CN112331270B - 一种新型冠状病毒拉曼光谱数据中心的构建方法 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了一种新型冠状病毒拉曼光谱数据中心的构建方法，该方法包括以下步骤：S1.构建新冠病毒结构蛋白拉曼光谱数据库；S2.构建新冠病毒核酸拉曼光谱数据库；S3.构建新冠病毒颗粒拉曼光谱数据库；S4.构建新冠病毒临床检测样本拉曼光谱数据库；将各新型冠状病毒拉曼光谱数据库存入新型冠状病毒拉曼光谱检测服务器构成新型冠状病毒拉曼光谱数据中心。本发明有效建立了一套完整的新型冠状病毒拉曼光谱数据库，为新冠病毒拉曼检测技术提供可靠的标准数据支撑，有效提高检测结果的准确性及置信度。
Description
技术领域
本发明属于新冠病毒检测领域，尤其涉及一种新型冠状病毒拉曼光谱数据中心的构建方法。
背景技术
目前，新冠病毒（SARS-CoV-2）的检测主要基于实时荧光聚合酶链反应（RT-PCR）核酸检测方法，实验步骤较多，检测全流程约需4个多小时，难以实现大规模快速筛查。
表面增强拉曼光谱（SERS）技术可快速、精准、实时地识别和检测特定病毒分子。然而，生物大分子的拉曼光谱将受到多种因素的影响，如生物活性，生理环境的复杂性，个体之间的差异性，以及生物大分子与SERS增强基底之间的相互作用等。这些因素的影响给SERS技术检测病毒带来了较大干扰，严重影响了检测结果的可靠性。同时，采用拉曼光谱技术检测病毒仍处于实验室研究阶段，目前国内外尚缺乏有效的病毒拉曼光谱数据库建立方法。为此，亟待建立一套新型冠状病毒拉曼光谱数据库作为新冠病毒SERS检测的判断标准。
发明内容
为解决上述问题，本发明的目的在于提供一种新型冠状病毒拉曼光谱数据中心的构建方法，其能提供方便使用的新型冠状病毒拉曼光谱数据库，作为病毒拉曼检测判断标准。
本发明采取的技术方案是：
一种新型冠状病毒拉曼光谱数据中心的构建方法，其特点是，该方法包括以下步骤：
S1.构建新冠病毒结构蛋白拉曼光谱数据库，所述结构蛋白包括刺突蛋白（S蛋白）和核蛋白（N蛋白）；
S2.构建新冠病毒核酸拉曼光谱数据库；
S3.构建新冠病毒颗粒拉曼光谱数据库；
将步骤S1-S3所构建的新型冠状病毒拉曼光谱数据库存入新型冠状病毒拉曼光谱检测服务器中构成新型冠状病毒拉曼光谱数据中心；
其中，
所述步骤S1包含以下子步骤：
S1.1.获取新冠病毒纯化结构蛋白拉曼光谱；
S1.2.获取新冠病毒不同浓度结构蛋白拉曼光谱；
S1.3.获取新冠病毒灭活结构蛋白拉曼光谱；
所述步骤S2包含以下子步骤：
S2.1.获取新冠病毒纯化核酸拉曼光谱；
S2.2.获取新冠病毒不同浓度核酸拉曼光谱；
所述步骤S3包含以下子步骤：
S3.1.获取纯化新冠病毒颗粒拉曼光谱；
S3.2.获取不同浓度新冠病毒颗粒拉曼光谱；
所述步骤S1.1包含以下子步骤
S1.1.1.获取新冠病毒重组表达的结构蛋白；
S1.1.2.对所获取的新冠病毒结构蛋白进行预处理，所述预处理包括脱盐处理和浓缩处理；
S1.1.3.对处理后的结构蛋白进行拉曼光谱检测；
S1.1.4.对采集到的拉曼光谱进行去宇宙射线、去背底、平滑降噪、归一化等数据处理，将处理后的光谱数据作为纯化结构蛋白拉曼光谱。
所述步骤S1.2包含以下子步骤
S1.2.1.获取新冠病毒重组表达的结构蛋白；
S1.2.2.对所获取的新冠病毒结构蛋白进行预处理，所述预处理包括脱盐处理和浓缩处理；
S1.2.3.采用无菌水对浓缩后的结构蛋白进行梯度稀释，获得一系列不同浓度的结构蛋白溶液；
S1.2.4.将稀释后的结构蛋白溶液滴至SERS增强基底上自然干燥；
S1.2.5.对干燥后的结构蛋白进行拉曼光谱检测；
S1.2.6.对采集到的拉曼光谱进行去宇宙射线、去背底、平滑降噪、归一化等数据处理，将处理后的光谱数据作为不同浓度结构蛋白拉曼光谱。
所述步骤S1.3包含以下子步骤
S1.3.1.获取新冠病毒重组表达的结构蛋白；
S1.3.2.对所获取的新冠病毒结构蛋白进行预处理，所述预处理包括脱盐处理和浓缩处理；
S1.3.3.对浓缩后的结构蛋白进行灭活处理；
S1.3.4.对灭活后的结构蛋白进行拉曼光谱检测；
S1.3.5.对采集到的拉曼光谱进行去宇宙射线、去背底、平滑降噪、归一化等数据处理，将处理后的光谱数据作为灭活结构蛋白拉曼光谱；
所述步骤S2.1包含以下子步骤：
S2.1.1.获取分离、纯化后的新冠病毒；
S2.1.2.对所获取的新冠病毒进行灭活处理；
S2.1.3.采用核酸提取试剂提取新冠病毒核酸；
S2.1.4.采用离心、超滤等方法对提取的新冠病毒核酸进行纯化和浓缩；
S2.1.5.为确保光谱检测过程中的人员安全，将纯化浓缩后新冠病毒核酸密封至石英盒中；
S2.1.6.对密封后的新冠病毒核酸进行拉曼光谱检测；
S2.1.7.对采集到的拉曼光谱进行去宇宙射线、去背底、平滑降噪、归一化等数据处理，将处理后的光谱数据作为纯化核酸拉曼光谱。
所述步骤S2.2包含以下子步骤：
S2.2.1.获取分离、纯化后的新冠病毒；
S2.2.2.对所获取的新冠病毒进行灭活处理；
S2.2.3.采用核酸提取试剂提取新冠病毒核酸；
S2.2.4.核酸纯化与浓缩步骤，采用离心、超滤等方法对提取的新冠病毒核酸进行纯化和浓缩；
S2.2.5.采用无菌水对浓缩后的新冠病毒核酸进行梯度稀释，获得不同浓度的新冠病毒核酸溶液；
S2.2.6.将稀释后的病毒核酸溶液滴至SERS增强基底上自然干燥；
S2.2.7.将干燥后的新冠病毒核酸密封至石英盒中；
S2.2.8.对密封后的新冠病毒核酸进行拉曼光谱检测；
S2.2.9.对采集到的拉曼光谱进行去宇宙射线、去背底、平滑降噪、归一化等数据处理，将处理后的光谱数据作为不同浓度核酸拉曼光谱。
所述步骤S3.1包括以下子步骤：
S3.1.1.获取分离、纯化后的新冠病毒颗粒；
S3.1.2.对所获取的新冠病毒进行灭活处理；
S3.1.3.采用离心、超滤等方法对灭活后的新冠病毒进行纯化和浓缩；
S3.1.4.将纯化浓缩后新冠病毒密封至石英盒中；
S3.1.5.对密封后的新冠病毒进行拉曼光谱检测；
S3.1.6.对采集到的拉曼光谱进行去宇宙射线、去背底、平滑降噪、归一化等数据处理，将处理后的光谱数据作为纯化新冠病毒颗粒拉曼光谱；
所述步骤S3.2包括以下子步骤：
S3.2.1.获取分离、纯化后的新冠病毒颗粒；
S3.2.2.对所获取的新冠病毒进行灭活处理；
S3.2.3.采用离心、超滤等方法对灭活后的新冠病毒进行纯化和浓缩；
S3.2.4.采用无菌水对浓缩后的病毒进行梯度稀释，获得不同浓度的病毒颗粒溶液；
S3.2.5.将稀释后的病毒溶液滴至SERS增强基底上自然干燥；
S3.2.6.将干燥后的新冠病毒密封至石英盒中；
S3.2.7.对密封后的新冠病毒进行拉曼光谱检测；
S3.2.8.对采集到的拉曼光谱进行去宇宙射线、去背底、平滑降噪、归一化等数据处理，将处理后的光谱数据作为不同浓度病毒颗粒拉曼光谱。
进一步，该方法还包括步骤S4.构建新冠病毒临床检测样本拉曼光谱数据库，并将新冠病毒临床检测样本拉曼光谱数据库存入新型冠状病毒拉曼光谱检测服务器中构成新型冠状病毒拉曼光谱数据中心。
进一步，步骤S4包括步骤S4.1获取阴性临床样本拉曼光谱，所述步骤S4.1具体包括以下子步骤：
S4.1.1.获取新冠病毒阴性临床样本；
S4.1.2.对所获取的新冠病毒阴性样本进行灭活处理；
S4.1.3.将灭活后的阴性样本滴至SERS增强基底上自然干燥；
S4.1.4.将干燥后的阴性临床样本密封至石英盒中；
S4.1.5.对密封后的阴性临床样本进行拉曼光谱面扫描检测；
S4.1.6.对采集到的拉曼光谱面扫描数据进行去宇宙射线、去背底、平滑降噪、归一化数据处理，并采用聚类算法进行聚类分析，将处理后的数据作为新冠病毒阴性临床样本拉曼光谱。
进一步，步骤S4包括步骤S4.2获取阳性临床样本拉曼光谱，所述步骤S4.2具体包括以下子步骤：
S4.2.1.获取新冠病毒阳性临床样本；
S4.2.2.对所获取的新冠病毒阳性样本进行灭活处理；
S4.2.3.将灭活后的阳性样本滴至SERS增强基底上自然干燥，所述SERS增强基底为具有SERS活性的贵金属纳米结构，如金、银纳米颗粒等；
S4.2.4.将干燥后的阳性临床样本密封至石英盒中；
S4.2.5.对密封后的阳性临床样本进行拉曼光谱面扫描检测；
S4.2.6.对采集到的拉曼光谱面扫描数据进行去宇宙射线、去背底、平滑降噪、归一化等数据处理，并采用聚类算法进行聚类分析，将处理后的数据作为新冠病毒阳性临床样本拉曼光谱。
进一步，所述SERS增强基底为具有SERS活性的贵金属纳米结构，如金、银纳米颗粒等。
进一步，所述SERS增强基底包含基底及形成于基底表面的三明治前驱体多层增强结构，其中，三明治前驱体多层增强结构体依次由粘附层、过渡层以及表面功能层组成，所述粘附层形成于基底表面，过渡层用于连接粘附层与表面功能层，表面功能层均匀分布有若干尺寸可调的纳米多孔金簇以及簇与簇之间的纳米沟道，所述纳米多孔金簇内部分布有若干孔隙，纳米沟道尺寸可调且与病毒颗粒尺寸相匹配；
所述粘附层、过渡层和表面功能层的金含量逐渐减少，形成了从粘附层到过渡层再到表面功能层的金原子浓度梯度，使粘附层与过渡层界面以及过渡层与表面功能层界面处的金原子沿浓度梯度方向扩散。
通过本发明方法所构建的新型冠状病毒拉曼光谱数据中心包含新冠病毒结构蛋白拉曼光谱数据库、新冠病毒核酸拉曼光谱数据库、新冠病毒颗粒拉曼光谱数据库以及新冠病毒临床检测样本拉曼光谱数据库等4个子数据库；其中，新冠病毒结构蛋白拉曼光谱数据库包含纯化结构蛋白拉曼光谱、不同浓度结构蛋白拉曼光谱及灭活结构蛋白拉曼光谱；新冠病毒核酸拉曼光谱数据库包含纯化核酸拉曼光谱及不同浓度核酸拉曼光谱；新冠病毒颗粒拉曼光谱数据库包括纯化病毒颗粒拉曼光谱及不同浓度病毒颗粒拉曼光谱；新冠病毒临床检测样本拉曼光谱数据库包括阴性临床样本拉曼光谱及阳性临床样本拉曼光谱。
本发明创造技术方案带来的有益效果：
由于生物大分子的拉曼光谱将受到多种因素的影响，如生物活性，生理环境的复杂性，个体之间的差异性，以及生物大分子与SERS增强基底之间的相互作用等。这些因素的影响给SERS技术检测病毒带来了较大干扰，严重影响了检测结果的可靠性。本发明提出了一套系统的新型冠状病毒拉曼光谱数据中心建立方法，利用该方法可有效地建立一套完整的新型冠状病毒拉曼光谱数据库，从而为实际的新冠病毒拉曼检测提供可靠的标准数据支撑，有效提高检测结果的准确性及置信度。
附图说明
图1为本发明方法所构建的新型冠状病毒拉曼光谱数据中心整体架构；
具体实施方式
下面结合附图及实施例对本发明作进一步详细解释。
实施例1
如图1所示，本实施例提供一种新型冠状病毒拉曼光谱数据中心构建方法，包括以下步骤：
S1.构建新冠病毒结构蛋白拉曼光谱数据库，所述结构蛋白包括刺突蛋白和核蛋白；
S2.构建新冠病毒核酸拉曼光谱数据库；
S3.构建新冠病毒颗粒拉曼光谱数据库；
S4.构建新冠病毒临床检测样本拉曼光谱数据库；
将步骤S1-S4所构建的新型冠状病毒拉曼光谱数据库存入新型冠状病毒拉曼光谱检测服务器中构成新型冠状病毒拉曼光谱数据中心。
具体地，所述步骤S1包含以下子步骤：
S1.1.获取新冠病毒纯化结构蛋白拉曼光谱；
S1.2.获取新冠病毒不同浓度结构蛋白拉曼光谱；
S1.3.获取新冠病毒灭活结构蛋白拉曼光谱；
所述步骤S2包含以下子步骤：
S2.1.获取新冠病毒纯化核酸拉曼光谱；
S2.2.获取新冠病毒不同浓度核酸拉曼光谱；
所述步骤S3包含以下子步骤：
S3.1.获取纯化新冠病毒颗粒拉曼光谱；
S3.2.获取不同浓度新冠病毒颗粒拉曼光谱；
所述步骤S4包含以下子步骤：
S4.1.获取阴性临床样本拉曼光谱；
S4.2.获取阳性临床样本拉曼光谱；
具体地，步骤S1.1包含以下子步骤：
S1.1.1.通过基因重组表达技术分别获得浓度1mg/ml，PBS缓冲的新冠病毒重组表达S蛋白和N蛋白；
S1.1.2.分别取500 μl上述S蛋白和N蛋白于容量0.5ml，截留分子量为10~30kDa（本实施例为30kDa）的超滤离心管中，用无菌水进行脱盐处理，反复操作3~5次（本实施例为3次），获得无菌水置换的S蛋白溶液，并浓缩至10~25μl（本实施例为20μl）；
S1.1.3.分别取1μl浓缩后的S蛋白和N蛋白滴加至洁净的抛光单晶硅片上，用显微共聚焦拉曼光谱仪进行拉曼光谱测试，激发波长采用532nm，功率5~20mW（本实施例为10mW），信号收集时间1~10s（本实施例为5s），重复测试3~5次（本实施例为3次）取平均值作为该测试点的拉曼光谱，重新选取5~15个（本实施例为5个）测试点重复进行拉曼光谱测试，获得空间平均的拉曼光谱；
S1.1.4.对采集到的拉曼光谱（即空间平均拉曼光谱）进行数据处理，包括去宇宙射线、去背底、平滑降噪、归一化等，将处理后的光谱数据作为纯化结构蛋白拉曼光谱。
步骤S1.2包含以下子步骤：
S1.2.1.通过基因重组表达技术分别获得浓度1mg/ml，PBS缓冲的新冠病毒重组表达S蛋白和N蛋白；
S1.2.2.分别取500 μl上述S蛋白和N蛋白于容量0.5ml，截留分子量为10~30kDa（本实施例为30kDa）的超滤离心管中，用无菌水进行脱盐处理，反复操作3~5次（本实施例为3次），获得无菌水置换的S蛋白溶液，并浓缩至10~25μl（本实施例为20μl）；
S1.2.3.用无菌水分别对浓缩后的S蛋白和N蛋白溶液进行梯度稀释，分别稀释至10ppm，1ppm，0.1ppm和0.01ppm；
S1.2.4.分别取1μl稀释后的S蛋白和N蛋白溶液滴至SERS基底表面，自然干燥；
S1.2.5. 对干燥后的结构蛋白用显微共聚焦拉曼光谱仪进行拉曼光谱测试，激发波长采用785nm，功率5~30mW（本实施例为15mW），信号收集时间1~10s（本实施例为5s），重复测试3~5次（本实施例为3次）取平均值作为该测试点的拉曼光谱，重新选取5~15个（本实施例为5个）测试点重复进行拉曼光谱测试，获得空间平均的拉曼光谱；
S1.2.6.对采集到的拉曼光谱（即空间平均拉曼光谱）进行数据处理，包括去宇宙射线、去背底、平滑降噪、归一化等，将处理后的光谱数据作为不同浓度结构蛋白拉曼光谱。
步骤S1.3包含以下子步骤：
S1.3.1.通过基因重组表达技术分别获得浓度1mg/ml，PBS缓冲的新冠病毒重组表达S蛋白和N蛋白；
S1.3.2.分别取500 μl上述S蛋白和N蛋白于容量0.5ml，截留分子量为10~30kDa（本实施例为30kDa）的超滤离心管中，用无菌水进行脱盐处理，反复操作3~5次（本实施例为3次），获得无菌水置换的S蛋白溶液，并浓缩至10~25μl（本实施例为20μl）；
S1.3.3.分别对浓缩后的S蛋白和N蛋白进行热灭活和酒精灭活，热灭活方式为56℃加热30~60min（本实施例为30min），酒精灭活方式为将S蛋白置于75%酒精中处理5~15min（本实施例为5min）；
S1.3.4.分别取1μl灭活后的S蛋白和N蛋白滴加至洁净的抛光单晶硅片上，用显微共聚焦拉曼光谱仪进行拉曼光谱测试，激发波长采用532nm，功率5~20mW（本实施例为10mW），信号收集时间1~10s（本实施例为5s），重复测试3~5次（本实施例为3次）取平均值作为该测试点的拉曼光谱，重新选取5~15个（本实施例为5个）测试点重复进行拉曼光谱测试，获得空间平均的拉曼光谱；
S1.3.5.对采集到的拉曼光谱（即空间平均拉曼光谱）进行数据处理，包括去宇宙射线、去背底、平滑降噪、归一化等，将处理后的光谱数据作为灭活结构蛋白拉曼光谱。
步骤S2.1包含以下子步骤：
S2.1.1.在生物安全三级实验室中，通过病毒毒株分离和培养获得浓度106~1010copies/ml（本实施例为108 copies/ml）的新冠病毒；
S2.1.2.取100μl上述新冠病毒于容量500μl的灭菌离心管中，置于加热装置中加热至56℃，保温30min进行灭活处理；
S2.1.3.采用全自动核酸提取仪及配套核酸提取试剂盒提取灭活后的新冠病毒核酸；
S2.1.4.采用离心、超滤等手段对提取的新冠病毒核酸进行纯化和浓缩；
S2.1.5.取1μl浓缩后的新冠病毒核酸溶液滴加至洁净的抛光单晶硅片上，并将硅片封装至石英盒中；
S2.1.6.用显微共聚焦拉曼光谱仪进行拉曼光谱测试，激发光波长为532nm，功率5~20mW（本实施例为10mW），信号收集时间1~10s（本实施例为5s），重复测试3~5次（本实施例为3次）取平均值作为该测试点的拉曼光谱，重新选取5~15个（本实施例为5个）测试点重复进行拉曼光谱测试，获得空间平均的拉曼光谱；
S2.1.7.对采集到的拉曼光谱（即空间平均拉曼光谱）进行去宇宙射线、去背底、平滑降噪、归一化数据处理，将处理后的光谱数据作为纯化核酸拉曼光谱。
步骤S2.2包含以下子步骤：
S2.2.1.在生物安全三级实验室中，通过病毒毒株分离和培养获得浓度106~1010copies/ml（本实施例为108 copies/ml）的新冠病毒；
S2.2.2.取100μl上述新冠病毒于容量500μl的灭菌离心管中，置于加热装置中加热至56℃，保温30min进行灭活处理；
S2.2.3.采用全自动核酸提取仪及配套核酸提取试剂盒提取灭活后的新冠病毒核酸；
S2.2.4.采用离心、超滤等手段对提取的新冠病毒核酸进行纯化和浓缩；
S2.2.5.用无菌水对浓缩后的新冠病毒病毒核酸溶液进行梯度稀释，分别稀释至10ppm，1ppm，0.1ppm和0.01ppm；
S2.2.6.取1μl稀释后的核酸溶液滴至SERS基底表面，自然干燥；
S2.2.7.将干燥后的新冠病毒核酸密封至石英盒中；
S2.2.8.用显微共聚焦拉曼光谱仪进行拉曼光谱测试，激发光波长为785nm，功率5~30mW（本实施例为15mW），信号收集时间1~10s（本实施例为5s），重复测试3~5次（本实施例为3次）取平均值作为该测试点的拉曼光谱，重新选取5~15个（本实施例为5个）测试点重复进行拉曼光谱测试，获得空间平均的拉曼光谱；
S2.2.9.对采集到的拉曼光谱（即空间平均拉曼光谱）进行去宇宙射线、去背底、平滑降噪、归一化数据处理，将处理后的光谱数据作为不同浓度核酸拉曼光谱。
步骤S3.1包含以下子步骤：
S3.1.1.在生物安全三级实验室中，通过病毒毒株分离和培养获得浓度106~1010copies/ml（本实施例为108 copies/ml）的新冠病毒；
S3.1.2.取100μl上述新冠病毒于容量500μl的灭菌离心管中，置于加热装置中加热至56℃，保温30min进行灭活处理；
S3.1.3.采用离心、超滤等手段对提取的新冠病毒核酸进行纯化和浓缩；
S3.1.4.取1μl浓缩后的新冠病毒溶液滴加至洁净的抛光单晶硅片上，并将硅片封装至石英盒中；
S3.1.5.用显微共聚焦拉曼光谱仪进行拉曼光谱测试，激发光波长为532nm，功率5~20mW（本实施例为10mW），信号收集时间1~10s（本实施例为5s），重复测试3~5次（本实施例为3次）取平均值作为该测试点的拉曼光谱，重新选取5~15个（本实施例为5个）测试点重复进行拉曼光谱测试，获得空间平均的拉曼光谱；
S3.1.6.对采集到的拉曼光谱（即空间平均拉曼光谱）进行去宇宙射线、去背底、平滑降噪、归一化数据处理，将处理后的光谱数据作为纯化新冠病毒颗粒拉曼光谱。
步骤S3.2包含以下子步骤：
S3.2.1.在生物安全三级实验室中，通过病毒毒株分离和培养获得浓度106~1010copies/ml（本实施例为108 copies/ml）的新冠病毒；
S3.2.2.取100μl上述新冠病毒于容量500μl的灭菌离心管中，置于加热装置中加热至56℃，保温30min进行灭活处理；
S3.2.3.采用离心、超滤等手段对提取的新冠病毒核酸进行纯化和浓缩；
S3.2.4.用无菌水对浓缩后的新冠病毒病毒溶液进行梯度稀释，分别稀释至10ppm，1ppm，0.1ppm和0.01ppm；
S3.2.5.取1μl稀释后的病毒溶液滴至SERS基底表面，自然干燥；
S3.2.6.将干燥后的病毒溶液密封至石英盒中；
S3.2.7.用显微共聚焦拉曼光谱仪进行拉曼光谱测试，激发光波长为785nm，功率5~30mW（本实施例为15mW），信号收集时间1~10s（本实施例为5s），重复测试3~5次（本实施例为3次）取平均值作为该测试点的拉曼光谱，重新选取5~15个（本实施例为5个）测试点重复进行拉曼光谱测试，获得空间平均的拉曼光谱；
S3.2.8.对采集到的拉曼光谱（即空间平均拉曼光谱）进行去宇宙射线、去背底、平滑降噪、归一化数据处理，将处理后的光谱数据作为不同浓度病毒颗粒拉曼光谱。
步骤S4.1包含以下子步骤：
S4.1.1.在医院新冠病毒检验实验室获取新冠病毒阴性临床检测样本；
S4.1.2.在生物安全二级实验室中，分别10 μl新冠病毒阴性临床检测样本进行热灭活和酒精灭活，热灭活方式为56℃加热30min，酒精灭活方式为将S蛋白置于75%酒精中处理5min；
S4.1.3.在生物安全柜中，取1μl灭活后的阴性临床样本溶液滴至SERS基底表面，自然干燥；
S4.1.4.将干燥后的阴性临床样本密封至石英盒中；
S4.1.5.将密封后的新冠病毒临床样本置于显微共聚焦拉曼光谱仪样品台上，采用785nm激光，功率5~30mW（本实施例为20mW），进行拉曼光谱面扫描，扫描面积50μm×50μm，扫描步长1~5μm（本实施例为2μm），信号收集时间0.1~10s（本实施例为1s），每个样本测试1~5幅（本实施例为2幅）面扫描光谱；
S4.1.6.对采集到的拉曼光谱面扫描数据进行去宇宙射线、去背底、平滑降噪、归一化数据处理，并采用聚类算法进行聚类分析，将处理后的数据作为新冠病毒阴性临床样本拉曼光谱。
步骤S4.2包含以下子步骤：
S4.2.1.在医院新冠病毒检验实验室获取新冠病毒阳性临床检测样本；
S4.2.2.在生物安全二级实验室中，分别10 μl新冠病毒阳性临床检测样本进行热灭活和酒精灭活，热灭活方式为56℃加热30min，酒精灭活方式为将S蛋白置于75%酒精中处理5min；
S4.2.3.在生物安全柜中，取1μl灭活后的阳性临床样本溶液滴至SERS基底表面，自然干燥；
S4.2.4.将干燥后的阳性临床样本密封至石英盒中；
S4.2.5.将密封后的新冠病毒临床样本置于显微共聚焦拉曼光谱仪样品台上，采用785nm激光，功率5~30mW（本实施例为20mW），进行拉曼光谱面扫描，扫描面积50μm×50μm，扫描步长1~5μm（本实施例为2μm），信号收集时间0.1~10s（本实施例为1s），每个样本测试1~5幅（本实施例为2幅）面扫描光谱；
S4.2.6.对采集到的拉曼光谱面扫描数据进行去宇宙射线、去背底、平滑降噪、归一化数据处理，并采用聚类算法进行聚类分析，将处理后的数据作为新冠病毒阳性临床样本拉曼光谱。
以上所述仅为本发明的较佳实施例而已，并不用以限制本发明，凡在本发明的精神和原则之内所作的任何修改、等同替换和改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。
Claims (6)
1.一种新型冠状病毒拉曼光谱数据中心的构建方法，其特征在于，该方法包括以下步骤：
S1.构建新冠病毒结构蛋白拉曼光谱数据库，所述结构蛋白包括刺突蛋白和核蛋白；
S2.构建新冠病毒核酸拉曼光谱数据库；
S3.构建新冠病毒颗粒拉曼光谱数据库；
将步骤S1-S3所构建的新型冠状病毒拉曼光谱数据库存入新型冠状病毒拉曼光谱检测服务器中构成新型冠状病毒拉曼光谱数据中心；
其中，
所述步骤S1包含以下子步骤：
S1.1.获取新冠病毒纯化结构蛋白拉曼光谱；
S1.2.获取新冠病毒不同浓度结构蛋白拉曼光谱；
S1.3.获取新冠病毒灭活结构蛋白拉曼光谱；
所述步骤S2包含以下子步骤：
S2.1.获取新冠病毒纯化核酸拉曼光谱；
S2.2.获取新冠病毒不同浓度核酸拉曼光谱；
所述步骤S3包含以下子步骤：
S3.1.获取纯化新冠病毒颗粒拉曼光谱；
S3.2.获取不同浓度新冠病毒颗粒拉曼光谱；
所述步骤S1.1包含以下子步骤：
S1.1.1.获取新冠病毒重组表达的结构蛋白；
S1.1.2.对所获取的新冠病毒结构蛋白进行预处理，所述预处理包括脱盐处理和浓缩处理；
S1.1.3.对处理后的结构蛋白进行拉曼光谱检测；
S1.1.4.对采集到的拉曼光谱进行去宇宙射线、去背底、平滑降噪及归一化数据处理，将处理后的光谱数据作为纯化结构蛋白拉曼光谱；
所述步骤S1.2包含以下子步骤
S1.2.1.获取新冠病毒重组表达的结构蛋白；
S1.2.2.对所获取的新冠病毒结构蛋白进行预处理，所述预处理包括脱盐处理和浓缩处理；
S1.2.3.采用无菌水对浓缩后的结构蛋白进行梯度稀释获得一系列不同浓度的结构蛋白溶液；
S1.2.4.将稀释后的结构蛋白溶液滴至SERS增强基底上自然干燥；
S1.2.5.对干燥后的结构蛋白进行拉曼光谱检测；
S1.2.6.对采集到的拉曼光谱进行去宇宙射线、去背底、平滑降噪及归一化数据处理，将处理后的光谱数据作为不同浓度结构蛋白拉曼光谱；
所述步骤S1.3包含以下子步骤
S1.3.1.获取新冠病毒重组表达的结构蛋白；
S1.3.2.对所获取的新冠病毒结构蛋白进行预处理，所述预处理包括脱盐处理和浓缩处理；
S1.3.3.对浓缩后的结构蛋白进行灭活处理；
S1.3.4.对灭活后的结构蛋白进行拉曼光谱检测；
S1.3.5.对采集到的拉曼光谱进行去宇宙射线、去背底、平滑降噪及归一化数据处理，将处理后的光谱数据作为灭活结构蛋白拉曼光谱；
所述步骤S2.1包含以下子步骤：
S2.1.1.获取分离、纯化后的新冠病毒；
S2.1.2.对所获取的新冠病毒进行灭活处理；
S2.1.3.提取新冠病毒核酸；
S2.1.4.对提取的新冠病毒核酸进行纯化和浓缩；
S2.1.5.将纯化浓缩后新冠病毒核酸密封至石英盒中；
S2.1.6.对密封后的新冠病毒核酸进行拉曼光谱检测；
S2.1.7.对采集到的拉曼光谱进行去宇宙射线、去背底、平滑降噪及归一化数据处理，将处理后的光谱数据作为纯化核酸拉曼光谱；
所述步骤S2.2包含以下子步骤：
S2.2.1.获取分离、纯化后的新冠病毒；
S2.2.2.对所获取的新冠病毒进行灭活处理；
S2.2.3.采用核酸提取试剂提取新冠病毒核酸；
S2.2.4.对提取的新冠病毒核酸进行纯化和浓缩；
S2.2.5.采用无菌水对浓缩后的新冠病毒核酸进行梯度稀释，获得不同浓度的新冠病毒核酸溶液；
S2.2.6.将稀释后的病毒核酸溶液滴至SERS增强基底上自然干燥；
S2.2.7.将干燥后的新冠病毒核酸密封至石英盒中；
S2.2.8.对密封后的新冠病毒核酸进行拉曼光谱检测；
S2.2.9.对采集到的拉曼光谱进行去宇宙射线、去背底、平滑降噪及归一化数据处理，将处理后的光谱数据作为不同浓度核酸拉曼光谱；
所述步骤S3.1包括以下子步骤：
S3.1.1.获取分离、纯化后的新冠病毒颗粒；
S3.1.2.对所获取的新冠病毒进行灭活处理；
S3.1.3.对灭活后的新冠病毒进行纯化和浓缩；
S3.1.4.将纯化浓缩后新冠病毒密封至石英盒中；
S3.1.5.对密封后的新冠病毒进行拉曼光谱检测；
S3.1.6.对采集到的拉曼光谱进行去宇宙射线、去背底、平滑降噪及归一化数据处理，将处理后的光谱数据作为纯化新冠病毒颗粒拉曼光谱；
所述步骤S3.2包括以下子步骤：
S3.2.1.获取分离、纯化后的新冠病毒颗粒；
S3.2.2.对所获取的新冠病毒进行灭活处理；
S3.2.3.对灭活后的新冠病毒进行纯化和浓缩；
S3.2.4.采用无菌水对浓缩后的病毒进行梯度稀释，获得不同浓度的病毒颗粒溶液；
S3.2.5.将稀释后的病毒溶液滴至SERS增强基底上自然干燥；
S3.2.6.将干燥后的新冠病毒密封至石英盒中；
S3.2.7.对密封后的新冠病毒进行拉曼光谱检测；
S3.2.8.对采集到的拉曼光谱进行去宇宙射线、去背底、平滑降噪及归一化数据处理，将处理后的光谱数据作为不同浓度病毒颗粒拉曼光谱。
2.如权利要求1所述的新型冠状病毒拉曼光谱数据中心的构建方法，其特征在于，该方法还包括步骤S4.构建新冠病毒临床检测样本拉曼光谱数据库，并将新冠病毒临床检测样本拉曼光谱数据库存入新型冠状病毒拉曼光谱检测服务器中构成新型冠状病毒拉曼光谱数据中心。
3.如权利要求2所述的新型冠状病毒拉曼光谱数据中心的构建方法，其特征在于，步骤S4包括步骤S4.1获取阴性临床样本拉曼光谱，所述步骤S4.1具体包括以下子步骤：
S4.1.1.获取新冠病毒阴性临床样本；
S4.1.2.对所获取的新冠病毒阴性样本进行灭活处理；
S4.1.3.将灭活后的阴性样本滴至SERS增强基底上自然干燥；
S4.1.4.将干燥后的阴性临床样本密封至石英盒中；
S4.1.5.对密封后的阴性临床样本进行拉曼光谱面扫描检测；
S4.1.6.对采集到的拉曼光谱面扫描数据进行去宇宙射线、去背底、平滑降噪、归一化数据处理，并采用聚类算法进行聚类分析，将处理后的数据作为新冠病毒阴性临床样本拉曼光谱。
4.如权利要求3所述的新型冠状病毒拉曼光谱数据中心的构建方法，其特征在于，步骤S4还包括步骤S4.2获取阳性临床样本拉曼光谱，所述步骤S4.2具体包括以下子步骤：
S4.2.1.获取新冠病毒阳性临床样本；
S4.2.2.对所获取的新冠病毒阳性样本进行灭活处理；
S4.2.3.将灭活后的阳性样本滴至SERS增强基底上自然干燥；
S4.2.4.将干燥后的阳性临床样本密封至石英盒中；
S4.2.5.对密封后的阳性临床样本进行拉曼光谱面扫描检测；
S4.2.6.对采集到的拉曼光谱面扫描数据进行去宇宙射线、去背底、平滑降噪及归一化数据处理，并采用聚类算法进行聚类分析，将处理后的数据作为新冠病毒阳性临床样本拉曼光谱。
5.如权利要求1-4任一项所述的新型冠状病毒拉曼光谱数据中心的构建方法，其特征在于，所述SERS增强基底为具有SERS活性的贵金属纳米结构。
6.如权利要求1-4任一项所述的新型冠状病毒拉曼光谱数据中心的构建方法，其特征在于，所述SERS增强基底为包含基底及形成于基底表面的三明治前驱体多层增强结构，其中，三明治前驱体多层增强结构体依次由粘附层、过渡层以及表面功能层组成，所述粘附层形成于基底表面，过渡层用于连接粘附层与表面功能层，表面功能层均匀分布有若干尺寸可调的纳米多孔金簇以及簇与簇之间的纳米沟道，所述纳米多孔金簇内部分布有若干孔隙，纳米沟道尺寸可调且与病毒颗粒尺寸相匹配；
所述粘附层、过渡层和表面功能层的金含量逐渐减少，形成了从粘附层到过渡层再到表面功能层的金原子浓度梯度，使粘附层与过渡层界面以及过渡层与表面功能层界面处的金原子沿浓度梯度方向扩散。
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