルコール、ポリアクリ
ルアミドなどのアクリル樹脂、イオン交換樹脂、光架橋
樹脂、テフロン、ポリアセタールなどの合成高分子、ガ
ラスビーズ、シリカゲル、アルミナ、セラミック、カー
ボン、硫酸マグネシウムなどの無機質材料などからな
る、微粒子、ビーズ、マイクロプレート、マイクロタイ
ターウェル、マイクロチューブ、ストリップ、メンブレ
ン、トレイ、ゲルなど、さらには赤血球、ラテックス粒
子、乳剤などの固定担体に固定しておき、この固定担体
を、分析対象としての抗体等を含有する試料と接触さ
せ、こうして固定担体に固定された抗原と、分析試料中
の抗体等とを特異的に結合反応せしめ、この特異的に結
合した分析対象物を検知することによりおこなうことが
できる。
化学又は生物発光免疫測定法、螢光免疫測定法などで
は、 125I、 3Hなどの放射性物質、西洋わさびペルオ
キシダーゼ、β−D −ガラクトシダーゼ、アルカリフォ
スファターゼなどの酵素、フルオレッセインなどの螢光
色素、金コロイド、セレンコロイドなどの発光又は発色
物質などで標識された抗原あるいは二次抗体が試薬とし
て用いられ、分析試料中の抗体、複合体等と特異的に結
合反応せしめられ、その放射活性、酵素活性あるいは螢
光などを測定して、試料中の抗体等が存在していたか否
かを判別することができる。
可溶性抗原を粒子状担体、例えば、赤血球、ポリスチレ
ン粒子などのラテックス粒子などに結合させたいわゆる
感作粒子抗原などの粒子状抗原と、それに対する抗体と
が特異的に結合反応して観察できるような凝集塊をつく
る反応を利用する。例えば、試料中の抗体を検知するた
め、上記したような粒子状抗原を試料と混合して反応さ
せ、例えば、水性媒質の中で抗原抗体反応により生じた
凝集反応が観察されるか否かにより、試料中に測定対象
の抗体が存在しているか否かが判別される。この凝集反
応を用いた測定法にあっては、一定量の抗原に対し、一
定の希釈列にある既知濃度あるいは量の抗体を加え、反
応の結果得られる溶液の凝集反応の程度を希釈倍数の逆
数で表して評価されることがなされる。逆に一定量の抗
体に対し、一定の希釈列にある既知濃度あるいは量の抗
原を加え、反応の結果得られる溶液の凝集反応の程度を
希釈倍数の逆数で表して評価されることもなされるし、
更に抗体に対する抗体、すなわち二次抗体を用いて間接
的な凝集反応を観察することもなされる。受身凝集反応
免疫測定法は、本発明に従い、例えば、HCVに対する
抗体の測定に用いられ、優れた作用効果が得られる。
抗原とを結合あるいは吸着させるには、当該分野で汎用
されている方法を用いることができ、例えばイオン相互
作用、疎水相互作用、共有結合などの物理的吸着や化学
的結合により行うことができる。例えば、架橋剤として
は、グルタルアルデヒド、1−エチル−3−(3−ジメ
チルアミノプロピル)カルボジイミド、スクシンイミジ
ル 3−(2−ピリジルジチオ)プロピオネート、スク
シンイミジル 4−(N−マレイミドメチル)シクロヘ
キサン−1−カルボキシレート、スクシンイミジル
(4−ヨードアセチル)アミノベンゾエート、スクシン
イミジル 4−(1−マレイミドフェニル)ブチレート
などが挙げられる。
上記したようなものが挙げられ、例えば寒天、アガロー
ス、架橋アガロース、架橋アルギン酸、架橋グアガム、
ニトロセルロースやカルボキシルセルロースなどのセル
ロースエステルあるいは混合セルロースエステル、ゼラ
チン、架橋ゼラチン、ラテックス、ゴム、ポリエチレ
ン、ポリプロピレン、ポリスチレン、スチレン−ブタジ
エン共重合体、ポリ塩化ビニル、ポリ酢酸ビニル、ポリ
アクリルアミド、ポリメタクリレート、スチレン−メタ
クリレート共重合体、ポリグリシジルメタクリレート、
アクロレイン−エチレングリコールジメタクリレート共
重合体などのポリエステル、ポリアミド、ポリウレタ
ン、ポリエポキシ樹脂などの天然あるいは合成の修飾あ
るいは非修飾の重合炭水化物、重合炭化水素など、それ
らの架橋誘導体など、ガラス、例えば活性化ガラス、シ
リカゲル、カオリン、タルク、シリカ−アルミナ、アル
ミナ、硫酸バリウムなどの無機材料などからなる群から
選ばれたものを、多孔性のゲル、微粒子などにしたもの
が挙げられる。
中和アッセイ、固相アッセイ、クロマトグラムアッセ
イ、サンドイッチアッセイなどに適したようにしておこ
なうこともできる。本発明で用いられる測定対象試料と
しては、全血、血清、血漿、脳脊髄液、リンパ液、リン
パ球、唾液、尿、汗、涙、糞便、生体粘液、生検組織、
細胞培養上清液などの生物由来材料をあげることができ
る。これら測定対象試料は、必要に応じ濃縮したり、希
釈して用いられるが、普通希釈剤などで希釈して用いる
ことが好ましい。本発明においては、検知用試薬とし
て、4−ヒドロキシフェニル酢酸、1,2−フェニレン
ジアミン、テトラメチルベンジジンなどと西洋ワサビ・
ペルオキシダーゼ、ウンベリフェリルガラクトシド、ニ
トロフェニルガラクトシドなどとβ−D −ガラクトシダ
ーゼ、ウンベリフェリルホスフェート、ニトロフェニル
ホスフェート、NADPなどとアルカリフォスファター
ゼ、グルコース−6−リン酸・デヒドロゲナーゼなどの
酵素試薬、放射性物質試薬、フルオレッセインイソチオ
シアネート、テトラメチルローダミンイソチオシアネー
トなどを用いている螢光試薬、発光試薬、化学発光試
薬、金コロイド、銀コロイド、セレンコロイドなどのコ
ロイド標識試薬、磁性体試薬、ビオチン標識抗ビオチン
抗体などのハプテン標識抗ハプテン抗体検出系試薬など
を用いることができる。
緩衝剤、希釈液又は希釈剤、ブロッキング剤、キレート
化剤、保存剤などを用いることができる。界面活性剤と
しては、陰イオン型界面活性剤、陽イオン型界面活性
剤、両性界面活性剤、非イオン型界面活性剤のうちから
選んで用いることが出来る。陰イオン型界面活性剤とし
ては、炭素数12〜18の高級脂肪酸のアルカリ金属
塩、炭素数12〜18の高級脂肪酸のトリエタノールア
ミンなどの有機塩基塩、炭素数12〜18の高級脂肪酸
又は高級アルコールの硫酸エステル、アルキルスルホン
酸塩、アルキルアリールスルホン酸塩などが挙げられ
る。陽イオン型界面活性剤としては、アルキル基、アリ
ール基、複素環基などを有する第四級アンモニウム化合
物などが挙げられる。
カルボン酸、炭素数12〜18の高級アルキルアミノ
酸、ラウリルジメチルベタインなどのアミノ酸のN−ト
リアルキル置換体などが挙げられる。非イオン型界面活
性剤としては、モノステアリン酸グリセリンなどの炭素
数12〜18の高級脂肪酸の多価アルコールエステル、
高級脂肪酸のポリオキシエチレンエステル、高級脂肪酸
のソルビタンエステル、高級脂肪酸とポリオキシエチレ
ン及びソルビタンエーテルとのエステル、ポリオキシエ
チレンラウリルアルコールなどの高級アルコールとポリ
オキシエチレンとのエーテル、ポリオキシエチレンとポ
リオキシプロピレンとのエーテルなどが挙げられる。好
ましい界面活性剤としては、ポリオキシエチレンソルビ
タン(代表的なものは、Tween 20などの商品名
で入手しうる)、ポリオキシエチレンエーテル(代表的
なものは、Triton X−100などの商品名で入
手しうる)、オクチルフェノール・エチレンオキサイド
縮合物(代表的なものは、Nonidet P−40な
どの商品名で入手しうる)、ドデシル硫酸ナトリウム、
N−ラウリルザルコシンなどが挙げられる。これら界面
活性剤は、約0.001%v/v〜約10%v/vの範
囲で用いることができる。
リン酸緩衝液、トリス(ヒドロキシメチル)アミノメタ
ン(Tris)緩衝液、例えば生理食塩水などの塩化ナ
トリウム液、N−(2−ヒドロキシエチル)ピペラジン
−N’−(2−エタンスルホン酸)液、ピペラジン−
N,N’−ビス(2−エタンスルホン酸)液、3−(シ
アノヘキシルアミノ)−1−プロパンスルホン酸)液、
3−(モルホリノ)プロパンスルホン酸液、アミノ酸液
などが挙げられる。これらは単独でも、任意に配合して
も用いることができる。キレート化剤としては、エチレ
ンジアミンテトラ酢酸(EDTA)、エチレングリコー
ル−ビス(β−アミノエチルエーテル)−N,N,
N’,N’−テトラ酢酸(EGTA)などが挙げられ
る。これらキレート化剤は、約0.01mM〜約20m
Mの範囲で用いることができる。保存剤としては、例え
ばナトリウムアジド、エチルパラベンなどが挙げられ
る。その他、本発明の測定系には、各種動物の血清、例
えば牛血清、牛血清アルブンミン(BSA)、牛胎児血
清(FCS)、ヤギ血清、卵白アルブンミン、ゼラチ
ン、各種乳タンパク質、例えばスキムミルク、カゼイ
ン、カゼイン分解物、ホエータンパク質など、ポリビニ
ルアルコール、ポリビニルピロリドンなどからなる群か
ら選ばれたものを添加することができる。これらは、約
0.01%v/v〜約50%v/vの範囲で添加するこ
とができる。
媒体中で行うことができるが、場合によっては免疫学的
反応を一時的に水性媒体中で行うようにされていてもよ
い。水性媒体は、好ましくは約5.0〜9.0のpHに
調整されて行うことができ、より好ましくは緩衝液中で
行うこともできる。水性媒体の塩濃度は、比較的低いほ
うが好ましく、例えば生理的に等張化されているものが
好ましい。本発明においては、もちろんリンパ球破砕
物、例えばヒトT−リンパ球抽出液、大腸菌抽出液、酵
母抽出液、マウス細胞培養液抽出液などの細胞抽出物を
添加することもできる。これらのものは、約0.001
%v/v〜約20%v/vの範囲で添加することもでき
る。本発明においては、試薬は単一の容器あるいは複数
の容器に入れてあり、使用にあたり配合されて用いるよ
うになっていてもよい。
説明するが、本発明はこの具体例により限定されるもの
でなく、その思想に従うかぎり各種の形態で実施できる
ことは理解されるべきである。
tories,米国)社から酵母水抽出物を入手した。 (2)大腸菌水抽出液の調製 リコンビナントタンパク質を発現するための、遺伝子組
換え操作が行われていない大腸菌XL−1 Blue
(ストラタジーン社:Stratagene)を培養し、培養液よ
り菌体を遠心分離により集め、こうして得られた菌体を
EDTA、トライトンX−100及びプロテアーゼ阻害
剤を含むトリス緩衝液に懸濁し、機械的に破砕した。こ
の菌体破砕液より、遠心分離及び0.2μmのフィルタ
ーを用いた濾過により不溶物を除き、大腸菌XL−1水
抽出物を得た。また、リコンビナントタンパク質を発現
するための、遺伝子組換え操作が行われていない大腸菌
JM103を培養し、上記の大腸菌XL−1水抽出物の
場合と同様な抽出操作により、大腸菌JM103水抽出
物を得た。このようにして得られる大腸菌XL−1水抽
出物及び大腸菌JM103水抽出物は、米国アボット社
より入手しうる。
む大腸菌水抽出液の調製 リコビナントCKSタンパク質の発現ベクターであるプ
ラスミドpTB210を、大腸菌XL−1 Blue
(ストラタジーン社:Stratagene)に導入し、形質転換
処理され、こうして形質転換された大腸菌pTB210
/XL−1を得た。この大腸菌pTB210/XL−1
を培養し、リコビナントCKSタンパク質を発現させ
た。この培養液より、発現させたリコビナントCKSタ
ンパク質を含む菌体を遠心分離により集め、集めた菌体
をEDTA、トライトンX−100及びプロテアーゼ阻
害剤を含むトリス緩衝液に懸濁し、機械的に破砕した。
この菌体破砕液より、遠心分離及び0.2μmのフィル
ターを用いた濾過により不溶物を除き、リコビナントC
KSタンパク質を含む大腸菌pTB210/XL−1水
抽出液を得た。このようにして得られるリコビナントC
KSタンパク質を含む大腸菌pTB210/XL−1水
抽出液は、米国アボット社より入手しうる。
質の調製 上記(3)で得られた、リコビナントCKSタンパク質
を含む大腸菌pTB210/XL−1水抽出液から、
4.8M以上の濃度の硫酸アンモニアにより、リコビナ
ントCKSタンパク質をを含むタンパク質を沈殿させ
た。この沈殿させたタンパク質を、0.5mMジチオス
レイトール(DTT)水溶液に懸濁し、この懸濁液を
0.1Mトリス緩衝液(pH7.6)中で透析し、粗精
製リコビナントCKSタンパク質を得た。このようにし
て得られる粗精製リコビナントCKSタンパク質は、米
国アボット社より入手しうる。
の調製 上記(4)で得られた、粗精製リコビナントCKSタン
パク質を、TSKgel DEAE−5PW(東ソー)
を用いたイオン交換クロマトグラフィーにより、次いで
TSKgel G3000 SWXL(東ソー)を用い
たゲル濾過クロマトグラフィーにより分画し、精製リコ
ビナントCKSタンパク質を得た。
ラスミドSOD8−3を、ソルビトール要求性の酵母変
異株に導入し、形質転換処理した。この形質転換酵母を
培養し、リコビナントSODタンパク質を発現させた。
この培養液より、発現させたリコビナントSODタンパ
ク質を含む菌体を遠心分離により集め、集めた菌体をE
DTA及びプロテアーゼ阻害剤を含むトリス緩衝液に懸
濁し、機械的に破砕した。この菌体破砕液より、遠心分
離により不溶物を除いた上清液を、攪拌しながら85〜
95℃で5分間熱処理し、45〜65℃まで冷やした
後、遠心分離及び0.2μmのフィルターを用いた濾過
により不溶物を除き、リコビナントSODタンパク質を
含む抽出液を得た。
む20mMトリス緩衝液(pH8.5)で希釈した後、
陰イオン交換カラム(Q セファロース(Sephar
ose)、ファルマシア(Pharmacia)社)に
かけた。このカラムを60mM塩化ナトリウム液で洗浄
し、酵母菌体由来の不純物を除いた後、350mM塩化
ナトリウムによりリコビナントSODタンパク質を溶出
した。この溶出液を、限外濾過により濃縮し、0.2μ
mのフィルターを用いて濾過して、粗精製リコビナント
SODタンパク質を得た。このようにして得られる粗精
製リコビナントSODタンパク質は、米国アボット社よ
り入手しうる。
胎盤由来の精製SODタンパク質及びウシ赤血球由来の
精製SODタンパク質を、それぞれ入手した。
球凝集反応(PHA)を用いて測定するため、HCV関
連抗原を感作した赤血球を次のようにして調製した。H
CV関連抗原として、HCV c100−3 リコビナ
ント抗原、pHCV−31 リコビナント抗原及びpH
CV−34 リコビナント抗原の混合物をヒト赤血球に
感作し、感作血球濃度が1.0(v/v)%になるよう
に生理食塩水(pH7.0)に溶解した。また、この感
作血球溶解液に、非特異反応の吸収剤として、実施例1
の(1)〜(7)で得た酵母水抽出物、大腸菌XL−1
水抽出物、大腸菌JM103水抽出物、大腸菌pTB2
10/XL−1水抽出液、粗精製リコビナントSODタ
ンパク質、ヒト胎盤由来の精製SODタンパク質、ウシ
赤血球由来の精製SODタンパク質、粗精製リコビナン
トCKSタンパク質、又は精製リコビナントCKSタン
パク質をそれぞれ添加した。添加した濃度は、酵母水抽
出物は0.1(w/v)%、大腸菌水抽出物や大腸菌p
TB210/XL−1水抽出液は0.1(v/v)%、
粗精製リコビナントSODタンパク質、ヒト胎盤由来の
精製SODタンパク質、ウシ赤血球由来の精製SODタ
ンパク質、粗精製リコビナントCKSタンパク質、及び
精製リコビナントCKSタンパク質は、それぞれ20μ
g/mlになるようにした。
応性の抗体を、受身赤血球凝集反応(PHA)を用いて
測定するため、HCV関連抗原を感作した赤血球を調製
した。HCV関連抗原として、HCV c100−3
リコビナント抗原、pHCV−31 リコビナント抗原
又はpHCV−34 リコビナント抗原を用いた。これ
らのHCV関連抗原をそれぞれ単独でヒト赤血球に感作
し、感作血球濃度が1.0(v/v)%になるように生
理食塩水(pH7.0)に溶解した。また、この感作血
球溶解液に、非特異反応の吸収剤として、実施例1の
(1)〜(7)で得た酵母水抽出物、大腸菌XL−1水
抽出物、大腸菌JM103水抽出物、大腸菌pTB21
0/XL−1水抽出液、粗精製リコビナントSODタン
パク質、ヒト胎盤由来の精製SODタンパク質、ウシ赤
血球由来の精製SODタンパク質、粗精製リコビナント
CKSタンパク質、又は精製リコビナントCKSタンパ
ク質をそれぞれ添加した。添加した濃度は、実施例2の
場合と同様にした。
ける、CKS及びSODの非特異的反応の抑制効果を、
受身赤血球凝集反応(PHA、15〜30℃で2時間イ
ンキュベーション)を用いて測定した。 (1)先ず、実施例2で得られた、何も非特異反応の吸
収剤の添加してない感作血球を用いて、健常人の血清検
体5000例についてPHAアッセイをおこなった。こ
のPHAアッセイで凝集反応が観察された偽陽性検体と
して20例を得た。次にこの偽陽性検体20例につい
て、実施例2で得られた、各種(酵母水抽出物、大腸菌
XL−1水抽出物、大腸菌JM103水抽出物、大腸菌
pTB210/XL−1水抽出液、粗精製リコビナント
SODタンパク質、ヒト胎盤由来の精製SODタンパク
質、ウシ赤血球由来の精製SODタンパク質、粗精製リ
コビナントCKSタンパク質、又は精製リコビナントC
KSタンパク質)の非特異反応の吸収剤を添加した感作
血球を用いて、PHAアッセイを行った。得られた結果
を表1に示す。
特異反応の吸収剤の添加してない感作血球、及び実施例
3で得られた、各種(酵母水抽出物、大腸菌XL−1水
抽出物、大腸菌JM103水抽出物、大腸菌pTB21
0/XL−1水抽出液、粗精製リコビナントSODタン
パク質、ヒト胎盤由来の精製SODタンパク質、ウシ赤
血球由来の精製SODタンパク質、粗精製リコビナント
CKSタンパク質、又は精製リコビナントCKSタンパ
ク質)の非特異反応の吸収剤を添加した感作血球を用い
て、上記の偽陽性検体20例について、PHAアッセイ
を行った。得られた結果を表2に示す。
パク質又はSODタンパク質を含む吸収剤を添加するこ
とにより、偽陽性検体が吸収され陰性化した。また、C
KSタンパク質及びSODタンパク質の両者を含む吸収
剤を同時に添加することにより、全ての偽陽性検体が吸
収され陰性化した。一方、酵母水抽出物やリコンビナン
トタンパク質を発現するための遺伝子組換え操作が行わ
れていない大腸菌の水抽出液の添加によっては、偽陽性
検体は全く陰性化しなかった。このようにCKSタンパ
ク質又はSODタンパク質を含む感作血球溶解液を用い
ることにより、非特異的反応を吸収して、顕著に偽陽性
を抑制できることが明らかとなった。また、上記実施例
とは別の実験において、上記実施例で使用した各種の非
特異反応の吸収剤を、上記実施例で使用した各種の感作
血球溶解液に添加しても、HCV関連抗体の測定には影
響しなかった。従って、CKSタンパク質又はSODタ
ンパク質を含有する感作血球溶解液を用いることによ
り、HCV関連抗体の測定を損なうこと無く、非特異的
反応のみを吸収して、偽陽性を抑制し、HCV関連抗体
に対するより特異性の高いアッセイ試薬となることが明
らかとなった。
遺伝子組換え法で産生された抗原を用いた、試料中のH
CV抗原と免疫学的に反応性の抗体の測定において、非
特異的反応の発生を効果的に中和でき、より特異性に優
れた測定ができる。また、CKSタンパク質に加えて、
SODタンパク質を一緒に用いることにより、より優れ
たHCV抗原と免疫学的に反応性の抗体測定系が提供で
き、臨床検査においての有用性が高いし、より早い時期
でHCV関連抗体を検出したり、非A非B型肝疾患にお
ける検出率を高めたり、供血者のスクリーニングを確実
に行なうことができる。
cPプロモーター領域のDNA配列を示す。
5’端の合成領域のDNA配列を示す。
配列を示す。
Claims (27)
- 【請求項1】 遺伝子組換え法で産生された抗原を用い
た、試料中のHCV抗原と免疫学的に反応性の抗体の測
定法において、CKS又はそれと実質的に同等の作用を
有するものを用いて、偽陽性を抑制することを特徴とす
るHCV関連抗体の測定法。 - 【請求項2】 遺伝子組換え法で産生された抗原が、融
合タンパク質として得られるものである請求項1記載の
HCV関連抗体の測定法。 - 【請求項3】 遺伝子組換え法で産生された抗原が、遺
伝子組換え法でCKS又はSODあるいはそれらの関連
タンパク質の融合タンパク質として得られるものである
請求項1又は2記載のHCV関連抗体の測定法。 - 【請求項4】 遺伝子組換え法で産生された抗原が、宿
主細胞として大腸菌を用いて得られるものである請求項
1〜3のいずれか一記載のHCV関連抗体の測定法。 - 【請求項5】 遺伝子組換え法で産生された抗原が、宿
主細胞として酵母を用いて得られるものである請求項1
〜3のいずれか一記載のHCV関連抗体の測定法。 - 【請求項6】 CKS又はそれと実質的に同等の作用を
有するものが、宿主細胞として大腸菌を用いて得られる
ものである請求項1〜5のいずれか一記載のHCV関連
抗体の測定法。 - 【請求項7】 CKS又はそれと実質的に同等の作用を
有するものが、リコビナントCKSタンパク質の発現ベ
クターであるプラスミドを大腸菌に導入して形質転換処
理され、こうして形質転換された大腸菌を培養してリコ
ビナントCKSタンパク質を発現させ、得られた培養液
より単離精製処理して得られたものである請求項1〜6
のいずれか一記載のHCV関連抗体の測定法。 - 【請求項8】 CKS又はそれと実質的に同等の作用を
有するものが、リコビナントCKSタンパク質の発現ベ
クターで形質転換された大腸菌を培養し、リコビナント
CKSタンパク質を発現させて得られた培養液よりの菌
体をプロテアーゼ阻害剤存在下破砕し、得られたリコビ
ナントCKSタンパク質を含む液から蛋白質沈殿剤によ
り沈殿させたタンパク質沈殿物を透析し、それを精製処
理して得られたものである請求項1〜7のいずれか一記
載のHCV関連抗体の測定法。 - 【請求項9】 CKS又はそれと実質的に同等の作用を
有するものが、リコビナントCKSタンパク質の発現ベ
クターで形質転換された大腸菌を培養し、リコビナント
CKSタンパク質を発現させて得られた培養液よりの菌
体をプロテアーゼ阻害剤存在下破砕し、得られたリコビ
ナントCKSタンパク質を含む液から蛋白質沈殿剤によ
りタンパク質を沈殿させ、ついで透析したものをイオン
交換クロマトグラフィーにより精製処理して得られたも
のである請求項1〜8のいずれか一記載のHCV関連抗
体の測定法。 - 【請求項10】 CKS又はそれと実質的に同等の作用
を有するものが、リコビナントCKSタンパク質の発現
ベクターで形質転換された大腸菌を培養し、リコビナン
トCKSタンパク質を発現させて得られた培養液よりの
菌体をプロテアーゼ阻害剤存在下破砕し、得られたリコ
ビナントCKSタンパク質を含む液から蛋白質沈殿剤に
よりタンパク質を沈殿させ、ついで透析したものをさら
にゲル濾過クロマトグラフィーにより精製処理して得ら
れたものである請求項1〜8のいずれか一記載のHCV
関連抗体の測定法。 - 【請求項11】 リコビナントCKSタンパク質の発現
ベクターが、pTB201,pTB210、pTB26
0,pTB270又はそれらから制限酵素及び/又は合
成オリゴヌクレオチドを用いて遺伝子組換え法で修飾さ
れて誘導されたプラスミドである請求項7〜10のいず
れか一記載のHCV関連抗体の測定法。 - 【請求項12】 遺伝子組換え法で産生された抗原を用
いた、試料中のHCV抗原と免疫学的に反応性の抗体の
測定法において、CKS又はそれと実質的に同等の作用
を有するもの、及びSOD又はそれと実質的に同等の作
用を有するものを用いて、偽陽性を抑制することを特徴
とするHCV関連抗体の測定法。 - 【請求項13】 SOD又はそれと実質的に同等の作用
を有するものが、宿主細胞として酵母を用いて得られる
リコビナント蛋白質である請求項12記載のHCV関連
抗体の測定法。 - 【請求項14】 SOD又はそれと実質的に同等の作用
を有するものが、リコビナントSODタンパク質の発現
ベクターであるプラスミドを、酵母に導入し形質転換処
理され、こうして形質転換された酵母を培養し、リコビ
ナントSODタンパク質を発現させ、得られた培養液よ
り単離精製処理して得られたものである請求項12又は
13記載のHCV関連抗体の測定法。 - 【請求項15】 SOD又はそれと実質的に同等の作用
を有するものが、リコビナントSODタンパク質の発現
ベクターで形質転換された酵母を培養しリコビナントS
ODタンパク質を発現させて得られた培養液よりの菌体
を、プロテアーゼ阻害剤存在下破砕し、得られたリコビ
ナントSODタンパク質を含む液から加熱処理によりタ
ンパク質を沈殿させたタンパク質抽出液を、精製処理し
て得られたものである請求項12〜14のいずれか一記
載のHCV関連抗体の測定法。 - 【請求項16】 SOD又はそれと実質的に同等の作用
を有するものが、リコビナントSODタンパク質の発現
ベクターで形質転換された酵母を培養しリコビナントS
ODタンパク質を発現させて得られた培養液よりの菌体
を、プロテアーゼ阻害剤存在下破砕し、得られたリコビ
ナントSODタンパク質を含む液から加熱処理によりタ
ンパク質を沈殿させたタンパク質抽出液を、イオン交換
クロマトグラフィーによりにより精製処理して得られた
ものである請求項12〜15のいずれか一記載のHCV
関連抗体の測定法。 - 【請求項17】 リコビナントSODタンパク質の発現
ベクターが、SOD8−3又はそれらから制限酵素及び
/又は合成オリゴヌクレオチドを用いて遺伝子組換え法
で修飾されて誘導されたプラスミドである請求項14〜
16のいずれか一記載のHCV関連抗体の測定法。 - 【請求項18】 SOD又はそれと実質的に同等の作用
を有するものが、ヒト胎盤由来のSODタンパク質及び
ウシ赤血球由来のSODタンパク質から成る群から選ば
れたものである請求項12記載のHCV関連抗体の測定
法。 - 【請求項19】 遺伝子組換え法で産生された抗原が、
遺伝子組換え法で融合タンパク質として得られる複数の
HCV関連抗原からなる請求項1〜18のいずれか一記
載のHCV関連抗体の測定法。 - 【請求項20】 遺伝子組換え法で産生された抗原が、
HCV c100−3リコビナント抗原、pHCV−3
1リコビナント抗原及びpHCV−34リコビナント抗
原のHCV関連抗原からなる請求項1〜19のいずれか
一記載のHCV関連抗体の測定法。 - 【請求項21】 遺伝子組換え法で産生された抗原を用
いた試料中のHCV抗原と免疫学的に反応性の抗体の測
定試薬において、偽陽性を抑制するため、CKS又はそ
れと実質的に同等の作用を有するものが配合されている
ことを特徴とするHCV関連抗体の測定試薬。 - 【請求項22】 遺伝子組換え法で産生された抗原を用
いた試料中のHCV抗原と免疫学的に反応性の抗体の測
定試薬において、偽陽性を抑制するため、CKS又はそ
れと実質的に同等の作用を有するもの、及びSOD又は
それと実質的に同等の作用を有するものが、配合されて
いることを特徴とするHCV関連抗体の測定試薬。 - 【請求項23】 測定試薬が、ラジオイムノアッセイ、
酵素免疫測定法、螢光免疫測定法、化学又は生物発光免
疫測定法、及び凝集反応免疫測定法からなる群から選ば
れたものにおいて用いられるものであることを特徴とす
る請求項21又は22記載のHCV関連抗体の測定試
薬。 - 【請求項24】 測定試薬が、競合アッセイ、中和アッ
セイ、固相アッセイ、クロマトグラムアッセイ、及びサ
ンドイッチアッセイからなる群から選ばれたものにおい
て用いられるものであることを特徴とする請求項21〜
23のいずれか一記載のHCV関連抗体の測定試薬。 - 【請求項25】 試料が、全血、血清、血漿、脳脊髄
液、リンパ液、リンパ球、唾液、尿、汗、涙、糞便、生
体粘液、生検組織、及び細胞培養上清液からなる群から
選ばれたものであることを特徴とする請求項21〜24
のいずれか一記載のHCV関連抗体の測定試薬。 - 【請求項26】 検知用試薬として、酵素試薬、放射性
物質試薬、螢光試薬、発光試薬、化学発光試薬、コロイ
ド標識試薬、磁性体試薬、及びハプテン標識抗ハプテン
抗体検出系試薬からなる群から選ばれたものを用いるも
のであることを特徴とする請求項21〜25のいずれか
一記載のHCV関連抗体の測定試薬。 - 【請求項27】 請求項1〜20のいずれか一記載のH
CV関連抗体の測定法に用いるものである請求項21〜
26のいずれか一記載のHCV関連抗体の測定試薬。
Priority Applications (1)
Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
---|---|---|---|
JP6117550A JP2803019B2 (ja) | 1994-05-06 | 1994-05-06 | Hcv関連抗体測定法 |
Applications Claiming Priority (1)
Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
---|---|---|---|
JP6117550A JP2803019B2 (ja) | 1994-05-06 | 1994-05-06 | Hcv関連抗体測定法 |
Publications (2)
Publication Number | Publication Date |
---|---|
JPH07301635A true JPH07301635A (ja) | 1995-11-14 |
JP2803019B2 JP2803019B2 (ja) | 1998-09-24 |
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ID=14714591
Family Applications (1)
Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
---|---|---|---|
JP6117550A Expired - Fee Related JP2803019B2 (ja) | 1994-05-06 | 1994-05-06 | Hcv関連抗体測定法 |
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Country | Link |
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JP (1) | JP2803019B2 (ja) |
Cited By (1)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
JP2002535656A (ja) * | 1999-01-23 | 2002-10-22 | ミナーヴァ・バイオテクノロジーズ・コーポレーション | コロイド固定化種と非コロイド構造上の種との相互作用 |
Citations (2)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
JPH06506770A (ja) * | 1991-01-25 | 1994-07-28 | アボット・ラボラトリーズ | 試料希釈液中でのスーパーオキシドジスムターゼの使用 |
JPH06510289A (ja) * | 1991-08-21 | 1994-11-17 | アボツト・ラボラトリーズ | Ns5領域由来の組換え抗原を利用したc型肝炎アッセイ |
-
1994
- 1994-05-06 JP JP6117550A patent/JP2803019B2/ja not_active Expired - Fee Related
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JPH06506770A (ja) * | 1991-01-25 | 1994-07-28 | アボット・ラボラトリーズ | 試料希釈液中でのスーパーオキシドジスムターゼの使用 |
JPH06510289A (ja) * | 1991-08-21 | 1994-11-17 | アボツト・ラボラトリーズ | Ns5領域由来の組換え抗原を利用したc型肝炎アッセイ |
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---|---|---|---|---|
JP2002535656A (ja) * | 1999-01-23 | 2002-10-22 | ミナーヴァ・バイオテクノロジーズ・コーポレーション | コロイド固定化種と非コロイド構造上の種との相互作用 |
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JP2803019B2 (ja) | 1998-09-24 |
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