CN107109469B - 选择靶核酸序列的方法 - Google Patents

Abstract

本发明涉及用于利用核酸探针来选择靶核酸分子中的靶目标区域(ROI)的方法，该核酸探针包含能够杂交至靶核酸分子并且作为引物以用于产生该靶ROI(即，通过引物的靶模板化延伸)的互补序列的3’方向的序列，以及能够模板化该延伸的探针的环化和连接的序列，该延伸的探针包含靶ROI的反向互补序列和该探针的一部分。因此所获得的环化的分子含有靶ROI的反向互补序列并且可经历进一步分析和/或扩增等。该探针可作为包含茎环结构的寡核苷酸提供，或作为部分双链构建体提供，并且包含含有靶结合位点的单链3’末端区域。该探针中提供的第二结合位点起到环化的连接模板的作用，并且如果存在茎环结构的话，其被切割以使得该第二结合位点可用于杂交至靶互补序列。还提供了用于实施这种方法的探针和试剂盒。

Description

选择靶核酸序列的方法

技术领域

本发明涉及用于选择靶核酸序列的方法。具体地，本发明涉及利用特定核酸探针来选择靶核酸分子中的靶目标区域(target region of interest，ROI)的方法，该核酸探针包含能够杂交至靶核酸分子并且作为引物以用于产生该靶ROI(即，通过引物的靶模板化延伸)的互补序列的3’序列，以及能够模板化该延伸的探针的环化和连接的序列，该延伸的探针包含靶ROI的反向互补序列和该探针的一部分。因此获得的该环化的分子含有靶ROI的反向互补序列并且可经历进一步分析和/或扩增等。因此，本发明的选择方法提供了不仅用于选择性分离或分开所需的靶序列(ROI)，而且还用于检测靶核酸序列(ROI)或用于扩增靶序列(ROI)的方法。

背景技术

存在描述用于选择并随后扩增核酸的所选部分的若干方法。实例包括所谓的选择子探针(US 7883849，或在Drmanac等人2010.Science,327,78-81和US 8518640中所描述的基因组片段的一般环化)。

US 7883849中所描述的选择子探针被设计用于以序列特异性方式结合至所需靶序列，从而使得其能够从核酸分子中或者实际上从含有核酸分子的样品中被“选择”出来。在US 7883849的方法中，部分双链选择子探针(单个对称分子，在其两端均具有较长的链悬突(overhang)，或两个对称分子，各自仅在一端具有单链悬突)以靶特异性方式通过其单链悬突而杂交至由于核酸样品片段化产生的单链(变性的)靶片段的两端。在使用对称选择子探针的该方法的一个特定实施方式中，仅靶片段的一端杂交至选择子探针的一端，选择子探针的另一端与靶核酸片段内部杂交并且需要结构特异性核酸内切酶通过切掉突出超过内部杂交区域的靶片段的部分来拆分(resolve)所得的结构。因此，在所有的情形中，靶片段的所选部分都是通过(多个)选择子探针被设计为与之杂交的已知序列的区域(不论是末端区域，或者是一端和一个内部区域)来描绘的。在杂交之后(以及，在适当的时候，二级结构的拆分)，(多个)选择子和靶核酸片段都是通过连接而结合，从而(i)在对称选择子探针的情形中，得到环状核酸分子以及(ii)在两个对称选择子的情形中，得到位于选择子探针序列侧翼(flank)的包含靶片段的线性分子。(多个)选择子探针的双链区域含有引物对基序，其是多重检测中使用的多个不同靶特异性选择子共有的。因此，能够同时实现多个靶片段的扩增，同时避免由于使用多种不同引物对带来的扩增假象。

在US 7883849的选择方法中确认的一个特别问题是需要在选择之前仔细选择用于消化靶核酸分子的限制酶，从而避免选择能够在待查询(interrogate)的靶序列中切割靶核酸分子的酶。这在根据该方法可能的复用的程度上设置了限制，并且能够导致过长的核酸片段的扩增，从而增加分析所选靶核酸的成本。

发明内容

与现有技术所公开的方法相反，本发明并不需要在选择之前进行样品核酸的预先切割(但并不排除)，并且尤其是不需要以在靶分子中产生探针的特异性结合位点的方式进行切割。而是，本发明涉及产生单链靶核酸分子(通过探针的靶模板化延伸)的特定区域的互补序列，以及随后切割该探针并且可选地切割靶，使所得的靶核酸分子的互补序列的环化模板化。因此，本发明可被看作是最低程度地需要准确选择所使用的限制酶，在一些实施方式中，避免了准确选择所使用的限制酶的需要。因此，本发明提供了用于选择靶核酸分子的改进方法，并且允许更准确地选择待查询或待分析的序列，例如，通过测序，而不需要在其末端含有特异性探针结合位点的靶核酸分子。

因此，本发明提供了一种用于选择所需或靶核酸序列的新型探针，其提供了产生含有靶序列(更具体地，靶序列的互补序列)的环状分子的新方式。环状分子可容易地被分离和处理(例如，通过利用核酸外切酶来消化任意线性非环化核酸分子)并且也可以利用滚环扩增(RCA)或其它扩增程序容易地被扩增和/或检测。因此，其是一种提供用于进一步处理或加工或者分析或检测等的所选靶序列的非常方便的方式。

用于本发明的新型探针是单链核酸分子(即，寡核苷酸)，其能够形成在3’末端具有单链区域的茎环结构。因此，该探针包括第一靶结合位点和茎环结构，第一靶结合位点在其能够杂交至位于ROI的3’末端的侧翼的靶分子的互补结合位点的3’末端，茎环结构包含第二结合位点，其与所述ROI的5’末端侧翼的旁侧序列同源并且能够杂交至所述5’旁侧序列的互补序列，并且在该茎环结构中还包含位于所述第二结合位点的3’方向的切割位点，以使切割能够打开环(例如，茎环结构的茎或环中的切割位点)。第一靶结合位点用来通过探针的靶模板化延伸来产生靶ROI的互补序列。一旦茎环结构已通过切割被打开，第二结合位点便用作延伸的探针的环化模板。序列元件(或间隔序列或元件)可位于第一靶结合位点和茎环结构之间，在茎环结构的环(例如，在环的5’末端处)中，或茎环结构的5’方向，以使得各种下游应用能够进行或便于各种下游应用，例如，作为标签的元件或者检测或鉴定序列或者用于靶序列/ROI的捕获(例如固定化)或扩增的序列，例如，检测或ID标签或基序(例如，条形码等)，检测探针或引物或者扩增引物的结合位点，或能够结合至互补序列或同源结合伴侣的捕获(或“锚定”)序列，例如，在固体支持物上提供的。这样的元件(或标签)也可以存在于茎环结构的茎序列中，并且因此当其被环化时将被结合到核酸中(例如，当该元件或标签在茎环结构中的切割位点的3’方向时)。

在探针延伸以产生包含ROI的靶互补序列之后，将靶分子除去，以留下延伸的探针。尽管这可以以多种方式进行，但探针/靶杂交体可被方便地变性。可见，在这样的实施方式中，当探针经历结合于靶分子、靶分子的延伸和去除的步骤时，茎环结构用来将探针的各特定区域(尤其是环中的第二结合位点)结合在一起。然而，在其它实施方式中，可以以其它方式除去靶分子，例如通过酶消化(例如，利用核糖核酸酶来除去RNA靶分子)并且在这样的实施方式中，茎环结构并不是必需的并且该探针可在与靶分子接触之前被切割或者可替代地其可作为部分双链构建体提供。在这样的实施方式中，可以以不涉及变性的方式，并且尤其是不涉及探针变性的方式，除去靶分子。因此，探针的第二链上存在的第二结合位点可保留在探针中。

本发明的方法允许使用单链靶分子和靶片段，而不需要知道靶的末端序列。然而，同时避免需要创建具有靶特异性末端的片段，并且该方法不需要片段化步骤，在该方法中包括片段化步骤可以是方便的和合乎需要的。

本发明以下讨论的内容将证明靶分子的互补序列在该方法中和本发明的探针中被环化。因此，当提及环化的靶序列或靶ROI等时，在本发明的上下文中将理解其意指靶序列或靶ROI的互补序列。因此，本领域技术人员根据本文所讨论的上下文将理解，当提及靶序列或靶ROI的检测、分析等时，包括其互补序列的检测、分析等，其中检测探针可需要杂交至靶序列的互补序列(例如，当直接分析被捕获或选择的靶片段时)或杂交至“原始”靶序列(例如，当被捕获或选择的靶序列已被扩增，例如通过RCA，以使得该扩增产物含有所捕获的互补序列的互补序列时)。由于双链核酸分子是反式平行的，因此当取向为5’至3’时，互补序列可以是指反向互补序列并且这些术语在本文中可互换使用。

因此，本发明最宽泛地提供了在靶核酸分子中选择靶目标区域(ROI)的方法，在靶分子中所述ROI的侧翼具有3’旁侧序列和5’旁侧序列，所述方法包括：

(a)提供探针，该探针包含：

(i)第一靶结合位点，位于所述探针的3’末端区域处，该结合位点能够杂交至靶分子中的互补结合位点，所述互补结合位点是该ROI的3’末端侧翼的3’旁侧序列，并且其能够在靶-模板化延伸反应中被延伸以产生靶分子的互补序列，所述靶互补序列包含所述3’旁侧序列以及至少ROI和5’旁侧序列的互补序列；和

(ii)第二结合位点，其与ROI的5’末端的5’旁侧序列同源，并且能够杂交至所述靶互补序列中的所述5’旁侧序列的互补序列；

其中所述探针作为寡核苷酸提供，所述寡核苷酸包含茎环结构，其在在该结构的环中包含第二结合位点，并且进一步包含位于所述第二结合位点的3’方向的切割位点，该切割位点可切割以打开所述环，从而使第二结合位点能用于结合，所述寡核苷酸还在3’末端包含单链区域，该单链区域包括第一结合位点；或

其中所述探针作为部分双链的构建体提供，所述构建体包含第一链和第二链，所述第一链包含在其3’末端包括第一结合位点的单链3’末端区域，且所述第二链在所述第一链的5’末端杂交并且包含包括第二结合位点的单链3’末端区域；

(b)使探针与靶分子接触，并且使得位于探针的3’末端处的第一靶结合位点杂交至靶分子中的其互补结合位点，其中靶分子至少部分是单链的，且在该单链区域中包括所述互补结合位点和可选地ROI和5’旁侧序列；

(c)利用靶分子作为延伸模板来延伸探针的杂交的3’末端，以产生靶分子的互补序列；

(d)除去靶分子，留下延伸的探针，所述延伸的探针在所延伸的区域中从3'至5'包括该靶分子的5'旁侧序列、ROI和3'旁侧序列的互补序列，其中第二结合位点保留在探针中；

(e)允许延伸的探针经历分子内重排，从而使第二结合位点杂交至靶互补序列中的其互补结合位点，该靶互补序列是靶分子的5'旁侧序列的互补序列，

其中，如果所述探针包含茎环结构，则重排包含在探针的茎环结构中的切割位点处切割延伸的探针，以释放包含第二结合位点的探针的3'末端，从而产生包含第一延伸链和第二链的部分双链的构建体，所述第一延伸链包含靶互补序列，并且所述第二链杂交至在该茎中的第一链并且包含释放的3’末端，所述释放的3’末端随后能够杂交至第一链中的其互补结合位点，并且

其中，如果所述5’旁侧序列位于靶分子的5’末端的内部并且第一延伸链的靶互补序列含有5’旁侧序列的互补序列的3’方向的另外的序列，则重排包含该另外的序列中的切割或该另外的序列的切割，以释放包含第二结合位点的互补结合位点的第一链的3’末端，

以使可选地释放的第一延伸链的5’末端与可选地释放的第一延伸链的3’末端并置，以用于利用第二结合位点作为连接模板直接或间接地彼此连接；

(f)将探针的延伸链的末端直接或间接地彼此连接，以使探针的延伸链环化；

(g)扩增或分离环化的延伸链，从而选择ROI。

然而，在一个优选的实施方式中，探针作为包含茎环结构的寡核苷酸提供。

因此，在第一个特定方面中，本发明提供了在靶核酸分子中选择靶目标区域(ROI)的方法，所述方法包括：

(a)提供探针，所述探针包含茎环结构和在3’末端的单链区域，其中所述3’末端区域包含能够杂交至靶分子的互补结合位点的第一靶结合位点，所述互补结合位点是ROI的3’末端侧翼的旁侧序列，并且所述环包含与ROI的5’末端侧翼的旁侧序列同源并且能够杂交至所述5’旁侧序列的互补序列的第二结合位点，并且其中所述茎环结构进一步包含位于所述第二结合位点的3’方向的切割位点，使得该切割能够打开环；

(b)使探针与靶分子接触并使探针的3’末端处的第一靶结合位点杂交至靶分子中的其互补结合位点，其中该靶分子至少部分是单链的，且在该单链区域中包括该互补结合位点和可选地ROI和5’旁侧序列；

(c)利用靶分子作为延伸模板来延伸探针的杂交的3’末端，以产生靶分子的互补序列；

(d)除去靶分子，留下延伸的探针，所述延伸的探针在所延伸的区域中从3'至5'包括靶分子的5'旁侧序列、ROI和3'旁侧序列的互补序列；

(e)允许延伸的探针经历分子内重排，从而第二结合位点能够杂交至靶互补序列中的其互补结合位点，其为靶分子的5'旁侧序列的互补序列，其中重排包含至少在探针的茎环结构的切割位点处切割延伸的探针，以释放包含第二结合位点的探针的3'末端，从而产生包含第一延伸链和第二链的部分双链的构建体，所述第一延伸链包含靶互补序列，并且所述第二链杂交至该茎中第一链并且包含释放的3’末端，所述释放的3’末端随后能够杂交至第一链中的其互补结合位点，并且如果所述5’旁侧序列位于靶分子的5’末端的内部并且第一延伸链的靶互补序列含有5’旁侧序列的互补序列的另外的3’，则还有该另外的序列中的第二切割或该另外的序列的第二切割，以释放包含第二结合位点的互补结合位点的第一链的3’末端，以使释放的第一延伸链的5’末端与可选地释放的第一延伸链的3’末端并置，以用于利用第二结合位点作为连接模板直接或间接地彼此连接；

(f)将探针的延伸链的末端直接或间接地彼此连接，以使探针的延伸链环化；

(g)扩增或分离该环化的延伸链，从而选择ROI。

在又一方面，提供了探针用于本发明的方法中。更具体地，在这一方面中，本发明提供了用于选择靶核酸分子中的靶ROI的寡核苷酸探针，所述探针包含茎环结构和在3’末端的单链区域，其中所述3’末端区域包含第一靶结合位点，该第一靶结合位点能够杂交至靶分子中的互补结合位点，所述互补结合位点是ROI的3’末端侧翼的旁侧序列，并且所述环包含与ROI的5’末端侧翼的旁侧序列同源的并且能够杂交至所述5’旁侧序列的互补序列的第二结合位点，并且其中所述茎环结构进一步包含位于所述第二结合位点的3’方向的切割位点，以使得切割能够打开环。

在替代的实施方式中，探针作为部分双链构建体提供。

因此，在第二个特定方面中，本发明提供了在靶核酸分子中选择靶目标区域(ROI)的方法，所述方法包括：

(a)提供探针，其为具有第一链和第二链的部分双链的构建体，该第一链包含单链3’末端区域，该单链3’末端区域在其3’末端处包含第一靶结合位点，其中所述第一靶结合位点能够杂交至靶分子中的互补结合位点，所述互补结合位点是ROI的3’末端侧翼的旁侧序列，第二链在其5’末端处杂交至所述第一链，并且包含包括第二结合位点的单链3’末端区域，其中第二结合位点与ROI的5’末端侧翼的旁侧序列同源并且能够杂交至所述5’旁侧序列的互补序列；

(b)使探针与靶分子接触，并且使得位于探针的第一链的3’末端处的第一靶结合位点杂交至靶分子中的其互补结合位点，其中靶分子至少部分是单链的，且在该单链区域中包括该互补结合位点和可选地ROI和5’旁侧序列；

(c)利用靶分子作为延伸模板来延伸探针的第一链的杂交的3’末端，以产生靶分子的互补序列；

(d)除去靶分子而不使探针变性，留下延伸的探针，所述延伸的探针在所延伸的区域中从3'至5'包括靶分子的5'旁侧序列、ROI和3'旁侧序列的互补序列，

(e)允许延伸的探针经历分子内重排，从而使第二链中的第二结合位点能够杂交至延伸的第一链中的靶互补序列中的其互补结合位点，该靶互补序列是靶分子的5'旁侧序列的互补序列，其中，如果所述5’旁侧序列位于靶分子的5’末端的内部并且第一延伸链中的靶互补序列含有位于所述5’旁侧序列的互补序列的3’方向的另外的序列，则重排包含该另外的序列中的切割或该另外的序列切割，以释放包含第二结合位点的互补结合位点的第一链的3’末端，

以使第一延伸链的5'末端与可选地释放的第一延伸链的3’末端并置，以用于利用第二结合位点作为连接模板直接或间接地彼此连接；

(f)将探针的延伸链的末端直接或间接地彼此连接，以使探针的延伸链环化；

(g)扩增或分离环化的延伸链，从而选择ROI。

在又一方面，提供了探针用于本发明的方法中。更具体地，在这一方面中，本发明提供了用于选择靶核酸分子中的靶ROI的寡核苷酸探针，所述探针是具有第一链和第二链的部分双链构建体，该第一链包含单链3’末端区域，该单链3’末端区域在其3’末端处包含第一靶结合位点，其中所述第一靶结合位点能够杂交至靶分子中的互补结合位点，所述互补结合位点是ROI的3’末端侧翼的旁侧序列，该第二链在其5’末端处杂交至所述第一链并且包含包括第二结合位点的单链3’末端区域，其中第二结合位点与ROI的5’末端侧翼的旁侧序列同源并且能够杂交至所述5’旁侧序列的互补序列。

从上文中应理解，该探针不需要包含能够杂交至ROI或其互补序列的序列，即，第一靶结合位点包含能够杂交至位于ROI的3’侧翼的序列的序列。然而，在一些实施方式中，第一靶结合位点也可含有能够杂交至ROI的3’末端的一部分的序列。

然而，在其它的实施方式中，该探针(部分双链的探针或茎环探针)也可含有互补于(或能够杂交至)ROI的互补序列的序列(即，同源于ROI)，或其一部分，该序列能够在探针延伸之后杂交至ROI的互补序列。所述序列可与ROI同源，或者可与ROI的一部分(即5’部分)同源。所述序列可在探针中形成第二结合位点的一部分(或者可以形成第二结合位点)，并因此可在延伸和分子步骤之后作为环化延伸的探针的模板。根据本发明的特定实施方式，与ROI互补的序列可被视为形成全部第二结合位点或第二结合位点的一部分(部分双链的探针或茎环探针)。

在另一实施方式中，该探针可进一步包含另外的探针序列，其位于第二结合位点的3’方向，该序列与3’旁侧序列同源(在靶核酸分子中)并且因此与探针中的第一结合位点互补，其中当所述探针包含茎环结构时，所述另外的探针序列位于所述环中，或当所述探针为双链构建体时，该另外的探针序列位于第二链的3’末端处。在这样的实施方式中，该另外的探针序列可杂交至第一结合位点并且与第二结合位点一同起到连接模板的作用。图13描绘了这样的布置。

因此，以替代方式观察本发明的这些实施方式，在可替代的方面，靶核酸分子可以可替代地被定义为包含目标区域和3’旁侧区，其中探针被设计为杂交至目标区域的5’末端(或目标区域)的互补序列。根据上述讨论，可看出ROI本身，或者更有具体地其5’末端起到5’旁侧区的功能或包含5’旁侧区。

在第三个特定方面中，本发明因此提供了在靶核酸分子中选择靶目标区域(ROI)的方法，所述方法包括：

(a)提供探针，所述探针包含：

(i)第一靶结合位点，位于所述探针的3’末端区域处，该结合位点能够杂交至靶分子中的互补结合位点，所述互补结合位点是ROI的3’末端侧翼的3’旁侧序列，并且其能够在靶-模板化延伸反应中被延伸以产生靶分子的互补序列，所述靶互补序列包含所述3’旁侧序列和ROI的互补序列；和

(ii)第二结合位点，其与ROI同源，或与其5’末端同源，并且能够杂交至所述靶互补序列中的ROI或其5’末端的互补序列；

(iii)另外的探针序列，其位于第二结合位点的3’，其与3’旁侧序列同源并且与第一结合位点互补；

其中所述探针作为寡核苷酸提供，所述寡核苷酸包含茎环结构，其在该结构的环中包含第二结合位点以及该另外的探针序列，并且在第二结合位点以及该另外的探针序列的3’方向进一步包含切割位点，该切割位点可切割以打开所述环，从而使第二结合位点和另外的探针序列可用于结合，所述寡核苷酸还在3’末端包含单链区域，该单链区域包括第一结合位点；或

其中所述探针作为部分双链的构建体提供，该构建体包含第一链和第二链，第一链包含在其3’末端包括该第一结合位点的单链3’末端区域，且第二链在所述第一链的5’末端杂交，并且包含单链3’末端区域，其在该单链区域的3’末端包括第二结合位点和该另外的探针序列；

(b)使探针与靶分子接触，并且使得位于探针的3’末端处的第一靶结合位点杂交至靶分子中的其互补结合位点，其中该靶分子至少部分是单链的，且在该单链区域中包括该互补结合位点和可选地ROI；

(c)利用靶分子作为延伸模板来延伸探针的杂交的3’末端，以产生靶分子的互补序列；

(d)除去靶分子，留下延伸的探针，所述延伸的探针在所延伸的区域中从3'至5'包括该靶分子的ROI以及3'旁侧序列的互补序列，其中第二结合位点保留在探针中；

(e)允许延伸的探针经历分子内重排，从而使第二结合位点杂交至靶互补序列中的其互补结合位点，该靶互补序列是ROI互补序列或ROI的5'末端的互补序列，并且该另外的探针序列杂交至第一结合位点，

其中，如果所述探针包含茎环结构，则重排包含在探针的茎环结构中的切割位点处切割延伸的探针，以释放包含第二结合位点和该另外的探针序列的探针的3'末端，从而产生包含第一延伸链和第二链的部分双链的构建体，第一延伸链包含靶互补序列和释放的5’末端，并且第二链杂交至该茎中的第一链并且包含释放的3’末端，该释放的3’末端随后能够杂交至第一链中的其互补结合位点，并且

其中，如果所述ROI位于靶分子的5’末端内部并且第一延伸链中的靶互补序列含有ROI的3’方向的另外的序列，则重排包含该另外的序列中的切割或该另外的序列的切割以释放第一链的3’末端，该第一链的3’末端包含第二结合位点的互补结合位点，

以使可选地释放的第一延伸链的5’末端与可选地释放的第一延伸链的3’末端并置，以用于利用第二结合位点和该另外的探针序列作为连接模板直接或间接地彼此连接；

(f)将探针的延伸链的末端直接或间接地彼此连接，以使探针的延伸链环化；

(g)扩增或分离该环化的延伸链，从而选择ROI。

可参见图13中描绘了这种方法。

在更具体的实施方式中，该方法包括：

(a)提供探针，所述探针是具有第一链和第二链的部分双链构建体，第一链包含在其3’末端包含第一靶结合位点的单链3’末端区域，其中所述第一靶结合位点能够杂交至靶分子中的互补结合位点，所述互补结合位点是ROI的3’末端侧翼的旁侧序列，并且第二链在其5’末端杂交至所述第一链并且包含单链3’末端区域，该单链3’末端区域包含第二结合位点和3’方向至第二结合位点以及在该单链区域的3’末端处的另外的探针序列，其中该第二结合位点与ROI同源，或与其5’末端同源，并且能够杂交至所述ROI的互补序列或其5’末端的互补序列，并且所述另外的探针序列与3’旁侧序列同源并且与第一结合位点互补；

(b)使探针与靶分子接触，并使得探针的第一链的3’末端处的第一靶结合位点杂交至靶分子中的其互补结合位点，其中靶分子至少部分是单链的，且在该单链区域中包括该互补结合位点和可选地ROI；

(c)利用靶分子作为延伸模板延伸探针的第一链的杂交的3’末端，以产生靶分子的互补序列；

(d)除去靶分子而不使探针变性，留下延伸的探针，所述延伸的探针在所延伸的区域中从3'至5'包括靶分子的ROI以及3'旁侧序列的互补序列；

(e)允许第二链中的第二结合位点和另外的探针序列杂交至延伸的第一链中的靶互补序列中的它们的互补结合位点，以使第一延伸链的5’末端与3’末端并置，以用于利用第二结合位点和另外的探针作为连接模板直接或间接地彼此连接，

其中，如果所述ROI位于靶分子的5’末端内部并且第一延伸链中的靶互补序列在ROI的互补序列的3’方向含有另外的序列，则重排包含该另外的序列中的切割或该述另外的序列的切割，以释放包含第二结合位点的互补结合位点的第一链的3’末端；

(f)将探针的延伸链的末端直接或间接地彼此连接，以使探针的延伸链环化；

(g)扩增或分离环化的延伸链，从而选择ROI。

在另一实施方式中，该方法包括：

(a)提供探针，所述探针包含茎环结构和在3’末端的单链区域，其中所述3’末端区域包含能够杂交至靶分子的互补结合位点的第一靶结合位点，所述互补结合位点是ROI的3’末端侧翼的3’旁侧序列，并且所述环包含第二结合位点(其与ROI同源，或与其5’末端同源，并且能够杂交至ROI的互补序列、或其5’末端的互补序列)以及3’方向至第二结合位点(另外的探针序列，其与3’旁侧序列同源并且与第一结合位点互补)，并且其中所述茎环结构在第二结合位点和另外的探针序列的3’方向进一步包含切割位点，以使所述切割能够打开所述环；

(b)使探针与靶分子接触并允许探针的3’末端处的第一靶结合位点杂交至靶分子中的其互补结合位点，其中靶分子至少部分是单链的，且在该单链区域中包括该互补结合位点的和可选地ROI；

(c)利用靶分子作为延伸模板来延伸探针的杂交的3’末端，以产生靶分子的互补序列；

(d)除去靶分子，留下延伸的探针，所述延伸的探针在所延伸的区域中从3'至5'包括靶分子的ROI以及3'旁侧序列的互补序列，其中第二结合位点保留在探针中；

(e)允许延伸的探针经历分子内重排，以使得第二结合位点杂交至ROI的互补序列，或杂交至其5’末端，并且该另外的探针序列杂交至第一结合位点，其中重排包含探针的茎环结构中的切割位点处的延伸的探针的切割，该探针包含第二结合位点和另外的探针序列，从而产生包含第一延伸链和第二链的部分双链构建体，该第一延伸链包含靶互补序列和释放的5’末端，并且该第二链在杂交至茎中的第一链并且包含释放的3’末端，该3’末端随后能够杂交至第一链中的其互补结合位点，以使释放的第一延伸链的5’末端与可选的释放的第一延伸链的3’末端并置，以用于利用第二结合位点和另外的探针序列作为连接模板直接或间接地彼此连接；

(f)将探针的延伸链的末端直接或间接地彼此连接，以使探针的延伸链环化；

(g)扩增或分离环化的延伸链，从而选择ROI。

在本发明方面中，其中探针包含与ROI同源的序列，ROI可位于靶分子的5’末端，或可位于靶分子的5’末端的内部。如果ROI位于靶分子的5’末端的内部并且第一延伸链中的靶互补序列在ROI的互补序列的3’方向含有另外的序列，则重排包括该另外的序列中的切割或该另外的序列的切割，以释放包含第二结合位点的互补结合位点的第一链的3’末端(即，ROI的互补序列)。

然而，在一个具体的方面，ROI可位于靶核酸分子的5’末端并且步骤(e)包括允许第二链中的第二结合位点杂交至延伸的第一链中的靶互补序列中的其互补结合位点，以使第一延伸链的5’末端与3’末端并置，以用于利用第二结合位点作为连接模板直接或间接地彼此连接。

因此，在一个实施方式中，探针可为具有第一链和第二链的部分双链构建体，该第一链包含在其3’末端处包含第一靶结合位点的单链3’末端区域，其中所述第一靶结合位点能够杂交至靶分子中的互补结合位点，所述互补结合位点为ROI的3’末端侧翼的旁侧序列，并且第二链在其5’末端杂交至所述第一链并且包含单链3’末端区域，所述单链3’末端区域包括第二结合位点和3’方向至第二结合位点以及在单链区域的3’末端的另外的探针序列，其中第二结合位点与ROI的5’末端同源，或与ROI同源，并且能够杂交至所述ROI的互补序列或其5’末端的互补序列，并且所述另外的探针序列与3’旁侧序列同源并且与第一结合位点互补。

在另一实施方式中，探针可包含茎环结构和在3’末端的单链区域，其中所述3’末端区域包含第一靶结合位点，其能够杂交至靶分子中的互补结合位点，所述互补结合位点为ROI的3’末端侧翼的3’旁侧序列，并且所述环包含第二结合位点(其与ROI的5’末端同源或与ROI同源，并且能够杂交至ROI的互补序列或其5’末端的互补序列)以及3’方向至第二结合位点(另外的探针序列，其与3’旁侧序列同源并且与第一结合位点互补)，并且其中所述茎环结构在第二结合位点和另外的探针序列的3’方向进一步包含切割位点，以使得切割能够打开环。

探针以选择的方式通过其，末端结合至靶核酸分子中的互补结合位点，其中该互补结合位点为ROI的3’末端侧翼的旁侧序列。探针的靶模板化延伸允许产生包含ROI和旁侧序列的“所选的”靶序列的互补序列。随后至少在探针的茎环结构中的切割位点处(例如，在探针的茎或环中)切割延伸的探针，并且通过在探针-模板化连接中的延伸的链末端的连接来进行环化。

通过提供具有第一靶结合位点的探针来选择靶ROI，第一靶结合位点结合至(即，能够杂交至)靶ROI侧翼的区域(3’旁侧序列或“互补结合位点”)，这有利于产生靶核酸分子的互补序列链，即，该靶ROI和旁侧序列(ROI每一侧的序列)。为了使延伸的探针(含有ROI的互补序列)能够被环化，通过茎环结构的环中或双链探针的第二链中的核苷酸序列来提供同源于靶ROI侧翼的5’旁侧序列(或“同源序列”)的第二结合位点，其结合至(即，能够杂交至)5’旁侧序列的互补序列。因此，探针的第一靶结合位点的互补序列以及探针中的第二结合位点的序列定义了被“选择的”靶核酸分子的区域，并且靶ROI是两个旁侧序列之间的序列。或者可认为，靶核酸分子的区域的互补序列被“选择”，其通过第一靶结合位点和第二结合位点的互补序列的序列来定义。因此，探针的第一靶结合位点和第二结合位点的序列确定了靶核酸分子的区域，其“被选择”并且结合至环化的核酸分子中。

在本发明的某些实施方式中，5’旁侧区可与ROI或其部分重叠，或者包含ROI或其部分(即，ROI的5’部分)。换言之，ROI或其5’部分可包含或含有该旁侧区(全部或部分)。换句话说，ROI可被看作本文中所定义的5’旁侧区或者可以起到本文中所定义的5’旁侧区的作用，即，ROI的互补序列可杂交至第二结合位点从而形成可环化的结构以用于连接。因此，在一个特定的实施方式中，5’旁侧区可被看作位于ROI内，尤其是位于ROI的5’末端处，以使ROI的互补序列在其3’末端包含互补于5’旁侧区(因此互补于ROI的5’末端)的序列，该序列可杂交至探针的第二结合位点中的其互补序列。因此，ROI的互补序列，或其一部分可杂交至第二结合位点，以使探针的第一延伸链的3’末端与5’末端并置以用于连接。为了进行探针的环化，必须除去靶核酸分子(即，必须破坏探针和靶之间的相互作用，例如，变性)以留下延伸的探针，所述延伸的探针包含靶核酸的互补序列和自由3’末端。此外，当探针包含茎环结构时，茎环结构3’方向至第二结合位点被切割，其打开了茎环结构并导致形成包含第一延伸链(其也被看作“可环化的链”)和第二链(其可被看作“连接模板链”)的部分双链构建体，其中第一延伸链包含靶互补序列(即，互补于靶核酸的序列)，且第二链通过“茎”区杂交至第一链并且包含释放的3’末端(其包含第二结合位点或同源序列)。茎环结构的茎区可被定义为具有第一(即，3’)链和第二(即，5’)链，或者“茎序列”，其杂交以形成茎环结构的茎。第一延伸(可环化的)链还包含5’末端，其通过切割而被释放(“释放的5’末端”)。该末端在切割后保留的茎结构中方便地杂交。因此，术语“释放的5’末端”并不意味5’末端是自由的；其可被杂交至构建体中的第二链。术语“释放的”仅表达该5’末端是切割后的探针/链的5’末端。探针的释放的3’末端(尤其是构建体中的第二链的)是释放的自由3’末端。因此，在切割探针的茎环结构时，第一茎序列形成可环化的链的部分并且第二茎序列形成连接模板链的部分。该部分双链构建体中的每条链(即，打开的茎环结构)包含3’悬突，并且该链通过来自茎环结构的茎的第一茎序列和第二茎序列(即，在切割前形成茎环结构的茎的序列)杂交。该“茎结构”(即，部分双链的构建体)的第一链(即，延伸的链或可环化的链)的3’悬突包含靶分子的互补序列(包括位于靶ROI的侧翼的5’旁侧序列的互补序列)。该“茎结构”的第二链(即，连接模板链)的3’悬突包含第二结合位点(或同源序列)，其能够杂交至位于靶ROI的侧翼的5’旁侧序列的互补序列。因此，该部分双链核酸构建体的3’悬突区包含彼此互补的序列的区域并且允许该构建体经历分子内重排，以使该部分双链构建体的第一链(即，可环化的链)的3’末端与5’末端并置以用于(直接或间接)连接，其通过该部分双链构建体的第二链(连接模板链)来模板化。更具体地，第一链(可环化的链)的分子内连接通过探针的第二结合位点(或同源序列)被模板化，其形成部分双链构建体的第二链(连接模板链)的部分。图1中描绘了本发明探针的机制的一个实例。

当探针为部分双链构建体时，显然延伸的探针(即，包含第一延伸链和第二链，其中第一延伸链包含至少ROI的互补序列，且第二链包含至少第二结合位点，所述第一链和第二链通过互补序列的区域杂交)类似于包含如上所述已在茎环结构的3’方向至第二结合位点被切割以释放第一链的3’末端的延伸的探针。因此，该部分双链核酸构建体的3’悬突区包含彼此互补的序列的区域并且允许该构建体经历分子内重排以使该部分双链构建体的第一链的3’末端与5’末端并置以用于连接，通过该部分双链构建体的第二链被模板化。

因此，当延伸的(可环化的)链的3’末端被杂交至连接模板链的第二结合位点时，可发生探针的延伸(可环化的)链的末端的直接或间接连接。然而，在一些实施方式中，靶ROI侧翼的5’旁侧序列可位于靶核酸分子的5’末端的内部，这意味着在探针结合和延伸后形成的延伸产物将包含在其3’末端的不与茎环结构内的第二结合位点或第二探针链互补的区域(即，延伸的探针将含有与5’旁侧序列之外的区域互补的区域)。因此，当靶核酸分子包含位于其5’末端内部的5’旁侧序列时，为了使连接发生，有必要除去与5’旁侧序列之外的区域互补的序列(例如，通过切割，如利用3’核酸外切酶)(参见图5)。

因此，探针的延伸产生了分子内互补序列的区域，即，在延伸的探针的3’末端处或朝向延伸的探针的3’末端的区域，其互补于第二结合位点(同源序列)。然而，这些互补区域不能发生相互作用，直至将靶核酸除去并且已经通过切割打开茎环结构(如果存在的话)，从而减少发生非特异性连接的机会。

因此，在最宽泛的意义上，本发明的探针包含如上文所定义的第一靶结合位点和第二结合位点，但可以可选地包含另外的位点或区域，例如，能够结合至靶核酸分子的区域或与靶核酸分子同源的区域，和/或使各种下游应用能够进行或有助于各种下游应用的另外的序列元件。然而，其中基于其3’和5’旁侧序列选择靶ROI的本发明的方法并不依赖于任何另外的元件的存在，提供另外的元件是为了有助于本发明方法的一个或多个方面，并且将在下文中更加详细地讨论。图1-5和图10-13中示出了代表性的探针结构(design)及其作用方式。

如上文中所提到的，当延伸链(即，可环化的链，其为部分双链“开放”构建体的第一链)的3’末端和5’末端直接连接在一起时，探针的分子内连接可以是直接的，或者当延伸的(可环化的)链的3’末端杂交至具有间隔(space)(即，空位(gap))或在其与延伸链的5’末端之间具有间插序列的探针中的第二结合位点(连接模板链中)时，可以是间接的。如在下文中将要更详细描述的，这可在当另外的序列元件(或“间隔序列”)被引入探针中时发生。在这样构造中，延伸链末端之间的空位将通过“空位”寡核苷酸或者通过片段的3’末端的杂交被填充，其中“空位”寡核苷酸杂交至位于探针中的第二结合位点与第二茎序列(即，模板连接链的茎序列，其为部分双链“开放”构建体的第二链)之间的间隔序列(即，间插序列)。可提供空位寡核苷酸预杂交至探针中的间插序列或间隔序列，或者分别加入，例如，在本方法过程后期。也可以在一个或多个部分中提供。

所选的靶ROI可以是靶核酸分子中的任何所需的序列或子序列。因此，可替代地，ROI可被称作靶核酸分子中的"靶序列"。例如，其可以是需要扩增的样品中的核酸的一个区域。

术语"选择"在本文中广泛被使用，并且包括例如从含有其它核酸分子尤其是其它DNA或RNA的核酸样品，除了靶核酸分子之外或确实从含有靶ROI的较长核酸分子中选择、分离和/或分开目标核酸序列的任何含义。

因此，靶核酸分子为含有靶ROI的任何核酸分子。如在下文中将更详细讨论的，其因此可以是基因组分子或其片段，或任意类型的合成或人工核酸分子。在优选的实施方式中，该核酸分子为RNA分子或其片段。因此，如果不是实际物理上的，“选择”涵盖事实上从样品中存在的其它核酸，和/或从其余靶分子中“分离”靶ROI(或者更具体地，其互补序列)任何含义。环化的探针中所含有的所选ROI的互补序列可经历扩增，例如，通过众多已知的核酸扩增方法之一，来扩增ROI，例如用于检测该ROI或使得能够进行进一步分析，例如，通过测序或通过物理分离，如捕获，例如通过固定于固相体，可选地随后通过扩增。

因此，本发明的方法可以包括分析ROI(即，包含在环化探针或其扩增子中的所选的ROI的互补序列)的另外步骤。如将在下文中更详细讨论的，这可以通过测序，或通过序列分析方法(例如，检测ROI中是否存在序列变体或特定的(多种)核苷酸)，或通过检测探针至ROI的杂交，可选地具有进一步检测和/或信号扩增步骤来进行。

这样的分析步骤将使靶ROI得以被检测，例如在含有核酸的样品中。因此，在一个实施方式中，该靶ROI可以是靶分析物。

因此，从又一个方面能够看出，本发明提供了检测靶ROI的方法，例如利用本发明的探针来结合至含有ROI的靶核酸分子并如前文所述选择该靶ROI。

术语“检测”在本文中也被广泛使用，并且包括鉴定、检测或确定或分析靶ROI的存在的任何含义，或者包括分析该靶ROI的任何含义。术语“检测”涵盖靶ROI的直接分析(即，靶ROI的全部或任意部分的测序)。

本发明的方法可以以“单一(simplex)”形式实施，以富集(enrich)单个靶ROI(即，单一种类的靶ROI，其通常存在于许多复制中)或用于多个靶ROI，其在序列中十分类似，或者充分类似或完全相同地位于序列侧翼，从而可以利用相同的探针对它们进行选择。在本文上下中，可以看出，如与探针有关的所使用的术语“单一(single)”意指特定靶ROI的语境中的单一，即，每个靶ROI(即，单个探针/靶ROI)使用一种探针(或者更具体地为一种或一类探针)。根据上文描述，显然“单一”探针意指单一种类的探针，而不是指对所使用的探针分子的实际数量的任何限制。

或者，多种(即，多种类型的)探针可以以“多倍”形式同时用于富集多种靶ROI，其可以是相同的，或者通常是不同的靶分子。因此，上文所定义的本发明后一方面是用于选择多种靶ROI，其中提供了多种探针，每一种被设计为选择不同的靶ROI在。在这样的实施方式中，每一种探针可具有不同的第一靶结合位点和/或第二结合位点，例如，在其茎环中或在第一链和第二链的3’末端区域处的单链区域中，即，探针具有不同的靶特异性。在这样的多倍方法中，对于多种靶ROI的每一种(即，每种不同类型或种类的靶ROI)，可以使用单一(即，意指单一种类的)探针。因此，可以使用多种探针，对于每一个靶ROI都具有(不同的)探针。因此，在一个实施方式中，每一探针具有不同的第一靶结合位点和/或第二结合位点，从而可以选择多种不同的靶核酸分子(以及因此多个不同的靶ROI)。在另一个实施方式中，可以选择相同靶分子(例如，其中靶分子来源于多种来源)中的不同ROI。在又一个实施方式中，可以使用相同的探针(即，包含单一组的第一和第二结合位点)来检测可能存在于来源于多种(各种)不同来源的相同靶核酸分子中的多种不同靶ROI。

本文中使用的术语“多种”意指2种或更多种(或至少2种)，更具体地指3种或更多种(或至少3种)，或4、5、6、8、10、15、20、30、50、70或100或更多种，等。在某些实施方式中，甚至可以使用更大数量的探针并且可以检测非常多个不同的靶ROI，例如，500、1,000、2,000、5,000或10,000或更多个。例如，可同时使用10、100、1,000或10,000种不同的探针，来分别检测或富集10、100、1,000或10,00种不同的靶ROI。

靶ROI可以是期望被检测、分析或扩增的任意序列，例如核苷酸序列或核酸序列或核酸分子或核苷酸序列池中的其所选部分，例如基因组核酸(人或任意来源)，来自于转录组或任意其它核酸(例如，细胞器核酸，即，线粒体或质体核酸)，天然存在的或合成的。因此，靶核酸分子可以是任意种类的核酸分子。因此其可以是DNA或RNA，或其修饰的变体。因此该核酸可由核糖核苷和/或脱氧核糖核苷以及能够参与沃森-克里克(Watson-Crick)型或类似碱基对相互作用的合成核苷酸组成。因此，该核酸可以是或可以包含，例如，亚硫酸氢盐转化的DNA、LNA、PNA或含有非核苷酸骨架的任意其它衍生物。因此，该靶分子或ROI可以是编码或非编码DNA，例如基因组DNA或其子部分，或者可以来源于基因组DNA，例如，其复制或扩增子，或其可以是cDNA或其子部分，或其扩增子或其复制等等。或者，该ROI或靶分子可以是或可以来自于编码(即，前体mRNA(pre-mRNA)或mRNA)或非编码RNA序列(例如tRNA、rRNA、snoRNA、miRNA、siRNA、snRNA、exRNA、piRNA和长ncRNA)。在优选的实施方式中，该靶核酸分子为RNA分子。在尤其优选的实施方式中，该靶核酸分子为微小RNA(miRNA)。

在某些实施方式中，定义了靶分子的5’末端。因此，期望该靶分子的5’末端是已知的和/或包含ROI的5’末端以用于检测。在这种情况下，5’旁侧序列可以是(即，可形成或提供)该分子的5’末端。在其它的实施方式中或在其它的方面，ROI的5’末端可以是(即，可形成或提供)该分子的5’末端。这样的靶分子尤其包括RNA分子，例如，miRNA分子或转录本或mRNA分子。因此，该定义端可以是miRNA分子的5’末端或转录本的5’末端。

探针可类似地由上文中详细描述的任意核酸组成，或可以包含上文中所述的任意核酸。靶ROI的序列可以是未知的，条件是靶ROI侧翼区域的序列已知，从而便于设计探针，该探针必须能够杂交至3’旁侧序列以及5’旁侧序列的互补序列，如上文所定义和解释的。然而，在某些实施方式中，靶ROI的序列可以是已知的，例如，当探针含有与ROI同源的第二结合位点时，或者该ROI包含5’旁侧序列时。因此，为了设计在本发明方法中使用的探针，位于第一结合位点的互补序列5’的序列必须是已知的。这可以是5’旁侧区，或ROI或其一部分。

本发明的方法要求核酸探针是延伸的从而“选择”靶目标区域，由此靶核酸分子起到延伸模板的作用以产生靶核酸分子的互补序列(即，所见的5’至3’反向互补序列)。任何适合的聚合酶都可用于本发明的方法中，例如RNA聚合酶(DNA→RNA)、DNA聚合酶(DNA→DNA)或逆转录酶(RNA→DNA)。然而，探针的3’末端的延伸所需的特异性核酸聚合酶可取决于靶核酸分子的性质、靶ROI的大小、以及在所选靶ROI上将要实施的分析的性质。

靶ROI的大小不是关键性的且可以在宽范围内变化。因此，在本发明的一个实施方式中，靶ROI的长度可为至少10个核苷酸，并且优选为至少15个核苷酸。因此，靶ROI的长度可为至少20、25、30、40、50、60、70、80或90个核苷酸。也可以预见可用本发明的方法来选择较长的靶ROI，例如靶ROI的长度为至少100、150、200、300或400个核苷酸，或者长度长达500、1,000、1,500、2,000、2,500、3,000、5,000、10,000、25,000、50,000或100,000个核苷酸。尽管核酸环的RCA可随着环尺寸的增加(例如，5,000或10,000个核苷酸以上)而效率下降，但其仍是可行的。因此，ROI长度的代表性范围包括从10、12或15中的任一个至高达100,000、50,000、25,000、10,000、5,000、2,000、1,000、800、750、700、600或500中的任一个数量的核苷酸。在特定的实施方式中，该尺寸范围可以是从10、12或15中的任一个至500、400、300、200、100或50中的任一个数量的核苷酸。

靶核酸分子可存在于样品中。期望从其中选择靶ROI的样品可以是含有任意数量核酸、来自于任意来源或用任意起源的任何样品。因此，样品可以是临床或非临床样品，并且可以是其中可存在靶核酸分子的生物学的、临床的或环境样品。更具体地，该样品可以是含有核酸的任何样品。该靶核酸分子可以以单链或部分单链或以双链形式存在。然而，如上文所述，为了实施该方法，需要该靶分子至少在探针杂交的区域中是单链的。因此，如下文中进一步讨论的，在必要时，该方法可包括使靶核酸至少部分是单链的步骤。

如上文所述，通过本文所述的方法来选择靶ROI需要除去靶核酸分子，之后延伸探针的杂交的3’末端从而得到靶核酸分子单链的互补序列。可通过本领域已知的任何适合的方法来除去靶核酸分子，这取决于靶核酸的类型、大小和性质。例如，可以通过变性(例如，通过改变样品或测定中的条件，例如通过加热，或者改变组分(例如盐)的浓度，或者通过加入变性物质或变性剂，例如脲，或者任何其它的变性剂或促溶剂)和/或通过靶核酸分子的链特异性化学或酶促降解来除去靶核酸分子。

如上文所述，当探针作为部分双链构建体提供，或者当在与靶分子接触之前切割探针时，以这样的方式进行或实施除去靶分子的步骤以使得探针中保留第二结合位点。因此，在这种情形下，不使用将会导致探针变性的方法。在实践中，这意味着不使用变性方法，尤其是不使用热变性。因此，对于RNA靶分子来说，利用部分双链探针或在靶接触之前切割探针的方法是尤其有用的，因为杂交的RNA分子可被容易地除去，同时保留延伸的探针完好无损。因此，当不需要或不使用变性来除去靶分子时，包含茎环结构的探针可被切割以在该方法开始时打开环，例如，在与靶接触之前，或者更一般地，在接触步骤、延伸步骤或去除步骤之前、期间或之后。

例如，可利用碱法水解或RNA酶消化来降解RNA靶核酸分子，或者可利用绿豆核酸酶来降解单链DNA靶分子。在靶核酸分子为RNA的实施方式中，发现任何适合的RNA酶都可用于本文所述的方法。在尤其优选的实施方式中，靶核酸分子包含RNA且除去靶分子的步骤包含碱法水解，例如，使样品或测定与碱(例如NaOH或KOH)接触，其可使靶核酸与延伸的探针之间的双链体变性并且还可降解靶核酸。除了变性步骤之外(即，之前，与之同时或之后)，也会发生靶核酸分子的降解。因此在一些实施方式中，除去靶核酸分子的步骤可以包括使靶核酸与延伸的探针之间的双链体变性的第一步，以及随后的降解(即，选择性降解)靶核酸分子的第二步。

分离步骤可以可选地在除去靶核酸分子之后，或者作为除去靶核酸分子的一部分采用，以确保在继续本发明方法之前样品中不存在靶核酸分子。分离可以包括明确除去不想要的靶核酸分子或分离延伸的探针的任意方法，例如通过将探针固定在固相体上，用合适的缓冲液洗涤样品，凝胶电泳，高效液相色谱法(HPLC)或优先沉淀靶核酸分子或延伸的探针。因此在一些实施方式中，除去靶核酸分子的步骤可以包括将延伸的探针从样品中的其它核酸分子分离。可替代地来看，该方法可包括从样品中的其它组分(例如，其它核酸分子，尤其是靶核酸分子)分离或纯化(部分或全部地)延伸的探针的步骤。

在上述方法的一个实施方式中，可原位检测靶ROI，因为其天然存在于样品中的核酸分子中。在这样的实施方式中，靶核酸分子可在样品中的固定的、可检测的或可见的位置处存在于样品中。因此，样品可以是反映了靶核酸分子的正常或天然(“原位”)定位的任何样品，即，正常或天然存在的任何样品。这样的样品有利地为细胞或组织样品。尤其优选的是例如其中可检测靶ROI以展现靶ROI相对于样品的其它特征的定位的经培养或收获的或活检的细胞或组织样品。还有细胞或组织制备，这样的样品还可以包括，例如，脱水的或固定的生物学流体，以及核质(例如染色体/染色质制备)，例如，在显微镜载玻片上。样品可以是新鲜制备的，或者它们可以是以任何方便的方式预先处理的，例如通过固定或冷冻。因此，可使用新鲜的、冷冻的或固定的细胞或组织，例如，FFPE组织(福尔马林固定石蜡包埋)。

因此，代表性的样品可以包括可含有靶核酸分子的任何材料，包括例如食品或类似产品、临床和环境样品等。该样品可以是生物学样品，其可含有任何病毒或细胞材料，包括所有的原核或真核细胞、病毒、噬菌体、支原体、原生质体和细胞器。因此，这样的生物学材料可以包含所有类型的哺乳动物和非哺乳动物细胞、植物细胞、藻类(包括蓝绿藻)、真菌、细菌、原生动物等。因此，代表性的样品包括临床样品，例如，全血和血源产品例如血浆、血清和白细胞层、血细胞、其它循环细胞(例如，循环肿瘤细胞)、尿液、粪便、脑脊髓液或任何其它体液(例如，呼吸道分泌物、唾液、乳汁等)、组织、活检以及其它样品例如细胞培养物、细胞悬液、条件培养基或细胞培养物构成的其它样品等。

尽管本发明的方法可用于在原位(即，天然的)环境中来选择靶核酸分子中的靶ROI，但也考虑了该方法可被用于在体外检测系统中选择靶核酸分子中的靶ROI，即，当靶核酸分子已从其天然环境中被分离或纯化时。因此，该样品可以是核酸分离过程或细胞裂解过程的直接产物，或者可以以一些方式将其进一步分解或纯化，例如，其可以含有已经从其天然环境中被部分或全部分离的核酸。也可以用任意方式处理样品，(例如)以产生RNA分子的cDNA逆转录本。

尽管片段化步骤不是必需的，但在某些靶核酸分子或某些样品中，例如在基因DNA的环境中，在该方法中包括片段化步骤是合乎需要的或者方便的，这样使得该样品或靶分子中的核酸在探针杂交之前被片段化。这可以在样品或靶核酸分子与探针接触之前、同时或基本同时发生。如上文中所提到的，当靶分子为双链时，需要使分子至少部分为单链的步骤。该步骤可与片段化步骤分开，例如，在片段化之后，但也可以作为片段化步骤的一部分发生。片段化可以是需要的或者有帮助的，以允许制备至少部分单链的核酸。

在本文中广泛使用的术语“片段化”包括样品中的核酸或者更具体地靶分子可被片段化或切割的任何方法。因此，片段化可以以酶解法进行，例如，利用限制性或其它核酸内切酶或核酸酶(例如DNA酶)，和/或物理法进行，例如，通过雾化或超声或基于剪切的方法。这样的物理方法会导致不可预期的非序列特异性片段化，就像用某些(非限制性)核酸内切酶的那样。因此，随机的和预定的(或位置特异性)片段化均包括在内，但后者不是必需的。“片段化”还包括固有地作为样品老化的结果存在的核酸样品的片段化，其储存的条件和样品任意处理(例如，固定，如在福尔马林固定的石蜡包埋的样品中)以及降解这些因素所造成的。可以使用任意合适种类的限制性核酸内切酶，包括一种或多种II型酶。或者，可利用瓣状核酸内切酶(flap endonuclease，FEN)来实现片段化，其中利用添加的核酸或寡核苷酸来产生用于例如结构特异性核酸内切酶的底物的结构，即，具有突出的非杂交的5’末端区域的结构。片段化方式可以组合使用，例如，两种或更多种核酸内切酶一起使用，更具体地两种或更多种限制性核酸内切酶一起使用，或者酶促方式和物理方式一起使用。此外，核酸样品在单个等分试样中可以是不同片段化的，然后该等分试样被合并并且一起经历本发明方法的其余步骤。在某些情形下，利用单一限制性核酸内切酶进行片段化是适当且足够的，但在其它情形下，可优选使用另外的限制性核酸内切酶。

因此，可通过将核酸样品分离成多个等分试样并且用不同的方式或不同方式的组合来片段化各等分试样来实现片段化，这样的方式例如是限制性酶。样品的任意数量的等分试样可被不同地处理，例如，2种或更多种，或3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15或20或更多种等。然后，使等分试样经历该方法的其余步骤并且可将其合并，例如在步骤(b)之前。

在靶分子可与探针杂交之前，其必须是至少部分单链的。如果有必要，这可以通过本领域已知的任何方式实现，例如变性，例如，通过热或pH，或通过使用化学试剂，例如碱。优选热变性。

因此，如果有必要，在任意片段化步骤之后或者与其同时，可以使样品中的核酸(包括靶核酸分子)为至少部分单链的，以允许探针在步骤(b)中发生杂交。当核酸分子不被制成全部是单链时，则需要其至少在包含(多个)探针互补部分的(多个)部分中是单链的(从而允许结合至探针)，即，靶核酸分子的互补结合位点是单链的以允许探针的第一靶结合位点结合。在一些实施方式中，尤其优选起到探针延伸模板的作用的5’方向至探针结合位点(互补结合位点)的区域是单链的。然而，在一些实施方式中，5’方向至探针结合位点(互补结合位点)的区域可以是双链的，例如，当使用链置换聚合酶，例如phi29(即，具有链置换活性的聚合酶)来延伸探针时。具有链置换活性的聚合酶是本领域中已知的并且发现任何适合的链置换聚合酶均可用于本发明的方法中。此外，通过变性，至少部分单链化可通过利用适当的3'或5'核酸外切酶来进行3'或5'核酸外切酶降解来实现。在自由双链片段端处开始，这样的酶逐渐降解或消化双链核酸的一条链，剩下互补链并使得该核酸单链沿着酶作用的长度。核酸外切酶降解的程度(即所得单链区域的长度)可通过反应的时长来控制。选择核酸外切酶反应的时长以使得片段的链的一端的适当长度被除去。消化的程度必须足以允许与探针杂交。适合的核酸外切酶是本领域已知的，并且包括例如，核酸外切酶III(3')和λ核酸外切酶(5')。

此外，在某些应用中，例如原位过程，靶核酸分子的双链体可以被打开以允许探针杂交，而不使核酸完全变性。出于这种目的的过程是本领域中已知的。

在一些实施方式中，可以通过RCA来检测环化的链，其中其可用于促进RCA产物向其天然位置的定位，例如，使得RCA产物在样品中起到靶核酸分子的定位标志物的功能。例如，RCA产物可通过将RCA产物固定至靶核酸或在靶核酸附近而固定至样品。下文中进一步描述了固定RCA产物的方法。然而，在一个代表性实例中，探针可以包含间隔(间插)序列，其起到锚定或捕获序列的功能。在一些实施方式中，捕获序列可以形成探针的连接模板链的一部分并且可包含能够直接或间接结合至靶核酸分子或其互补序列的序列。更具体地，捕获序列可在远离ROI和旁侧序列的位点处结合至靶分子，例如，捕获序列可互补于靶核酸或其互补序列(例如，如果靶核酸是双链分子，例如DNA，例如，基因组DNA)，例如，互补于ROI的侧翼区域或ROI旁侧序列之一的序列(例如，ROI的3’末端侧翼的旁侧序列侧翼的序列)。因此，在除去靶分子的步骤之后(即，在上述方法的步骤(d)之后)，捕获序列可杂交至靶分子从而将连接模板链直接固定至ROI位点处的位置或其附近。由于连接模板链也可以起到RCA引物的作用，因此随后的RCA产物可被定位在ROI位点处或其附近。或者，捕获序列可以互补于捕获寡核苷酸，该捕获寡核苷酸含有互补于靶核酸或其互补序列的序列区域并且因此能够将探针固定在靶核酸分子上，并且因此将RCA产物间接固定在靶核酸分子上。应该理解，当存在第二切割(即，当5’旁侧序列(或ROI)位于靶分子的5’末端内部时)时，捕获序列将位于探针中的第二切割位点的内部的位点或位置处(参见下文进一步描述)。这样的捕获序列可被看作是锚定序列。具体地，这样的捕获序列起到捕获或锚定延伸的探针的作用，或者更具体地捕获或锚定延伸的探针的扩增产物。因此，这可看作是定位序列，尤其是用于延伸的探针的扩增产物的定位序列。

在另一代表性实施方式中，RCA的引物可以单独提供，其中该引物含有能够杂交至探针的环化链的序列和能够杂交至靶核酸或其互补序列的序列，例如，互补于ROI的侧翼区域或ROI旁侧序列之一的序列。因此，在RCA时，RCA产物将被固定在靶分子上，例如在ROI处或其附近，例如靠近ROI。

在一些实施方式中，不必积极固定该RCA产物(例如)至靶核酸分子，从而产生原位定位的信号(参见例如，实施例2和图8)。在这一方面，不想受到理论的束缚，假设RCA产物迅速变得过大从而容易远离其来源分散，即，RCA产物被定位在其细胞来源但其并不会直接或间接固定(例如)于靶核酸或靶核酸附近。

本发明的探针可以采用许多不同的设计。作为最简化的方式，如图1中所示，探针为在3’末端包含单链区域的发夹或茎环探针，其中第一靶结合位点和第二结合位点通过茎环的茎分离。因此，该探针包含至少一个第一3’靶结合位点、茎环结构、第二结合位点的3’端，其中第一3’靶结合位点能够杂交至靶ROI的3’末端侧翼的旁侧序列，茎环结构包含与靶ROI的5’末端侧翼的旁侧序列同源的第二结合位点和茎环结构内(例如，在茎或环内)的切割位点。然而，可采用探针的进一步设计，其可包含一个或多个另外的靶结合位点、同源于靶分子的部分的另外区域、和/或可起到间隔子的作用或者能够或促进选择靶ROI的一个或多个另外的序列元件。

显然，在与靶核酸分子相互作用之前，探针的3’末端的单链区域不必完全是单链。例如，探针的3’末端可以包含二级结构的区域，例如在3’末端处或其附近的发夹。探针的3’末端必须是仅能够特异性杂交至靶ROI的3’末端侧翼的旁侧序列并且起到用于利用靶核酸分子作为延伸模板来延伸探针的引物的作用。因此，例如，如果探针的3’末端包含发夹区域，则第一结合位点与靶ROI的3’末端侧翼的旁侧序列之间的相互作用比在探针的3’末端处的分子内杂交更加稳定(即，热力学上更加有利)，使得在靶核酸分子的存在下，探针的3’末端展开以允许探针与靶核酸之间发生相互作用。这对于减少非靶特异性结合和延伸可以是尤其有利的。

在第一种变化实施方式中，如图2中所示，探针可包含茎环结构的5’方向的第三结合位点，所述结合位点具有同源于紧邻靶分子中5’旁侧序列的5’端序列，并且能够杂交至所述序列的互补序列。更具体地，第三结合区域可位于探针的5’单链序列(即，5’单链端或区域)中。因此，延伸的探针能够经历分子内杂交，其中第三结合位点杂交至靶互补序列中的其互补结合位点，从而产生延伸的探针中的第二双链区域。在本发明的一个实施方式中，当杂交至其互补序列时，第三结合位点可包含能够形成第二切割位点的序列。因此，这样的实施方式能够用于靶分子(或ROI)中的5’旁侧序列不是位于靶分子5’末端处，而是位于该分子5’末端内部的情形。在一个优选的实施方式中，切割位点为限制酶识别序列。在另一优选的实施方式中，切割位点为切口酶识别序列，其将第二双链区域的3’链中的延伸的探针的单链切割模板化。在一些实施方式中，能够形成切割位点(更具体地第二切割位点)的序列可位于第三结合位点的3’末端的末端处或朝向第三结合位点的3’末端的末端。或者，能够形成切割位点的序列可位于远离第三结合位点3’末端(即，位于第三结合位点的5’末端处或朝向第三结合位点的5’末端)，以使在切割后与第三结合位点互补的序列的部分保留在探针的第一链的3’末端处(即，部分双链的“开放”探针和可环化链的第一链)(参见图3)。在一些实施方式中，当能够形成第二切割位点的序列位于远离第三结合位点的3’末端时，茎环结构的环可包含另外的序列(即，位于环的5’末端或朝向环的5’末端)，其互补于靶互补序列中的至少一部分序列，其形成第三结合位点的互补结合位点，即，茎环结构的环包含与在第二切割位点处切割之后保留在探针的第一链(可环化的链)的3’末端处的序列互补的序列。或者，可以看到，茎环结构的环在环的5’末端处或朝向环的5’末端处包含另外的序列，其同源于邻近于(优选直接邻近于)ROI的5’末端侧翼的旁侧序列的序列的至少一部分。

因此，在一些实施方式中，其中当5'旁侧序列位于靶核酸分子的5’末端的内部时，探针在5’末端处进一步包含单链区域，其包含同源于靶分子中5’旁侧序列的5’端(例如，紧邻5’)的切割序列的第三结合位点，并且其能够杂交至所述切割序列的互补序列，其中所述第三结合位点可选地通过间隔序列从茎的5’末端分离并且其中上述方法的步骤(e)包括：

(i)允许延伸的探针经历分子内杂交，其中第三结合位点杂交至靶互补序列中的其互补结合位点，从而产生第二切割位点；

(ii)在第二切割位点处和茎环结构中的切割位点处(例如，在茎或环中3’方向至第二结合位点)切割杂交的探针，从而产生部分双链的构建体，其包含在茎处杂交的两条链，第一链包含靶互补序列，并且第二链包含第二结合位点；

(iii)允许第二结合位点杂交至第一链中的靶互补序列中其互补结合位点，以使第一延伸链的5’与3’末端并置，以用于利用第二结合位点作为连接模板直接或间接地彼此连接。

在又一个实施方式中，探针中的环在第二结合位点的5’方向序列进一步包含与针对第三结合位点的靶互补序列中的互补结合位点的序列互补的序列，该序列在第二切割位点处切割之后保留在探针的第一链的3’末端处。

然而，第三结合位点不需位于探针的5’单链区域中，并且可存在于可替代的位置。因此，在进一步的实施方式中，其在5’旁侧区位于靶分子5’末端内部的情形下使用，第三结合位点可位于茎环结构的环中。这在图10中示出。

因此，在进一步的实施方式中，其中当5'旁侧序列位于靶核酸分子的5’末端内部时，探针进一步包含第三结合位点，该第三结合位点同源于位于靶分子中5’旁侧序列的5’端(例如，紧邻5’端)的切割序列，并且能够杂交至所述切割序列的互补序列，其中所述第三结合位点位于茎环结构中，优选位于茎环结构的环中，并且在第二结合位点的3’方向，并且其中上述方法的步骤(e)包括：

(i)允许延伸的探针经历分子内杂交，其中第三结合位点杂交至靶互补序列中的其互补结合位点，从而产生第二切割位点；

(ii)在第二切割位点处以及茎环结构中的切割位点处(即，第一切割位点，例如，在茎或环中3’方向至第二结合位点)切割杂交的探针，从而产生部分双链的构建体，该构建体包含在茎处杂交的两条链，第一链包含靶互补序列且第二链包含第二结合位点；

(iii)允许第二结合位点杂交至第一链中的靶互补序列中的其互补结合位点，以使第一延伸链的5’与3’末端并置，以用于利用第二结合位点作为连接模板直接或间接地彼此连接。能够看出，在该实施方式中，第三结合位点(其产生第二切割位点,)位于第二结合位点与茎环结构中的切割位点(即第一切割位点)之间的环中。因此，第三结合位点在茎环结构中的切割位点的5’方向。当切割位点(即，第一切割位点)位于环中时，第三结合位点在切割位点的5’方向。

当第三结合位点(其用于模板化延伸产物的切割)位于环中时，平衡杂交强度可非常重要。

在其它变化的实施方式中，探针可包含至少一个(即，一个、两个、三个或更多个)另外的序列元件(间隔子或间插序列)。例如，一个或多个间插序列或间隔子可存在于第一靶结合位点与茎环结构之间，在茎环结构中，或茎环结构的5’方向，其包括在探针的可选单链5’方向的区域中。间插序列或间隔子也可存在于茎环结构的环和/或茎序列中。例如，间插序列能够在茎结构的茎中形成单链环，例如，第一茎序列可包含不与第二茎序列互补的区域，从而当第一和第二茎序列彼此杂交时在茎中形成环。在一个优选的实施方式中，茎环结构的环中的间隔子位于第二结合位点的5’方向，即，第二结合位点与茎环结构第二茎序列之间。因此，探针中可存在多个间插序列或间隔子，散布在本文中所定义的探针的各个区域之间。如上文所述，这些间插序列或间隔子可用于引入可用于或有助于下游处理或操作的元件，例如引入允许探针和/或环化片段(即，ROI的环化互补序列)被捕获的标签或检测序列或元件，例如用于固定至固相体。在一个实施方式中，其可以是捕获或者锚定序列，其被设计为将环化链的扩增产物(例如，原位RCA产物)(例如)以从其来源固定至靶分子。

因此，探针可包含在第一靶结合位点与茎环结构之间的间插序列或间隔子，和/或茎环结构的5’方向的间隔子(即，第二茎序列的5’方向，例如上文所述在第二茎序列与探针的单链5’末端区域中的第三结合位点之间，或第二茎序列的5’方向与第三结合位点之间，如果存在的话)，和/或茎环结构的环中的间插序列或间隔子。例如，当第三结合位点位于环中时，间插序列可以位于第三结合序列的3’方向。在进一步的实施方式中，探针可以在第一靶结合位点与茎环结构之间以及在第一靶结合位点与茎环结构的5’方向之间包含间插序列或间隔子。当探针包含第三结合位点时，第三结合位点的3’或5’方向可以存在一个或多个间插序列或间隔子。因此，间隔子可以位于第三结合位点的5’末端处、第三结合位点的3’末端处(例如，在第三结合位点与茎环结构之间)，或间隔子可以存在于第三结合位点的5’和3’末端处。

在一些实施方式中，间插序列或间隔子可以位于第三结合位点和茎环结构之间(即，第三结合位点的3’方向和第二茎序列的5’方向)，并且有利地可以包含第四靶结合位点，第四靶结合位点能够杂交至靶分子中的互补结合位点，其位于靶分子的3’旁侧序列的3’方向，优选紧邻3’)参见图4)。第四结合位点的存在可以使探针和靶核酸分子之间的相互作用稳定，例如，可以改善探针的选择性和特异性。

因此，在一些实施方式中，间隔序列包含第四靶结合位点，其能够杂交至靶分子中的互补结合位点，其位于靶分子的3’旁侧序列的3’方向，优选紧邻3’，并且上述方法的步骤(b)进一步包括允许第四靶结合位点杂交至靶分子中的其互补结合位点。

显然，位于第二结合位点和茎环结构的第二茎序列(即，位于茎环结构的环的5’末端处或朝向茎环结构的环的5’末端)之间的间插序列或间隔子可导致探针的延伸链(可环化的链)的杂交端之间存在空位。例如，如果在延伸的探针的3’末端，5’旁侧区的3’方向的互补序列(其互补于间插序列或间隔子)处没有另外的序列，这就会发生。这种另外的序列可(例如)由通过第三结合位点产生的切割位点的切割产生；如上文所述，来自第三结合位点的延伸探针中的靶互补序列中的互补结合位点的序列可在第二切割位点处切割后保留在探针的(延伸)第一链的3’末端处。如果存在这种另外的序列，并且其互补于环中的第二结合位点的5’方向的另外的(例如，间插)序列，则将不存在空位。因此，环中的该另外的或间插序列可被设计为与第三结合位点中的序列同源(例如与其完全相同)，其切割位点的3’方向并且其在切割后保留在第二链的5’末端处。图11和图12中示出了这样的构造。然而，可替代地，即使是在这样的实施方式中，探针也可以被设计成存在空位。

如上文所述，任意这样的空位需要被填充，从而用于进行末端的连接。因此，这样的间插序列或间隔子可用于将序列引入到环化的靶分子中，例如标签或检测序列，例如，条形码或鉴别(identificatory)基序，或用于检测探针或引物的结合位点。事实上，形成探针的可环化的链的任何间插序列或间隔子都可以被用于向环化的靶分子中引入序列，例如上文中所述的标签或检测序列。可出于不同需要/目的来设计标签(例如条形码/基序或探针/引物结合位点)，例如用于引入通用或共有序列，从而使不同的环化靶分子能够以多倍方式一起处理，例如引入用于通用或共有扩增引物的结合位点。这将使不同的环化靶序列能够被一起扩增，例如，通过PCR或RCA以文库扩增的方式。可替代地或另外，标签/条形码序列可用于“标记”不同的环化片段，使得它们可被容易地彼此(即，“靶”标签或标志物)区分，或给不同的样品加标签等，从而可将它们合并，之后一起进行共有/通用扩增(即，“样品”标签或标志物)。因此，在多倍设定中，不同探针(即，不同靶ROI的探针)可以具有不同的标签序列(例如，不同的标志物或检测序列)和/或它们可以具有相同的(多个)标签序列，例如，用于引入共有或通用序列。这样的标签也可以通过设计茎环结构的茎序列以包含能够用作标签或检测序列的序列而被结合到环化的链中。如上文所述，在一些实施方式中，可以仅将标签结合到第一茎序列中。

如上文中所提到的，空位填充可通过延伸靶片段的杂交的3’末端，或更常用地通过使一个或多个空位寡核苷酸杂交到空位中来进行。空位寡核苷酸可以作为探针的一部分提供，例如，预杂交至探针，之后与靶核酸接触，或其可以在探针与靶核酸接触的同时或基本同时提供，或其可以在之后的任意时间加入，例如，在探针杂交之后，或在切割之后。因此，空位寡核苷酸可以被视为检测、标签、条形码或ID基序寡核苷酸等。如在下文中将要具体描述的，空位寡核苷酸可包含不与间插序列或间隔子互补或者不与间插序列或间隔子杂交的区域，使得当其杂交时，其含有其中引入了标签、条形码、或ID基序序列等的非杂交的环。

在进一步的实施方式中，引入到本发明探针中的间插或间隔序列可包含捕获或“锚定”序列元件。这样的元件可以在任意位点之间与检测/ID元件组合。例如，捕获元件可存在于第一靶结合位点和茎环结构之间，位于茎环结构的茎或环中，和/或茎环结构的5’方向(即，在5’单链区域中)。这样的捕获元件可以与茎环结构的茎或环中的检测/ID元件组合。在一些实施方式中，这样的捕获元件将位于第一靶结合位点和茎环结构之间。在一个替代的实施方式中，这样的捕获元件将位于茎环结构的5’方向。在本发明的一个实施方式中，当探针包含茎环结构的5’方向的第三结合位点时，通过间隔序列将其从茎的5’末端隔离，间隔序列可以是捕获序列元件。在进一步优选的实施方式中，捕获元件可以位于第三结合位点的5’方向或茎序列的5’方向(如果不存在第三结合位点)。这样的捕获或锚定元件可被设计为杂交至同源互补结合位点(即，“诱饵(bait)”序列)，例如在固相支持物上提供的或原位固定的(例如，如上文所述固定在靶核酸上)，以使探针和/或靶片段能够被固定。因此，这可使该方法能够以一个或多个步骤在固相体上进行，例如探针可在在杂交至靶分子之前或之后，或者在切割步骤之前或之后被固定。有利地，捕获或锚定元件可用于原位实施方式，例如，用于靶核酸分子的定位检测。

在一些实施方式中，捕获或锚定元件可以位于第三结合位点中。换言之，第三结合位点可以包含捕获序列。在这种情形下，捕获/锚定序列可在切割位点(即，其可以在切割位点的3’方向)内部，以使其在切割(例如，在第二链的5’末端处)后保留在探针中。如上文所述，当捕获或锚定序列用于定位环化链的RCA扩增的RCA产物时，这可以是有用的，其中第二链作为扩增引物。这也示于图11和图12，其中示出了探针的单链5’区域中的捕获序列，其位于切割位点的内部(3’)。

因此，(多个)间插或间隔序列可以含有或携带元件，通过该元件靶片段可被检测或分离，例如，鉴定或扩增或捕获。“含有或携带”意指这样的元件可以被包含在寡核苷酸的核苷酸序列中，例如，序列标签(例如，其可用于鉴定靶片段)或者基于探针或引物结合位点或其它核酸的亲和结合位点(例如，杂交探针或DNA结合蛋白等的结合位点，该结合位点可被视为捕获或检测元件(这取决于探针和亲和结合元件的性质)，或者测序引物的结合位点，该测序引物的结合位点因此可被视为检测元件，或扩增引物的结合位点，该扩增引物结合位点因此可被视为扩增元件)可被包含在寡核苷酸的核苷酸序列中。或者，其可以以任何与间插序列或间隔子连接或偶合或共轭的方式来附接或联合。例如，它可以是功能性部分(例如，化学基团或分子)，其附接(等)至寡核苷酸，例如固定部分或检测部分(例如，报告子或标记物)。例如，固定部分可以是亲和结合部分或基团，例如，亲和结合对的一个成员(即，亲和配体，例如，生物素或半抗原)，其附接或共轭(等)至所述寡核苷酸，并且能够结合至亲和结合对的其它成员(即，其同源结合伴侣，例如，链霉亲和素或抗体)，目的是捕获或分离，例如，当同源结合伴侣附接至固相体时。

如上所述这样的附接或共轭部分(即，用于捕获和/或检测的功能性部分)不一定需要附接至间插序列或间隔子，但是可以在探针的不同部分中提供(即，附接或共轭于探针的不同部分)，例如，结合位点。具体地，功能性部分(例如，亲和配体或结合伴侣)可以被提供附接至探针的第二链，或将会形成第二链的探针的一部分。在一个实施方式中，该功能性部分可以在探针(或探针的第二链)的5’末端处附接，例如其可以在或在第三结合位点处附接或附接至第三结合位点，并且尤其是附接至具有包含第三结合位点的单链5’区的探针的5’末端。

这样的安排可以方便地用来除去未反应的探针，例如，如图11和12中所示。除去未反应的探针以减少或防止(例如，最小化)背景是合乎需要的。例如，未反应的探针(如果存在的话)可反应以引起(prime)不希望的反应，例如它们会杂交至RCA产物或者会在RCA产物上引起延伸，该RCA产物是由环化的延伸链的RCA扩增(例如，潜在地导致超支化反应产物)产生的。

为了除去未反应的探针，在探针的5’末端，尤其是在包含第三结合位点的5’单链区域的5’末端处，提供亲和结合伴侣或配体(例如，生物素)，其能够结合至同源结合伴侣(例如，链霉亲和素)。因此，亲和结合伴侣为由第三结合位点产生的切割位点的5’方向，并且可以通过在第三结合位点处的切割从探针中除去或分离。因此，尚未结合至靶分子且尚未延伸和切割的任意探针将保留亲和基团。已结合至靶且已经延伸的探针(即，反应的探针)将通过在(由第三结合位点产生的)第二切割位点处的切割被切割，并且因此不保留亲和基团(换言之，亲和基团将通过第二切割被除去或者从反应的探针中失去)。因此，未反应的探针可通过亲和基团从反应的探针中选择性分离，亲和基团仅被保留在未反应的探针上，但其通过反应的探针中的切割被除去。因此，为了分离未反应的探针(例如，未结合的探针，从未结合至靶的意义上来说)，探针可通过探针与同源亲和基团(例如，链霉亲和素)的结合而被分离，其允许同源亲和基团结合的探针与已丧失亲和基团的未反应的探针分离。方便地，这可以通过在固相支持物上提供同源亲和基团来实现。因此，探针中提供的亲和基团(即，亲和结合伴侣或配体)可以是可固定化的基团，即，“固定元件”，并且尤其是可固定化的基团，其能够结合至固相支持物上提供的同源亲和基团。

以这种方式除去未反应探针的步骤可在该方法中以不同方式、或在不同的时间或点进行。例如，在一个实施方式中，可在步骤(e)之后，例如在探针的切割和重排之后，或者在连接至环化重排的探针之后(例如，在步骤(f)之后)，通过与同源亲和基团(例如，在固相支持物上)接触来除去未反应的探针。或者，可在步骤(e)之前进行，以使反应的和未反应的探针均结合至同源亲和基团(例如，通过结合至固相支持物上的同源亲和基团从溶液中除去，或者更简化地，将探针结合至固相支持物)，并且在步骤(e)中通过在第二切割位点处切割延伸的探针从同源亲和基团中释放反应的探针(例如，释放到溶液中，或者从固相支持物中释放)。

在某些实施方式中，如上文所述，用于除去未反应探针的这样的捕获部分可与另外的单独的用于扩增产物定位的锚定序列组合。例如这样的捕获部分和锚定序列可在第三结合位点中提供，其中锚定序列位于由第三结合位点提供的切割位点的内部(例如，该切割位点内部或切割位点的’方向)。更具体地，第三结合位点可在探针的5’单链区域中，例如在图11和图12中所示出的。

如上文所讨论的，以该方式在探针中提供的亲和基团可以是(例如)生物素或者能够结合至同源亲和基团的任何配体，例如抗体的半抗原等。

检测元件可以(例如)包括鉴定元件，即允许或准许鉴定(例如)特定的靶ROI或样品(例如当样品被合并时)，或者鉴定实际上为样品中的靶核酸分子的元件。这样的鉴定元件或ID标签或基序可简单地为序列标签或基序，例如，特定的或唯一的核苷酸序列。因此，其可被视为序列标志物。这种序列标签/基序或标志物的设计是本领域中众所周知的。例如用作标签的条形码序列/基序在本领域中被广泛使用和熟知，用于标识样品或分子等。降解序列可被用作这种标签的基础，并且以这种方式使用降解序列基序也是本领域中已知的。

可以包括大量不同的标签来标记或标识靶核酸分子或ROI的不同方面。例如，可以包括标签(例如条形码基序)作为样品标签，连同用于特定靶ROI的标签，探针被设计成选择性用于该特定靶ROI的标签。有利地，“分子”标签可被用于标记或标识(即，鉴定)样品中的单个分子，例如，样品的原始分子的初始互补序列。这在测序情况下，并且尤其是在NGS技术中，是特别有利的，其中追踪回到用于测序的扩增的原始分子的序列读取是有价值的。

因此可见，各种类型的鉴定元件或标签可以单独使用或组合使用。

序列标签或条形码可以在长度为20个核苷酸的区域中，例如7至30个核苷酸，例如，7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29或30个核苷酸。序列标签或条形码可随机产生，例如一组序列标签可包含具有标签序列中核苷酸总数的所有可能的序列组合的标签。

因此，探针可含有样品序列标签，例如，允许用于在特定样品中实施的本发明方法中的探针与在不同样品上实施的该方法中使用的探针区别开并且从而允许鉴定从其中给定靶片段(即，靶序列的互补序列)已被环化的样品的特征。

标签样品允许鉴定样品，特定靶片段及因此ROI来源于该样品。例如，样品可以对应于患者样品。如果以多倍形式进行该方法以用于检测来自不同样品的许多不同靶ROI，则每个探针中可以包括单独的样品和“靶”标签。利用本发明的方法和探针，这种特征有利地允许合并样品，例如在与探针接触以及探针与标识的每个样品连接之后，可将不同的样品合并。

如上文所述，检测元件也可以是包含在寡核苷酸序列中的结合位点(例如，检测探针或部分的结合位点，或者在检测反应中使用的引物的结合位点，例如测序引物)或者其可以是通过寡核苷酸以任何方式携带的检测部分，例如报告子基团或部分或标记物，其可以直接或间接发出信号。例如，其可以是可见的标记物，例如彩色的或荧光的或颗粒状标记物，或者可以是促使或参与信号发出反应的部分，例如亲和结合伴侣或配体或者酶的底物或辅因子。

捕获元件可以是用于扩增和/或捕获环化靶片段的任意元件。"扩增元件"可用于扩增环化靶片段(即，含有靶ROI的互补序列的探针的环化链)。其通常为扩增引物结合位点。其也可以是许多扩增因素或一组(例如一对)扩增引物之一的结合位点，例如以允许指数扩增，例如PCR引物或用于基于PCR程序的引物。该引物结合位点也可以用于测序引物的结合。

"捕获元件"可以是探针所携带(例如附接或共轭于)的任何部分，或者探针的序列的任何特征(例如，结合位点、间隔序列)，其可以潜在地用于将延伸的探针(例如，含有靶片段的互补序列的环化探针)选择性附接至固相体或支持物，包括例如颗粒(例如磁珠)，和/或原位。因此，捕获元件可以被看作是"固定元件"。延伸的探针，例如，由本发明方法产生的探针的环化链可被直接固定或捕获，例如，通过杂交至环化链中的序列的捕获元件，例如固定的引物或可被固定的连接模板链，即，在一些实施方式中，连接模板链含有捕获元件。或者，延伸的探针可被直接固定或捕获，例如，通过结合至连接模板链中的结合位点的捕获元件，其中该连接模板链结合至环化链。这样的元件的大量实例是本领域中已知的，并且包括(例如)能够结合至其结合伴侣(即，同源结合伴侣，例如，链霉亲和素或抗生物素蛋白，或抗体，在固相体或支持物上提供)的亲和结合伴侣(例如，生物素或半抗原)。捕获元件可以是在固相支持物上提供的具有互补于相应的“结合”或“报告子”寡核苷酸或核苷酸序列的核苷酸序列，或者可以是附接(等)至寡核苷酸的功能性部分(例如，化学基团或分子)，例如，生物素或半抗原。探针和固相体之间的相互作用(例如，通过固定结合或报告子寡核苷酸，或结合伴侣例如链霉亲和素或抗体)可以尤其通过点击化学(click chemistry)来介导(Kolb HC等人,Angew Chem Int Ed Engl.2001年6月1日；40(11):2004-2021)。

如上文中所讨论的，除了用于捕获延伸的探针的捕获元件，该探针也可替代地或另外地具有用于捕获和选择性除去未反应的探针的(独立)捕获元件。

该固相体可以是目前被广泛使用或建议用于固定、分离等的公知的支持物或基质。这些固相体可为颗粒(例如，可为磁珠、顺磁珠或非磁珠)、片、凝胶、过滤器、膜、纤维、毛细管或微孔板、管、板或孔等的形式。该支持物可由玻璃、二氧化硅、胶乳和聚合物材料制成。适合的材料表现出用于结合分析物的较大表面积。这样的支持物具有不规则的表明，并且可以(例如)是多孔的或颗粒状的，例如，颗粒、纤维、网状物、熔结物或筛网。可以使用颗粒状材料(例如微珠(bead))因为其具有较大的结合能力，尤其是聚合物微珠。方便地，根据本发明使用的颗粒状固相支持物将包含球形微珠。微珠的尺寸不是关键因素，但其可(例如)大约是直径为至少1μm且优选至少2μm，并且具有优选不超过10μm，并且例如不超过6μm的最大直径。单分散性颗粒的尺寸基本上是均匀的(例如尺寸的直径标准差小于5％)，具有这样的优点：其提供非常均匀的反应再现性。例如，为了辅助操作和分离，磁珠或顺磁珠是有利的。其它固相支持物包括非常小的颗粒，其能够有效地接触大比例的可固定化的寡核苷酸。这样的颗粒可进一步通过阻碍颗粒附接的靶片段(即，靶片段互补序列)通过凝胶的运动来使用，以允许从游离的非颗粒附接的(非靶)片段分离。或者，还优选使用由可与探针中的捕获元件共价地反应或非共价地反应的基团修饰的色谱基质。

如上文所述，可被杂交至位于茎环结构的第二结合位点与第二茎序列之间的间插序列或间隔子的“空位”寡核苷酸含有互补于间插序列或间隔子的的序列的区域，该区域可被不与该间插序列或间隔子互补的序列隔离。因此，互补于间插序列或间隔子的序列的两个区域位于互补寡核苷酸的两端，和位于不与间插序列互补的寡核苷酸中的区域旁侧。因此，不与该将插序列互补的序列形成环或凸出，并且可包含标签，例如条形码序列等，例如，用于鉴定所选的靶ROI。

在本发明的一个实施方式中，本发明的探针包含发夹结构，即，茎环结构，其包含第二结合位点。有必要使探针展开以打开环，这可在延伸步骤之前、期间或之后，在第二结合位点可成为可用并且模板化探针的延伸链的连接之前进行。因此，发夹的环可以含有结合位点，以使直到探针已经被打开以释放该第二结合位点，其才可用于在探针的延伸链(可环化的链)的3’末端处或朝向3’末端杂交至其互补结合位点。

发夹结构也可被称为发夹环或茎环，并且这些术语在本文中可以互换使用。发夹是一种分子内碱基配对的模式，其能够在单链DNA或RNA分子中出现。当同一链的两个区域，通常在以相反方向读取时在核苷酸序列中互补的碱基对形成终止于未配对的(即单链)环的双螺旋(双链体)时出现发夹。所得到的结构可被描述为棒棒糖形。

发夹可通过切割被展开或者“打开”，例如，在环中或者环附近，例如在茎环结构的茎或环中，其中切割发生在第二结合位点的3’方向。如上文所述，当发夹结构的茎或环被切割时，在(至少部分的)打开的结构中保留了探针的双链元件，即，茎环结构的茎，从而第一链包含延伸的链(即，可环化的链，含有靶核酸分子的互补序列和任意可选的间插序列或间隔子)，且打开的发夹的第二链(连接模板链)包含第二结合位点和任意可选的另外的间插序列或间隔子元件。因此，切割位点必须位于探针中以使当发生切割时发夹能够打开同时保留足够量的茎结构是显而易见的，足够量的茎结构允许延伸的(可环化的)链在本发明的条件下保持其与连接模板链的相互作用，即，切割位点的位置必须使发夹能够打开并且使探针形成部分双链分子。WO2012/152942中提供了可用于展开发夹结构的技术的讨论，其全部内容以引用方式并入本文中。如下文所讨论的，切割优选为酶切。

在一些实施方式中，发夹(茎环)结构的茎包含切割位点(参见，例如，分别记载于实施例1～3中的探针ExCirc_2(SEQ ID NO:2)、ExCirc_hTert(SEQ ID NO:7)和ExCirc_miR208(SEQ ID NO:11))。优选地，发夹的茎中的切割位点(例如，切割识别位点)位于茎序列(第一茎序列)的第一链的5’末端处或朝向5’末端，并且优选地切割将发生在茎序列的第一链的5’末端处或朝向5’末端。因此，在一些实施方式中，茎中的切割位点邻近环。因此，在切割之后，只有部分的或者一部分原始茎序列将被保留在双链体中，即，在双链体中必须保留足够量的茎序列以使延伸的(可环化的)链和连接模板链能够形成部分双链的分子。在其中切割位点位于茎环结构的茎中的实施方式中，切割必须仅在茎的单链中发生，即，茎的第一链(将形成可环化的链的部分的茎的部分)。因此，在一些实施方式中，茎中的切割位点为切口酶切割位点，即，由下文所讨论的切口酶识别的切割位点，其中该切口酶切割茎环结构的第一茎序列。

在一些实施方式中，当切割位点位于茎环结构的茎中时，茎(第一茎序列)的切割可不会直接或立即导致发夹展开，例如，甚至是在单链切割时，双链体在反应的条件下也可以是稳定的。然而，在探针的分子内重排时，发夹可展开，其中延伸链的3’末端和第二结合位点之间的相互作用比茎序列在茎的“环端”处的相互作用更加稳定(即，热力学上更加有利)。换言之，延伸链的3’末端可被视为置换了切割的第一茎链的3’末端。

在一些实施方式中，发夹(茎环)结构的环包含切割位点。在优选的实施方式中，环中的切割位点紧邻于茎。在一些实施方式中，发夹结构的环可以包含分子内互补序列的区域，以使其能够在环中形成双链体，即，该环含有由该环形成突出的双链区域(双链体)并且因此区别于发夹结构的“茎”。环的内部双链体可以包含切割位点，例如，限制性核酸内切酶识别位点，其中在环中切割双链体导致发夹结构的展开(参见，例如，实施例1中的探针ExCirc_1(SEQ ID NO:1))。因此，在一些实施方式中，位于第二结合位点3’的间插序列或间隔子(更具体地在第一茎序列和第二结合位点之间)可以含有分子内互补序列的区域。在环的内部双链体中具有切割位点的这种实施方式中，内部双链体的两条链都可被切割。

在一些实施方式中，环中的内部双链体含有MlyI切割位点。该切割位点(例如，MlyI切割位点)可被设置以允许以这种方式切割除去内部环。这在图12中示出。切割可留下在茎中杂交的延伸的第一链的5’末端，其通过切割被释放。

在本文中被广义定义的"切割"包括破坏或破除核苷酸链(即，核苷酸序列)的任何方式。因此，切割可包括破坏共价键。通常，切割包括核苷酸链的切割(即，链切割或链切断)，例如通过切割磷酸二酯键。如下文所述，探针的茎环结构中切割位点的切割(例如，在茎或环中)可以通过任意常规手段来实现，但优选酶切。

例如，发夹结构可包含或者可被设计或修饰为包含限制性核酸内切酶识别序列。在一个优选的实施方式中，例如，当发夹结构包含限制性核酸内切酶识别位点时，该限制性核酸内切酶将仅切割发夹结构的双链体部分的单链。例如，这可以通过使寡核苷酸(在本文中被称为“限制性寡核苷酸”)杂交至发夹结构的单链环从而在环中包含双链体来实现。至少部分所形成的双链体将包含限制性核酸内切酶识别位点，其可被切割导致发夹结构展开。可以使用任何合适的限制性核酸内切酶来展开发夹结构。在其它的实施方式中，切割可包括破坏核酸序列中的一个或多个核苷酸中的共价键。在一些实施方式中，可以通过将一个或多个尿嘧啶残基结合到茎和/或环序列中来创建切割位点。在尤其优选的实施方式中，可通过用尿嘧啶DNA糖基化酶(UNG)与核酸内切酶组合进行处理来展开发夹结构，其中核酸内切酶能够识别dsDNA的无嘌呤/无嘧啶(AP)位点，例如，核酸内切酶IV。

在进一步优选的实施方式中，可以利用切口酶来切割，并且从而展开发夹结构，其中该切口酶仅切割发夹结构的双链体中的一条链。切口酶是仅切割DNA双链体的单链的核酸内切酶。如上文所述，可将切割位点引入到发夹结构的单链环中，例如，通过退火(杂交)寡核苷酸至所述环。在一些实施方式中，茎环结构的茎包含切口酶切割位点。

一些切口酶通过结合至并识别特定的核苷酸识别序列而仅在DNA分子上的特定位点处引入单链切口(nick)。已经发现了大量天然存在的切口酶，根据存在的序列识别性质，将其确定为至少四类。美国专利6,867,028中描述了切口酶，其全部内容通过引用并入本文中，并且任何适合的切口酶都可用于本发明的方法中。

在使用切口酶的一些优选的实施方式中，在探针展开之后从测定除去切口酶或使切口酶失活，以防止产生连接产物的不希望的切割。

如上文所讨论的，本发明的方法中使用的探针至少包含第一靶结合位点，其互补于靶核酸分子中的靶ROI侧翼的3’旁侧序列。本文中使用的“互补”是指功能性互补(即，能够介导杂交)，而不需指代两个核酸分子之间的100％互补。根据本发明的杂交包括通过沃森-克里克型碱基配对或通过任何类似的碱基配对在彼此充分互补的核苷酸序列之间形成形成双链体。杂交是富有成效的(productive)杂交，即杂交对于能够实施其功能的探针是足够稳定的或者足够坚固的，例如，对于待从样品中分离的探针/靶分子杂交体，或者对于创建待切割的切割位点，以及对于能够通过连接而环化的靶片段。

因此，在适当的杂交条件下，互补核苷酸序列将与特异性组合以形成稳定的双链体。例如，当第一序列的一部分可在反向平行的意义上结合至第二序列的一部分时，两条序列是互补的，其中每个序列的3'-端结合至另一序列的5'-端，并且随后每条序列的每个A、T(U)、G和C分别与另一条序列的T(U)、A、C和G对齐。RNA序列也可以包括互补G＝U或U＝G碱基对。因此，在本发明中，两条序列不需要具有成为"互补"的完美同源性。通常，当至少约85％(优选至少约90％，并且最优选至少约95％)的核苷酸在分子的既定长度上共有碱基对结构，两个序列就是充分互补的。

如上文所讨论的，探针包含至少一个与靶核酸分子的区域同源并且能够杂交至这样的序列的互补序列的结合位点。显然，与靶核酸分子的区域具有同源性的探针的结合位点的序列不需要为了能够杂交至其互补序列而与该靶核酸分子的序列完全相同。因此，当实际上相同时，结合位点可被视为同源于靶分子中的相应区域。例如，结合位点可与靶核酸分子的区域共有至少75％的序列同一性，或至少80％、85％或90％的同一性。在一个优选的实施方式中，结合位点与靶核酸分子的区域具有至少95％的同一性，例如96％、97％、98％或99％的同一性。在又一实施方式中，结合位点与靶核酸分子的区域具有100％的同一性。尤其是，第二结合位点的序列可以不与5’旁侧序列完全相同，只要其能够结合至5’旁侧序列的互补序列即可。因此，在一个实施方式中，单个探针可以能够从多个靶分子中选择靶ROI，其中靶分子在位于靶ROI侧翼的5’旁侧序列中具有一定程度的序列可变性，或者其中5’旁侧序列的序列并不是完全已知的。

对于本领域技术人员而言，在探针中适当地设计靶结合位点是常规事项，例如，考虑位点的长度、G/C含量和Tm等。通常，靶结合位点的长度为至少5个核苷酸长，更典型地长度为至少6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、30、40或50个核苷酸或任意这些数值之间或多达或高于任意这些数值的任何整数。

为了使延伸链在本发明方法的(f)部分中经历直接或间接连接，延伸链(即，含有5’旁侧序列的互补序列的可环化的链)的3’末端必须能够杂交至第二结合位点。在本发明的某些实施方式中，当靶ROI侧翼的5’旁侧序列位于靶核酸分子的5’末端时，例如当靶核酸分子为miRNA或转录本时，延伸的探针的3’末端可在第二结合位点中完全杂交至其互补序列。

然而，在一些实施方式中，靶ROI的5’旁侧序列可位于靶核酸分子的5’末端的内部，并且可因此有必要在发生连接之前除去探针的延伸链的区域，该探针的延伸链的区域互补于紧邻5’旁侧序列的5’方向的区域(即，不互补于第二结合位点的延伸的探针的3’末端处的区域)。可通过任何适合的方式除去该序列，例如，利用3’核酸外切酶降解。

因此，在当5’旁侧序列位于靶分子的5’末端内部的实施方式中，上文所述的本发明的步骤(e)可包括：

(i)在探针的茎环结构中的切割位点处切割延伸的探针，以释放包含第二结合位点的探针的3’末端，从而产生部分双链的构建体，其包含靶互补序列的第一延伸链和杂交至茎中的第一链且包含释放的3’末端的的第二链；以及

(ii)允许第二链中的释放的3’末端中的第二结合位点杂交至第一链中的靶互补序列中的其互补结合位点，以使第一延伸链的5’末端与3’末端并置，其中第一链的3’末端处的另外的序列不发生杂交并且形成突出单链端；

(iii)切割该突出单链端，以留下所述第一链的3’末端，其杂交至第二链的第二结合位点，以使第一延伸链的5’末端与3’末端并置，以用于利用第二结合位点作为连接模板直接或间接地彼此连接。

如上文所讨论的，本发明的探针可以包含另外的序列，其同源于靶分子中序列紧邻5’旁侧序列的5’方向并且包含在杂交至延伸的探针时能够形成第二切割位点的序列。在探针分子延伸之后，延伸的探针可经历分子内杂交，其中第三结合位点杂交至靶互补序列中的其互补结合位点，从而产生第二切割位点。该切割位点这样定位，以使5’旁侧序列的3’方向的互补序列的序列在切割后被除去。如上文所讨论的，该切割位点可以位于第三结合位点的3’末端处，或者可以位于第三结合位点内(即，位于不会除去互补于第三结合位点的序列整体的位置中)。在这种情况下，茎环结构的环可以包含这样的序列：针对第三结合位点互补于来自靶互补序列中的互补结合位点的序列，该序列在第二结合位点处切割之后保留在探针的第一链的3’末端处。

如上文所述，第二切割位点的切割(例如，在延伸的探针的3’末端处或朝向3’末端由第三结合位点和其互补区域的相互作用产生的)可通过任何常规方式实现，但优选酶切。该切割也可以在切割茎环结构的环之前、同时或之后发生。

因此，在一个优选的实施方式中，由延伸的探针的分子内重排创建的第二切割位点(在靶核酸除去之后)代表切割识别位点，例如，被一种或多种能够切割核酸分子的酶识别的序列。重排的探针中的该切割位点可以相同或者不同。

任意适合的切割酶都可以用于切割第二切割位点以释放包含第二结合位点的互补结合位点的第一链(可环化的链)的3’末端。

在一个优选的实施方式中，第二切割位点是限制性位点。在该优选的实施方式中，限制性核酸内切酶将切割第二切割位点的两条链。该核酸内切酶可以可替代地切割单链，即延伸的链(可环化的链)。在又一优选的实施方式中，第二切割位点为切口酶识别序列，其将第二双链区域的延伸链的单链切割模板化。因此，延伸的探针链中的特异性位点处的酶切可释放延伸链的3’末端，其互补于第二结合位点。在本发明的又一实施方式中，当通过多种不同探针来选择多种不同靶ROI时，可以使用单一切割酶，或者多种不同的切割酶。

在一个可替代的实施方式中，当5’旁侧序列位于靶核酸的5’末端内部时，互补于第二结合位点的延伸的探针的区域可杂交至第二结合位点，以形成具有突出3’末端的环状核酸构建体(即，互补于5’旁侧序列的5’方向的序列的序列)。具有3’→5’核酸外切酶活性的酶(例如，具有3’→5’核酸外切酶“校正(proofreading)”活性的聚合酶)可用于降解突出的3’末端，从而释放延伸的探针的3’末端。

在本发明实施方式中，其中探针具有部分双链构建体，该部分双链构建体包含第一链和第二链，第一链包含在其3’末端包括第一结合位点的单链3’末端区域，且第二链在第一链的5’末端处杂交并且包含包括第二结合位点的单链3’末端区域(或者，其中茎环探针在与靶分子接触之前就被切割)，显然并不需要在探针的延伸之后进行切割以释放第二结合位点。在这样的实施方式中，一旦发生延伸，第二结合位点(即，第二链的3’末端)就可用于杂交至靶互补序列中的其互补序列(即，5’旁侧序列的互补序列)。

因此，在本发明某些实施方式中，其中5’旁侧序列位于靶核酸分子的5’末端处，步骤(e)包括允许第二链中的第二结合位点杂交至延伸的第一链中的靶互补序列中的其互补结合位点，以使得第一延伸链的5’末端与3’末端并置，以用于利用第二链作为连接模板直接或间接地彼此连接。

在本发明另外的实施方式中，其中5’旁侧序列位于靶核酸分子的5’末端内部，有必要在可发生连接之前除去探针的延伸链的区域，其互补于紧邻5’旁侧序列的5’方向的区域(即，不与第二结合位点互补的延伸的探针的3’末端处的区域)。可通过任何适合的方式除去该序列。

可通过产生切割位点来实施除去互补于紧邻5’旁侧序列的5’方向的区域的延伸链区域，例如，通过使互补核酸分子杂交至紧邻5’旁侧序列的5’方向的切割序列。这可以作为独立核酸分子(即，同源于靶核酸分子的一部分的分子)提供，或者可以作为探针中的另外序列提供。

因此，在一个方面，探针的第二链可以进一步包含第三结合位点，该第三结合位点同源于靶分子中紧邻5’旁侧序列的5’方向的切割序列并且能够杂交至第一延伸链中的靶互补序列中的另外的序列中的所述切割序列，其为至5’旁侧序列的3’方向的互补序列。第三结合位点可以位于第二结合位点的3’方向的第二链的单链3’区域中，或者可以位于第二链的另外的单链5’区域中，即，双链区域的5’方向。

因此，本发明方法的步骤(e)可以包括以下步骤：

(i)允许延伸的探针经历分子内杂交，其中第三结合位点杂交至靶互补序列中的其互补结合位点，从而产生切割位点；

(ii)在该切割位点处切割所述杂交的探针，从而产生释放的第一延伸链的3’末端；

(iii)允许第二结合位点杂交至第一链中的靶互补序列中的其互补结合位点，以使第一延伸链的5’末端与释放的3’末端并置，以用于利用第二结合位点作为连接模板直接或间接地彼此连接。

在另一方面，探针可以包含第二结合位点的3’方向的另外的探针序列，其同源于靶核酸分子的3’旁侧序列并且因此互补于第一结合位点。这样的序列可以杂交至第一结合位点(或其一部分)之后延伸该探针，并且可被用于模板化延伸的探针与第二结合位点(其分别杂交至3’旁侧序列和5’旁侧序列)组合的环化。该另外的探针序列可以与第二结合位点部分重叠，或者换言之，第二结合位点可以包含同源于5’旁侧序列的区域(其可以是ROI的一部分)和同源于3’旁侧序列的区域。

当第二结合位点同源于ROI(或ROI的5’末端)时，并且能够杂交至ROI的互补序列时，这样的探针可具有特定用途。因此，第二结合位点和另外的探针序列可形成互补于延伸的探针(靶互补序列)的3’末端的延伸区域。然而，当第二结合位点同源于靶核酸分子中的5’旁侧序列时(即，当第二结合位点不与ROI同源)时，上述探针也是有用的。3’和5’旁侧序列的互补序列可以杂交至第二结合位点和另外的探针序列，其具有在3’和5’旁侧区(即，ROI)之间形成环的序列。

因此，在本发明的又一实施方式中，探针可以包含位于第二结合位点的3’方向并且同源于3’旁侧序列且互补于第一结合位点的另外的探针序列，其中当所述探针包含茎环结构时，所述另外的探针序列位于环中，或者当所述探针为双链构建体时，该另外的探针序列位于第二链的3’末端处；并且其中在本发明方法的步骤(e)中，该另外的探针序列杂交至第一结合位点并且与第二结合位点一起作为连接模板。

如上文所讨论的，第二结合位点模板化所述连接以及由此的延伸的链(可环化的链)的环化，从而第二靶结合位点可以杂交至延伸链中的其互补结合位点，因此使延伸链的末端并置以用于连接。

如上文所讨论的，延伸的链(可环化的链))的末端的位置可以是彼此直接邻近，并且因此可在延伸链的末端之间直接发生连接。或者，延伸的链的末端不是彼此直接邻近的，即，在探针的第二结合位点的5’末端和第二茎序列之间存在间插序列或间隔子。在这种情况下，延伸链的末端可以间接连接，例如，通过一个或多个空位寡核苷酸或在寡核苷酸的3’末端的"空位填充"延伸之后。空位寡核苷酸将互补于第二结合位点和第二茎序列之间的间插序列，并且可将其单独针对探针加入到样品中，或者可在选择靶ROI之前使其杂交至探针。

连接步骤可以通过本领域已知的程序来进行。适合用于连接步骤的酶是本领域中已知的，并且包括例如，Tth DNA连接酶、Taq DNA连接酶、嗜热古菌(Thermococcussp.)(9°N株)DNA连接酶(9°N^TM DNA连接酶,New England Biolabs)、Ampligase^TM(EpicentreBiotechnologies)和T4DNA连接酶。

根据本文中的方法环化的靶ROI(即，靶ROI的互补序列)可被直接分离、分析或检测，或者可以首先被扩增。事实上，可以通过扩增的方式对其进行检测。靶ROI的扩增可通过用于扩增核酸并且尤其是环状核酸的任意合适的方式来进行。根据需要，扩增可以是线性扩增或指数扩增，其中代表性的目标扩增方案包括，但不限于：聚合酶链反应(PCR)；等温扩增、滚环扩增(RCA)、以及它们的公知变形方式，例如超支化RCA等。其它核酸扩增方法可以包括环介导等温扩增(LAMP)、智能扩增方法(SMAP)、基于核酸序列的扩增(NASBA)或连接酶链反应(LCR)。其中该检测步骤包括扩增，可以检测扩增产物，以检测靶ROI。

基于RCA的扩增方法代表了一种优选的实施方式，并且在一个特定的方面，该扩增可以包括第二轮RCA，例如在WO2014/076209中描述的超级RCA(sRCA)反应，其通过引用并入本文。在这样的sRCA反应中，利用另外的RCA模板环来进行二级RCA反应，并且该RCA由杂交至初始RCA产物的引物开始(此处为第一RCA步骤的扩增子，其利用含有靶片段的互补序列的环化探针作为模板)。以这样的方式提供该引物，以使其在整个二级RCA中仍杂交至第一RCA产物，从而使二级RCA产物被局限于初始RCA产物。在局限化的超级RCA反应的进一步优选的实施方式中，二级RCA反应可以通过锁式(padlock)探针而被模板化，该锁式探针与初级RCA产物杂交并且连接以形成环，之后该环经历二级RCA反应(所谓的"锁式sRCA"，其在我们的共同未决GB专利申请第1320145.4号中描述)。

在这样的sRCA反应中，二级RCA产物与初级RCA模板(即，该第一环)无关，即，在这种情况下，第一环为环化的靶片段(更具体地，为环化的靶片段互补序列)。因此，sRCA被用作信号扩增的手段(例如，在检测方法中)，而不是作为扩增靶ROI的手段(例如，在制备性方法中)。出于这样的目的，环至环RCA反应(如WO/2003/012119中所描述的)可用于增加由RCA产生的产物的量，其基本上为线性扩增过程或超支化RCA。

或者，可以使用指数扩增反应，例如PCR。通过PCR扩增环化的片段(即，环化的靶片段互补序列)代表了另一优选实施方式。如上文所讨论的，PCR引物的结合位点可以通过结合到环化分子中的空位寡核苷酸方便地提供。或者，扩增引物可以被设计成结合至靶片段中的其它位置。在多倍实施方式中，可以引入通用或常用PCR引物结合位点并且利用单引物对将其用于平行扩增不同的环化靶片段。单引物对的这种用途已在其它情况和应用中得到证实，例如，上文所述的US 7883849中公开的用于选择子探针。

显然，模板化靶ROI的连接的探针的部分(即，第二结合位点和第二茎序列)在连接和环化已经发生之后仍然可结合至可环化的链(例如，结合至靶ROI的互补序列)。因此，在本发明的一个实施方式中，探针的第二结合位点可以作为引物来启功滚环扩增。在一个替代的实施方式中，可将引物加入到样品中以起动滚环扩增。

尽管环化的靶片段的扩增是方便的，并且在该方法的许多应用中其也是优选的，但也可以以其它方式分离环化的靶片段(即，含有靶ROI的互补序列的环化链)，例如通过利用核酸外切酶来消化存在的线性分子，从而富集环状核酸，或者通过本领域已知的其它核酸分离或分馏程序进行。

上文所述的方法可用于产生在溶液中包含靶ROI的互补序列的环化分子也是显而易见的，因此，该方法可以以均质的方式(homogenous format)进行。然而，在一个可替代的实施方式中，可在杂交至靶核酸分子之前或之后或者事实上在该方法的任何阶段，将探针固定在固相支持物上。如上文所述，固定探针或靶片段的手段可以是通过在探针中引入间插序列或间隔子元件的方式。

间插序列或间隔子元件可以在第一靶结合位点与茎环结构、茎环结构的5’之间，或者位于茎环结构的环中，在第二结合位点的5’末端与第二茎序列之间，并且可被杂交至互补核酸分子，从而形成部分双链核酸探针。在第一实施方式中，间插序列或间隔子元件可被附接至固相载体。在第二实施方式中，该互补核酸分子可被附接至固相支持物。在一些实施方式中，第二茎序列可被直接或间接附接至固相支持物。在又一实施方式中，间插序列或间隔子元件可以是第三结合位点的5’方向，并且可被杂交至互补核酸分子，从而形成部分双链核酸探针，并且探针或其互补核酸分子可被附接至固相支持物。

在一些实施方式中，一个或多个间隔序列可以位于茎环结构的茎的3’方向。

以此类推，当探针是部分双链时，间插序列或间隔子元件可以位于第一靶结合位点和探针的双链区域之间，在双链区域的第二链5’方向，或者位于双链区域的第一链5’方向，并且可被杂交至互补核酸分子，从而形成包含超过一个双链区域的部分双链核酸探针。如上所述，间插序列或其互补序列可以类似地被附接至固相支持物。

在有一个具体实施方式中，本发明还提供了选择靶核酸分子中的靶目标区域(ROI)的方法，其中所述ROI位于靶分子的5’末端，所述方法包括：

(a)提供探针，该探针包含：

(i)第一靶结合位点，位于探针的3’末端区域处，该结合位点能够杂交至该靶分子中的互补结合位点，所述互补结合位点是ROI的3’末端侧翼的3’旁侧序列，并且能够在靶-模板化延伸反应中被延伸以产生靶分子的互补序列，所述靶互补序列包含所述3’旁侧序列以及ROI的互补序列；和

(ii)第二结合位点，其与ROI或与其5’末端同源，并且能够杂交至所述靶互补序列中的ROI或与其5’末端的互补序列；中

(iii)另外的探针序列，其位于第二结合位点的3’方向，其与3’旁侧序列同源并且与第一结合位点互补；

其中所述探针作为寡核苷酸提供，所述寡核苷酸包含茎环结构，其在该结构的环中包含第二结合位点和该另外的探针序列，并且在第二结合位点和该另外的探针序列的3’方向进一步包含切割位点，该切割位点可切割以打开所述环，从而使第二结合位点和另外的探针序列可用于结合，所述寡核苷酸还在所述探针的3’末端包括单链区域，该单链区域在其3’末端包含第一结合位点；或

其中所述探针作为部分双链的构建体提供，该构建体包含第一链和第二链，第一链包含在其3’末端包括第一结合位点的单链3’末端区域，且第二链在所述第一链的5’末端杂交，并且包含单链3’末端区域，其在该单链区域的3’末端包括第二结合位点和该另外的探针序列；

(b)使探针与靶分子接触，并且允许位于探针的3’末端处的第一靶结合位点杂交至靶分子中的其互补结合位点，其中该靶分子至少部分是单链的，且在该单链区域中包括该互补结合位点和可选地ROI；

(c)利用靶分子作为延伸模板来延伸探针的杂交的3’末端，以产生靶分子的互补序列；

(d)除去靶分子，留下延伸的探针，所述延伸的探针在所延伸的区域中从3'至5'包括靶分子的ROI以及3'旁侧序列的互补序列，其中第二结合位点保留在探针中；

(e)允许延伸的探针经历分子内重排，以使第二结合位点杂交至靶互补序列中的其互补结合位点，该靶互补序列是ROI或ROI的5'端的互补序列，并且该另外的探针序列杂交至第一结合位点，

其中，如果所述探针包含茎环结构，则重排包括在探针的茎环结构中的切割位点处切割延伸的探针，以释放包含第二结合位点的和该另外的探针序列的探针的3'端，从而产生包含第一延伸链和第二链的部分双链的构建体，第一延伸链包含靶互补序列和释放的5’末端，并且第二链杂交至茎中的第一链并且包含释放的3’末端，该释放的3’末端随后能够杂交至第一链中的其互补结合位点，

以使可选地第一延伸链的释放的5'端与第一延伸链的释放的3'端并置，以用于利用第二结合位点和该另外的探针序列作为连接模板直接或间接地彼此连接；

(f)将探针的延伸链的端直接或间接地彼此连接，以使探针的延伸链环化；

(g)扩增或分离环化的延伸链，从而选择ROI。

在一个具体的方面，第二结合位点同源于ROI的5’末端，并且能够杂交至ROI的5’末端的互补序列。

本文还提供了探针用于本发明的方法中的，所述探针包含：

(i)第一靶结合位点，位于所述探针的3’末端区域，该结合位点能够杂交至靶分子中的互补结合位点，所述互补结合位点是ROI的3’末端侧翼的旁侧序列，并且能够在靶-模板化延伸反应中被延伸以产生靶分子的互补序列，所述靶互补序列包含所述3’旁侧序列和ROI的互补序列；以及

(ii)第二结合位点，其与ROI或与其5’末端同源，并且能够在所述靶互补序列中杂交至ROI或其5’末端的互补序列；

(iii)另外的探针序列，位于第二结合位点的3’方向，其与所述3’旁侧序列同源并且与第一结合位点互补。

在一个方面，探针可作为寡核苷酸提供，所述寡核苷酸包含茎环结构，其在该结构的环中包含第二结合位点和另外的探针序列，并且在第二结合位点和另外的探针序列的3’方向进一步包含切割位点，该切割位点可切割以打开所述环，以使第二结合位点和另外的探针序列可用于结合，所述寡核苷酸还在探针的3’末端包括单链区域，该单链区域在其3’末端处包含第一结合位点。

在又一个方面，探针作为部分双链的构建体提供，该部分双链构建体包含第一链和第二链，第一链包含在其3’末端包括第一结合位点的单链3’末端区域，第二链在所述第一链的5’末端杂交，并且包含在该单链区域的3’末端处包括第二结合位点和该另外的探针序列的单链3’末端区域。

可以对根据本发明的方法选择的环化的靶片段互补序列或其扩增子进行检测。该检测可通过核酸读出平台来进行，包括测序或任何测序或任何序列分析程序、实时PCR和sRCA。可利用大量的已知手段对所选的和扩增的靶ROI进行检测和分析，例如，通过将检测探针杂交至可被标记的扩增产物，或者其可以参与进一步的信号产生或信号扩增反应，例如，基于连接的反应，例如，锁式探针，或用于OLA测定的探针。锁式探针可在进一步的扩增反应中进行检测，例如，在sRCA反应中。

因此，可以利用任意常规的方案来检测扩增反应的扩增产物，其可以非特异性地或特异性地检测扩增产物，如下文中更具体描述的。代表性的目标非特异性检测方案包括采用信号产生系统的方案，其选择性检测双链DNA产物，例如通过嵌插(intercalation)。发现用于这种实施方式中的代表性的可检测分子包括荧光核酸染色剂，例如菲啶鎓染料，包括单体或者其同二聚体或异二聚体，当其与核酸络合时显示增强的荧光。菲啶鎓染料的实例包括乙啶同二聚体、溴化乙啶、碘化丙啶和其它烷基取代的菲啶鎓染料。在本发明的另一实施方式中，核酸染色剂为吖啶染料或结合吖啶染料，或者其同二聚体或异二聚体，例如吖啶橙、吖啶同二聚体、乙啶-吖啶异二聚体,或9-氨基-6-氯-2-甲氧基吖啶。在本发明的又一实施方式中，核酸染色剂为吲哚或咪唑染料，例如Hoechst 33258、Hoechst 33342、Hoechst34580(BIOPROBES 34,Molecular Probes,Inc.Eugene,Oreg.,(2000年5月))DAPI(4',6-二脒基-2-苯基吲哚)或DIPI(4',6-(二咪唑啉基-2-基)-2-苯基吲哚)。其它允许使用的核酸染色剂包括，但不限于，7-氨基放线菌素D、羟芪巴脒、LDS 751、所选的补骨脂素(呋喃香豆素)、苯乙烯染料、金属络合物(例如钌络合物)和过渡金属络合物(例如，结合Tb³⁺和Eu³⁺)。在本发明的某些实施方式中，核酸染色剂可以是花青染料或者花青染料的同二聚体或异二聚体，当其与核酸结合时显示增强的荧光。可以使用在授予Lee的U.S.专利第4,883,867号(1989)、授予Yue等人的U.S.专利第5,582,977号(1996)、授予Yue等人的U.S.专利第5,321,130号(1994)、和授予Yue等人的U.S.专利第5,410,030号(1995)(全部四项专利通过引用并入本文)中描述的任何染料，包括以商标名TOTO、BOBO、POPO、YOYO、TO-PRO、BO-PRO、PO-PRO和YO-PRO出售的来自Molecular Probes,Inc.,Eugene,Oreg的可商购的核酸染色剂。在授予Haugland等人的U.S.专利第5,436,134号(1995)、授予Yue等人的U.S.专利第5,658,751号(1997)和授予Haugland等人的U.S.专利第5,863,753号(1999)(全部三项专利通过引用并入本文)中描述的的任何染料，包括以商标名SYBR Green,EvaGreen,SYTO,SYTOX,PICOGREEN、OLIGREEN和RIBOGREEN出售的来自Molecular Probes,Inc.,Eugene,Oreg的可商购的核酸染色剂。在本发明的其它实施方式中，核酸染色剂是单体的、同二聚体的或异二聚体的花青染料，其结合氮杂苯并唑鎓杂环或聚氮杂苯并唑鎓杂环，例如氮杂苯并噁唑、氮杂苯并咪唑或氮杂苯并噻唑，当其与核酸结合时产生增强的荧光，包括以商标名SYTO、SYTOX、JOJO、JO-PRO、LOLO、LO-PRO出售的来自Molecular Probes,Inc.,Eugene,Oreg的核酸染色剂。

在其它的实施方式中，通常与双链分子相反，特异性用于扩增产物的信号产生系统可被用于检测扩增。在这些实施方式中，信号产生系统可以包括特异性结合至在扩增产物中发现的序列的检测探针，其中可用直接或间接可检测的标记物标记该检测探针。直接可检测的标记物是可被直接检测而不需要使用另外的试剂的标记物，而间接可检测的标记物是可通过采用一种或多种另外的试剂检测的标记物，例如其中该标记物为由两种或更多种组分构成的信号产生系统的成员。在许多实施方式中，该标记物是直接可检测的标记物，其中直接可检测的目标标记包括，但不限于：荧光标记物、放射性同位素标记物、化学发光标记物等。在许多实施方式中，该标记物为荧光标记物，其中在该实施方式中所采用的标记试剂为荧光标识的(多种)核苷酸，例如，荧光标识的CTP(例如Cy3-CTP、Cy5-CTP)等。可用于标识用于产生标记的探针的核苷酸的荧光部分包括，但不限于：荧光素、花青染料，例如Cy3、Cy5、Alexa 555、Bodipy630/650等。也可以使用如本领域中已知的那些其它标记物，例如上文中所描述的那些。

在某些实施方式中，用“能量转移”标记物来标记特异性标记的检测探针。如本文中使用的，“能量转移”是指这样的过程：通过该过程，荧光基团的荧光发射通过荧光修饰基团被改变。如果该荧光修饰基团是淬灭基团，则来自该荧光基团的荧光发射减弱(淬灭)。能量转移可通过荧光共振能量转移或者通过直接能量转移而发生。在这两种情况中精确的能量转移机制是不同的。应该理解，在本申请中提及能量转移时均涵盖所有这些机制性差异现象。如本文中所使用的“能量转移对”是指参与能量转移的任意两个分子。通常，该分子中的一个起到荧光基团的作用，而另一个起到荧光修饰基团的作用。使用“能量转移对”来指代形成在其中发生能量转移的单个络合物的一组分子。这样的络合物可以包含，例如，可以是彼此不同的两个荧光基团和一个淬灭基团，两个淬灭基团和一个荧光基团，或者多个荧光基团和多个淬灭基团。在其中有多个荧光基团和/或多个淬灭基团的情况下，单个基团可以是彼此不同的。如本文中所使用的，“荧光能量共振转移”或“FRET”是指其中由受激荧光基团发射的光至少部分地被荧光修饰基团吸收的一种能量转移现象。如果该荧光修饰基团为淬灭基团，则该基团可作为不同波长的光辐射所吸收的光，或者可将其作为热耗散。FRET取决于荧光基团的发射光谱和淬灭基团的吸收光谱之间的重叠。FRET还取决于淬灭基团和荧光基团之间的距离。高于某一临界距离，淬灭基团就不能吸收由荧光基团发射的光，或者仅能够吸收少量。如本文中所使用的，“直接能量转移”是指其中荧光基团和荧光修饰基团之间的光子的通道不存在的一种能量转移机制。在不受单一理论的束缚的情况下，据信在直接能量转移中，荧光基团和荧光修饰基团干扰彼此的电子结构。如果荧光修饰基团为淬灭基团，那么这会导致该淬灭基团阻止荧光基团甚至发射光。

能量转移标记的检测探针(例如，寡核苷酸)可以以各种不同的方式来排布，只要其包括供体、受体和靶核酸结合结构域即可。这样，在本发明方法的这些实施方式中采用的能量转移标记的寡核苷酸为包括荧光团结构域(其中荧光能量供体(即供体)是被定位的)和受体结构域(其中荧光能量受体(即受体)是被定位的)的核酸检测器。如上文中所提到的，供体结构域包括供体荧光团。供体荧光团可以位于核酸检测器的任何位置，但其通常存在于检测器的5'终端处。受体结构域包括荧光能量受体。受体可以位于受体结构域的任何位置，但其通常存在于核酸检测器或探针的3'终端处。

除了荧光团和受体结构域之外，能量转移标记的探针寡核苷酸还包括靶核酸结合结构域，其结合于在目标扩增产物(如上文所述)中发现的靶核酸序列(例如，标签(例如条形码序列))。这样标记的寡核苷酸探针的具体实例包括

型探针，如在美国专利第6,248,526号中描述的，其公开内容通过引用并入本文(以及Held等人,GenomeRes.(1996)6:986-994；Holland等人,Proc.Natl Acad.Sci.USA(1991)88:7276-7280；和Lee等人,Nuc.Acids Res.(1993)21:3761-3766)。其它类型的探针结构的实例包括：Scorpion探针(如在Whitcombe等人,Nature Biotechnology(1999)17:804-807；美国专利第6,326,145号中所描述的，其公开内容通过引用并入本文)、Sunrise探针(如在Nazarenko等人,Nuc.Acids Res.(1997)25:2516-2521；美国专利第6,117,635号中所描述的，其公开内容通过引用并入本文)、Molecular Beacons(Tyagi等人,NatureBiotechnology(1996)14:303-308；U.S.专利第5,989,823号,其公开内容通过引用并入本文)，以及构象辅助的探针。

所述方法中的下一步是从标记的目标扩增产物中检测信号，信号检测可根据所采用的特定信号产生系统而变化。在某些实施方式中，在所述测定中仅可确定和使用存在或者不存在可检测信号(例如荧光)，(例如)以确定或鉴定储存在或不存在靶ROI(或者更具体地是ROI的互补序列)。根据所采用的特定标记，信号的检测可以指示存在或不存在靶ROI。

在在信号产生系统为荧光信号产生系统的那些实施方式中，信号检测通常包括从反应混合物检测荧光信号中的变化以获得测定结果。换言之，由反应混合物产生的荧光信号中的任何调整都会被评估。该变化可以是荧光的增加或减少，这取决于所采用的标记物的性质，但在某些实施方式中为荧光增加。可采用任意常规方式(例如适合的荧光计，例如耐热玻璃管或读板器荧光计)来筛选样品以用于增加荧光，或者其中样品可以为显微镜载玻片上的组织样品，可以利用荧光显微镜来检测荧光。利用已知的荧光计来适当地监测荧光。来自这些设备的信号(例如以光电倍增管电压的形式)被发送至数据处理器主板并被转化为与每个样品管相关的光谱。能够同时评价多个管(例如96个管)。因此，在一些实施方式中，可以平行检测多个靶，而在其它实施方式中，可以顺序检测多个靶。

当检测方案为实时方案时，例如在实时PCR反应方案中采用的，可在整个反应中以频繁的时间间隔(例如每3分钟一次)以这样的方式来收集数据。通过在每一循环过程中监测来自样品的反应性分子的荧光，能够以各种方式来监测扩增反应的进程。例如，可对由熔融峰提供的数据进行分析，例如，通过计算熔融峰下面积并且将这些数据对循环数作图。

以这种方式产生的光谱可被分解，例如，利用预先选择的荧光部分(例如染料)的“拟合(fits)”，以形成代表每个信号部分(即，荧光团)的峰。能够确定代表每个信号的强度值的峰下面积，并且如果需要的话，表示为彼此的商。信号强度和/或比值的微分将允许通过反应或者在不同反应条件(例如温度)下使待记录的标记的探针发生变化。这些变化与检测探针和靶序列之间的结合现象或者结合至靶序列的检测探针的降解有关。微分峰下面积的积分将允许计算针对标记物影响的强度值。

针对荧光变化来筛选混合物提供了一个或多个测定结果，这取决于在引物延伸反应结束时样品是否被筛选过一次，或多次，例如在扩增反应的每一次循环之后(例如，如在实时PCR监测中进行的)。

如上文所述产生的数据能够以各种方式被解释。在其最简单的方式中，在扩增反应过程中或结束时来自样品的荧光增加或减少是样品中存在的靶数量增加的指征，例如，与在反应混合物中检测到的扩增产物的量有关，提示扩增反应已经开始进行并且因此在初始样品中实际上存在靶标的事实。通过在整个扩增过程中监测扩增反应也可以进行定量化。如上文所述，定量分析还可以包括测定反应混合物中的一个或多个核酸对照。

本发明的方法可以具有多种用途和应用。一种这样的用途可为制备用于测序或其它序列分析的底物或模板。如上文所述，该方法也可以用于检测，例如用于鉴别靶ROI或用于检测给定样品中特定靶ROI的存在或不存在，或者量或水平。因此，该方法可用于检测靶生物体，例如样品中的病原体，其可用于临床或用于研究或其它目的，例如流行病学研究或用于研究微生物耐受性等等。此外，该方法可以发现筛选或检测罕见突变的效用，例如，当筛选癌症中(例如在循环肿瘤细胞中)的微小残留病(minimal residual disease)时，尤其是当与敏感性检测策略例如sRCA组合使用时。

如上所述，本发明的方法具有许多益处，包括用于这样的应用中。例如，其不要求存在探针的正确5’和3’末端从而用于发生选择，条件是第一靶结合区域能够结合至其互补序列。N-1和N-2缺失在合成核酸中是经常存在的，尤其是当使用较长的寡核苷酸时。对于环化，其也要求待环化的寡核苷酸的5’末端为磷酸化的。如果使用大量的探针，则探针的5'磷酸化是一种技术障碍并且成本高昂。合成的核酸探针可在其5’末端经常缺少磷酸基团，一旦其被选择后便能够阻止靶核酸分子的连接和环化，例如在选择子探针的情形中。因此，本发明绕过了这两个障碍来选择靶核酸序列，减少了与保证使用高度同源的磷酸化核酸探针有关的成本。

有利地，如上文提到的，本发明可以是均质(非固相体)或基于固相体的形式。因此，所选的靶核酸可被原位鉴定或者在基于阵列的测定中利用一些本领域中已知的技术来鉴定。使用固相体可以使洗涤步骤能够被包括或有助于洗涤步骤被包括。

探针以及可选的用于实施本发明方法的其它组分可以方便地以试剂盒的形式提供。

因此，在本发明的又一个方面，提供了一种试剂盒，更具体的提供了用于选择靶核酸分子中的靶ROI的试剂盒，所述试剂盒包含：

(a)本发明前文中所定义的探针；以及可选地一个或多个选自下列的的另外组分：

(b)用于切割探针的茎环结构中的切割位点的工具，例如一种或多种限制性酶或切口酶；

(c)用于切割第二切割位点的工具，如果存在的话，例如一种或多种如上文所述的切割酶；

(d)当5’旁侧序列位于靶分子的5’末端内部时，用于降解延伸的探针的3’末端的工具，例如3’→5’核酸外切酶；

(e)用于延伸探针的工具，例如，聚合酶，其可具有链置换活性；

(f)连接酶；

(g)一个或多个空位寡核苷酸；

(h)用于扩增包含靶片段的互补序列的环化的延伸链的工具，例如，一个或多个扩增引物(例如，PCR引物)和/或扩增酶(例如，聚合酶，例如phi29或用于RCA的另一链置换聚合酶、或适用于PCR的聚合酶，如本领域中已知的)；

(i)用于检测环化的延伸链(包含靶片段互补序列)或其扩增子的工具，例如，一个或多个检测探针，或标记物，或用于进一步检测反应的工具，例如，用于实施sRCA反应的工具，例如用于sRCA反应的引物，用于sRCA反应的模板，或锁式探针等，如上文所述。

该试剂盒组分可以存在于单独容器中，或一个或多个组分可以存在于同一容器中，其中该容器可以是贮存容器和/或在试剂盒为其而设计的测定中采用的容器。

除了上述组分之外，所述的试剂盒还可以进一步包括用于实施所述方法的说明。这些说明可以以各种形式存在于所述试剂盒中，在该试剂盒中可以存在一个或多个。这些说明可存在的一种形式可以是印刷在合适的介质或基材上的信息，例如在试剂盒包装中、药品说明书等中印刷有信息的一张或多张纸。其它方式可以是计算机可读介质，例如其中已经录制了信息的磁盘、CD、闪存驱动器等等。可存在的其它方式可以是网络地址，其可以在删除站点通过互联网登录信息来使用。任何常规形式都可以存在于试剂盒中。

附图说明

在以下的非限制性实施例中将参照附图进一步描述本发明，其中：

图1示出了本发明的针对靶核酸分子的方法，其中位于靶ROI侧翼的5’旁侧序列处于靶分子的末端。本发明的探针结合至位于靶ROI侧翼的3’旁侧序列，并且被延伸以产生靶分子的互补序列。靶分子随后被除去。切割茎环结构的茎或环，释放包含第二结合位点的探针的3’末端，并使其杂交至延伸链中的其互补结合位点。然后连接延伸链的末端，并且可扩增或分离环化的延伸链。虚线表示与靶ROI具有相同取向(5’→3’)的序列。

图2示出了针对靶核酸分子的方法，其中位于靶ROI侧翼的5’旁侧序列位在靶分子的5’末端的内部。该探针可包含与邻近于5’旁侧序列的5’的切割序列同源的第三结合位点。5’旁侧区的互补序列能够杂交至第三结合位点，产生第二切割位点。在第二切割位点和茎环结构的茎或环中的切割位点处切割杂交的探针，释放延伸链的3’末端，其可如图1中所示被环化。虚线表示与靶ROI具有相同取向(5’→3’)的序列。

图3示出了本发明的方法，其中第二切割位点不是位于第三结合位点的3’末端，并且序列的一部分保留在切割后的第一链的3’末端。该探针在第二结合位点的5’方向包含，与靶互补序列中的序列互补的序列，该序列互补于第三结合位点(用*标记)。如图2中所示发生第二切割位点和茎或环的切割。虚线表示与靶ROI具有相同取向(5’→3’)的序列。

图4示出了本发明的方法，其中探针包含茎环结构的的5’方向的第四靶结合序列，其与紧邻于位于靶ROI侧翼的3’旁侧序列的3’方向的区域互补。

图5示出了本发明的针对靶核酸分子的方法，其中位于靶ROI侧翼的5’旁侧序列在靶分子的5’末端内部，并且探针不包含第三结合位点。如图1中所示进行茎环结构中的茎或环的切割，并且5’旁侧序列的互补序列杂交至第二结合位点，形成具有突出的3’悬突的环状结构。该悬突可通过具有3’→5’核酸外切酶活性的任何酶被消化。虚线表示与靶ROI具有相同取向(5’→3’)的序列。

图6示出了利用具有茎环结构的环内的限制酶切割位点的探针通过本发明的方法检测基因组DNA的结果。A)仅在存在靶、限制酶和连接酶时观察到阳性信号。与具有RCA扩增的反应相比，无RCA扩增(-phi29)的反应的信号减少表示在RCA后的酶切后延伸的探针的成功环化。重复测量的计算结果为CV～18.5％。B)用4％琼脂糖凝胶来证实PCR产物。

图7示出了利用具有茎环结构的茎内的切口酶切割位点的探针通过本发明的方法检测基因组DNA的结果。A)仅在存在靶、限制酶和连接酶时观察到阳性信号。与具有RCA扩增的反应相比，无RCA扩增(-phi29)的反应的信号减少表示在RCA后的酶切后延伸的探针的成功环化。重复测量的计算结果为CV～10.3％。用4％琼脂糖凝胶(B)和Sanger测序(C)来证实PCR产物。

图8示出了通过本发明的方法原位检测hTERTmRNA的结果。用两种不同的荧光团来标记RCA产物；一种被设计为特异性用于标记正确选择的靶序列，而另一种被设计为用于标记探针中的嵌入序列。预期正确的信号含有两种颜色并且仅当存在所有酶时可观察到。

图9示出了利用以其5’末端固定在固相支持物上的探针通过本发明的方法检测微RNA(微RNA)的结果。仅当存在靶时观察到阳性信号。

图10示出了本发明的方法，其中探针包含茎环结构的环中的第三结合位点，在茎环结构中的第二结合位点和切割位点之间。因此该第三结合位点在茎环结构中的切割位点的5’方向。该第三结合位点使靶互补序列的3’方向的多余序列的切割模板化，释放靶互补序列的3’末端用于连接。

图11示出了本发明的针对靶核酸分子的方法，其中位于靶ROI侧翼的5’旁侧序列在靶分子的5’末端的内部。该探针在其5’末端包含生物素部分(其可用于从样品中选择性除去未切割的探针)以及切割位点的3’方向的另外的序列(其可用于固定切割的和延伸的探针)(例如，用于原位检测)。

图12示出了图11的本发明的方法，其中探针在茎环结构的环中包含另外的发夹结构，其可被限制酶(在本例中为MlyI)切割。

图13示出了本发明的方法，其中探针在其环中包含另外的探针序列，其与靶核酸分子的3’旁侧区同源(并且互补于第一结合位点)。该探针进一步包含(另外的结合位点的5’方向)第二结合位点，其与ROI同源。同时，第二结合位点和另外的探针序列能够杂交至靶核酸分子的互补序列(即，3’旁侧区的互补序列和ROI的互补序列)以模板化探针的第一延伸链的环化。

具体实施方式

实施例1-基因组DNA的检测。

利用本发明的方法来检测基因组DNA的一部分中的靶ROI。靶核酸分子包含位于靶ROI侧翼的5’旁侧序列的HaeIII切割位点5’方向，并且利用包含与该区域同源的第三结合位点的探针来进行该检测。在茎环结构中具有限制酶切割位点(ExCirc_1)和切口酶切割位点(ExCirc_2)的探针被用于选择靶ROI。表1中示出了用于检测KRAS靶目标区域的探针的序列。茎环结构的茎以斜体示出。ExCirc_1探针被设计为结合至KRAS_1靶序列的一部分，且ExCirc_2探针被设计为结合至KRAS_2靶序列的一部分。表2中示出了靶序列。将大约1e5的人类基因组(Promega)和本发明的100nM的探针在20μl延伸混合物中混合，该延伸混合物由1x EINAR缓冲液(50mM KAc,20mM Tris-HAc pH 7.6,3mM MgAC₂)、0.06U/μl PlatinumTaqDNA聚合酶(Invitrogen)、0.2mM d(A,T,G,C)TP(Thermo Scientific)组成。延伸在95℃下进行5分钟并且在60℃下进行1分钟。在每一反应中加入1μl的蛋白酶K(ThermoScientific)，随后在37℃下孵育30分钟并在95℃下孵育20分钟。在表1中定义了ExCirc_1(包含限制酶切割位点)和ExCirc_2(包含切口酶切割位点)。探针中的切割位点以粗体表示。

表1.用于选择KRAS靶ROI的探针的列表

表2.KRAS靶序列的列表

对于ExCirc_1探针，向每一延伸反应加入5μl的切割和连接混合物，随后在37℃下孵育30分钟并在55℃下孵育20分钟，该切割和连接混合物由1x EINAR缓冲液、1U/μl的每一种限制酶(HaeIII(NEB)和MlyI(NEB))、2.5mMNAD(Sigma-Aldrich)、0.1U/μl Ampligase连接酶(Epicenter Biotechnology)组成。

对于ExCirc_2探针，向每一延伸反应加入5μl的切割混合物，随后在37℃下孵育30分钟并在85℃下孵育20分钟，该切割混合物由1x EINAR缓冲液、1U/μlHaeIII和1U/μlNb.BtsI(NEB)组成。

向每一切割产物加入5μl的连接混合物，接着在55℃下孵育15分钟，该连接混合物由1x EINAR缓冲液、3mM NAD、0.12U/μl ampligase连接酶组成。在环化之后，将10μl的RCA混合物加入至10μl的连接产物，随后在37℃下孵育60分钟并在65℃下孵育15分钟，该RCA混合物由1x EINAR缓冲液、0.4μg/μlBSA(NEB)、0.5mM d(A,T,G,C)TP、0.04U/μl phi29DNA聚合酶(Thermo Scientific)组成。在RCA之后，将10μl的PCR混合物加入至10μl的RCA产物，该PCR混合物由1x EINAR缓冲液,200nM CLR_Kras正向和反向引物(参见表3)、1xSYBR(分子探针)、0.12U/μl Platinum Taq DNA聚合酶、0.4mM d(A,U,G,C)TP(Thermo Scientific)、0.004U/μl UNG(Thermo Scientific)组成。在StralabeleneMX3005PCR仪(AgilentTechnologies)中进行实时PCR，利用如下温度曲线(thermalprofile)进行：开始在95℃下进行2分钟，随后以95℃持续15秒和60℃持续1分钟进行45次循环。

表3.用于检测KRAS靶ROI的PCR引物的列表

SEQ ID NO:	引物名称	序列
			5	CLR_KRAS_1	CGTGCCTTGACGATACAGCTAA
6	CLR_KRAS_2	CAAGGCACTCTTGCCTACG

在图6和图7中分别示出了利用在茎环结构的环中包含限制酶和切口酶切割位点的探针进行的基因组DNA的检测的结果。这两幅图的部分(A)示出了当在该检测方法中使用靶核酸以及第一和第二切割酶时仅检测到阳性信号。这两幅图的部分(B)指示了在两种情况下选择靶ROI，以及当不存在靶核酸分子、HaeIII或ampligase(DNA连接酶)时不发生选择。图7的部分(C)指示了选择了正确的序列，并且其是用或不用环化的延伸链滚环扩增可检测的。

实施例2-原位mRNA的检测

使BJhTERT细胞在超级防脱金印载玻片(Superfrost Plus Gold Slides，ThermoScientific)上生长，并在3％(w/v)多聚甲醛(Sigma-Aldrich)于1x PBS中的溶液中在室温下固定30分钟。在固定之后，将细胞在DEPC处理的1x PBS中洗涤两次并用乙醇系列脱水。在风干之后，将载玻片在-80℃下储存。在研究前，使用secure-Seal^TMSpacers(d＝8mm)(Life Technologies)在载玻片上制造50μl反应室。在整个实验方案中，在每次孵育和加入新的反应混合物之间用DEPC处理的1xPBS、0.05％Tween-20进行两次洗涤。首先，用封闭缓冲液在37℃下孵育细胞1小时，该封闭缓冲液由2x SSC、1U/μl RiboLock RNA酶抑制剂(Thermo Scientific)、1μg/μl BSA、1μg/μl鲑鱼精DNA(Invitrogen)、1μg/μl E.coli tRNA(Sigma-Aldrich)组成。

将封闭缓冲液中的50μl的100nM的ExCirc_hTERT探针加入到细胞中，随后在37℃下孵育1小时。该探针包含茎环结构的第四结合位点5’方向。表4中示出了所使用的探针的序列–以粗体表示切割位点。以斜体示出茎环结构的茎。表5中示出了hTERT靶序列的序列。接着，将50μl的延伸混合物加入至细胞，随后在55℃下孵育60分钟，该延伸混合物由1x RT缓冲液(Thermo Scientific)、0.2μg/μlBSA(NEB)、0.5mM d(A,T,G,C)TP(ThermoScientific)、10U/μl RevertAid H Minus逆转录酶(Thermo Scientific)、1U/μlRiboLock RNA酶抑制剂组成。

表4.用于检测hTERT mRNA的探针的序列

表5.hTERT靶序列的序列

在用3.7％(w/v)多聚甲醛在室温下后固定5分钟之后，将50μl的切割混合物加入至细胞，接着在37℃下孵育30分钟，该切割混合物由1x CutSmart缓冲液(NEB)、0.5U/μlNb.BtsI、0.1U/μl RNA酶H(Thermo Scientific)、0.5U/μl AluI和1U/μl RiboLock RNA酶抑制剂组成。切割后，向细胞加入50μl的连接混合物，随后在37℃下孵育30分钟，该连接混合物由1x CutSmart缓冲液、0.3U/μl T4DNA连接酶和0.5mM ATP组成。接着，向细胞加入50μl的RCA混合物，随后在37℃下孵育60分钟，该RCA混合物由1x phi29缓冲液(ThermoScientific)、0.2μg/μlBSA、0.25mM d(A,T,G,C)TP、2.5％甘油(Sigma-Aldrich)和0.5U/μlphi29DNA聚合酶组成。

通过将50μl检测混合物(含有100nM检测寡核苷酸在2x SSC中的溶液、20％甲酰胺(Sigma-Aldrich))在37℃下孵育20分钟来使RCA产物可视化。用含有100ng/ml DAPI(Olink)的抗荧光淬灭剂(anti-fade medium)封固载玻片，并用40倍油性物镜的AxioplanII落射荧光显微镜(Zeiss)来成像，其分别具有Cy3和Cy5的激发和发射滤波器且暴露时间为2000ms和8000ms。检测寡核苷酸被设计为检测靶ROI中的特异性序列(ExCirc_hTERT_检测1)(参见表5，加下划线的序列)或引入到探针中的序列元件(ExCirc_hTERT_检测2)(参见表4，加下划线的序列)，并且在表6中示出。

表6.用于检测hTERT靶ROI的检测寡核苷酸

SEQ ID NO:	寡核苷酸名称	序列
			9	ExCirc_hTERT_检测1	Cy3-CAGCCCGTCCCGCCG
10	ExCirc_hTERT_检测2	Cy5-TGCGAGTCCGTCTUUU

探针的非特异性连接导致形成环状核酸分子，该环状核酸分子包含引入到探针(但不是靶ROI)中的序列元件，并且仅在Cy5通道中检测到扩增产物。特异性连接(即，根据本发明的方法)导致包含引入到探针中的序列元件和靶ROI序列的核酸分子的形成和扩增。在Cy3和Cy5通道中均检测到扩增产物(参见图8)。

实施例3–合成微RNA的检测

在37℃下将本发明的1pM 50μl的5’生物素标记的探针(ExCirc_miR208b，参见表7)固定在1x PBS中的涂布有链霉亲和素的Codelink载玻片(SurModics)上60分钟。茎环结构的茎以斜体表示。使用Secure-Seal^TMSpacer(d＝8mm)在载玻片上制造50μl反应室。在整个实验方案中，在每次孵育和添加新的反应混合物之间用1x PBS、0.05％Tween20进行两次洗涤。

表7.用于检测miRNA的探针的序列

将100nM的合成微RNA(合成_RNA_miR208b–参见表8)施加于载玻片并在37℃下孵育60分钟以允许杂交。接着，向载玻片加入50μl的延伸混合物，随后在37℃下孵育30分钟，该延伸混合物由1x RT缓冲液、0.2μg/μl BSA、0.5mM d(A,T,G,C)TP、10U/μl RevertAid HMinus逆转录酶组成。

表8.在本发明的方法中检测的miRNA

SEQ ID NO:	miRNA名称	序列
			12	合成_RNA_miR208b	AUAAGACGAACAAAAGGUUUGU

将50μl切割混合物加入至载玻片，之后在37℃下孵育30分钟，该切割混合物由1xNEBuffer 4(NEB)、0.5μg/μl BSA、0.5U/μl Nb.BtsI组成。将50μl的连接混合物加入至载玻片，之后在37℃下孵育30分钟，该连接混合物由1x NEBuffer4、0.5μg/μl BSA、0.3U/μlT4DNA连接酶、0.5U/μl RNA酶H、0.5mM ATP组成。接着，将50μl的RCA混合物加入至载玻片，之后在37℃下孵育30分钟，该RCA混合物由1x phi29缓冲液、0.25mM d(A,T,G,C)TP和0.5U/μl phi29DNA聚合酶组成。

通过将50μl检测混合物(含有100nM检测寡核苷酸(ExCirc_miR208b_检测–参见表9)在2x SSC中的溶液、20％甲酰胺)在37℃下孵育20分钟来使RCA产物可视化。用抗荧光淬灭剂(Olink)封固载玻片，并用20倍物镜的Axioplan II落射荧光显微镜(Zeiss)来成像，其具有Cy3的激发和发射滤波器且暴露时间为800ms。

表9.用于检测miR208miRNA的检测寡核苷酸

SEQ ID NO:	寡核苷酸名称	序列
			13	ExCirc_miR208b_检测	Cy3-CAGTGAATGCGAGTCCGTCT

仅在其中靶miRNA已被加入到固定的寡核苷酸的载玻片上检测到扩增产物(参见图9)。

序列表

<110> 欧凌科生物科技公司

<120> 选择靶核酸序列的方法

<130> 27.35.121033/02

<150> GB 1413718.6

<151> 2014-08-01

<160> 16

<170> PatentIn版本3.5

<210> 1

<211> 119

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> ExCirc_1

<400> 1

cattattttt attataaggc ctggcgcatg cgtcctcctg ctgaaaatga ctggggggac 60

tcgaaaacga gtccccccag gacgcatgcg ccctctattg ttggatcata ttcgtccac 119

<210> 2

<211> 106

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> ExCirc_2

<400> 2

gtcacatttt cattattttt attataaggc ctgcgtgctt gtgcagtgcc tgctgaaaat 60

gaccaggcac tgcacaagca cggaattgtt ggatcatatt cgtcca 106

<210> 3

<211> 140

<212> DNA

<213> 智人

<400> 3

cattattttt attataaggc ctgctgaaaa tgactgaata taaacttgtg gtagttggag 60

ctggtggcgt aggcaagagt gccttgacga tacagctaat tcagaatcat tttgtggacg 120

aatatgatcc aacaatagag 140

<210> 4

<211> 150

<212> DNA

<213> 智人

<400> 4

gtcacatttt cattattttt attataaggc ctgctgaaaa tgactgaata taaacttgtg 60

gtagttggag ctggtggcgt aggcaagagt gccttgacga tacagctaat tcagaatcat 120

tttgtggacg aatatgatcc aacaatagag 150

<210> 5

<211> 22

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> CLR_KRAS_1

<400> 5

cgtgccttga cgatacagct aa 22

<210> 6

<211> 19

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> CLR_KRAS_2

<400> 6

caaggcactc ttgcctacg 19

<210> 7

<211> 149

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> ExCirc_hTERT

<400> 7

tacggcgaca tggagaacaa gctgtttttt tttttttttt tttttttcgt gcttgtgcag 60

tgctgtttgc ggggattaca gcactgcaca agcacggaag agtgaatgcg agtccgtctc 120

aacaagaaat catccaccaa acgcaggag 149

<210> 8

<211> 72

<212> DNA

<213> 智人

<400> 8

tacggcgaca tggagaacaa gctgtttgcg gggattcggc gggacgggct gctcctgcgt 60

ttggtggatg at 72

<210> 9

<211> 15

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> ExCirc_hTERT_检测1

<220>

<221> misc_feature

<222> (1)..(1)

<223> Cy3

<400> 9

cagcccgtcc cgccg 15

<210> 10

<211> 16

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> ExCirc_hTERT_检测2

<220>

<221> misc_feature

<222> (1)..(1)

<223> Cy5

<400> 10

tgcgagtccg tctuuu 16

<210> 11

<211> 118

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> ExCirc_miR208b

<400> 11

tttttttttt tttttttttt tctctctctc agctcactgg cagtgataag acgaattatc 60

actgccagtg agctagactt attgcggagt gaatgcgagt ccgtctacaa accttttg 118

<210> 12

<211> 22

<212> RNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 合成RNA_miR208b

<400> 12

auaagacgaa caaaagguuu gu 22

<210> 13

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> ExCirc_miR208b_检测

<220>

<221> misc_feature

<222> (1)..(1)

<223> Cy3

<400> 13

cagtgaatgc gagtccgtct 20

<210> 14

<211> 145

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> PCR产物

<220>

<221> misc_feature

<222> (1)..(1)

<223> n为a、c、g或t

<220>

<221> misc_feature

<222> (72)..(72)

<223> n为a、c、g或t

<220>

<221> misc_feature

<222> (95)..(95)

<223> n为a、c、g或t

<400> 14

ncaaggcact cttgcctacg ccaccagctc caactaccac aagtttatat tcagtcattt 60

tcagcaggca cngcacaagc acggaattgt tggancatat tcgtccacaa aatgattctg 120

aattagctgt atcgtcaagg cacga 145

<210> 15

<211> 143

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 参照序列

<400> 15

caaggcactc ttgcctacgc caccagctcc aactaccaca agtttatatt cagtcatttt 60

cagcaggcac tgcacaagca cggaattgtt ggatcatatt cgtccacaaa atgattctga 120

attagctgta tcgtcaaggc acg 143

<210> 16

<211> 145

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> PCR产物

<220>

<221> misc_feature

<222> (1)..(1)

<223> n为a、c、g或 t

<220>

<221> misc_feature

<222> (41)..(42)

<223> n为a、c、g或t

<220>

<221> misc_feature

<222> (57)..(57)

<223> n为a、c、g或t

<220>

<221> misc_feature

<222> (95)..(95)

<223> n为a、c、g或t

<220>

<221> misc_feature

<222> (107)..(107)

<223> n为a、c、g或t

<220>

<221> misc_feature

<222> (109)..(110)

<223> n为a、c、g或t

<220>

<221> misc_feature

<222> (113)..(113)

<223> n为a、c、g或t

<400> 16

ncaaggcact cttgcctacg ccaccagctc caactaccac nngtttatat tcagtcnttt 60

tcagcaggca ctgcacaagc acggaattgt tggancatat tcgtccncnn aangattctg 120

aattagctgt atcgtcaagg cacga 145

Claims (60)

1.一种在靶核酸分子中选择靶目标区域(region of interest，ROI)的方法，在所述靶核酸分子中所述ROI的侧翼具有3’旁侧序列和5’旁侧序列，所述方法包括：

(a)提供探针，所述探针包含：

(i)第一靶结合位点，位于所述探针的3’末端区域处，该结合位点能够杂交至所述靶核酸分子中的互补结合位点，所述互补结合位点是所述ROI的3’末端侧翼的3’旁侧序列，并且其能够在靶-模板化延伸反应中被延伸以产生所述靶核酸分子的互补序列，所述靶核酸分子的互补序列包含所述3’旁侧序列以及至少所述ROI和所述5’旁侧序列的互补序列；和

(ii)第二结合位点，其与位于所述ROI的5’末端侧翼的所述5’旁侧序列同源，并且能够杂交至所述靶核酸分子的互补序列中的所述5’旁侧序列的互补序列；

其中所述探针作为寡核苷酸提供，所述寡核苷酸包含茎环结构，其在该结构的所述环中包括第二结合位点，并且进一步包括位于所述第二结合位点的3’方向的切割位点，该切割位点可切割以打开所述环，从而使第二结合位点能用于结合，并且所述寡核苷酸还在3’末端包括单链区域，该单链区域包括第一靶结合位点；或

其中所述探针作为部分双链的构建体提供，所述部分双链的构建体包含第一链和第二链，所述第一链包含在其3’末端处包括所述第一靶结合位点的单链3’末端区域，且所述第二链在所述第一链的5’末端处杂交并且包含包括所述第二结合位点的单链3’末端区域；

(b)使所述探针与所述靶核酸分子接触，并且允许位于所述探针的3’末端处的所述第一靶结合位点杂交至所述靶核酸分子中的其互补结合位点，其中所述靶核酸分子至少部分是单链的，且单链区域包括包含所述互补结合位点的区域，或包括包含所述互补结合位点、所述ROI和所述5’旁侧序列的区域；

(c)利用所述靶核酸分子作为延伸模板来延伸所述探针的杂交的3’末端，以产生所述靶核酸分子的互补序列；

(d)除去所述靶核酸分子，留下延伸的探针，所述延伸的探针在所延伸的区域中从3'至5'包括所述靶核酸分子的所述5'旁侧序列、所述ROI和所述3'旁侧序列的互补序列，其中所述第二结合位点保留在所述探针中；

(e)允许所述延伸的探针经历分子内重排，以使所述第二结合位点杂交至所述靶核酸分子的互补序列中的其互补结合位点，所述靶核酸分子的互补序列中的其互补结合位点是所述靶核酸分子的所述5'旁侧序列的互补序列，

其中，当所述探针包含茎环结构时，所述重排包含在所述探针的所述茎环结构中的所述切割位点处切割所述延伸的探针，以释放包含所述第二结合位点的所述探针的3'末端，从而产生包含第一延伸链和第二链的部分双链的构建体，所述第一延伸链包含所述靶核酸分子的互补序列，并且所述第二链杂交至所述茎中的所述第一延伸链并且包含释放的3’末端，所述释放的3’末端随后能够杂交至所述第一延伸链中的其互补结合位点，并且

其中，当所述5’旁侧序列位于所述靶核酸分子的5’末端的内部，并且所述第一延伸链中的所述靶核酸分子的互补序列含有位于所述5’旁侧序列的互补序列的3’方向的另外的序列时，所述重排包含所述另外的序列中的切割或所述另外的序列的切割，以释放包含所述第二结合位点的互补结合位点的所述第一延伸链的3’末端，

以使所述第一延伸链的5’末端与所述第一延伸链的3’末端并置，以用于利用所述第二结合位点作为连接模板直接或间接地彼此连接，其中当所述探针包含茎环结构时，用于连接的5’末端通过所述茎环结构中的切割而释放，并且当所述5’旁侧序列位于所述靶核酸分子的5’末端的内部时，用于连接的3’末端通过所述另外的序列中的切割或所述另外的序列的切割而释放；

(f)将所述探针的延伸链的末端直接或间接地彼此连接，以使所述探针的延伸链环化；

(g)扩增或分离环化的延伸链，从而选择所述ROI。

2.如权利要求1所述的方法，其为选择靶核酸分子中的靶ROI的方法，所述方法包括：

(a)提供包含茎环结构和在3’末端处的单链区域的探针，其中所述3’末端区域包含能够杂交至所述靶核酸分子中的互补结合位点的第一靶结合位点，所述互补结合位点是所述ROI的3’末端侧翼的旁侧序列，并且所述环包含第二结合位点，所述第二结合位点与所述ROI的5’末端侧翼的旁侧序列同源并且能够杂交至该5’旁侧序列的互补序列，并且其中所述茎环结构进一步包含位于所述第二结合位点的3’方向的切割位点，以使所述切割能够打开所述环；

(b)使所述探针与靶核酸分子接触并允许所述探针的3’末端处的所述第一靶结合位点杂交至所述靶核酸分子中的其互补结合位点，其中所述靶核酸分子至少部分是单链的，且单链区域包括所述互补结合位点的区域，或包括包含所述互补结合位点、所述ROI和所述5’旁侧序列的区域；

(c)利用所述靶核酸分子作为延伸模板来延伸所述探针的杂交的3’末端，以产生所述靶核酸分子的互补序列；

(d)除去所述靶核酸分子，留下延伸的探针，所述延伸的探针在所延伸的区域中从3'至5'包括所述靶核酸分子的5'旁侧序列、所述ROI以及3'旁侧序列的互补序列；

(e)允许所述延伸的探针经历分子内重排，以使所述第二结合位点能够杂交至所述靶核酸分子的互补序列中的其互补结合位点，所述靶核酸分子的互补序列中的其互补结合位点是所述靶核酸分子的所述5'旁侧序列的互补序列，其中所述重排包含至少在所述探针的所述茎环结构中的所述切割位点处切割所述延伸的探针，以释放包含所述第二结合位点的所述探针的3'末端，从而产生包含第一延伸链和第二链的部分双链的构建体，所述第一延伸链包含所述靶核酸分子的互补序列和释放的5'末端，并且所述第二链杂交至所述茎中的所述第一延伸链并且包含释放的3’末端，所述释放的3’末端随后能够杂交至所述第一延伸链中的其互补结合位点，并且当所述5’旁侧序列位于所述靶核酸分子的5’末端的内部，并且所述第一延伸链中的所述靶核酸分子的互补序列含有位于所述5’旁侧序列的互补序列的3’方向的另外的序列时，所述重排还包含所述另外的序列中的第二切割或所述另外的序列的第二切割，以释放包含所述第二结合位点的互补结合位点的所述第一延伸链的3’末端，以使释放的第一延伸链的5’末端与第一延伸链的3’末端并置，以用于利用所述第二结合位点作为连接模板直接或间接地彼此连接，其中当所述5’旁侧序列位于所述靶核酸分子的5’末端的内部时，用于连接的3’末端通过所述另外的序列中的切割或所述另外的序列的切割而释放；

(f)使所述探针的延伸链的末端直接或间接地彼此连接，以使所述探针的延伸链环化；

(g)扩增或分离环化的延伸链，从而选择所述ROI。

3.如权利要求2所述的方法，其中，所述5'旁侧序列位于所述靶核酸分子的5'末端，并且步骤(e)包含

(i)在所述探针的所述茎环结构中的所述切割位点处切割所述延伸的探针，以释放包含所述第二结合位点的所述探针的3’末端，从而产生部分双链的构建体，所述部分双链的构建体包含包括所述靶核酸分子的互补序列的第一延伸链和杂交至所述茎中的所述第一延伸链且包含所述释放的3’末端的第二链；以及

(ii)允许所述第二链中的所释放的3’末端中的所述第二结合位点杂交至所述第一延伸链中的所述靶核酸分子的互补序列中的其互补结合位点，以使所述第一延伸链的5’末端与3’末端并置，以用于利用所述第二结合位点作为连接模板直接或间接地彼此连接。

4.如权利要求2所述的方法，其中，当所述5'旁侧序列位于所述靶核酸分子的5’末端内部时，所述探针在5’末端处进一步包括包含第三结合位点的单链区域，所述第三结合位点与紧邻所述靶核酸分子中所述5’旁侧序列的5’端的切割序列同源并且能够杂交至所述切割序列的互补序列，其中所述第三结合位点在所述茎的5’端处或通过间隔序列与所述茎的5’末端分离，并且其中步骤(e)包括：

(i)允许所述延伸的探针经历分子内杂交，其中所述第三结合位点杂交至所述靶核酸分子的互补序列中的其互补结合位点，从而产生第二切割位点；

(ii)在所述第二切割位点处和所述茎环结构中的所述切割位点处切割杂交的探针，从而产生部分双链的构建体，所述部分双链的构建体包含在所述茎处杂交的两条链，第一延伸链包含所述靶核酸分子的互补序列并且第二链包含所述第二结合位点；

(iii)允许所述第二结合位点杂交至在所述第一延伸链的所述靶核酸分子的互补序列中的其互补结合位点，以使所述第一延伸链的所述5’末端与3’末端并置，以用于利用所述第二结合位点作为连接模板直接或间接彼此连接。

5.如权利要求4所述的方法，其中，所述探针中的所述环在所述第二结合位点5’方向进一步包含与针对所述第三结合位点的靶核酸分子的互补序列中的所述互补结合位点中的序列互补的序列，其中针对所述第三结合位点的靶核酸分子的互补序列中的所述互补结合位点中的所述序列在所述第二切割位点处切割之后保留在所述探针的第一延伸链的3’末端处。

6.如权利要求4或权利要求5所述的方法，其中，所述间隔序列包含第四靶结合位点，其能够杂交至位于所述靶核酸分子的3’旁侧序列3’方向处的所述靶核酸分子中的互补结合位点，并且其中步骤(b)进一步包含允许所述第四靶结合位点杂交至所述靶核酸分子中的其互补结合位点。

7.如权利要求2所述的方法，其中，所述5'旁侧序列位于所述靶核酸分子的5’末端的内部，并且所述探针的所述茎环结构进一步包含在所述环中的第三结合位点，所述第三结合位点与紧邻于所述靶核酸分子中的所述5’旁侧序列的5’端的切割序列同源并且能够杂交至所述切割序列的互补序列，其中所述第三结合位点在所述第二结合位点的3’方向，并且其中步骤(e)包括：

(i)允许所述延伸的探针经历分子内杂交，其中所述第三结合位点杂交至所述靶核酸分子的互补序列中的其互补结合位点，从而产生第二切割位点；

(ii)在所述第二切割位点处和所述茎环结构中的所述切割位点处切割杂交的探针，从而产生包含在所述茎处杂交的两条链的部分双链的构建体，第一延伸链包含所述靶核酸分子的互补序列且第二链包含所述第二结合位点；

(iii)允许所述第二结合位点杂交至在所述第一延伸链中所述靶核酸分子的互补序列中的其互补结合位点，以使所述第一延伸链的所述5’末端与3’末端并置，以用于利用所述第二结合位点作为连接模板直接或间接地彼此连接。

8.如权利要求2所述的方法，其中，当所述5’旁侧序列位于所述靶核酸分子的5’末端的内部时，步骤(e)包括：

(i)在所述探针的所述茎环结构中的切割位点处切割所述延伸的探针以释放包含所述第二结合位点的所述探针的3’末端，从而产生包含第一延伸链和第二链的部分双链的构建体，所述第一延伸链包含所述靶核酸分子的互补序列，且所述第二链杂交至所述茎中的所述第一延伸链且包含所释放的3’末端；以及

(ii)允许所述第二链中的所述释放的3’末端中的第二结合位点杂交至所述第一延伸链中的所述靶核酸分子的互补序列中的其互补结合位点，其中所述第一延伸链的3’末端处的另外的序列不发生杂交并且形成突出单链端；

(iii)切割所述突出单链端，以留下所述第一延伸链的3’末端，其杂交至所述第二链中的所述第二结合位点，以使所述第一延伸链的所述5’末端与3’末端并置，以用于利用所述第二结合位点作为连接模板直接或间接地彼此连接。

9.如权利要求1所述的方法，其是在靶核酸分子中选择靶目标区域(ROI)的方法，所述方法包括：

(a)提供探针，所述探针为具有第一链和第二链的部分双链的构建体，所述第一链包含单链3’末端区域，所述单链3’末端区域在其3’末端处包含第一靶结合位点，其中所述第一靶结合位点能够杂交至所述靶核酸分子中的互补结合位点，所述互补结合位点是所述ROI的3’末端侧翼的旁侧序列，所述第二链在其5’末端处杂交至所述第一链并且包含包括第二结合位点的单链3’末端区域，其中所述第二结合位点与所述ROI的所述5’末端侧翼的旁侧序列同源并且能够杂交至所述5’旁侧序列的互补序列；

(b)使所述探针与所述靶核酸分子接触，并且允许位于所述探针的第一链的3’末端处的所述第一靶结合位点杂交至所述靶核酸分子中的其互补结合位点，其中所述靶核酸分子至少部分是单链的，且单链区域包括包含所述互补结合位点的区域，或包括包含所述互补结合位点、所述ROI和所述5’旁侧序列的区域；

(c)利用所述靶核酸分子作为延伸模板来延伸所述探针的第一链的所述杂交的3’末端，以产生所述靶核酸分子的互补序列；

(d)除去所述靶核酸分子而不使所述探针变性，留下延伸的探针，所述延伸的探针在所延伸的区域中从3'至5'包括所述靶核酸分子的所述5'旁侧序列、所述ROI和所述3'旁侧序列的互补序列；

(e)允许所述延伸的探针经历分子内重排，从而使所述第二链中的第二结合位点能够杂交至第一延伸链中的靶核酸分子的互补序列中的其互补结合位点，所述靶核酸分子的互补序列中的其互补结合位点是所述靶核酸分子的所述5'旁侧序列的互补序列，其中，当所述5’旁侧序列位于所述靶核酸分子的5’末端的内部，并且所述第一延伸链中的所述靶核酸分子的互补序列含有位于所述5’旁侧序列的互补序列的3’方向的另外的序列时，所述重排包含所述另外的序列中的切割或所述另外的序列的切割，以释放包含所述第二结合位点的所述互补结合位点的第一延伸链的3’末端，

以使所述第一延伸链的5'末端与所述第一延伸链的3’末端并置，以用于利用所述第二结合位点作为连接模板直接或间接地彼此连接，其中当所述5’旁侧序列位于所述靶核酸分子的5’末端的内部时，用于连接的3’末端通过所述另外的序列中的切割或所述另外的序列的切割而释放；

(f)使所述探针的延伸链的末端直接或间接地彼此连接，以使所述探针的延伸链环化；

(g)扩增或分离环化的延伸链，从而选择所述ROI。

10.如权利要求9所述的方法，其中，所述5’旁侧序列位于所述靶核酸分子的5’末端处，并且步骤(e)包括：

允许所述第二链中的所述第二结合位点杂交至第一延伸链中的所述靶核酸分子的互补序列中的其互补结合位点，以使第一延伸链的5’末端与3’末端并置，以用于利用所述第二结合位点作为连接模板直接或间接地彼此连接。

11.如权利要求1或9所述的方法，其中，所述5'旁侧序列位于所述靶核酸分子的所述5’末端的内部，并且所述探针的所述第二链进一步包含第三结合位点，所述第三结合位点与紧邻所述靶核酸分子的所述5’旁侧序列的5’端的切割序列同源并且能够杂交至所述第一延伸链中的所述靶核酸分子的互补序列中的所述另外的序列中的所述切割序列的互补序列，所述切割序列的互补序列在所述5’旁侧序列的所述互补序列的3’方向，其中所述第三结合位点位于第二结合位点3’方向的所述第二链的所述单链3’末端区域中，或在所述第二链的另外的单链5’末端区域中；

并且其中步骤(e)包括：

(i)允许所述延伸的探针经历分子内杂交，其中所述第三结合位点杂交至所述靶核酸分子的互补序列中的其互补结合位点，从而产生切割位点；

(ii)在所述切割位点处切割杂交的探针，从而产生所述释放的第一延伸链的3’末端；

(iii)允许所述第二结合位点杂交至所述第一延伸链的所述靶核酸分子的互补序列中的其互补结合位点，以使所述第一延伸链的所述5’末端与3’末端并置，以用于利用所述第二结合位点作为连接模板直接或间接彼此连接。

12.如权利要求3或10所述的方法，其中，所述靶核酸分子是微小RNA或RNA转录本。

13.如权利要求1、2至5或7至8中任一项所述的方法，其中，所述探针包含另外的探针序列，其位于所述第二结合位点的3’方向并且与所述3’旁侧序列同源且与所述第一靶结合位点互补，其中，当所述探针包含茎环结构时，所述另外的探针序列定位于所述环中，或者当所述探针为双链构建体时，所述另外的探针序列定位于所述第二链的3’末端处；并且其中，在所述方法的步骤(e)中，所述另外的探针序列杂交至所述第一靶结合位点并且所述第二结合位点杂交至所述5’旁侧序列的互补序列，并且所述另外的探针序列与所述第二结合位点一同起到连接模板的作用。

14.一种在靶核酸分子中选择靶ROI的方法，所述方法包括：

(a)提供探针，所述探针包含：

(i)第一靶结合位点，位于所述探针的3’末端区域处，该结合位点能够杂交至所述靶核酸分子中的互补结合位点，所述互补结合位点是所述ROI的3’末端侧翼的3’旁侧序列，并且其能够在靶-模板化延伸反应中被延伸以产生所述靶核酸分子的互补序列，所述靶核酸分子的互补序列包含所述3’旁侧序列以及所述ROI的互补序列；和

(ii)第二结合位点，其与所述ROI或与其5’末端同源并且能够杂交至所述靶核酸分子的互补序列中的所述ROI或其5’末端的互补序列；

(iii)另外的探针序列，位于所述第二结合位点的3’方向，其与所述3’旁侧序列同源并且与所述第一靶结合位点互补；

其中所述探针作为寡核苷酸提供，所述寡核苷酸包含茎环结构，所述茎环结构在该结构的所述环中包括第二结合位点和所述另外的探针序列，并且在第二结合位点以及另外的探针序列的3’方向进一步包含切割位点，该切割位点可切割以打开所述环，从而使第二结合位点和另外的探针序列能用于结合，所述寡核苷酸还在所述探针的3’末端包含单链区域，该单链区域在其3’末端包括第一靶结合位点；或

其中所述探针作为部分双链的构建体提供，所述部分双链的构建体包含第一链和第二链，所述第一链包含在其3’末端包括所述第一靶结合位点的单链3’末端区域，且所述第二链在所述第一链的5’末端杂交，并且在单链区域的3’末端包含包括第二结合位点和另外的探针序列的单链3’末端区域；

(b)使所述探针与所述靶核酸分子接触，并且允许位于所述探针的3’末端处的第一靶结合位点杂交至所述靶核酸分子中的其互补结合位点，其中所述靶核酸分子至少部分是单链的，且单链区域包括包含所述互补结合位点的区域，或包括包含所述互补结合位点、所述ROI的区域；

(c)利用所述靶核酸分子作为延伸模板来延伸所述探针的杂交的3’末端，以产生所述靶核酸分子的互补序列；

(d)除去所述靶核酸分子，留下延伸的探针，所述延伸的探针在所延伸的区域中从3'至5'包括所述靶核酸分子的所述ROI以及3'旁侧序列的互补序列，其中所述第二结合位点保留在所述探针中；

(e)允许所述延伸的探针经历分子内重排，从而使所述第二结合位点杂交至所述靶核酸分子的互补序列中的其互补结合位点，所述靶核酸分子的互补序列中的其互补结合位点是所述ROI或所述ROI的5'末端的互补序列，并且所述另外的探针序列杂交至所述第一靶结合位点，

其中，当所述探针包含茎环结构时，所述重排包含在所述探针的所述茎环结构中的所述切割位点处切割所述延伸的探针，以释放包含所述第二结合位点和所述另外的探针序列的所述探针的3'末端，从而产生包含第一延伸链和第二链的部分双链的构建体，所述第一延伸链包含所述靶核酸分子的互补序列和释放的5’末端，并且所述第二链杂交至在所述茎中的所述第一延伸链并且包含释放的3’末端，所述释放的3’末端随后能够杂交至所述第一延伸链中的其互补结合位点，并且

其中，当所述ROI位于所述靶核酸分子的5’末端的内部并且所述第一延伸链中的所述靶核酸分子的互补序列在所述ROI的互补序列的3’方向含有另外的序列时，所述重排包含所述另外的序列中的切割或所述另外的序列的切割，以释放所述第一延伸链的3’末端，所述第一延伸链的3’末端包含所述第二结合位点的互补结合位点，

以使所述第一延伸链的5’末端与所述第一延伸链的3’末端并置，以用于利用所述第二结合位点和所述另外的探针序列作为连接模板直接或间接地彼此连接，其中当所述探针包含茎环结构时，用于连接的5’末端通过所述茎环结构中的切割而释放，并且当所述ROI位于所述靶核酸分子的5’末端的内部时，用于连接的3’末端通过所述另外的序列中的切割或所述另外的序列的切割而释放；

(f)使所述探针的延伸链的末端直接或间接地彼此连接，以使所述探针的延伸链环化；

(g)扩增或分离环化的延伸链，从而选择所述ROI。

15.如权利要求4或5所述的方法，其中，所述探针在茎环探针的5’末端或在部分双链探针的所述第二链的5’末端处包含可固定化的亲和结合基团或捕获序列元件，其中所述可固定化的基团或序列元件位于包含第三结合位点的所述探针的5’单链区域的5’末端，并且其中，在由所述第三结合位点产生的所述切割位点处进行切割时，所述可固定化的基团或序列元件从延伸的探针被切割，使得未反应的探针通过所述可固定化基团或序列元件而被除去或被分离，所述未反应的探针尚未延伸或在所述第三结合位点处被切割并且保留所述可固定化基团或序列元件。

16.如权利要求5或14所述的方法，其中，所述探针包含茎环结构，并且其中所述切割位点在所述探针的环中。

17.如权利要求5或14所述的方法，其中，所述探针包含茎环结构，并且其中所述切割位点在所述探针的茎中。

18.如权利要求5或14所述的方法，其中，所述探针的所述茎或双链区域包含一个或多个标签序列。

19.如权利要求1或14所述的方法，其中，所述靶核酸分子是RNA并且其在步骤(d)中通过RNA酶消化或碱法水解被除去。

20.如权利要求5或14所述的方法，其中，所述探针包含茎环结构，并且其中所述靶核酸分子在步骤(d)中通过变性被除去。

21.如权利要求1或14所述的方法，其中，使用多个探针来选择来自于不同来源的同一靶核酸分子内的多个靶目标区域。

22.如权利要求1或14所述的方法，其中，使用单个探针来选择来自于不同来源的同一靶核酸分子内的多个不同靶目标区域。

23.如权利要求1或14所述的方法，其中，所述探针包含一个或多个间隔序列。

24.如权利要求23所述的方法，其中

a)所述探针包含茎环结构，并且一个或多个间隔序列位于所述第一靶结合位点和所述茎环结构之间、所述茎环结构的5’方向、在所述茎中和/或在所述环中；或

b)所述探针为部分双链结构，并且在所述第一链中在所述第一靶结合位点和所述双链区域之间或所述双链区域的5’方向包含一个或多个间隔序列，或在所述第二链中所述双链区域的5’方向或所述双链区域的3’方向包含一个或多个间隔序列。

25.如权利要求23所述的方法，其中，所述探针包含茎环结构，并且在所述环中或在所述探针的5’末端的单链区域中包含第三结合位点，或

所述探针为部分双链结构，并且在所述第二结合位点3’方向的所述第二链的所述单链3’末端区域或在所述第二链的另外单链5’末端区域中包含第三结合位点，并且，其中所述探针在所述第三结合位点的3’或5’方向进一步包含一个或多个间隔序列。

26.如权利要求23所述的方法，其中

a)所述探针包含茎环结构并且所述一个或多个间隔序列位于所述茎环结构的茎的3’方向；或

b)所述探针为部分双链结构并且在所述双链区域的第一链3’方向包含一个或多个间隔序列。

27.如权利要求23所述的方法，其中，所述间隔序列为捕获序列。

28.如权利要求27所述的方法，其中，所述捕获序列杂交至固体表面上提供的同源互补结合位点。

29.如权利要求27所述的方法，其中，所述捕获序列或与其杂交的互补寡核苷酸附接至亲和结合部分。

30.如权利要求27所述的方法，其中

a)所述探针包含茎环结构，并且在所述茎环结构的所述茎的5’方向提供捕获序列；或

b)所述探针为部分双链结构并且在所述双链区域的所述第二链5’方向中包含捕获序列。

31.如权利要求23所述的方法，其中，所述间隔序列为标签序列或其互补序列，或包含标签序列或其互补序列，其中所述标签序列选自检测序列或鉴别序列元件，或引物或检测探针的结合位点。

32.如权利要求31所述的方法，其中，所述标签序列为所述靶ROI的鉴别元件或样品鉴别序列。

33.如权利要求23所述的方法，其中，所述探针包括茎环结构，并且所述间隔序列位于所述茎环结构的所述环中，并且位于所述第二结合位点的5’方向，从而在步骤(e)中当延伸链的各末端杂交至所述第二结合位点时在延伸链的各末端之间产生空位，并且其中在连接前所述空位被一个或多个空位寡核苷酸填充，其通过在所述延伸链之间的空位中杂交来连接或利用聚合酶通过杂交的延伸链的3’末端的空位填充延伸，以使所述延伸链和空位寡核苷酸可被连接为包含所述靶核酸分子的所述互补序列的环状分子。

34.如权利要求33所述的方法，其中，所述空位寡核苷酸包含与所述间隔序列中的标签序列互补序列互补的标签序列。

35.如权利要求33所述的方法，其中，所述空位寡核苷酸包含不与所述间隔序列互补的区域，并且其中非互补的所述区域包含标签序列。

36.如权利要求33所述的方法，其中，所述空位寡核苷酸包含检测序列或鉴别序列元件，或用于扩增引物或检测探针的结合位点。

37.如权利要求36所述的方法，其中，所述扩增引物为通用扩增引物。

38.如权利要求33所述的方法，其利用多种不同探针以多倍形式进行，并且其中每个探针的所述空位寡核苷酸包含相同的标签序列。

39.如权利要求33所述的方法，其中，(i)在使所述探针与所述靶核酸分子接触之前，所述空位寡核苷酸被预杂交至所述探针；或(ii)在所述探针与所述靶核酸分子接触的同时或之后单独提供所述空位寡核苷酸。

40.如权利要求1或14所述的方法，其中，所述探针包含茎环结构，并且所述茎环结构的所述环包含分子内互补序列的区域，以使其能够在所述环中形成双链体。

41.如权利要求40所述的方法，其中在所述环中的所述双链体包含切割位点。

42.如权利要求1或14所述的方法，其中，切割为酶切。

43.如权利要求1或14所述的方法，其中，所述切割位点被能够切割核酸分子的一种或多种酶识别。

44.如权利要求43所述的方法，其中，所述一种或多种酶为切口酶或限制性核酸内切酶。

45.如权利要求44所述的方法，其中，在所述探针展开之后，从反应中除去所述切口酶或使所述切口酶失活。

46.如权利要求42所述的方法，其中，所述酶切包含尿嘧啶DNA糖基化酶(UNG)与能够识别dsDNA的无嘌呤/无嘧啶位点的核酸内切酶的组合。

47.如权利要求46所述的方法，其中，所述能够识别dsDNA的无嘌呤/无嘧啶位点的核酸内切酶为核酸内切酶IV。

48.如权利要求1或14所述的方法，其中，所述探针的环化的延伸链的扩增是通过PCR或滚环扩增(RCA)进行的。

49.如权利要求48所述的方法，其中，扩增是通过RCA进行的，并且其中扩增进一步包含第二轮RCA。

50.如权利要求1或14所述的方法，进一步包括检测和/或分析所述环化的延伸链或其扩增子的步骤。

51.如权利要求50所述的方法，其中，通过使利用直接或间接检测的标记物标记的检测探针与扩增的产物杂交来检测扩增产物。

52.如权利要求51所述的方法，其中，所述检测的标记物为荧光标记物。

53.如权利要求51所述的方法，其中，通过测序来检测或分析所述延伸链或其扩增子。

54.一种用于如权利要求1至8或11至53中任一项所述的方法中的探针，所述探针包含茎环结构和在所述3’末端处的单链区域，其中所述3’末端区域包含能够杂交至所述靶核酸分子中的互补结合位点的第一靶结合位点，所述互补结合位点为所述ROI的所述3’末端侧翼的旁侧序列，并且所述环包含与所述ROI的所述5’末端侧翼的旁侧序列同源并且能够杂交至所述5’旁侧序列的互补序列的第二结合位点，并且其中所述茎环结构进一步包含位于所述第二结合位点的3’方向的切割位点，从而切割允许所述环打开。

55.一种用于如权利要求1或9至53中任一项所述的方法中的探针，所述探针为具有第一链和第二链的部分双链构建体，所述第一链包含单链3’末端区域，所述单链3’末端区域在其3’末端包含第一靶结合位点，其中所述第一靶结合位点能够杂交至所述靶核酸分子中的互补结合位点，所述互补结合位点为所述ROI的所述3’末端侧翼的旁侧序列，并且所述第二链在其5’末端杂交至所述第一链并且包含包括第二结合位点的单链3’末端区域，其中所述第二结合位点与所述ROI的所述5’末端侧翼的旁侧序列同源并且能够杂交至所述5’旁侧序列的互补序列。

56.一种用于如权利要求14所述的方法中的探针，所述探针包含

(i)第一靶结合位点，其位于所述探针的3’末端区域，该结合位点能够杂交至所述靶核酸分子中的互补结合位点，所述互补结合位点是所述ROI的所述3’末端侧翼的旁侧序列，并且能够在靶-模板化延伸反应中被延伸以产生所述靶核酸分子的互补序列，所述靶核酸分子的互补序列包含所述3’旁侧序列和所述ROI的互补序列；和

(ii)第二结合位点，其与所述ROI同源或与其5’末端同源，并且能够杂交至所述ROI或其5’末端的互补序列；

(iii)另外的探针序列，位于所述第二结合位点的3’方向，其与所述3’旁侧序列同源并且与所述第一靶结合位点互补；

其中，所述探针作为寡核苷酸提供，所述寡核苷酸包含茎环结构，所述茎环结构在该结构的所述环中包括第二结合位点和所述另外的探针序列，并且在第二结合位点和另外的探针序列的3’方向进一步包括切割位点，该切割位点可切割以打开所述环，从而使第二结合位点和另外的探针序列能用于结合，所述寡核苷酸还在3’末端包括单链区域，该单链区域在其3’末端处包括第一靶结合位点；或

其中，所述探针作为部分双链的构建体提供，所述部分双链的构建体包含第一链和第二链，所述第一链包含在其3’末端包括所述第一靶结合位点的单链3’末端区域，且所述第二链在所述第一链的所述5’末端杂交，并且在单链区域的3’末端包含包括第二结合位点和另外的探针序列的单链3’末端区域。

57.如权利要求54所述的探针，其中，所述探针如权利要求4至7、15至18、23至33或41中任一项所定义。

58.如权利要求55所述的探针，其中，探针如权利要求11、13、15或23至32中任一项所定义。

59.如权利要求56所述的探针，其中，所述探针如权利要求16至18、23至33或41中任一项所定义。

60.一种用于选择靶核酸分子中的靶目标区域的试剂盒，所述试剂盒包含：

(a)如权利要求54、55或56中任一项所定义的探针；以及一个或多个选自如下的另外部件：

(b)用于切割所述探针的茎环结构中的所述切割位点的工具；

(c)用于切割所述第二切割位点的工具；

(d)用于降解所述延伸的探针的3’末端的工具；

(e)用于延伸所述探针的聚合酶；

(f)连接酶；

(g)一个或多个空位寡核苷酸；

(h)用于扩增所述环化的延伸链的工具；

(i)用于检测所述环化的延伸链或其扩增子的工具。

Images