CN110672590A - 基于电化学合成的Ru-MOF构建乙酰转移酶电化学发光传感器及其应用 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了一种基于电化学合成的Ru‑MOF构建乙酰转移酶电化学发光传感器及其应用。我们采用电化学辅助的自组装方法合成Ru(bpy)3 2+‑功能化MOF薄膜，合成步骤简单、时间较短，且对环境友好。Ru‑MOF的ECL信号可以被Cu(II)猝灭，加入乙酰化反应液后，乙酰化产物CoA与Cu(II)反应形成了一种铜‑巯基配位聚合物，ECL信号得到恢复。基于此，我们构建了一种电化学发光生物传感器，应用于组蛋白乙酰转移酶的检测。本发明提供的电化学发光传感器在应用中具有性能稳定、灵敏度高的优势，可广泛应用于临床、医药等领域。
Description
技术领域
本发明涉及一种电化学发光传感器及其检测方法，尤其是涉及基于电化学合成的Ru-MOF构建乙酰转移酶电化学发光传感器及其应用，属于功能生物材料和生物传感技术领域。
背景技术
表观遗传学是指DNA序列变化以外的可遗传的基因表达改变，这种影响基因转录活性而不涉及DNA序列改变的基因表达调控方式称为表观转录调控，组蛋白乙酰化修饰是基因表观转录调控的重要机制。组蛋白翻译后修饰所引起的染色质结构重塑在真核生物基因表达调控中发挥着重要的作用。组蛋白乙酰化修饰是由组蛋白乙酰转移酶(HAT)以及组蛋白去乙酰化酶(HDAC)两种酶相互协同作用，使组蛋白乙酰化修饰水平处于动态平衡中，从而达到调控基因表达的作用。其中，HAT能够催化乙酰辅酶A(Ac-CoA)的乙酰基，转移到赖氨酸残基(组蛋白)上，生成辅酶A(CoA)。最近有研究发现，肿瘤细胞的组蛋白大部分呈低乙酰化状态。组蛋白乙酰化修饰对基因表达调控及其在肿瘤发生发展中的作用具有重要意义。因此，开发一种简单，快速，低成本、选择性好的方法用于HAT活性检测是非常迫切的。
金属有机框架材料(MOFs)由金属离子或金属团簇与有机配体之间通过配位键或分子间作用力自组装形成的具有周期性网络结构的新型有机-无机杂化晶态材料，因其具有超大的比表面积和孔容积、可调的孔径和拓扑结构等，在近年来受到了广泛的关注。由于传统的MOFs合成方法在不同程度上存在着高温高压高能耗、合成时间长、合成工艺复杂、对反应设备和环境要求比较苛刻且反应过程难以控制等缺点。因此，为了克服以上缺点，寻找一种常温常压、简单易控、清洁环保的合成方法是当前MOFs合成领域的主要工作。电化学合成方法由于反应过程中的活性基团是电子，由电子直接作为反应剂参与到合成反应中去，所以是一种清洁环保的绿色合成方法，具有反应条件温和、操作简单易控制、反应时间短和转化效率高等优点，许多科学家的目光被吸引到用电化学方法来合成MOFs材料上，并且电化学合成方法具有其他合成方法无法比拟的优点。但在室温环境中，无需加热加压的条件下采用电化学法合成MOFs材料对科研工作者来说仍然是个挑战。
本发明构建了一种新型电化学发光传感器，检测HAT活性(以p300为例)。我们采用电化学辅助的自组装方法合成Ru(bpy)3 2+-功能化MOF(Ru-MOF)薄膜，合成步骤简单、时间较短，且对环境友好。这些Ru-MOF薄膜在合成过程通过原位固定在电极表面上。因为大量的Ru(bpy)3 2+分子封装在框架中，Ru-MOF作为传感平台，表现出优良的电化学发光强度(ECL)。之后通过实验我们发现Cu(II)可以淬灭Ru-MOF的ECL信号。随着乙酰化反应液的加入，乙酰化副产物CoA能够与Cu(II)反应形成了一种铜-巯基配位聚合物，使得ECL信号得到恢复。ECL强度恢复可以用(I2-I1)/I1来描述，其中I2和I1表示分别存在和不存在p300的ECL强度。基于此，实现了p300的电化学发光检测。目前，国内外还没有公开任何基于电化学合成的Ru-MOF构建乙酰转移酶电化学发光传感器及其应用的相关报道。
发明内容
本发明的目的是提出一种基于电化学合成的Ru-MOF构建乙酰转移酶电化学发光传感器及其应用。此方法首次将基于电化学合成的Ru-MOF构建的电化学发光传感器用于p300的活性检测，采用该传感器能够快速、超灵敏的检测p300的活性。
本发明解决上述技术问题所采用的技术方案为：一种基于电化学合成的Ru-MOF构建乙酰转移酶电化学发光传感器及其应用，具体步骤如下：
Electrode 1的制备：
首先将玻碳电极(GCE，直径为3mm)在麂皮上用三氧化二铝粉末(0.05μm)抛光2～8min，抛光后将电极置于超声清洗器中用二次蒸馏水中超声清洗2～8min，然后用N2吹干，得到裸玻碳电极。标记为Electrode 1。
Electrode 2的制备：
A液配制：将ZnCl2(0.9～1.8mmol，0.123～0.246g)，KNO3(0.1～0.2M，0.0303～0.0606g)，溶解在3～6mL的水中。
B液配制：将均苯三甲酸(0.5～1mmol，0.105～0.21g)，溶解在3～6mL的乙醇中。
A液和B液在室温下混合，5～10mmol的Ru(bpy)3 2+加在A和B的混合液中，在剧烈搅拌下，室温搅拌3～5h。溶液备用。将准备好的玻碳电极浸入到上述溶液中，采用电流-时间法合成Ru-MOF，电压为-1.5V～-1.30V，时间为100～600s。完成后先向电极表面滴加0.5％的壳聚糖溶液(2.5～5μL)以固定Ru-MOF。标记为Electrode 2。
Electrode 3的制备：
取Cu(II)(50～100μM，2.5～5μL)溶液滴涂于Electrode 2表面，37℃孵育5～20min，标记为Electrode 3。
Electrode 4的制备：
乙酰化反应液的配制：依次取Ac-CoA(0.1～1μL，0.1～1mM)，多肽(0.1～1μL，0.1～1mM)，HAT p300(0.1～1μL，0.01～1000nM)，加H2O至总体积2～5μL，搅拌器上剧烈搅拌2～5min至混合均匀，然后移至温度为35～40℃的水浴锅中孵育1～3h，稀释10倍备用。取2～5μL乙酰化反应液滴涂于Electrode 3表面，在37℃孵育10～30min，而后蒸馏水缓缓冲洗电极，标记为Electrode 4。
在Electrode 4制备过程中，改变p300浓度，用于传感器制备，然后如以上Electrode 1～Electrode 4步骤制备一系列传感器，用来检测不同浓度p300的电化学发光响应。
利用上述一种基于电化学合成的Ru-MOF构建乙酰转移酶电化学发光传感器，检测HAT p300活性。通过BPCL T15测量分析系统，设置高压为800V，扫描速率为100mV/s，扫描电压为0～1.35V，检测所制备电化学生物传感器在PBS(0.1M，pH 7.0，含有0.1M KCl和100mM的三乙醇胺)中对p300的电化学发光响应，获得p300对应的电化学发光大小，建立发光强度与p300浓度之间的定量关系，根据两者之间的定量关系，确定待测样品中p300含量。
发明原理：在本发明中，我们采用电化学辅助的自组装方法合成Ru(bpy)3 2+-功能化MOF薄膜(Ru-MOF)，合成步骤简单、时间较短，且对环境友好。Ru-MOF的ECL信号可以被Cu(H)猝灭，加入乙酰化反应液后，乙酰化产物CoA与Cu(II)反应形成了一种铜-巯基配位聚合物，ECL信号得到恢复。基于此，我们构建了一种电化学发光传感器，应用于组蛋白乙酰转移酶p300的检测。
相对于现有技术，本发明所述的基于电化学合成的Ru-MOF构建组蛋白乙酰转移酶电化学发光传感器及其应用具有以下优势：
(1)高灵敏度。实验得出传感器的电化学发光强度对p300对数的线性范围为0.01～500nM，线性相关方程为y＝2.49x+5.43，R2＝0.9970，检测限为0.001nM，可实现对p300的高灵敏检测。
(2)高特异性和强抗干扰能力。其他常见的酶如尿嘧啶-糖基化酶(UDG)、胆固醇氧化酶(Cho)、蛋白激酶(PKA)、碱性磷酸酶(ALP)和脲酶(Urease)等对本检测体系均无干扰。
(3)制备与检测方法试剂用量少、检测速度快、成本低。
(4)传感器可以用于p300小分子抑制剂漆树酸和C646的筛选，IC50分别为26.55μM、6.17μM，对临床诊断及药物开发意义重大。
综上所述，本发明是基于电化学合成的Ru-MOF构建的电化学发光传感器，通过电化学发光来实现p300活性检测其抑制剂的筛选，具有灵敏度高、选择性好、操作简单、分析快速、易于操作等优点，可以实现低浓度p300检测，具有良好的应用前景。
附图说明
图1为本发明传感器的可行性实验图；
图2为本发明传感器对有无p300的对比图；
图3为本发明传感器对p300的电化学发光强度对p300浓度对数的校准曲线图；
图4为本发明传感器对p300的选择性实验图；
图5为本发明传感器对p300的抗干扰实验图；
图6为本发明传感器对p300的抑制剂漆树酸的校准曲线图；
图7为本发明传感器对p300的抑制剂C646的校准曲线图。
具体实施方式
以下结合附图实施例对本发明作进一步详细描述。
实施例1 传感器的制备
本发明解决上述技术问题所采用的技术方案为：基于电化学合成的Ru-MOF构建乙酰转移酶电化学发光传感器及其应用，具体步骤如下：
Electrode 1的制备：
首先将玻碳电极(GCE，直径为3mm)在麂皮上用三氧化二铝粉末(0.05μm)抛光5min，抛光后将电极置于超声清洗器中用二次蒸馏水中超声清洗5min，然后用N2吹干，得到裸玻碳电极。标记为Electrode 1。
Electrode 2的制备：
A液：将ZnCl2(0.9mmol，0.123g)，KNO3(0.1M，0.0303g)，溶解在3mL的水中。B液：将均苯三甲酸(0.5mmol，0.105g)，溶解在3mL的乙醇中。
A液和B液在室温下混合，5mmol的Ru(bpy)3 2+加在A和B的混合液中，在剧烈搅拌下，室温搅拌3h。溶液备用。将准备好的玻碳电极浸入到上述溶液中，采用电流-时间法合成Ru-MOF，电压为-1.30V，时间为300s。完成后先向电极表面滴加0.5％的壳聚糖溶液(2.5～5μL)以固定Ru-MOF。标记为Electrode 2。
Electrode 3的制备：
取Cu(II)(50μM，2.5μL)溶液滴涂于Electrode 2表面，37℃孵育10min，电化学发光猝灭，得到的电极标记为Electrode 3。
Electrode 4的制备：
依次取Ac-CoA(0.1μL，1mM)，多肽(0.4μL，1mM)，HAT p300(0.4μL，500nM)，加H2O至总体积2μL。搅拌器上剧烈搅拌5min至混合均匀，然后移至温度为37℃的水浴锅中孵育3h，稀释10倍备用。取上述乙酰化反应液滴涂于Electrode 3表面，在37℃孵育10min，而后蒸馏水缓缓冲洗电极。标记为Electrode 4。
实施例2 可行性实验
本发明解决上述技术问题所采用的技术方案为：一种基于电化学合成的Ru-MOF构建乙酰转移酶电化学发光传感器及其应用，具体步骤如下：
(1)如实施例1制备Electrode 1～Electrode 4，并检测其在PBS(0.1M，pH 7.0，含有0.1M KCl和100mM的三乙醇胺)溶液的电化学发光响应。利用BPCL T15测量分析系统，设置高压为800V，扫描速率为100mV/s，扫描电压为0～1.35V。从图1可以看出：Electrode 2在PBS(0.1M，pH 7.0，含有0.1M KCl和100mM的三乙醇胺)中有明显的电化学响应信号，证明Ru-MOF成功合成。Electrode 4同样有明显的电化学发光响应信号，Electrode 1、Electrode 3电化学响应信号几乎可以忽略。由此证明了Cu(II)猝灭的Ru-MOF电化学发光可以被乙酰化产物CoA恢复，基于Ru-MOF构建的HAT传感器成功制备和乙酰化反应发生，说明其在理论上和技术上是可行的。
(2)利用BPCL T15测量分析系统，设置高压为800V，扫描速率为100mV/s，扫描电压为0～1.35V，研究了有无p300存在时，制备的电化学生物传感器在PBS(0.1M，pH 7.0，含有0.1M KCl和100mM的三乙醇胺)中的电化学发光响应。从图2可以看出：无p300存在时，传感器在PBS(0.1M，pH 7.0，含有0.1M KCl和100mM的三乙醇胺)中几乎无响应，即Cu(II)淬灭的电化学发光信号没有恢复；有p300存在时，传感器在PBS(0.1M，pH 7.0，含有0.1M KCl和100mM的三乙醇胺)中有明显的电化学发光响应，即Cu(II)淬灭的电化学发光信号得到恢复。证明该传感器可用于p300活性的检测。
实施例3 p300活性的检测
在实施例1Electrode 4的制备过程中，改变p300浓度，控制p300终浓度分别为：0，0.01，0.05，0.1，0.5，1，5，10，50，100，200，500，800，1000nM，如实施例1制备一系列电化学发光传感器。实验结果如图3所示，Cu(II)淬灭的电化学发光信号随着p300浓度的增加恢复的更多。传感器的发光强度对p300浓度对数值的线性相关方程为y＝2.49x+5.43，R2＝0.9970，线性范围为0.01～500nM，检测限为0.001nM，说明传感器对p300活性可实现宽范围、高灵敏检测。
实施例4 选择性及抗干扰实验
(1)选择性实验：在实施例1 Electrode 4的制备过程中，将p300替换为其它酶(尿嘧啶-糖基化酶(UDG)、胆固醇氧化酶(Cho)、蛋白激酶(PKA)、碱性磷酸酶(ALP)和脲酶(Urease))，如实施例1步骤制备一系列传感器，浓度均为500nM，blank为空白信号。结果如图4所示，与p300对比，传感器对其他酶的电化学发光恢复非常小，基本接近空白信号，说明传感器对于p300的检测有很好的选择性。
(2)抗干扰实验：在实施例1 Electrode 4的制备过程中，将其它酶(尿嘧啶-糖基化酶(UDG)、胆固醇氧化酶(Cho)、蛋白激酶(PKA)、碱性磷酸酶(ALP)和脲酶(Urease))添加到乙酰化反应液中，如实施例1步骤制备一系列生物传感器，浓度均为500nM，mixture为所有酶的混合物。结果如图5所示，电化学发光强度与仅有p300存在时的发光强度基本没有差异，说明该传感器的抗干扰能力较好。
实施例5 抑制剂筛选
(1)小分子抑制剂漆树酸的检测：在实施例1Electrode 4的制备过程中，将不同浓度的漆树酸(终浓度分别为：0，0.01，0.02，0.05，0.1，0.5，1，5，10，50，100，200，500，800，1000μM)加入到乙酰化反应液中，如实施例1步骤制备一系列传感器。根据实验结果得知(如图6)，随着抑制剂漆树酸浓度的增大，电化学发光恢复程度随之减弱，说明漆树酸对p300活性有良好的抑制作用，半抑制浓度为26.55μM。
(2)小分子抑制剂C646的检测：在实施例1Electrode 4的制备过程中，将不同浓度的C646(终浓度分别为：0，0.01，0.05，0.1，0.5，1，5，10，20，50，100，120，150μM)加入到乙酰化反应液中，如实施例1步骤制备一系列传感器。根据实验结果得知(如图7)，随着抑制剂C646浓度的增大，电化学发光恢复程度随之减弱，说明C646对p300活性的抑制作用越强，半抑制浓度为6.17μM。
当然，上述说明并非对本发明的限制，本发明也并不限于上述举例。本技术领域的普通技术人员在本发明的实质范围内做出的变化、改型、添加或替换，也应属于本发明保护范围。
Claims (5)
1.基于电化学合成的Ru-MOF构建乙酰转移酶电化学发光传感器及其应用，其特征在于，机理如下：在本发明中，我们采用电化学辅助的自组装方法合成Ru(bpy)3 2+-功能化MOF薄膜，合成步骤简单、时间较短，且对环境友好。Ru-MOF的ECL信号可以被Cu(II)猝灭，加入乙酰化反应液后，乙酰化产物CoA与Cu(II)反应形成了一种铜-巯基配位聚合物，ECL信号得到恢复。基于此，我们构建了一种电化学发光传感器，应用于组蛋白乙酰转移酶的检测。
2.基于电化学合成的Ru-MOF构建乙酰转移酶电化学发光传感器及其应用，其特征在于，具体包括如下步骤：
Electrode 1的制备：
首先将玻碳电极(GCE，直径为3mm)在麂皮上用三氧化二铝粉末(0.05μm)抛光2～8min，抛光后将电极置于超声清洗器中用二次蒸馏水中超声清洗2～8min，然后用N2吹干，得到裸玻碳电极。标记为Electrode 1。
Electrode 2的制备：
A液配制：将ZnCl2(0.9～1.8mmol，0.123～0.246g)，KNO3(0.1～0.2M，0.0303～0.0606g)，溶解在3～6mL的水中。
B液配制：将均苯三甲酸(0.5～1mmol，0.105～0.21g)，溶解在3～6mL的乙醇中。
A液和B液在室温下混合，5～10mmol的Ru(bpy)3 2+加在A和B的混合液中，在剧烈搅拌下，室温搅拌3～5h。溶液备用。将准备好的玻碳电极浸入到上述溶液中，采用电流-时间法合成Ru-MOF，电压为-1.5V～-1.30V，时间为100～600s。完成后先向电极表面滴加0.5％的壳聚糖溶液(2.5～5μL)以固定Ru-MOF。标记为Electrode 2。
Electrode 3的制备：
取Cu(II)(50～100μM，2.5～5μL)溶液滴涂于Electrode 2表面，37℃孵育5～20min，标记为Electrode 3。
Electrode 4的制备：
乙酰化反应液的配制：依次取Ac-CoA(0.1～1μL，0.1～1mM)，多肽(0.1～1μL，0.1～1mM)，HAT p300(0.1～1μL，0.01～1000nM)，加H2O至总体积2～5μL，搅拌器上剧烈搅拌2～5min至混合均匀，然后移至温度为35～40℃的水浴锅中孵育1～3h，稀释10倍备用。取2～5μL乙酰化反应液滴涂于Electrode 3表面，在37℃孵育10～30min，而后蒸馏水缓缓冲洗电极，标记为Electrode 4。
3.根据权利要求1和权利要求2所述的基于电化学合成的Ru-MOF构建乙酰转移酶电化学发光传感器及其应用，其特征在于：采用电化学辅助的自组装方法合成Ru-MOF，Ru-MOF合成步骤简单、时间较短，且对环境友好。
4.根据权利要求1和权利要求2所述的基于电化学合成的Ru-MOF构建乙酰转移酶电化学发光传感器及其应用，其特征在于：第一次将电化学合成的Ru-MOF用来检测p300活性，方法为电化学发光法，测量系统为BPCL T15测量分析系统，高压设置为800V，扫描速率为100mV/s，扫描电压为0～1.35V。
5.根据权利要求1和权利要求2所述的基于电化学合成的Ru-MOF构建乙酰转移酶电化学发光传感器及其应用，其特征在于：本发明传感器，可以实现不同浓度p300检测及其小分子抑制剂的筛选，检测限为0.001nM，其小分子抑制剂漆树酸的半抑制浓度为26.55μM，C646的半抑制浓度为6.17μM。
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