CN109187708A - 一种检测蛋白质乙酰转移酶活性的电化学方法 - Google Patents

一种检测蛋白质乙酰转移酶活性的电化学方法 Download PDF

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Abstract

本发明公开了一种检测蛋白质乙酰转移酶活性的电化学方法，P1修饰的金电极和p300蛋白的检测体系中加入P2模板化银纳米粒子和葫芦[8]脲，通过电化学测量检测p300蛋白的活性，从而得到蛋白质转移化酶活性；所述P1的氨基酸序列为：11‑巯基十一烷酸(MUA)‑GGGFRGKGGKGLGKGGAKA；所述P2的氨基酸序列为：FGGGASLWWSEKL。以p300为模型，以信号模板P2合成银纳米粒子，通过腔体与传感模板P1进行组装，既保证了检测的灵敏性，又具有高度的设计灵活性，同时增强了HATs的选择性。发展能够检测HATs活性的简单、实用的电化学方法，有望为重大疾病的早期诊断提供帮助。

Description

一种检测蛋白质乙酰转移酶活性的电化学方法
技术领域
本发明属于生物电化学检测技术领域，具体地，涉及一种检测蛋白质乙酰转移酶活性的电化学方法。
背景技术
1931年，Warburg医生凭借“癌症是代谢性疾病”的重大发现，获得诺贝尔生理学和医学奖。美国多所大学的研究也证实：基因不是癌症产生的根本因素，掌控癌症产生的是细胞质。正常细胞质和癌细胞质的区别，就是代谢的不同，因此，代谢障碍才是细胞癌变的根源。根据相关标准估计，2015年全世界约有1/4 的人口患有代谢综合征（metabolicsyndrome，MS），我国的患病率为16.5%，年龄标化后男女患病率分别为10.0%和23.3%，北方患病率高于南方，城市患病率高于农村。研究发现，83%的糖尿病患者和51%心脑血管疾病是由于MS引起，而大多数高血压的发生也由MS引起。我国现有7700万MS患者，即每8个成年人中至少有1人患有MS，这超过了目前其他任何一种疾病的患病率。通过广州市体检人群的研究表明，普通人群的MS患病率以平均每年0.97%的速度递增。2014年在重庆市35岁及以上人群中调查得出MS标化患病率为18.72%，女性（25.55%）显著高于男性（12.90%）。MS以肥胖、血压升高、血糖升高以及血脂异常为主要临床表现，多种危险因子汇聚于同一个个体，是严重影响人类健康的代谢性疾病。但是，MS的早期症状并不明显，临床上主要通过测试患者的身高、体重、血压，以及血糖、血脂的指标进行综合评估。这种评估缺乏直接的证据，确诊率较低，失去了最佳的治疗时机。在此背景下，发展有效的MS早期检测技术成为MS治疗领域急需解决的问题之一。
早期检测蛋白乙酰转移酶(HATs)活性的方法主要依赖于放射自显影法及放射性同位素标记，该传统检测方法存在放射性标记耗时费力、成本高及对环境污染较大等缺点。多种HATs自身作用于底物并无法完成反应，还需要共反应物乙酰辅酶 A 提供乙酰基才能进行乙酰化反应， 在这过程中会产生辅酶 A， 建立一种方法定量其副产物，也同样能够间接地检测HATs的活性，但是对酶的间接检测是其无法克服的缺陷。另外，还易受到反应液中其他还原性物质或者其它巯基小分子的干扰，从而导致灵敏度的提高受到限制。
通过酶联免疫（Enzyme linked immunosorbent assay，ELISA）的方法对HATs进行的检测已经进入了商品化。依赖酶联免疫吸附的原理是将组蛋白H3和H4的氨基末端尾部与抗原决定簇标记的麦芽糖结合蛋白质连接产生融合蛋白。该融合蛋白发生反应后，经凝胶电泳分离后，通过显色来检测酶反应活性。在乙酰化抗体识别的方法上，2011年MollyM.Stevens 教授设计了一种依赖于乙酰化特异性抗体底物多肽调控与量子点间的荧光能量共振转移进行HATs检测的传感器。同样的还有基于乙酰化抗体介导的金纳米颗粒（AuNPs）组装策略。2013年 Jiang Jianhui 课题组基于上述思路报道了比色的方法用于HATs检测。基于酶联免疫和乙酰化抗体识别的方法是乙酰化相关酶活性检测的主导工具，但是存在着如抗体批次之间的差异、抗体标记的高成本和复杂探针的制备等缺点。
Minoru Yoshida 课题组自 2009 年以来，发表了一系列文章报道了基于溴结构域特异性识别乙酰化的方法用于乙酰化相关酶的检测，对多种细胞内的乙酰化水平实现实时连续地监测。
B. Devipriya等设计了一种漆树酸（Anacardic acid，AA）与p300绑定的复合体，AA作为HATs抑制剂，对HATs的活性起到抑制作用，通过分别检测气态AA以及AA-p300复合体的分子构象、电荷密度分布、静电作用，得出AA进入p300活泼位点前后的差异性，通过这种差异性的改变，进而评估HATs活性。
Yufang Hu等设计一种辅酶A-Ag+/GO（氧化石墨烯）修饰的玻碳电极，在氮气氛中催化氧化双氧水产生电信号，与蛋白质乙酰化过程中参与的HATs建立线性关系，进而检测HATs的活性，线性范围0.1~100nM，检测限0.067nM。
近年来，受到生物矿化作用的启发，多肽被越来越多地作为模板引导金纳米颗粒、银纳米颗粒、铜纳米颗粒、磁性纳米颗粒以及量子点等无机纳米材料的“绿色”合成。不同于化学合成中所需的高温、高压等条件，多肽模板化纳米材料的合成条件更为温和，通常发生在室温的中性水溶液环境中。与此同时，特定的多肽序列可以随着合成模板一起结合到纳米材料表面，避免了繁琐的化学修饰过程，使多肽与纳米材料的结合更为简便、高效且易于控制。
Philipp Graf等合成了二氧化硅包裹的多肽模板化银纳米颗粒，合成条件非常温和，在纳米颗粒低浓度情况下，具有很好的化学稳定性和生物相容性，这种生物模拟的软化学合成材料将会应用于生物体内光学器件和传感器的构建。
多肽模板化纳米材料应用于催化无机小分子，Hongyu Yang等在玻碳电极表面修饰多肽（R5）模板化的钯纳米线，用于催化碱性环境中氧的电解还原反应。Rohit Bhandari等合成了多肽（R5）模板化的钯和铂纳米材料，用于烯丙醇的催化加氢反应、Stille偶联反应和对硝基苯酚的氢化还原反应。Nicholas A. Merrill等合成多肽（R5）模板化的双金属钯-铂纳米材料用于烯烃的催化加氢反应。
多肽模板化纳米材料应用于生物分子检测，Yuanyuan Zhang等在金电极表面修饰多肽链，利用目标生物分子TGase 2（转谷氨酰胺酶）在多肽链上生长，营造生物矿化模拟环境，吸附和还原Ag+生成金属Ag产生电信号。此项研究成果已经应用于子痫前期临床实践。
Qian Wen等开发了一种多肽模板化的、实时的、免标记的金纳米族信号传感系统，通过荧光技术检测两种蛋白质修饰酶——HDACs和PKA（蛋白激酶A），其中HDACs的检测范围从15 pM 至 30 nM，检测限5 pM。因此，多肽模板化纳米材料为发展以多肽为底物的蛋白质修饰酶活性检测新方法提供了无限的选择空间。
发明内容
发明目的：本发明建立了一种基于葫芦脲[8]（CB[8]）模板自组装的HATs活性检测的电化学方法。
技术方案：本发明提供了一种检测蛋白质乙酰转移酶活性的电化学方法，包括以下步骤：P1修饰的金电极(P1/AuE)和p300蛋白的检测体系中加入P2模板化银纳米粒子（P2-AgNPs）和葫芦[8]脲（CB[8]），通过电化学测量检测p300蛋白的活性，从而得到蛋白质转移化酶活性；所述P1的氨基酸序列为：11-巯基十一烷酸(MUA)-GGGFRGKGGKGLGKGGAKA；所述P2的氨基酸序列为：FGGGASLWWSEKL。
本发明所述的检测蛋白质乙酰转移酶活性的电化学方法，方法合理，本发明提供了一段氨基酸序列为P1：11-巯基十一烷酸(MUA)-GGGFRGKGGKGLGKGGAKA的多肽探针，其中半胱氨酸C可以通过Au-S键实现多肽探针在金电极表面的自组装，得到P1修饰的金电极(P1/AuE)。苯丙氨酸F可以通过与葫芦[8]脲（CB[8]）的主客识别作用结合P2模板化银纳米粒子（P2-AgNPs），而赖氨酸K可以在p300蛋白的作用下发生乙酰化（Ac）。当检测体系中没有p300时，自组装在金电极表面的多肽探针P1可以在羧肽酶Y（carboxypeptidaseY，CPY，一种来自酵母的不含金属的肽链端解酶）的作用下从羧基端逐个降解；此时，若向检测体系中引入P2-AgNPs和CB[8]，P2-AgNPs无法被结合至电极表面，因而无法得到明显的电化学信号。当检测体系中存在p300时，自组装在金电极表面的多肽探针P1的赖氨酸被乙酰化，从而可以抵抗羧肽酶Y的水解作用；此时，若向检测体系中引入P2-AgNPs和CB[8]，CB[8]功能化的P2-AgNPs可以通过与F的主客识别作用被结合至电极表面，最终得到来源于AgNPs的显著电化学信号。通过电化学信号的强弱，我们最终可以实现p300活性的灵敏检测，最终实现蛋白质乙酰转移酶活性的检测。
进一步的，上述的检测蛋白质乙酰转移酶活性的电化学方法，所述P1修饰的金电极(P1/AuE)的制备方法：包括以下步骤：
（1）金电极在麂皮上依次用1μm，0.3μm和0.05μm氧化铝悬浊液打磨成镜面；
（2）用H2SO4:H2O2为3:1的溶液浸泡清洗5min，清除金电极上吸附的有机物；
（3）金电极分别在双蒸水和乙醇中超声清洗；
（4）金电极在50%硝酸中浸泡30min，然后在0.5M的H2SO4中电化学清洗，扫描电压从0V至1.5V，循环30次；
（5）金电极用氮气吹干，再将金电极浸入100μL，0.5μM的P1溶液，浸泡16h后，金电极温育在1mM的巯基己醇(MCH)30min封闭电极，之后双蒸水清洗，得所述P1修饰的金电极(P1/AuE)。
进一步的，上述的检测蛋白质乙酰转移酶活性的电化学方法，所述P1溶液中加入磷酸三氯乙酯（TCEP），防止P1的MUA端基形成二硫键。
进一步的，上述的检测蛋白质乙酰转移酶活性的电化学方法，所述P2模板化银纳米粒子（P2-AgNPs）的合成方法，包括以下步骤：将0.2mMAgNO3和100ng/μL的P2混合在5mL的水溶液中，磁力搅拌20min；混合溶液中缓缓加入2mM的NaBH4，磁力搅拌10min，得所述P2模板化银纳米粒子（P2-AgNPs）。
进一步的，上述的检测蛋白质乙酰转移酶活性的电化学方法，所述电化学测量检测包括以下步骤：
（1）所述P1修饰的金电极(P1/AuE)于30℃温育在p300蛋白和100μM乙酰辅酶A（Ac-CoA）溶液中1h，使用清洗液清洗；
（2）P1修饰的金电极(P1/AuE)浸入100μL，2.5U/mL的羧肽酶Y（CPY）溶液中，室温下反应45min；
（3）使用清洗液清洗之后，P1修饰的金电极(P1/AuE)电极与10μM的CB[8]和P2-AgNPs反应1h，形成CB[8]辅助的多肽模板化组装，进行电化学测量。
进一步的，上述的检测蛋白质乙酰转移酶活性的电化学方法，电化学测量后的P1修饰的金电极(P1/AuE)用清洗液洗净，进行下次的电化学测量。
进一步的，上述的检测蛋白质乙酰转移酶活性的电化学方法，所述清洗液为20mM的Tris-HCl，所述清洗液中还含有0.1M的NaCl以及1.0%的Tween-20；所述清洗液的pH为7.4。
进一步的，上述的检测蛋白质乙酰转移酶活性的电化学方法，所述电化学测量检测包括线性扫描伏安法（LSV）和电化学交流阻抗谱（EIS）。
进一步的，上述的检测蛋白质乙酰转移酶活性的电化学方法，所述P1修饰的金电极(P1/AuE)作为工作电极，Ag/AgCl电极和铂电极分别作为参比电极和对电极，电化学交流阻抗谱（EIS）的工作条件为：偏电压0.224V，振幅5-mV，频率范围0.1Hz至10kHz；线性扫描伏安法（LSV）扫描，工作溶液1M的KCl，工作电压-0.01至0.13V。
有益效果：本发明具有以下优点：本发明所述的检测蛋白质乙酰转移酶活性的电化学方法，方法合理，利用p300作为HATs的模型，构建设计简单、选择性和重复性好，能跟踪目标物p300活性的生物传感器。通过CB[8]的应用，在电极表面富集银纳米粒子，降低传感器的检测限。同时发明也能解决p300抑制剂的检测，以及与HATs相关的药物开发过程的蛋白质修饰酶活性的检测。以p300为模型，发展能够检测HATs活性的简单、实用的电化学方法，有望为重大疾病的早期诊断提供帮助。通过合理的设计，以信号模板P2合成银纳米粒子，通过（CB[8]）腔体与传感模板P1进行组装，既保证了检测的灵敏性，又具有高度的设计灵活性，同时增强了HATs的选择性。
附图说明
附图1：CB[8]辅助的多肽组装检测HATs活性的电化学实验原理示意图；
附图2：P2-AgNPs的UV光谱和TEM图（内插图）；
附图3：在P1/ACE电极上的LSV响应，(a)P2-AgNPs 和 CB[8]，(b)P2-AgNPs 和 (c)P3-AgNPs 和 CB[8]，扫描速率：100mV/s；缓冲溶液：1M的KCl；
附图4：EIS响应(a)AuE（b）P1/AuE，P1/AuE温育在(c)p300，(d)p300和CPY，(e)p300，CPY，CB[8]和P2-AgNPs，(f)CPY，CB[8]和P2-AgNPs，电解质溶液：5mM的[Fe(CN)6]3-/4-，偏电压：0.224V，振幅：5mV，频率范围：0.1Hz-10kHz；
附图5：改变p300与CPY不同存在形式下活性检测的LSV响应，体系中存在CPY情况下（a）500nM的p300，(b)0n的Mp300；体系中不存在CPY情况下（c）500nM的p300，（d）0nM的p300；扫描速率：100mV/s，缓冲溶液：1MKCl；
附图6：不同优化条件下的LSV响应（A）不同P1浓度下峰电流变化曲线；（B）不同CB[8]浓度下峰电流变化曲线；（C）P1/AuE温育在CB[8]和P2-AgNPs体系后，不同组装时间下峰电流变化曲线；（D）P1/AuE温育在CPY，CB[8]和P2-AgNPs体系后，不同CPY催化消化时间下峰电流变化曲线。
附图7：（A）不同p300浓度情况下活性检测的LSV响应（从a至k：0nM，0.1nM，1nM，5nM，10nM，25nM，40nM，50nM，100nM，250nM和500nM）（B）p300活性检测电化学实验的标准曲线。插图展示的是峰电流的绝对值与p300浓度的线性关系；
附图8：p300与对照物之间的实验选择性。
具体实施方式
下面将通过几个具体实施例，进一步阐明本发明，这些实施例只是为了说明问题，并不是一种限制。
实施例1
技术方案和工作原理
本发明所述的一种检测蛋白质乙酰转移酶活性的电化学方法，包括以下步骤：P1修饰的金电极(P1/AuE)和p300蛋白的检测体系中加入P2模板化银纳米粒子（P2-AgNPs）和葫芦[8]脲（CB[8]），通过电化学测量检测p300蛋白的活性，从而得到蛋白质转移化酶活性；所述P1的氨基酸序列为：11-巯基十一烷酸(MUA)-GGGFRGKGGKGLGKGGAKA；所述P2的氨基酸序列为：FGGGASLWWSEKL。
本发明的工作原理，如图1所示，本发明提供了一段氨基酸序列为P1：11-巯基十一烷酸(MUA)-GGGFRGKGGKGLGKGGAKA的多肽探针，其中半胱氨酸C可以通过Au-S键实现多肽探针在金电极表面的自组装，得到P1修饰的金电极(P1/AuE)。苯丙氨酸F（以方块标识）可以通过与葫芦[8]脲（CB[8]）的主客识别作用结合P2模板化银纳米粒子（P2-AgNPs），而赖氨酸K（以六角星标识）可以在p300蛋白的作用下发生乙酰化（Ac）。当检测体系中没有p300时，自组装在金电极表面的多肽探针P1可以在羧肽酶Y（carboxypeptidaseY，CPY，一种来自酵母的不含金属的肽链端解酶）的作用下从羧基端逐个降解；此时，若向检测体系中引入P2-AgNPs和CB[8]，P2-AgNPs无法被结合至电极表面，因而无法得到明显的电化学信号。当检测体系中存在p300时，自组装在金电极表面的多肽探针P1的赖氨酸被乙酰化，从而可以抵抗羧肽酶Y的水解作用；此时，若向检测体系中引入P2-AgNPs和CB[8]，CB[8]功能化的P2-AgNPs可以通过与F的主客识别作用被结合至电极表面，最终得到来源于AgNPs的显著电化学信号。通过电化学信号的强弱，我们最终可以实现p300活性的灵敏检测，最终实现蛋白质乙酰转移酶活性的检测。
实施例2
P2模板化银纳米粒子（P2-AgNPs）的合成
P2模板化银纳米粒子（P2-AgNPs）的合成方法，包括以下步骤：将0.2 mM AgNO3 和100ng/μL P2混合在5mL水溶液中，磁力搅拌20min。混合溶液中缓缓加入NaBH4 (2 mM)，磁力搅拌10min。当最终溶液出现稳定的黄色时，表明P2-AgNPs形成。
如图2所示， P2-AgNPs的形成和可用性首先被研究，在UV-vis光谱中，405nm处的特征峰证实了Ag纳米颗粒的存在。通过TEM分析，大多数颗粒是分散的，粒径大约10nm（内插图）。
在对照实验中，去除苯丙氨酸残基的对照多肽P3替代P2进行模板化合成银纳米粒子。其中，P3的氨基酸序列为：GGGASLWWSEKL。
实施例3
P1修饰的金电极(P1/AuE)制备
修饰前，金电极首先需要在麂皮上依次用1 μm， 0.3 μm and 0.05 μm氧化铝悬浊液打磨成镜面。然后，用piranha溶液（H2SO4: H2O2= 3: 1）浸泡清洗5min，清除电极上吸附的有机物。电极分别在双蒸水和乙醇中超声清洗。电极在50%硝酸中浸泡30min，然后在0.5 MH2SO4中电化学清洗，扫描电压从0 V 至 1.5 V， 循环30次。在氮气氛中吹干，将处理好的金电极浸入100 μL，0.5 μM P1 溶液。P1溶液中加入磷酸三氯乙酯（TCEP），防止P1的MUA端基形成二硫键。浸泡16h后，金电极温育在1 mM MCH 30min，之后双蒸水清洗，储存待用。
实施例4
检测p300活性的电化学实验
首先，P1/AuE电极温育在不同浓度p300和100 μM的Ac-CoA（辅酶A）溶液中，30℃，1h，清洗液清洗。其次，P1/AuE电极浸入100 μL，2.5 U/mL CPY溶液中，室温下保持消化反应45min。清洗之后，电极与10 μM CB[8] 和P2-AgNPs反应1h，形成CB[8]辅助的多肽模板化组装。最后，电极可以用清洗液洗净，用于下次的电化学测量。其中清洗液为20mM的Tris-HCl，所述清洗液中还含有0.1M的NaCl以及1.0%的Tween-20，并且清洗液的pH为7.4。
实施例5
电化学测量方法
所述的电化学测量方法包括线性扫描伏安法（LSV）和电化学交流阻抗谱（EIS），在CHI660c电化学工作站上运行。P1/AuE电极作为工作电极，Ag/AgCl电极和铂电极分别作为参比电极和对电极。EIS谱工作条件设置：偏电压0.224 V，振幅5-mV，频率范围0.1 Hz 至10 kHz。LSV扫描，工作溶液1 M KCl，工作电压-0.01 至0.13 V。
实施例6
如图3所示，在P1/AuE电极与P2-AgNPs 和 CB[8]共同孵育之后，LSV出现了很强的电流响应（曲线a）。形成对比地是：当体系中不存在CB[8]或者用去除苯丙氨酸的对照多肽模板P3替换信号多肽模板P2时，LSV只出现了极其微弱的电流响应（曲线b和c）。这个实验不仅验证了P2-AgNPs作为信号元件的可行性，而且也可以证明CB[8]辅助的P2-AgNPs的电化学响应并不是吸附或者其它的相互作用。
实施例7
如图4所示，裸露的AuE展示了几乎是一条直线（曲线a），修饰上P1之后，阻抗图出现半圆（曲线b），意味着电子转移的阻力增大，这主要归结于单层多肽模板P1自组装空间位阻的影响。当体系中引入p300之后，阻抗图中半圆直径增大（曲线c），这主要因为p300能通过中和一个正电荷，催化赖氨基残基的乙酰化反应。因此，可以减弱[Fe(CN)6]3-/4-氧化还原中的静电排斥作用。体系中进而再加入CPY，阻抗图中半圆直径稍微有所减弱（曲线d），这意味着CPY剪切传感模板P1.当电极最终暴露在含有CB[8] 和 P2-AgNPs的溶液中，能观察到阻抗图中半圆直径显著增加，这证明CB[8]参与辅助多肽模板化组装。相反，在HATs缺失的情况下，即使温育在含有P1/AuE ，CPY， CB [8] 和P2-AgNPs的体系中，阻抗图中也只能观察到很小的半圆直径（曲线f）。这个实验证明P1能够被CPY充分水解，也就不能结合CB[8]和P2-AgNPs。同时，也能证明检测HATs活性的可行性。
实施例8
如图5所示，当体系中引入500 nM p300时，能观察到很强的LSV响应（曲线a）；相反，当体系中缺失p300时，只能观察到很弱的LSV响应（曲线b），这表明本方法能很便利地检测HATs的活性。我们设计了不引入CPY的对照实验。在500 nM p300（曲线c）和0 nM p300（曲线d）体系中，观察到LSV响应很相似，这也符合我们的预期，不引入CPY，无论是否含有p300，LSV响应都很强烈。
实施例9
为了得到令人满意的效果，我们对实验条件进行了优化。如图6所示，首先需要优化P1的浓度，我们设计了LSV扫描不同浓度P1情况下，P1/AuE中引入CB[8]辅助的P2-AgNPs的电化学性能，当P1浓度达到0.5μM时，峰电流值达到最大值（曲线A）。这主要因为过高的P1浓度会引起电极表面空间位阻的增大，因此，将0.5μM 作为P1的最佳浓度。之后，我们优化了CB[8]浓度和组装时间。当CB[8]浓度达到和组装时间达到60min时，峰电流值分别达到最大值（曲线B和曲线C）。因此，将10 μM作为CB[8]最佳浓度，将60min作为组装的最佳时间。为了避免因为CPY水解不足可能造成假阳性结果，我们优化了CPY催化消化时间，最佳的催化消化时间为45min（曲线D）。
实施例10
在实施例9的最优化的条件下，我们设计了一系列不同浓度的p300活性检测。如图7所示，随着p300浓度的递增，LSV响应值也在逐渐增大（曲线A）。这与我们的假定是一致，p300浓度越大，在电极表面参与乙酰化的P1就越多，随后在乙酰化位点阻止CPY催化消化的P1也越多，这将导致通过CB[8]辅助多肽模板化的P2-AgNPs数量增加，产生的电信号增强。（曲线B）展示了峰电流绝对值与p300浓度之间的相关性，从0.1 nM 到 50 nM，峰电流绝对值与p300浓度之间展示出了很好的线性相关（曲线B插图），线性回归方程：y=1.184+0.2044x(r=0.999)，y为峰电流绝对值(μA)，x为p300浓度(nM)。实验的检测限按照3σ公式，（σ为标准空白溶液的标准差），经过计算，本实验的检测限为0.055 nM，低于先前的报道。不同浓度p300活性检测重复性实验的相对平均偏差(RSDs)为3.80%，展示了本方法很好的重复性。
通过引入其它不同的蛋白质(BSA，PKA，PAD4和APN)作为对照物，我们还设计了对照实验验证本方法的选择性。如图8所示，50 nM p300得到了一个很强LSV响应，形成对照的是，相似于空白对照的低响应，非特异性蛋白甚至达到4倍浓度，响应值也很低。这个实验很显然地断定了本方法检测p300活性的选择性极高。
以上所述仅是发明的几个实施方式，应当指出，对于本技术领域的普通技术人员来说，在不脱离发明原理的前提下，还可以做出若干改进，这些改进也应视为本发明的保护范围。

Claims (9)

1.一种检测蛋白质乙酰转移酶活性的电化学方法，其特征在于：P1修饰的金电极和p300蛋白的检测体系中加入P2模板化银纳米粒子和葫芦[8]脲，通过电化学测量检测p300蛋白的活性，从而得到蛋白质转移化酶活性；所述P1的氨基酸序列为：11-巯基十一烷酸-GGGFRGKGGKGLGKGGAKA；所述P2的氨基酸序列为：FGGGASLWWSEKL。
2.根据权利要求1所述的检测蛋白质乙酰转移酶活性的电化学方法，其特征在于：所述P1修饰的金电极的制备方法：包括以下步骤：
（1）金电极在麂皮上依次用1μm，0.3μm和0.05μm氧化铝悬浊液打磨成镜面；
（2）用H2SO4:H2O2为3:1的溶液浸泡清洗；
（3）金电极分别在双蒸水和乙醇中超声清洗；
（4）金电极在50%硝酸中浸泡30min，然后在0.5M的H2SO4中电化学清洗，扫描电压从0V至1.5V，循环30次；
（5）金电极用氮气吹干，再将金电极浸入100μL，0.5μM的P1溶液，浸泡16h后，金电极温育在1mM的巯基己醇30min，之后双蒸水清洗，得所述P1修饰的金电极。
3.根据权利要求2所述的检测蛋白质乙酰转移酶活性的电化学方法，其特征在于：所述P1溶液中加入磷酸三氯乙酯。
4.根据权利要求1所述的检测蛋白质乙酰转移酶活性的电化学方法，其特征在于：所述P2模板化银纳米粒子的合成方法，包括以下步骤：将0.2mM的AgNO3和100ng/μL的P2混合在5mL的水溶液中，磁力搅拌20min；混合溶液中加入2mM的NaBH4，磁力搅拌10min，得所述P2模板化银纳米粒子。
5.根据权利要求1所述的检测蛋白质乙酰转移酶活性的电化学方法，其特征在于：所述电化学测量检测包括以下步骤：
（1）所述P1修饰的金电极于30℃温育在p300蛋白和100μM乙酰辅酶A溶液中1h，使用清洗液清洗；
（2）P1修饰的金电极浸入100μL，2.5U/mL的羧肽酶Y溶液中，室温下反应45min；
（3）使用清洗液清洗之后，P1修饰的金电极电极与10μM的葫芦[8]和P2模板化银纳米粒子反应1h，进行电化学测量。
6.根据权利要求5所述的检测蛋白质乙酰转移酶活性的电化学方法，其特征在于：电化学测量后的P1修饰的金电极用清洗液洗净，进行下次的电化学测量。
7.根据权利要求5或6所述的检测蛋白质乙酰转移酶活性的电化学方法，其特征在于：所述清洗液为20mM的Tris-HCl，所述清洗液中还含有0.1M的NaCl以及1.0%的Tween-20；所述清洗液的pH为7.4。
8.根据权利要求1所述的检测蛋白质乙酰转移酶活性的电化学方法，其特征在于：所述电化学测量检测包括线性扫描伏安法和电化学交流阻抗谱。
9.根据权利要求8所述的检测蛋白质乙酰转移酶活性的电化学方法，其特征在于：所述P1修饰的金电极作为工作电极，Ag/AgCl电极和铂电极分别作为参比电极和对电极，电化学交流阻抗谱的工作条件为：偏电压0.224V，振幅5-mV，频率范围0.1Hz至10kHz；线性扫描伏安法扫描，工作溶液1M的KCl，工作电压-0.01至0.13V。
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