CN109312393A - 使用磁珠致动和检测进行的核酸突变检测 - Google Patents

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Abstract

本发明涉及用于区分目标核酸序列中的突变、单核苷酸多态性或其他变体与样品中的野生型序列的方法。所述方法包括经由三明治杂交进行表面结合磁珠的步骤，其中，珠子结合探针与目标核酸的一端杂交，并且表面结合探针与同一目标核酸的另一端杂交，通过磁力和/或温度对杂交施加严格性，确定保持附着到表面的磁珠的量，并且将保持附着到表面的磁珠的量与目标核酸中的突变、SNP变体或其他变体的存在和/或不存在相关。

Description

使用磁珠致动和检测进行的核酸突变检测
技术领域
本发明涉及用于区分目标核酸序列中的突变、单核苷酸多态性或其他变体与样品中的野生型序列的方法。本发明还涉及使用磁珠致动和/或温度控制。
背景技术
动力学结合实验用于确定结合(Kon)和解离(Koff)速率常数，假设结合遵循质量作用定律：
在任何给定时间，受体-配体复合物形成的速率都与配体浓度和仍然未被占据的受体数量成比例。解离速率与受体-配体复合物的浓度成比例。
目标核酸序列中的突变、单核苷酸多态性变体(SNV或SNP)和其他变体通常通过区分含有一个或多个突变、SNP变体或其他变体的任何给定目标核酸与杂交测定中的野生型核酸的相应Koff而得到与野生型序列的最佳区别，其中，受体和配体是互补核酸。这是因为对于错配的杂交Koff比Kon差异更大。
在一些情况下，Kon之间的区分是可能的，但是需要高度控制的反应条件(Knez等人，2014年)，这些条件难以在护理环境中提供。此外，通常将酶仅作用于完全匹配的核酸杂合体的酶促反应添加到基于Kon的反应中以增加特异性(Knez等人，2014年)。然而，酶的整合为整合系统提供了额外的挑战，并且每种这样的测定只能确定一种预期的突变、SNP变体或其他变体或几种此类突变、SNP变体或其他变体由于酶需要完美匹配的核酸杂合体以进行活动而在已知位置处的一种预期组合。
Koff之间的区分通常是通过以下操作完成的：对表面结合的探针进行杂交反应，并且随后通过将温度从杂交温度逐渐升至90-95℃来运行熔解曲线，在此期间，监测杂交信号(Meuzelaar等，2007年)。这种需要高温的两步过程同样不适用于护理点环境。
WO 2015/086654 A1、US 2010/173290 A1和Ngo Hoan T等人的“Sensitive DNAdetection and SNP discrimination using ultrabright SERS nanorattles andmagnetic beads for malaria diagnostics”(Biosensor and Bioelectronics，第81卷，2016年1月8日，第8-14页)公开了用于SNP检测的方法。
发明内容
因此，需要改进的装置和方法以用于简化、低成本、高效且灵活地检测目标核酸序列中的突变、SNP变体或其他变体并用于将它们与野生型核酸序列区分开。
此外，如果这种装置和方法能够用于护理点环境的集成系统中，不需要高温、酶促步骤或高度受控的反应条件，则这将是有利的。
此外，如果在相同测定中可以将包含不同突变、SNP变体或其他变体的多个目标核酸彼此区分开并且与野生型核酸区分开，则这将是有利的。
为了更好地解决这些问题中的一个或多个问题，本发明在杂交测定中使用磁珠致动，其具有任选的温度控制和光学读数。该方法基于经由三明治结构的磁珠表面结合，其中，一个检测探针与固体表面结合，并且一个检测探针与磁珠结合，这两者都与相同的目标核酸杂交(图1)。
由于在本发明的方法中能够控制磁致动和温度，因此能够在杂交反应期间检测到错配，从而消除了对随后的熔解曲线的需要。这不仅缩短了测定时间，而且还消除了对高温的需要，继而减少了蒸发和压力的问题。此外，不需要酶促反应。这些反应条件的简化使得将本发明的方法整合到集成系统中成为可能。这种集成系统例如是低成本的微流体试剂盒。这种试剂盒使得本发明更便于护理点使用。
本发明还允许在同一测定中区分含有不同突变、SNP变体或其他变体的多种目标核酸与野生型核酸，这是因为能够在同一个试剂盒上提供多组空间隔离的表面结合探针组(下文称为表面探针)，所述表面探针任选地含有与可与野生型核酸目标完全互补的探针序列相比的一个或多个错配。
通过控制本发明的方法中的多种变体的选择，使得含有不同突变、SNP变体或其他变体的多种目标核酸与野生型核酸之间的这种区分更加鲁棒。在接近探针熔点的固定温度下改变杂交的磁严格性(stringency)会引起表面结合磁珠的量的差异，这取决于杂交反应中的错配数。类似地，磁力能够保持恒定，同时可以改变反应温度。结合磁力和温度的变化能够使测定具有更高的灵敏度。备选地，磁力和温度都能够保持恒定。
此外，由于本方法在三明治杂交反应中使用两个探针，因此能够在一个反应中涵盖更多序列，允许微调测定设计和在一个反应中检测任何给定目标核酸的两个区域中的突变、SNP变体或其他变体。
最后，添加参考基因测量能够用于确定目标核酸中的突变、SNP变体或其他变体的存在，而不需要野生型核酸来进行比较。
在一个主要方面中，本发明采用用于检测目标核酸中的突变或SNP变体或其他变体的方法，包括：
a)提供珠探针和表面探针，其中，每个探针均是具有与所述目标核酸的序列互补的序列的寡核苷酸探针，任选地，所述探针的所述序列与所述目标核酸的所述序列相比含有一个或多个碱基变化，并且其中，所述珠探针被附着到磁珠，并且其中，所述表面探针被附着到固体表面，
b)提供包括所述目标核酸的样品，其中，与所述目标核酸的野生型序列相比，所述目标核酸可能含有一个或多个突变和/或变体，
c)使所述样品与所述珠探针和所述表面探针接触，
d)允许所述目标核酸与所述珠探针和所述表面探针杂交，形成三明治结构，任选地，获得所得的结合信号的第一读数，
e)通过磁力和温度对杂交结合施加严格性，
f)确定附着到所述表面的三明治结构中剩余的磁珠的量，
g)任选地，重复步骤e)和步骤f)一次或多次，并且
h)使附着到所述表面的三明治结构中剩余的结合信号与所述目标核酸中的突变、SNP变体或其他变体的存在和/或数量相关。
同时或按顺序施加增加的电压和升高的温度，并且其中，所述电压和所述温度被彼此独立地控制。
在一个实施例中，对所述杂交结合施加严格性包括向所述样品施加增加的电压的磁场。
在另一实施例中，控制所述温度包括将所述样品的温度升高至高于含有所述突变或所述SNP变体或所述其他变体的所述目标核酸的解链温度的温度。
在另一实施例中，控制所述温度包括将所述样品保持在接近所述探针的熔点的恒定温度。
在另一实施例中，确定附着到所述表面的三明治结构中剩余的结合信号的量包括对所述磁珠的光学检测。
在另一实施例中，几个空间隔离的表面探针存在于相同的固体表面上，并且在相同的严格条件下各自检测所述目标核酸的特定变体或所述目标核酸中可能存在突变或SNP变体或其他变体的特定区域。在一个实施例中，所述空间隔离的表面探针包括用于所述野生型序列的表面探针以及用于所述目标核酸的感兴趣的特定突变或SNP变体或其他变体的一种或多种表面探针。在一个实施例中，所述固体表面是试剂盒。
在另一实施例中，所述目标核酸在步骤d)之前或者在步骤d)期间经历扩增步骤。
在另一实施例中，所述目标核酸取自于涉及抗药性的基因，任选地，取自于自病原体，任选地，取自于病毒基因或者取自于细菌基因或者取自于真菌基因。在一个实施例中，通过检测取自于涉及抗药性的所述病原体基因的所述目标核酸中的变体来识别病原体的不同菌株。在一个实施例中，涉及抗药性的所述细菌基因是来自结核分枝杆菌的基因，所述目标核酸取自于涉及抗药性的所述细菌基因。在另一实施例中，所述病毒基因是流感基因。在实施例中，所述流感基因能够用于H/N分型。
在另一实施例中，所述目标核酸取自于涉及癌症的哺乳动物基因，优选取自于涉及癌症的人类基因。
在另一实施例中，控制所述电压和所述温度降低了具有强烈相关序列的核酸与所述目标核酸的非特异性结合。
附图说明
图1示出了经由三明治结构的磁珠表面结合的示意图，其中，一个检测探针与固体表面结合，并且一个检测探针与磁珠结合，这两者都与相同的目标核酸杂交。
图2示出了探针(空框)、目标野生型DNA(右斜阴影框)以及在DNA的表面侧(顶部)或珠子侧(底部)引入的具有错配的目标DNA(左斜阴影框的粗线框架框)。
图3示出了在升高的温度下各种探针的珠子计数和表面侧错配的固定磁力。误差线表示标准偏差。
图4示出了固定温度下各种探针的珠子计数和表面侧错配的固定磁力。误差线表示标准偏差。
图5示出了固定温度下各种探针的珠子计数和表面侧错配的增加的磁力，其被表示为标绘框。N＝2。
图6示出了在升高的温度下各种探针的珠子计数和珠子侧错配的固定磁力。对于空白水平以上的所有测量，N＝2。
具体实施方式
尽管将关于特定实施例描述本发明，但是该描述不应被解释为限制意义。
在详细描述本发明的示例性实施例之前，给出了对理解本发明重要的定义。
如在本说明书和权利要求中所使用的，除非上下文另有明确规定，否则单数形式的“一”和“一个”也包括相应的复数形式。
在本发明的上下文中，术语“大约”和“大致”指代本领域技术人员将理解为仍然确保所讨论的特征的技术效果的准确区间。该术语通常指示与指示数值的偏差为±20％，优选为±15％，更优选为±10％，甚至更优选为±5％。
应当理解，术语“包含”不是限制性的。出于本发明的目的，术语“由……组成”被认为是术语“包括”的优选实施例。如果在下文中将组定义为包括至少一定数量的实施例，则这意味着还包括优选仅由这些实施例组成的组。
此外，在说明书和权利要求书中的术语“第一”、“第二”、“第三”或“(a)”、“(b)”、“(c)”、“(d)”等用于区分相似元素，而不一定用于描述顺序或时间顺序。应当理解，如此使用的术语在适当的情况下是可互换的，并且本文描述的本发明的实施例能够以不同于本文描述或图示的顺序的其他顺序来操作。
如果术语“第一”、“第二”、“第三”或“(a)”、“(b)”、“(c)”、“(d)”等与方法的步骤或使用有关，那么除非在本申请中另有说明，否则这些步骤之间没有时间或时间间隔的一致性，即，步骤可以同时进行或者在这些步骤之间能够存在数秒、数分钟、数小时、数天、数周、数月或甚至数年的时间间隔，如下文所述。
术语“核酸”是指单链或双链形式的脱氧核糖核苷酸或核糖核苷酸聚合物，并且还包括天然核苷酸的已知类似物，其能够与天然存在的核苷酸类似的方式起作用。
术语“目标核酸”是指要检测其中的突变、SNP变体或其他变体的存在或数量的感兴趣核酸。珠探针和表面探针与目标核酸序列的区段互补。可以任选地在检测突变、SNP变体或其他变体之前扩增目标核酸。
术语“突变”是指核酸序列的永久性改变。突变是由于未修复的DNA损伤、复制过程中的错误或移动遗传元素插入DNA片段或缺失DNA片段造成的。突变能够在生物体的表型中产生可辨别的变化。突变在正常生物过程和异常生物过程中都会起作用，包括但不限于进化、癌症、免疫系统功能和抗药性。
术语“单核苷酸多态性”或“SNP”是指在基因组中的特定位置处发生的单核苷酸的变异，其中，每个变异在群体内以某种可感知的程度存在(例如>1％)。对于迄今发现的大多数SNP，在该位置处仅发生两种不同的碱基，但已经描述了具有三种不同碱基变异的SNP。SNP是疾病易感性差异的基础；引起广泛的人类疾病，例如，SNP导致的镰刀状细胞贫血、β-地中海贫血和囊性纤维化。疾病的严重程度和对处置的反应也可能取决于遗传变异。例如，在人类中，APOE(载脂蛋白E)基因中的单个碱基突变与阿尔茨海默症的高风险相关联。术语“变体”是指核酸中改变其核苷酸序列的任何改变。
术语“寡核苷酸探针”和“探针”是指与目标核酸的序列的至少部分互补的单链核酸序列，并且在适当的条件下，将与目标核酸杂交。任选地，与目标核酸序列相比，探针序列含有一个或多个碱基变化。通常，这种寡核苷酸探针的长度为大约10至1000个核苷酸，大约10至800个核苷酸，大约10至700个核苷酸，大约10至600个核苷酸，大约10至500个核苷酸，大约15至400个核苷酸，大约15至300个核苷酸，大约15至200个核苷酸，大约20至150个核苷酸，大约20至100个核苷酸，大约20至90个核苷酸，大约20至80个核苷酸，大约20至70个核苷酸，大约20至60个核苷酸或者大约20至50个核苷酸。通常，寡核苷酸的长度为大约20、30、40、50、60或70个核苷酸。
术语“珠探针”是指固定在磁珠上的寡核苷酸探针。
术语“表面探针”是指固定在固体表面上的寡核苷酸探针。
术语“互补”是指单链寡核苷酸探针的序列，其能够在适当的杂交条件下经由氢键与目标核酸的具有与探针相反意义的链进行碱基配对，从而形成双链核酸片段。出于本发明的目的，互补探针将被理解为完全互补(也被称为“匹配”)，即，其所有碱基将与直接与每个碱基相邻的目标核酸碱基配对，或者与完全互补的序列相比包含最高在一半位置上“错配”碱基的碱基变化。例如，与该探针的完全互补序列相比，20个核苷酸长度的探针可能含有0、1、2、3、4、5、6、7、8、9或10个碱基变化。错配的碱基不能与目标核酸中对应位置处的碱基形成氢键。碱基变化可以位于探针序列内的相邻位置或非相邻位置处，或者位于相邻位置和非相邻位置的混合物处。
术语“杂交化”和“杂交”是指这种现象：单链核酸与互补核酸退火，从而通过在匹配的嘌呤和嘧啶之间形成非共价氢键来形成双链核酸或“杂合体”。腺嘌呤-胸腺嘧啶或尿嘧啶-胸腺嘧啶碱基对形成两个氢键，而胞嘧啶-鸟嘌呤碱基对形成三个氢键。
术语“结合信号”是指经由三明治结构与表面结合的珠子产生的信号。结合信号能够是整个表面上的一般信号，或者能够与三明治结构中珠子的特定量相关，这取决于用于检测结合信号的方法。
术语“三明治结构”和“三明治杂交”是指这样的核酸复合物：目标核酸在该核酸复合物的核酸序列的分开的非重叠区段处与两个探针(一个是表面探针，并且一个是珠探针)杂交，从而“夹在”两个探针之间(图1)。通过该过程，磁珠将被结合到表面探针所固定的表面上。
用于本发明的目的的术语“严格性”是指越来越严格的条件，其使得核酸杂合体更难以维持。严格性能够以磁力的形式施加(所述磁力作用于经由三明治结构结合到表面的磁珠)，或者以接近或高于核酸杂合体的解链温度的升高的温度的形式施加，或者以磁力和升高的温度的组合的形式施加，从而破坏匹配碱基之间存在的非共价氢键。任何用于施加严格性的这些方法都能够与降低或增加严格性的缓冲组合物组合，即，促进或更难维持核酸杂合体。这允许严格控制严格性水平。
术语“解链温度”是指引起在双链杂合体中50％的核酸氢键碱基配对被破坏的温度，即，50％的杂合体被转化为单链核酸的温度。该过程也被称为“变性”。核酸杂合体的稳定性部分取决于其序列，这是因为鸟嘌呤-胞嘧啶对形成比尿嘧啶-腺嘌呤对或胸腺嘧啶-腺嘌呤对更多的氢键，因此需要更多能量(即，更高的解链温度)以用于破坏额外的氢键。杂合体的长度也在确定其解链温度中起作用，这是因为每个碱基对需要额外的能量。此外，错配的数量和位置也会影响解链温度，任何错配都会降低解链温度。杂合体内的中心位置处的错配比终端位置处的错配更能降低解链温度。相邻的匹配碱基区段越短，解链温度越低。解链温度还取决于离子强度和DNA浓度。在本发明的三明治结构中，对杂合体的氢键施加额外应变的磁力降低了杂合体的解链温度。
术语“空间隔离”是指固定在表面上的分离斑点上的表面探针，即，仅包含一种表面探针的区，所述表面探针由其中没有表面探针附着到表面的空间隔开。例如，微流体试剂盒可能包含四个单独的斑点，每个斑点均具有附着在试剂盒表面上的不同种类的表面。
术语“野生型”是指天然存在的核酸或基因序列。如果存在核酸或基因的多个等位基因，则群体中的一个最主要的等位基因被认为是野生型等位基因。
术语“扩增”是指使用例如聚合酶链式反应(PCR)或适合用于扩增核酸的任何其他方法生成目标核酸或其区段的额外拷贝。
术语“抗药性”是指药物在治愈疾病或病症或者杀死或抑制病原体中有效性降低。这种抗药性能够通过多种过程产生，例如通过获得宿主中的核酸序列的突变、SNP变体或其他变体和/或改变的核酸序列的基因产物的表达。当生物体或细胞对超过一种药物具有抗性时，将其称为多重抗药性。
术语“涉及抗药性的基因”是指有助于生物体(例如，病原体或细胞)的抗药性的任何基因。表现出对药物的抗性的主要机制是(1)药物失活或修饰，例如，酶促失活或降解，(2)药物目标的改变，例如，核酸序列的碱基变化或药物结合到的或导致构象变化的蛋白质或肽序列中的氨基酸变化，所述构象变化使得结合位点不能被药物接近或降低其对结合药物的亲和力，(3)改变药物抑制的代谢途径，例如使用替代前体，使用多余的酶(其也能够促进药物阻断的步骤)，或者摄取和使用来自周围环境的途径产物或中间产物，(4)减少药物积累，例如通过降低药物渗透性和/或增加药物穿过细胞表面的主动流出(泵出)，(5)药物的蛋白质目标的过度表达，例如通过增加转录和翻译，或者通过获得编码蛋白质目标的基因的额外拷贝，以及(6)获得药物的核酸目标的多个拷贝。
术语“病原体”是指感染因子，例如但不限于在其宿主中引起疾病的病毒、细菌、朊病毒、真菌、类病毒或寄生虫。宿主能够是人、动物、植物、真菌或微生物，包括其他病原体。
术语“病原体菌株”是指病原体种类在遗传上不同的亚型。
术语“涉及癌症的基因”是指有助于癌症的易感性和/或发展和/或进展的任何基因。这些基因包括“致癌基因”，它们有可能导致癌症；“肿瘤抑制基因”，它保护细胞免于通向癌症的步骤。致癌基因包括诱发细胞增殖的生长因子，转导用于细胞生长和分化的信号的受体酪氨酸激酶，介导细胞增殖、分化、细胞存活和凋亡的反应和激活受体的细胞质酪氨酸激酶，涉及生物体发育细胞周期调节、细胞增殖、分化和存活和凋亡的细胞质丝氨酸/苏氨酸激酶及其调节亚基，涉及对引起细胞增殖的主要途径的信号发送的调节性GTP酶，以及调节诱发细胞增殖的基因或其他致癌基因的转录的转录因子。通常，与野生型基因相比，致癌基因需要过度表达或突变以引起癌症。肿瘤抑制基因包括对涉及细胞周期进程所必需的基因进行抑制的基因，其将细胞周期与DNA损伤联系起来，即，在存在受损DNA时抑制细胞周期，启动细胞凋亡，细胞粘附，接触抑制和DNA修复。肿瘤抑制基因通常必须突变，低表达或沉默才会使癌症发展，尽管与致癌基因不同，肿瘤抑制基因的两个等位基因也必须受到这样的影响。
术语“非特异性结合”涉及非互补单链核酸的杂交。这种非特异性结合通常是弱的，因为形成的氢键较少，并且能够通过以下形式施加严格性来降低或消除：磁力或电压，高于非特异性杂合体的解链温度但低于特异性杂合体的解链温度的升高的温度，或两者的组合。
术语“强相关”涉及与目标核酸相似但不相同的核酸序列。该相似性低于探针与最大错配碱基数的相似性。
在一个主要方面中，本发明采用一种用于检测目标核酸中的突变或SNP变体或其他变体的方法，包括：a)提供珠探针和表面探针，其中，每个探针均是具有与所述目标核酸的序列的区段互补的序列的寡核苷酸探针，任选地，所述探针的所述序列与所述目标核酸的所述序列相比含有一个或多个碱基变化，并且其中，所述珠探针被附着到磁珠，并且其中，所述表面探针被附着到固体表面，b)提供包括所述目标核酸的样品，其中，与所述目标核酸的野生型序列相比，所述目标核酸可能含有一个或多个突变和/或变体，c)使所述样品与所述珠探针和所述表面探针接触，d)允许所述目标核酸与所述珠探针和所述表面探针杂交，形成三明治结构，任选地，获得附着到所述表面的结合信号的第一读数，e)任选地通过磁力和温度对杂交结合施加严格性，f)确定附着到所述表面的三明治结构中剩余的所述结合信号，g)任选地，重复步骤e)和步骤f)一次或多次，并且h)使附着到所述表面的三明治结构中剩余的所述结合信号与所述目标核酸中的突变、SNP变体或其他变体的存在和/或数量相关。
目标核酸可以是例如DNA、RNA或cDNA。与目标核酸的野生型序列相比，目标核酸可能含有一个或多个突变。与被认为是其野生型的目标核酸的主要序列相比，目标核酸可能含有一个或多个SNP。与目标核酸的野生型序列相比，目标核酸在其序列中可能含有一个或多个其他变体。此外，与野生型序列相比，目标核酸可能含有一个或多个突变以及一个或多个SNP。与野生型序列相比，目标核酸还可能含有一个或多个突变以及一个或多个其他变体。与野生型序列相比，目标核酸可能含有一种或多种SNP以及一个或多个其他变体。最后，与目标核酸的野生型序列相比，目标核酸还可能含有一个或多个突变、一个或多个SNP以及一个或多个其他变体。
许多重要的分子应用(例如，DNA寡核苷酸阵列)利用附着到固体支持物的合成寡核苷酸。为了发生这种附着，必须用官能团修饰寡核苷酸，以便附接到固体表面上的反应基团。寡核苷酸能够被附接到平坦的二维表面(例如，载玻片或聚合物表面)以及三维表面(例如，微珠和微球)。在本发明中，珠探针被固定到磁珠上，并且表面探针被固定到固体表面上。对此最容易实现的方法是合成个体寡核苷酸并随后将它们固定到固体表面或珠子。可用于固体支持物附着的更常用的化学物质包括：a)与醛或环氧化物处理的表面共价连接的酰肼修饰的寡核苷酸，b)与活化的羧酸酯基团或琥珀酰亚胺基酯共价连接的胺修饰的寡核苷酸，c)与氨基苯基或氨基丙基衍生的玻璃表面连接的琥珀酰化的寡核苷酸，d)与巯基硅烷化玻璃表面连接的二硫化物修饰的寡核苷酸，e)经由烷基化试剂(例如，碘乙酰胺或马来酰亚胺)共价连接的硫醇修饰的寡核苷酸，f)洋地黄毒苷NHS酯，g)胆固醇-TEG以及h)由固定化链霉抗生物素蛋白捕获的生物素修饰的寡核苷酸。珠探针和表面探针也能够经由本领域技术人员知道的其他化学物质来进行附着。
每个都与目标核酸的区段互补的珠探针和表面探针可以与目标核酸序列的末端或内部区段互补。珠探针和表面探针可以与位于目标核酸的相对末端区域互补，即，珠探针可以与一端互补，而表面探针与另一端互补。珠探针可以与目标核酸的一端互补，而表面探针可以与远离目标核酸末端的目标核酸区段互补。珠探针可以与目标核酸的一端互补，而表面探针可以与位于与珠探针互补的序列附近的目标核酸区段互补。表面探针可以与目标核酸的一端互补，而珠探针可以与远离目标核酸末端的目标核酸区段互补。表面探针可以与目标核酸的一端互补，而珠探针可以与位于与表面探针互补的序列附近的目标核酸区段互补。表面探针和珠探针可以都与目标核酸序列的内部区段互补。表面探针和珠探针可以在彼此接近的位置处都与目标核酸序列的内部区段互补。它们也可以永远不会与目标核酸序列的同一区段互补或者永远不会彼此互补。
通过使其上固定有表面探针的表面与样品接触来完成包括目标核酸的样品与表面探针的接触。这能够通过将样品添加到载玻片、阵列、试剂盒、孔或管来实现。通过使样品与其上固定有珠探针的磁珠接触来完成包括目标核酸的样品与珠探针的接触。这可以通过将珠子添加到样品或将样品添加到载玻片、阵列、试剂盒上的珠子或孔或管中的珠子来实现。优选地，同时进行这些步骤，即，通过将样品添加到也包含磁珠的孔、管、腔室或其他隔室的表面来进行这些步骤。最优选的是将样品添加到微流体试剂盒隔室中，其表面具有固定在其上的表面探针并且其包含磁珠，其珠探针在其表面上移动。这种微流体试剂盒的范例是US2010/310423 A1中描述的微流体试剂盒，其也被称为MagnotechTM试剂盒。MagnotechTM试剂盒是一次性试剂盒，其能够用一滴液体填充，随后不需要进一步的液体移动。这些试剂盒内的整个测定过程是通过在外部施加磁场来控制磁性纳米颗粒的移动来执行的，在试剂盒内预先装载有磁性纳米颗粒。这些磁场由位于试剂盒下方和上方的小的电磁体施加。
一旦样品与表面探针和珠探针都发生接触，就会发生杂交。最佳温度、缓冲液和其他反应条件将取决于本领域技术人员已知的许多因素。对于确定最佳温度和条件至关重要的是寡核苷酸探针的长度，鸟嘌呤和胞嘧啶的含量，以及两个序列之间最大耐受的错配数，这严重影响任何给定核酸杂合体的解链温度。杂交反应温度将低于解链温度以允许形成氢键。目标核酸与珠探针和表面探针杂交的示例性方案如下：珠探针和表面探针的长度为20个核苷酸和40-55％的鸟嘌呤+胞嘧啶，包括接通洗涤磁体的初始步骤。这使得能够进行参考测量，其中，能够检测表面上已经存在的任何伪影。接下来是使用马蹄形磁铁的短收集步骤，其中，珠子在包含表面探针的斑点上集中。使用马蹄形磁铁的较长结合步骤在收集步骤之后，允许珠子经由包含潜在错配的目标结合到表面。
在形成包括一个表面探针、一个目标核酸和一个珠探针的三明治结构之后，将磁珠有效连接到表面，在第一短的洗涤步骤中对杂交结构施加严格性，在此之后进行另一收集和结合步骤，并且进行第二较长的洗涤步骤，以评估珠子与表面之间的结合强度。在一个实施例中，对杂交结合施加严格性包括向样品施加增加的电压的磁场。本领域技术人员将意识到引起杂合体的解链所需的磁场范围取决于探针的长度(即，杂交序列的长度)，鸟嘌呤和胞嘧啶残基的含量，以及核酸杂合体内的错配数。对于长度为20个核苷酸、在54℃下具有50-55％的鸟嘌呤+胞嘧啶以及零个、一个或两个错配的珠探针和表面探针，在接近目标核酸与完全匹配的探针的杂合体的解链温度的温度下，用于增加目标核酸与珠探针和表面探针的杂交的严格性磁场强度的示例性范围为0至1V，更优选为0.2至1V，最优选为0.4至0.8V，以0.1V为增量，每次持续30秒(参见范例4)。在此期间，其他变量(例如，磁铁的频率和占空比)不会改变。
在另一实施例中，通过将样品的温度升高至高于含有突变或SNP变体或其他变体的目标核酸的解链温度的温度来施加严格性。对于长度为20个核苷酸、在54℃下具有40-55％的鸟嘌呤+胞嘧啶以及0至10个错配的珠探针和表面探针，用于增加目标核酸与珠探针和表面探针的杂交的严格性的示例性温度范围是45至60℃，更优选是48至58℃，最优选是51至57℃(参见范例2)。
在另一实施例中，通过将样品保持在接近探针的熔点的恒定温度，优选高于含有突变或SNP变体或其他变体的目标核酸的解链温度来施加严格性。对于长度为20个核苷酸、具有50-55％的鸟嘌呤+胞嘧啶以及0至2个错配的珠探针和表面探针，用于增加目标核酸与珠探针和表面探针的杂交的严格性的示例性恒定温度为57℃(参见范例3)。
在另一实施例中，同时或按顺序施加增加的电压和升高的温度，其中，所述电压和所述温度被彼此独立地控制。对于长度为20个核苷酸、在54℃下具有40-55％的鸟嘌呤+胞嘧啶以及零至十个错配的珠探针和表面探针，用于增加目标核酸与珠探针杂交的严格性的示例性的磁场强度的范围为0至1V，更优选为0.2至1V，最优选为0.4至0.8V，以0.1V为增量，每次持续30秒。在此期间，其他变量(例如，磁铁的频率和占空比)不会改变。示例性温度范围为45至60℃，更优选为48至58℃，最优选为51至57℃。
在实施例中，控制电压和/或温度还具有降低具有强相关序列的核酸与目标核酸的非特异性结合的效果，这是因为非特异性杂合体比目标核酸中存在少量突变、SNP或其他变体的特异性杂合体含有更多的错配，因此具有较低的解链温度和较少的由拉开核酸链的磁力拉紧的键。
在对杂交施加严格性之后，确定经由三明治结构仍然结合到表面的结合信号。类似地，能够在施加严格性之前的杂交步骤之后执行对结合信号的任选的第一读出。在实施例中，确定附着到表面的三明治结构中剩余的结合信号包括对磁珠的光学检测。光学检测可以通过本领域已知的任何方法来执行，例如通过在光、相衬或电子显微镜图像中用眼珠计数，或者通过受抑全内反射(FTIR)，其能够与方便的、低成本的微流体试剂盒一起使用，例如，MagnotechTM试剂盒。在FTIR中，光以全内反射角耦合到样品中。如果靠近样品表面不存在珠子，则光被完全反射。然而，如果磁珠结合到表面，则违反全内反射的条件，部分光被散射到样品中，因此表面反射的光量会减少。通过用光学检测器测量反射光的强度，可以估计结合到表面的磁珠的量。这允许估计样品内存在的感兴趣的特定目标分子的量。
任选地，将施加严格性的步骤和确定结合到表面的结合信号的步骤重复几次，例如，一次、两次、三次、四次、五次、六次、七次、八次、九次、十次等，最多一千次。每次重复都应当得到对目标核酸中的变体的更精确的确定，这是因为将更彻底地消除非特异性结合或弱结合。此外，通过比较在几次重复中保持结合到表面的珠子的数量，可以区分具有非常相似的杂交能量的变体。
一旦确定了结合到表面的结合信号，它就与目标核酸中的突变、SNP变体或其他变体的存在和/或数量相关，这是因为表面探针或珠探针与目标核酸之间的错配较少，这在严格条件下将得到更多数量的仍然结合到表面的珠子。如果施加一定范围的严格性，完全互补的序列将表面上的珠子保留在比含有错配的互补序列更高严格性的点。任选地，能够将不再有珠子或减少数量的珠子结合到表面的严格性条件与野生型序列或参考序列进行比较。
在一个实施例中，几个空间隔离的表面探针存在于相同的固体表面上，并且在相同的严格性条件下各自检测目标核酸的特异性变体或目标核酸中可能存在突变或SNP变体或其他变体的特定区域。空间隔离能够例如以单独的微滴、孔、槽、凹痕、腔室或印刷网格的形式或通过本领域技术人员已知的其他方式在载玻片、阵列、板、试剂盒、芯片或其他表面上实现。在优选实施例中，与几个空间隔离的探针附着的固体表面是试剂盒。在更优选的实施例中，试剂盒是微流体试剂盒。在特别优选的实施例中，微流体试剂盒是MagnotechTM试剂盒。
在另一实施例中，空间隔离的表面探针包括用于野生型序列的表面探针和用于目标核酸的感兴趣的特定突变或SNP变体或其他变体的一个或多个表面探针。野生型序列可以充当解链核酸杂合体所需的严格条件的参考。感兴趣的突变或SNP变体或其他变体可以是已知引起疾病或易患疾病或引起抗药性或耐药性的那些突变或SNP变体或其他变体或本领域技术人员能够设想到的任何其他感兴趣特征。
在实施例中，目标核酸在步骤d)之前或者在步骤d)期间经历扩增步骤，其中，使用例如聚合酶链反应(PCR)、环介导的等温扩增、基于核酸序列的扩增、链置换扩增、多重置换扩增或适合于扩增核酸的任何其他方法来生成目标核酸或其区段的额外拷贝。本领域技术人员将能够设想到最适合于本发明的特定应用的方法。
在实施例中，目标核酸取自于涉及抗药性的基因，任选地，取自于病原体，任选地，取自于病毒基因或者取自于细菌基因或者取自于真菌基因。这些病原体包括但不限于，例如，耐甲氧西林金黄色葡萄球菌(MRSA)、多重耐药细菌、流感病毒、呼吸道合胞病毒(RSV)、丙型肝炎病毒(HCV)、人类免疫缺陷病毒(HIV)、人乳头瘤病毒(HPC)、B组链球菌、艰难梭菌。涉及抗药性的基因通常是药物结合的基因。突变能够引起药物与药物目标结合的改变，例如，核酸序列的碱基变化或药物结合到的蛋白质或肽序列中的氨基酸变化(以减少药物与药物目标之间的化学相互作用)或导致构象变化的蛋白质或肽序列中的氨基酸变化(所述构象变化使得结合位点不能被药物接近或者降低其结合药物的亲和力)。为了确定这种基因中的任何突变的存在，在同一表面上以空间分开的方式印刷与覆盖整个基因或核酸区域的野生型序列完全互补的探针。如果任何探针在严格条件下示出在较低程度上保留与表面结合的珠子，则这指示存在错配，因此指示该特定探针覆盖的基因或区域的部分中的突变。有利地，这将检测任何可能的突变的存在，并且不限于本领域已知的特定突变的设计。
在另一实施例中，通过检测取自于涉及抗药性的所述致病基因的目标核酸中的变体来识别病原体的不同菌株。这些病原体和基因包括但不限于，例如，流感病毒、HPV、HIV、HCV、疟原虫、艰难梭菌及其基因。对目标与变体的区分可以在方案的末尾发生，其中，首先，在相对较低的严格性水平下，病原体的所有菌株将结合到与来自感兴趣的特定菌株或参考的序列完全互补的探针，确定从中获得含有样品的目标核酸的样品中的某种病原体的存在，并且其中，在进一步提高严格性水平时，通过由于核酸杂合体中的错配而引起的变体与探针的差异结合来检测变体，与感兴趣的菌株或参考相比，确定具有碱基变体的病原体的新的菌株或已知菌株的存在。这与例如具有高度变化的菌株(例如，流感和疟原虫)的病原体的检测相关。
在一个实施例中，涉及从中得到目标核酸的抗药性的细菌基因是来自结核分枝杆菌的基因。这些基因包括但不限于，例如，涉及对利福平、异烟肼、乙硫异烟胺、异烟肼-乙硫异烟胺、链霉素、氟喹诺酮、吡嗪酰胺、乙胺丁醇具有抗性的基因。
在另一实施例中，目标核酸取自于涉及癌症的哺乳动物基因。在优选实施例中，哺乳动物基因是人类基因。这种基因可以是致癌基因或肿瘤抑制基因。例如，这种基因可能是生长因子、受体酪氨酸激酶、细胞质酪氨酸激酶、细胞质丝氨酸/苏氨酸激酶、调节性GTP酶、涉及抑制细胞周期进展基因的基因，或耦合细胞周期与DNA损伤的基因。可以在同一表面上以空间分开的方式印刷与已知涉及癌症的目标核酸野生型和特定目标核酸变体完全匹配的探针。如果变体-探针在严格条件下比野生型探针保留更多数量的结合到表面的珠子，则存在变体。这对于检测癌症中的突变基因特别相关，其中，某些特定致癌变体(例如，KRAS或BRAF)的存在会影响治疗选择。
范例
通过参考以下范例来支持和说明用于检测目标核酸中的突变、SNP变体或其他变体的本发明的方法。必须强调的是，这些实施例决不应被解释为限制本发明的范围。
1.探针序列设计
通过在序列的杂交部分中设计具有增加数量的错配碱基对的探针-目标组合，能够检测所述序列之间的差异。理想地，所有错配序列都应产生比完全匹配探针更低的珠子计数。在实践中，检测匹配探针与边缘上具有一个错配的探针之间的差异是极不可能的。因此，用于检测错配的探针应当以这样的方式设计：即，错配出现在探针中间附近。
因为每个测定包含两个探针：一个珠探针和一个表面探针，所以在目标的两侧引入了错配(图2)。所有序列的SEQ ID列于下表中：
2.通过在固定磁力下改变温度对表面探针中的错配施加严格性
在与表面探针结合的序列中具有增加量的错配的DNA目标与表面和珠子杂交，珠子在45℃下利用固定的致动方案在微流体试剂盒中携带珠探针。然后通过在升高的温度下在0.4V下激活洗涤磁体来洗掉结合的珠子。所使用的致动协议包括接通洗涤磁体的初始步骤。这使得能够进行参考测量，其中，能够检测表面上已经存在的任何伪影。接下来是使用马蹄形磁体的短收集步骤，其中，珠子在含有表面探针的斑点上集中。使用马蹄形磁体的较长结合步骤在收集步骤之后，允许珠子经由包含潜在错配的目标结合到表面。接着进行短的洗涤步骤，在此之后进行另一收集和结合步骤。最后，进行较长的洗涤步骤以评估珠子与表面之间的结合强度，在此期间，温度以1摄氏度的增量增加，每次持续30秒，直至60℃。
所有具有错配的目标都示出珠子数量在54℃下低于参考值。具有一个(目标11和12)或两个(13和14)错配的目标仍然示出54℃下的珠子计数。含有一个或多个错配的目标的所有珠子计数与该温度下的野生型目标珠子计数显着不同(图3)。
3.在固定温度下以固定磁力对表面探针中的错配施加严格性
在与表面探针结合的序列中具有增加量的错配的DNA目标在空间上彼此隔离地与表面和珠子杂交，珠子在45℃下以固定的致动方案携带相同微流体试剂盒中的珠探针。然后通过致动洗去结合的珠子(图4)。所使用的致动方案包括初始步骤，其中，洗涤磁体在0.4V下接通。这使得能够进行参考测量，其中，能够检测表面上已经存在的任何伪影。接下来是使用马蹄形磁体的短收集步骤，其中，珠子在含有表面探针的斑点上集中。使用马蹄形磁体的较长结合步骤在收集步骤之后，允许珠子经由包含潜在错配的目标结合到表面。接着进行短的洗涤步骤，在此之后进行另一收集和结合步骤。最后，进行较长的洗涤步骤以评估珠子与表面之间在57℃的固定温度下的结合强度。
在含有一个或多个错配的每个测定目标与野生型目标之间获得珠子计数的显着差异，使得能够区分完全互补的目标(参考)与具有一个(目标11和12)或更多个(目标13)错配的目标。
4.通过在固定温度下改变磁力对表面探针中的错配施加严格性
在与表面探针结合的序列中具有增加量的错配的DNA目标与表面和珠子杂交，珠子在45℃下以固定的致动方案在微流体试剂盒中携带珠探针。所使用的致动方案包括接通洗涤磁体的初始步骤。这使得能够进行参考测量，其中，能够检测表面上已经存在的任何伪影。接下来是使用马蹄形磁体的短收集步骤，其中，珠子在含有表面探针的斑点上集中。使用马蹄形磁体的较长结合步骤在收集步骤之后，允许珠子经由包含潜在错配的目标结合到表面。接着进行短的洗涤步骤，在此之后进行另一收集和结合步骤。最后，进行更长的洗涤步骤以评估珠子与表面之间的结合强度。洗涤磁体的电压以0.2V的增量从0.4V增加到0.6V再到0.8V，每次持续30秒，同时保持反应温度固定在54℃。在此期间，其他变量(例如，磁体的频率和占空比)不会改变。
对于所有测量的目标，测量的珠子计数降低，但是对于具有较高错配数的目标，其降低得更多，对于那些在杂交序列的中心具有错配的目标，其降低得更多(图5)。
5.通过在固定磁力下改变温度对珠探针中的错配施加严格性
在与珠探针结合的序列中具有增加量的错配的DNA目标经由表面探针与表面杂交，并且在45℃下以固定致动方案与微流体试剂盒中的珠子杂交。然后通过在升高的温度下在0.4V下激活洗涤磁体来洗掉结合的珠子。所使用的致动方案包括接通洗涤磁体的初始步骤。这使得能够进行参考测量，其中，能够检测表面上已经存在的任何伪影。接下来是使用马蹄形磁体的短收集步骤，其中，珠子在含有表面探针的斑点上集中。使用马蹄形磁体的较长结合步骤在收集步骤之后，允许珠子经由包含潜在错配的目标结合到表面。接着进行短的洗涤步骤，在此之后进行另一收集和结合步骤。最后，进行较长的洗涤步骤以评估珠子与表面之间的结合强度，在此期间，温度以1摄氏度的增量增加，每次持续30秒，直至60℃。
将错配引入目标核酸结合珠探针的一侧给出了与将错配引入目标核酸结合表面探针的一侧的结果相似的结果，表明在目标的两侧都能够检测到错配(图6)。
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3.US 2010/310423 A1

Claims (14)

1.一种用于检测目标核酸中的突变或SNP变体或其他变体的方法，包括：
a)提供珠探针和表面探针，其中，每个探针均是具有与所述目标核酸的序列互补的序列的寡核苷酸探针，任选地，所述探针的所述序列与所述目标核酸的所述序列相比含有一个或多个碱基变化，并且其中，所述珠探针被附着到磁珠，并且其中，所述表面探针被附着到固体表面，
b)提供包括所述目标核酸的样品，其中，与所述目标核酸的野生型序列相比，所述目标核酸可能含有一个或多个突变和/或变体，
c)使所述样品与所述珠探针和所述表面探针接触，
d)允许所述目标核酸与所述珠探针和所述表面探针杂交，形成三明治结构，任选地，获得附着到所述表面的结合信号的第一读数，
e)通过磁力和温度对杂交结合施加严格性，
f)确定附着到所述表面的三明治结构中剩余的所述结合信号，
g)任选地，重复步骤e)和步骤f)一次或多次，并且
h)使附着到所述表面的三明治结构中剩余的所述结合信号与所述目标核酸中的突变、SNP变体或其他变体的存在和/或数量相关。
其中，同时或按顺序施加增加的电压和升高的温度，并且其中，所述电压和所述温度被彼此独立地控制。
2.根据权利要求1所述的方法，其中，对所述杂交结合施加严格性包括向所述样品施加增加的电压的磁场。
3.根据权利要求1或2所述的方法，其中，控制所述温度包括将所述样品的温度升高至高于含有所述突变或所述SNP变体或所述其他变体的所述目标核酸的解链温度的温度。
4.根据权利要求1或2所述的方法，其中，控制所述温度包括将所述样品保持在接近所述探针的熔点的恒定温度。
5.根据前述权利要求中的任一项所述的方法，其中，确定附着到所述表面的三明治结构中剩余的所述结合信号包括对所述磁珠的光学检测。
6.根据前述权利要求中的任一项所述的方法，其中，几个空间隔离的表面探针存在于相同的固体表面上，并且在相同的严格条件下各自检测所述目标核酸的特定变体或所述目标核酸中可能存在突变或SNP变体或其他变体的特定区域。
7.根据权利要求6所述的方法，其中，所述空间隔离的表面探针包括用于所述野生型序列的表面探针以及用于所述目标核酸的感兴趣的特定突变或SNP变体或其他变体的一种或多种表面探针。
8.根据权利要求6或7所述的方法，其中，所述固体表面是试剂盒。
9.根据前述权利要求中的任一项所述的方法，其中，所述目标核酸在步骤d)之前或者在步骤d)期间经历扩增步骤。
10.根据前述权利要求中的任一项所述的方法，其中，所述目标核酸取自于涉及抗药性的基因，任选地，取自于自病原体，任选地，取自于病毒基因或者取自于细菌基因或者取自于真菌基因。
11.根据权利要求10所述的方法，其中，通过检测所述目标核酸中的变体来识别病原体的不同菌株。
12.根据权利要求10或11所述的方法，其中，所述细菌基因是来自结核分枝杆菌的基因。
13.根据权利要求1至9中的任一项所述的方法，其中，所述目标核酸取自于涉及癌症的哺乳动物基因，优选取自于涉及癌症的人类基因。
14.根据前述权利要求中的任一项所述的方法，其中，控制所述电压和所述温度降低了具有强烈相关序列的核酸与所述目标核酸的非特异性结合。
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