CN109804236A

CN109804236A - 可重构表面增强拉曼光谱装置及其方法

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Publication number: CN109804236A
Application number: CN201780062660.4A
Authority: CN
Inventors: H·戴思; A·多克斯里斯; C·埃斯科韦多
Original assignee: Queens University at Kingston
Current assignee: Queens University at Kingston
Priority date: 2016-08-11
Filing date: 2017-08-04
Publication date: 2019-05-24
Also published as: SG11201901092UA; EP3497432A4; CA3033447A1; JP2019525186A; WO2018027309A1; US20190170652A1; EP3497432A1; KR20190039999A; US11237112B2

Abstract

一种表面增强拉曼光谱(SERS)装置，其包括非导电基板，至少两个微电极以间隔关系设置在所述基板上，使得沿着所述微电极的边缘和/或相对边缘形成检测位点，和纳米颗粒结构，其包括设置在所述检测位点上的多个金属纳米颗粒。所述纳米颗粒结构的组装可以通过所述至少两个微电极之间的电场来引导。所述的SERS装置便宜、坚固、便携且可重复使用。本文还描述了使用和制备SERS装置的方法，其使用了简单、快速及廉价的制造技术。

Description

可重构表面增强拉曼光谱装置及其方法

技术领域

本发明涉及的是表面增强拉曼光谱(SERS)。具体地说，本发明设计的是一种高灵敏度的SERS装置，其对于生产和再利用而言简单且成本有效。

发明背景

全球迫切需要更灵敏和更具成本效益的装置来检测环境或生物流体中痕量的生物化学物质，特别是致病的分析物。此外，在早期阶段以低水平检测诸如癌症的疾病的生物标志物的能力将允许快速和指导性治疗，最终获得更好的患者结果。目前的检测方法，例如聚合酶链反应(PCR)、酶联免疫吸附测定(ELISA)或质谱(MS)，需要昂贵的试剂、训练有素的人员和专用的实验室设备来进行精确和灵敏的检测。最近，拉曼光谱，特别是表面增强拉曼光谱(SERS)所赋予的附加灵敏度，已经显示出对生物分子、化学污染物、非法药物和全细胞的灵敏检测的前景。

SERS提供了大量高分辨率和化学特定的振动信息，其强度比普通拉曼光谱高出14个数量级，并且通过与光纤、二极管激光器和便携式拉曼光谱仪相结合，成为了一种有前景的护理点诊断或远程检测技术。SERS是通过两种机制产生的：(1)电磁增强，由局部表面等离子体共振-被限制在纳米结构金属表面内的电磁激励引起的，并起到局部增强入射电磁场和散射拉曼场的作用；(2)由金属和吸附的分析物之间的电荷转移产生的化学增强。SERS通常在悬浮纳米颗粒的胶体溶液中进行；然而，这种检测方法具有较差的重现性、不均匀的纳米颗粒/分析物分布以及SERS活性位点的瞬态。因此，精确制造、结构良好的纳米底物是良好的SERS检测的关键。目前的纳米制造方法昂贵且耗时，需要专用的洁净室设施，以及涉及的技术，例如聚焦离子束蚀刻、电子束光刻、原子层沉积或金属膜超纳米球沉积。不幸的是，成本和具体要求限制了SERS的广泛使用。

发明内容

本文描述了一种表面增强拉曼光谱(SERS)装置，其包括：非导电基板；至少两个微电极，其以间隔关系设置在所述基板上，使得沿着所述微电极的边缘和/或相对边缘形成检测位点；以及纳米颗粒结构，其包括设置在所述检测位点中的多个金属纳米颗粒。

所述纳米颗粒结构的组装可以通过所述至少两个微电极之间的电场来引导。所述的电场可以包括AC电场。所述的电场可以包括具有DC分量的AC电场。所述的电场可以包括DC电场。所述的电场可以包括静电场。所述纳米颗粒结构可以是分支的、成簇的、聚集的、分形的和/或树枝状的结构。在一个实施方案中，所述的纳米颗粒结构是树枝状结构。

所述的纳米颗粒可以是官能化的。官能化的纳米颗粒可以包括表面改性。表面改性可以包括设置在至少一个纳米颗粒上的至少一种蛋白质、核酸或功能分子、分子片段、表位或其组合。

本文还描述了一种制备SERS装置的方法，其包括：提供具有至少两个微电极的非导电基板，所述微电极以间隔关系设置在所述基板上，使得在所述微电极的相对边缘之间形成检测位点；在诱导、引导或影响金属纳米颗粒组装成检测位点的纳米颗粒结构的条件下，在检测位点上设置多个金属纳米颗粒。

所述诱导、引导或影响金属纳米颗粒组装成纳米颗粒结构的条件可包括在至少两个电极之间的电场。电场可以包括AC电场。电场可以包括具有DC分量的AC电场。电场可以包括DC电场。电场可以包括静电场。

本文还描述了一种制备SERS装置的方法，其包括：提供非导电基板，其具有至少两个微电极，所述微电极以间隔关系设置在所述基板上，使得沿所述微电基边缘和/或相对边缘之间形成检测位点；在所述至少两个微电极之间存在电场的情况下，在检测位点上设置多个金属纳米颗粒；其中所述金属纳米颗粒在所述电场的存在下在检测位点组装成纳米颗粒结构。所述方法可以包括使用AC电场，可选地具有DC分量。所述方法可包括组装支化的、成簇的、聚集的、分形的和/或树枝状的纳米颗粒结构，或其组合。

所述方法可包括使用官能化的纳米颗粒。官能化的纳米颗粒可包括所述纳米颗粒的表面改性。官能化的纳米颗粒可以在至少一个纳米颗粒上包括至少一种蛋白质、核酸或功能分子、分子片段、表位或其组合。

所述方法可包括使用所述电极和所述纳米颗粒结构在检测位点浓缩分析物。

所述方法可包括将所述树枝状纳米颗粒结构可移除地组装在检测位点中。

本文还描述了使用SERS分析样品的方法，其包括：提供非导电基板，其具有至少两个微电极，所述微电极以间隔关系设置在所述基板上，使得沿着微电极的边缘和/或相对边缘之间形成检测位点；在诱导、引导或影响金属纳米颗粒组装成检测位点中的纳米颗粒结构的条件下，在检测位点上设置多个金属纳米颗粒；将所述样品应用于检测位点；以及使用SERS在检测位点的一个或多个位置探测样品。

所述诱导、引导或影响金属纳米颗粒组装成纳米颗粒结构的条件可包括在所述至少两个电极之间的电场。所述电场可以是AC电场、DC场或静电场。所述电场可以包括具有DC分量的AC电场。所述方法可以包括在纳米颗粒结构的组装期间和在应用样品期间存在所述电场。

所述方法可以包括在检测位点处浓缩所述样品中的分析物。

所述方法可以进一步包括移除所述纳米颗粒结构和所述样品；以及重新使用所述具有至少两个微电极的非导电基板。

附图说明

为了更好地理解本发明，并且为了更清楚地展示出如何实施本发明，将通过示例的方式参考附图描述实施方案，其中：

图1是根据一个实施方案的示意图，其中(a)在SERS装置的微电极上制备纳米颗粒结构，(b)-(c)使用SERS装置检测分析物，和(d)移除纳米颗粒结构，使得所述微电极可以重复使用。

图2A-2H是根据不同的实施方案的SERS装置的图像，其中，图2A和2C是通过电动沉积在微电极上产生的AgNP结构的显微照片，图2B和2D是所述纳米结构的相应的SEM图像；图2E是由施加DC偏移通过电动沉积在微电极上产生的AgNP结构的显微照片，图2F是所述纳米结构的SEM图像；图2G是微电极的显微照片，其具有AuNP的电动沉积，以及图2H是所述AuNP的SEM图像。

图3是显示在不同电场条件下形成的用于AuNP和AgNP的SERS装置的性能的图，通过R6G的SERS光谱中的1360cm-1峰的强度进行量化。

图4显示的是根据一个实施方案的SERS装置与AgNP枝晶的电动沉积(光谱已经向上移动用于可视化)和海洋光学SERS基板比较的图，用于检测10-5M R6G。

图5A是根据一个实施方案的使用R6G校准SERS装置的对数-对数图(误差条表示在相同的采集参数下重复(n＝6)测量的标准偏差)。

图5B是显示图5A中的实施方案浓度为0.1mM至1nm(从上到下)之下的平均SERS光谱的图，突出显示的区域指示用于校准的峰。

图6A-6C是显示根据一个实施方案使用SERS装置检测分析物的图，其中，图6A、6B和6C分别显示了使用分析物的被动表面吸附的三聚氰胺、可卡因和福美双的结果；所有光谱代表SERS装置上三个不同位置的平均值。

图7A和7B是使用SERS装置实施方案和分析物的电动浓缩获得的BSA(图7A)和大肠杆菌K12(图7B)的光谱图；“硅”表明在没有AgNP枝晶的情况下没有观察到信号。

图8是显示使用未涂覆的树枝状晶体(下部迹线)和石墨烯涂覆的树枝状晶体(上部迹线)从罗丹明6G(R6G)获得的SERS信号的屏幕截图。

具体实施方式

本文描述的是廉价的、坚固的且便携的SERS装置。此外，如本文所描述的SERS装置可以是可重复使用的。本文还描述了使用简单、快速和廉价的制造技术来使用和制备SERS装置的方法。

如本文所用，术语“SERS装置”是指可用于使用拉曼光谱分析分析物的装置，其包括固体基板、设置在基板上的两个或更多个微电极，以及设置在结构上的纳米颗粒，使得纳米颗粒根据微电极之间的电场在两个或更多个微电极之间形成纳米颗粒结构。

如本文所用，术语“固体基板”是指用于SERS装置的载体材料，其上设置有两个或更多个微电极。所述的固体基板是坚固的，这意味着它具有一种或多种特性，例如：自支撑、抗弯曲、可清洗和防水等。尽管固体基板抗弯曲(例如，在没有施加力的情况下它不会弯曲)，但它可以是柔性的。固体基板不导电，并且可包含一种或多种材料，例如硅、玻璃、石英、氧化铝、聚合物、纸等。

术语“电极”和“微电极”在本文中可互换使用。通常，电极的尺寸可能会有很大的变化。根据本文描述的实施方案，电极的尺寸可根据给定的应用和SERS装置的设计而定。例如，电极可以是微米级、毫米级或更大。

如本文所用，术语“检测位点”是指可以形成树枝的电极边缘的任何地方和/或附近的区域，在该区域可以检测分析物。检测位点可以包括，例如，可以检测分析物的两个或更多个电极之间的区域。正在研究的样品可以放置在检测位点的SERS装置上。

形成两个或更多个微电极的导电层可以涂覆或沉积在所述固体基板材料的表面上。所述的导电层可包括金属(其可包括单一金属或合金，在一层或多层中)或一种或多种非金属材料(例如碳、石墨烯、导电聚合物(例如，聚吡咯))或导电聚合物复合材料)。所述的两个或更多个电极可以以2-D或3-D(例如，非平面)配置布置，并且以间隔关系布置，使得在所述两个或更多个微电极的相对边缘之间形成一个或多个检测位点。例如，一个或多个电极可以设置在基板上，并且一个或多个电极可以设置在装置(例如，探针)的尖端上，并且基板和装置的尖端被布置使得产生3-D电极配置。此配置可以允许尖端电极相对于基板电极移动。在另一个实施例中，一个或多个电极可以设置在第一基板上，并且一个或多个电极可以设置在第二基板上，并且第一和第二基板面对面(face-to-face)(例如，基本上共面，或者以选定的角度)地布置，以产生3-D电极配置。所述两个或更多个微电极可以以它们的最终形式沉积，或者可以通过随后去除金属(例如，通过使用机械、化学、激光和/或微加工技术)来形成，或者可以调整其形状和/或尺寸和/或间隔。例如，可以执行两个或更多个微电极的形状、尺寸和/或间隔以调整或定制检测位点的尺寸或形状。如本领域普通技术人员显而易见的，可以在沉积金属之前根据需要对固体基板进行表面处理，以实现或增强金属与固体基板的粘附。

如本文所用，术语“纳米颗粒结构”和“纳米结构”是指在诱导、引导或影响金属纳米颗粒组装成纳米颗粒结构的条件下由检测位点中的金属纳米颗粒假定或实现的结构。所述条件包括在所述至少两个电极之间的电场，其可以通过在所述两个或更多个电极上施加电势差来产生。在一个实施方案中，所述的电场可以是AC电场。在另一个实施方案中，所述的AC电场可以包括DC分量或DC偏移。在另一个实施方案中，所述电场可以是DC电场。在另一个实施方案中，所述电场可以是静电场。可以通过向电极提供静电荷来产生静电场。举例来说，带电分子(例如，可解离分子，例如聚赖氨酸、离子表面活性剂、DNA)或带有可解离基团的颗粒可布置在电极上，然后在没有外部电路或电源的情况下产生静电场。一般来说，纳米颗粒结构可以响应电场而形成，该电场会引起类似于随机运动(即布朗运动)的纳米颗粒的吸引/运动。

所述的纳米颗粒结构包括组装成分支、成簇、聚集、分形和/或树枝状结构的纳米颗粒。金属纳米颗粒可由单一金属或两种或更多种金属的合金制备。金属纳米颗粒可包括包含不同金属的纳米颗粒的混合物。所述金属可以选自但不限于银、金、铜和铂。

如本文所述的SERS装置实现两个设计原则：(1)强的SERS增强，其提高检测灵敏度，和(2)有效的表面覆盖。但是，在以前的方法中，这些目标往往是竞争的；由于产生纳米颗粒的局部表面等离子体共振(LSPR)的密度，完全以绝对能量最小沉积的纳米颗粒的致密聚集体可以产生强的SERS增强；然而，它们不会为分析物吸附和随后的SERS检测提供显著的表面积。

本文描述的实施方案通过在纳米颗粒结构之间提供强的LSPR耦合来克服这种折衷，纳米颗粒结构可包括分支、成簇和/或树枝状结构。如本文所述，这可以通过金属纳米颗粒的电动沉积，即纳米颗粒结构的电场驱动组装来实现。电动沉积包括将交流(AC)波形(例如，正弦波、方波、三角波、锯齿波等)应用于两个或更多个微电极以在它们之间(即，穿过检测位点)产生电场。在一些实施方案中，还可以将直流(DC)偏移应用于两个或更多个微电极。在一些实施方案中，可以将DC电场或静电场施加到两个或更多个微电极。所述的电场作用于纳米颗粒以影响、诱导或指导纳米颗粒结构的形成，在一些实施方案中，包括形成分支、成簇和/或树枝状结构。纳米颗粒结构可以是“主动的(active)”，其指的是结构的特征，包括分支、成簇和/或树枝状结构的形成和范围，可以在沉积期间被控制、调整和/或优化，以及在通过提供和任选地控制电极间隙上的电场来分析样品(即，动态地)期间。例如，可以通过调节AC电流的一个或多个参数(例如，电压、电流、频率，波形形状、占空比)以及可选地DC偏移来控制电场，从而调节电场。结果表明，诸如树枝的纳米颗粒结构不仅在基板表面上具有良好的覆盖，它们还充当微电极的延伸，局部增强电场并使活性分析物转移到检测位点。

金属纳米颗粒可以表现出两种性质：(1)高的宽高比和/或各向异性(例如，由非球形或不规则形状提供的高表面积与体积比，例如纳米棒、金字塔、半球形、十面体等，可以使用两种或更多种不规则形状)；(2)表面不规则性(例如，变化的表面形貌或表面特征，例如凸起、点、纳米星、纳米海胆等)。

此外，或可替代地，纳米颗粒和/或纳米颗粒结构(例如树枝)可以使用，例如，一种或多种蛋白质(例如，酶、抗体)、抗体片段(例如，表位)、核酸(例如，RNA、DNA、适体)或功能分子(例如，一种自组装单分子层(SAM)，其包含终止于两个官能团的烃尾，在链的任一侧上有一个官能团)，包括其组合，以优化选定分析物的特异性和灵敏度。例如，可以制备纳米颗粒，其投射某些表面官能团，以帮助分析物与纳米颗粒的耦合。表面改性/官能化可以包括将碳基材料(例如石墨烯和石墨烯衍生物)应用于纳米颗粒和/或纳米颗粒结构(例如树枝状结构)。例如，氧化石墨烯、还原的氧化石墨烯或多层石墨烯颗粒可沉积在纳米颗粒结构和/或纳米颗粒上，以增加SERS信号。石墨烯材料可以通过例如喷涂或以其他方式将石墨烯基纳米片的悬浮液直接施加在纳米颗粒结构的表面上和/或纳米颗粒结构下方(例如，首先施加涂层，然后将纳米颗粒结构组装到涂层顶部)来沉积为涂层。官能化纳米颗粒通过与分析物结合并将其浓缩在检测位点来增强分析物的SERS检测。官能化的纳米颗粒可以单独使用或与电场一起使用以将分析物浓缩在检测位点。

图1A-1D示出了根据一个实施方案的SERS装置的制备和使用的示意图。根据该实施方案，四个微电极12a、12b、13a、13b(即，四极微电极阵列)设置在基板10上。检测位点由图1A中的四个箭头表示。在图1A中，将包含金属纳米颗粒16的液滴14放置在微电极阵列上，并通过向微电极施加AC电压来激活阵列，其中相对的微电极对(即，12a、12b和13a、13b)具有相同的极性。纳米颗粒16通过电场诱导效应组装成分支或树枝状纳米结构16a。然后用空气流除去含有金属纳米颗粒的液滴，并用去离子水冲洗该装置。图1B显示了活性分析物收集，其中将样品18的液滴置于SERS装置上，并将分析物颗粒18a浓缩至检测位点。在图1C中，拉曼显微光谱19用于探测检测位点并识别/定量分析物。在图1D中，用表面活性剂溶液(例如洗碗皂)清洗微电极阵列，以除去树枝状晶体和样品，从而可以重复使用SERS装置。

而图1A-1B示出了2-D配置的实施方案，在其他实施方案中，电极可以以3-D配置设置。例如，一个电极阵列可以设置在一个表面上(全部具有相同的电荷)，而反电极阵列(相反电荷)则设置在面向前者的表面上(例如，类似于两个相对的壁)。

在AC电场下观察到的金属纳米颗粒的运动和组装被认为是由以下一种或多种因素引起的：(1)纳米颗粒的布朗运动；(2)介电电泳(DEP)，一种在空间非均匀电场中直接作用于极化粒子的确定力；(3)相互DEP，一种有吸引力的，电场产生的粒子-粒子相互作用，其作用通常是在诱导偶极子之间产生链；(4)电泳(EP)，一种直接作用于电场中带电粒子的确定力；和(5)电流体动力流体流动，包括交流电渗透(ACEO)和交流电热流(ACETF)。在某些AC电场条件(例如，电压、频率)下，这三种电动力可能会相互竞争，从而防止在复杂的结构中出现明显的NP组织和滞留。一般情况下，ACEO的工作频率范围为100Hz-100kHz(尽管此范围取决于介质的电导率)，交流ETF在交流频率大于100kHz时占主导地位。

这种有组织的、延伸的树枝状纳米结构被认为是通过涉及介电电泳和偶极粒子链力的质量转移控制过程形成的。球形颗粒上的时间平均介电泳力<FDEP>由下式给出：

其中，ε_m是介质的介电常数，r是粒子的半径，E是电场的均方根强度，代表复值克劳修斯-摩索蒂(Clausius-Mossotti)系数，这是粒子相对于介质的极化率的量度。对于导电纳米颗粒，该值在整个实验频率范围(<10GHz)内为正，因此介电电泳在高电场梯度区域的方向上起作用(这被称为正DEP，pDEP)。另外，对于具有不对称几何形状或高高宽比的纳米颗粒，可以远大于1，从而允许更强的吸引力DEP力和促进分支和枝晶生长的定向扭矩。

金属树枝状纳米结构以前是通过电化学过程产生的，主要是通过涉及从含金属离子的溶液中沉积和还原的电化学方法(Yu，J。等人，“Synthesis of Dendritic SilverNanoparticles and Their Applications as SERS Substrates(树枝状银纳米颗粒的合成及其作为SERS基质的应用)”，Adv.Mater.Sci.Eng.，2013:1–4；He,L.L等人，“Surface-enhanced Raman spectroscopy coupled with dendritic silver nanosubstrate fordetection of restricted antibiotics(用于检测限制性抗生素的表面增强拉曼光谱与树枝状银纳米基底结合)”，J.Raman Spectrosc，41：739-744,2010；Wang,Q等人，“Agdendritic nanostructures or rapid detection of thiram based on surface-enhanced Raman scattering(基于表面增强拉曼散射的Ag树枝状纳米结构或福美双的快速检测)”，RSC Adv.，5：70553-70557,2015；Fei Chan，Y等人，“Ag dendriticnanostructures as ultrastable substrates for surface-enhanced Ramanscattering(Ag树枝状纳米结构作为用于表面增强拉曼散射的超稳定基板)”，Appl.Phys.Lett.,102：183118，2013)。由于通过在紧密间隔的枝晶分支上耦合纳米颗粒而使等离子体共振扩大，这种树枝状晶体起到高度增强基板的作用(特别是当用Ag生产时)(Kneipp,K等人，“Surface-enhanced Raman scattering and biophysics(表面增强拉曼散射和生物物理学)J.Phys.Condens.Matter，14：R597-R624,2002)。然而，虽然Ag具有最高的贵金属增强因子，但它是最不稳定的(它在大气条件下氧化)；因此，为了能够利用其增强能力，需要一种原位、快速和使用点Ag枝晶制造的方法。

枝晶形成的过程是质量转移控制过程，其主要通过短程介电电泳力，在阈值局部纳米颗粒浓度和吸引力大小下发生。根据本文所述的实施方案，约2.5-3.5V峰-峰电压允许偶极链接力(例如，相互DEP)通过克服带电纳米颗粒之间的静电排斥来促进延伸的树枝状纳米颗粒结构的形成。由于金属纳米颗粒具有导电性，因此pDEP介导的纳米颗粒积累有效地延伸电极，局部地扭曲电场并产生促进电线延伸的高场区域。尽管先前已经注意到pDEP介导的导电纳米颗粒的组织，但是这种组织仅限于单向链或线状结构(参见，例如，Papadakis,S.J等人，“Dielectrophoretic assembly of reversible and irreversiblemetal nanowire networks and vertically aligned arrays(可逆和不可逆金属纳米线网络和垂直排列阵列的介电电泳组件)”，Appl.Phys.Lett.,88,no.23:233118,2006；Ranjan,N等人，“Growing one-dimensional metallic nanowires by dielectrophoresis(通过介电电泳生长一维金属纳米线)”，Small,2:1490–6,2006)。

然而，如本文所述，对于支化和枝晶形成，而不是单向伸长，纳米颗粒必须缓慢移动，并且经历足够小的力，从而能够对各种能量状态进行取样。因此存在小的电动参数窗口，其中可能发生枝晶形成：电压必须足够大以允许紧密的纳米颗粒结合，但不大到在单个高场区域引起聚集，并且频率必须使电流体动力学流体最小化流动以允许发生质量有限的增长。

实施方案包括特征的组合，例如金属纳米颗粒的电场引导组装、等离子体活性树枝状结构和电极结构，以及局部浓缩分析物的纳米颗粒(例如，树枝状)结构。这种组合特征共同提供了一种SERS装置，该装置对于痕量分析物的检测具有超灵敏性。

另外，实施方案的特征在于固体基板，其提供坚固的、可重复使用的和可重新配置的结构。在该特征中，实施方案与具有软基板的现有装置(例如，某些现有装置中的纸)形成鲜明对比。由于存在固体基板，树枝状结构可以在使用后从表面除去(例如，通过用简单的表面活性剂溶液清洗，如肥皂)，并通过施加新的纳米颗粒代替。此外，固体基板能够使用与批量生产兼容的制造技术，允许以非常低的每芯片成本生产“芯片上的SERS(SERS-on-a-chip)”装置，并且与微流体装置兼容。尽管可以使用光刻(洁净室)设备进行制备，但这并不总是必要的，因为一些实施方案，特别是那些具有更大和更简单的电极配置的实施方案，可以在工作/实验室工作台上组装，或者使用可以包括小型手持装置的简化设备。例如，活性枝晶组装过程可以在手持装置内进行，其中纳米粒子以包含在盒中的悬浮液的形式提供。因此，这些实施方案消除了对专用设施和设备的需求，从而在不牺牲灵敏度的情况下显著降低了成本和准备时间。

如本文所述的SERS装置可以在同一芯片上的多个位置独立组装，从而允许多个分析物检测同时发生。如本文所述的SERS装置和方法与光纤和模块化拉曼显微镜兼容，可实现小型化和改进的便携性。例如，实施方案可以被配置并适用于现场使用和手持使用。如本文所述的SERS装置和方法提供了在几分钟内几乎可以在任何地方建立的装置。例如，SERS装置可以在检测事件发生前立即就地构建，从而避免基板劣化(例如，氧化)。

通过以下非限制性实施例进一步描述实施方案。

实施例1

如本文所述，制备SERS装置并用于检测罗丹明、三聚氰胺、福美双、可卡因、牛血清白蛋白(BSA)和大肠杆菌(E.coli)K12。

材料

罗丹明6G(R6G，99％)、三聚氰胺(99％)、福美双(分析标准)、可卡因(1mg/mL，在乙腈中)、牛血清白蛋白(BSA，>98％)和抗生物素蛋白-FITC(来自蛋清)购自Sigma-Aldrich(Oakville，ON)。从Cytodiagnostics Inc.(伯灵顿，ON)获得的直径为50nm，在2mM柠檬酸盐中稳定的银纳米颗粒(AgNPs)和直径为60nm的稳定在0.1mM PBS中的球形金纳米颗粒(AuNP)。具有热生长的SiO₂层(0.5μm)的抛光硅晶片(4“直径)购自UniversityWafer(South Boston，MA)。在整个实验中使用了密理博水(Millipore water)(18.2MΩcm)。

微芯片制造

电极的微细加工在金士顿纳米制造厂(KNFL，Innovation Park，Kingston，ON)进行了电极的微加工，通过在硅晶片上的无掩模光刻作为基板进行，然后进行电子束金属膜蒸发和剥离。将负性光致抗蚀剂(SU-8，MicroChem Corp，Westborough，MA)与IMP无掩模光刻系统一起使用，以将微电极图案转移到硅基板上。使用5nm的铬层来改善沉积的Au层(100nm厚度)与硅基底的粘附性。

分析物样品制备

将R6G以0.1M的储备浓度溶解在甲醇中，并在甲醇/水(1：1)中稀释，以产生1mM、0.1mM、0.01mM、0.001mM、100nM、10nM和1nM的溶液。将三聚氰胺溶解在水中至储备浓度为1mg/mL(1000ppm)并在水中稀释以产生100ppm、10ppm、1ppm、100ppb，10ppb、1ppb和100ppt的溶液。购买可卡因时，可卡因以1000ppm的储备浓度溶解在乙腈中，并在水中稀释以产生100ppm、10ppm、1ppm、100ppb、10ppb和1ppb的溶液。大肠杆菌在LB琼脂平板上生长。通过将细菌悬浮在水中，以6000rpm离心10分钟，并重复悬浮/离心步骤两次，产生低电导率悬浮液(1.0±0.5mS/m)。使用Petroff-Hausser细菌计数器测定悬浮液的浓度。

纳米颗粒溶液制备

为了得到有效的表面覆盖，需要在电动力学沉积纳米颗粒之前进行预浓缩步骤。因此，通过在3800g离心20分钟浓缩所有纳米颗粒溶液，然后除去上清液以达到2.9×10¹¹个颗粒/mL的最终浓度。在浓缩后对样品进行超声处理，并且在Malvern Zetasizer Nano上使用动态光散射(DLS)和zeta电位测量来确保在适合于多次实验的一段时间内的单峰、非聚集、稳定的分散。

电动纳米颗粒沉积

所有实验均在室温下进行。稀释后立即使用细菌悬浮液。使用微量移液管(例如，图1A)将10μL浓缩的NP溶液样品置于微电极阵列中心上方。电动纳米颗粒组装在10Hz和2.5Vp(正弦波形)下进行12分钟，DC偏移为0.5V。在NP沉积之后，将芯片用水清洗并在空气流中干燥。

对于较小的分析物(R6G、三聚氰胺、可卡因和福美双)，使用被动分析物收集(即，被动吸附)，其中2μL分析物溶液沉积在微电极阵列表面上，并且在检测之前使溶剂蒸发。对于较大的分析物(BSA或大肠杆菌)，在检测之前以电动方式进行活性分析物收集：在微电极阵列中心沉积10μL分析物溶液滴，并且在10kHz和15Vpp下运行收集15分钟。

表面表征

扫描电子显微镜(SEM)是在Queen's Facility for Isotope Research(皇后的同位素研究设施)，在MLA 650FEG环境SEM上，在5.00kV的电压下进行。光学显微镜是在拉曼显微光谱仪的Olympus BX-41显微镜上进行。图像J用于处理SEM图像和百分比表面覆盖率分析。在具有绿色荧光蛋白(GFP)过滤器的Olympus 1X83倒置荧光显微镜上进行荧光显微镜检查。

拉曼测量和光谱处理

使用具有632.8nm氦/氖激光(17mW)，1800l/nm光栅和Olympus BX-41显微镜系统的HORIBA Jobin Yvon拉曼光谱仪(型号：LabRAM)。在以下条件下以反向散射模式进行光谱的收集：x100显微镜物镜，500μm针孔，500μm狭缝宽度。通过多项式减法对所有拉曼光谱进行背景校正，并使用Savitsky-Golay滤波器降低噪声。

电动纳米颗粒沉积的优化

在各种电压和频率条件下进行优化实验。发现枝晶形成的窗口包括约1-100Hz的频率，以及约2.5-3.5V峰-峰值电压(即，电场强度约1.5-2.1×105V/m)。例如，在一个实验中，在10Hz、2.9V峰-峰值(Vpp)下形成延伸的树枝。根据这些条件，在场激活的12分钟内，在相邻微电极之间产生延伸约15μm的枝晶，如图2A和2B中的光学显微镜和SEM图像所示。

在图2A中，AgNP(直径50nm的银纳米颗粒，稳定在2mM柠檬酸盐中)在10Hz和2.5Vpp下使用，具有正弦波形。光学显微镜显示了具有AgNP枝晶的微电极检测位点的有效表面覆盖，并且在图2B中，SEM图像显示这些结构的复杂分支，允许LSPR耦合和高的SERS活性。在图2C中，在100Hz下，一些AgNP枝晶在树枝状晶体周围的小区域中形成，这可以在图2D的SEM图像中看到，但是微电极检测位点的覆盖范围较小。在图2E和2F中，施加DC偏移，导致树枝状晶体定向生长，具有更好的延伸性。

对于图2G和2H，AuNP(直径60nm的球形金纳米颗粒，稳定在0.1mM PBS中)在与AgNP相同的频率和电压下使用。在这些条件下，AuNP不产生枝晶，而是沿着微电极边缘产生致密的纳米球层，如图2H中的SEM图像所示。这可能是由于纳米颗粒的不同稳定溶液(AgNP为2mM柠檬酸盐，AuNP为0.1mM PBS)或纳米颗粒的不同形状-在SEM下观察到AuNP呈高度球形(见图2H)，而AgNP是随机各向异性几何结构。

仅使用AC电场(无DC偏移)，树枝状晶体从两个电极以相同的速率生长，如图2A所示。施加小的DC偏移导致更广泛的枝晶生长，并且从单个电极以定向方式选择性生长。在图2E中施加了0.5V的正(AgNP具有负zeta电位)DC偏移，同时保持峰-峰电压的幅度恒定。得到的枝晶生长仅在一个微电极对上，并且在不短接微电极的情况下延伸穿过间隙。DC偏移可以通过允许EP(比DEP更大范围的力)将NP带到枝晶形成的位置来促进枝晶生长，从而实现质量受限的聚集过程。这有两个主要的好处，可以单独使用或同时增强活性分析物浓度：(1)直接分析物浓度放大，其中产生的微电极间隙越小，产生的电力越强，其能够将分析物溶液的主体中较小的分析物(例如，蛋白质、DNA)吸引到检测位置；以及(2)较小的微电极间隙可以产生强电场诱导的流体流动模式(电渗透、电热力)，可以作为“传送带”将分析物从大块体运输到枝晶表面，从而增强其吸附或捕获率。值得注意的是，由此产生的微电极间隙非常小(例如，微米或亚微米级)，并且可能难以用标准光刻技术再现。因此，这种增强枝晶生长的方法提供了具有小的微电极间隙的实施方案，同时避免了对专业生产技术或设备的需要，以及相关的成本。

用罗丹明6G表征SERS装置

图3显示了使用AgNP和AuNP的实施方案进行的优化实验的结果，其中SERS性能通过具有独特和强的拉曼光谱的拉曼报告分子罗丹明6G(R6G)的拉曼光谱中的关键峰(1360cm^-1)的强度来量化。R6G光谱的特征在于在612、1179、1306、1360、1505、1567、1595和1646cm^-1处的拉曼峰。从图3可以看出，与AgNP实施方案相比，AuNP实施方案的峰强度总是显著降低。这是预期的结果，因为Au本身具有比Ag更低的SERS活性，并且在电场条件下，未观察到来自AuNP的树枝状晶体的形成(图2G和图2H)。

用市售的SERS基板测试了电动制备的AgNP树枝状SERS装置的性能，所述SERS基板由沉积在纸贴纸上的AuNP组成，所述纸贴纸支撑在玻璃显微镜载玻片(Ram-SERS-Au,OceanOptics,Inc.)上。在相同的采集参数(633nm激光、10s采集时间和x10物镜以适应海洋光学基板厚度)下获取实施例和商业基板的光谱，并且在两种情况下均为10μL、10^-5M R6G甲醇滴加到表面上并使其蒸发。如图4所示的光谱表明，在所用的测试条件下，电动制备的AgNP实施方案的性能明显优于商业基底。

通过等式(2)，使用R6G光谱中的主峰(在1360cm^-1处)的强度来计算SERS增强因子(EF)：

其中I_SERS和I_NR分别是SERS装置/基板和硅(正常拉曼)表面上1360cm^-1峰的(背景校正)强度，N_SERS和N_NR分别是吸附在SERS和硅表面上的分析物的分子数。使用图4中所示的数据，对于该实施方案获得4×10⁵的EF，其在硅表面上估计的表面覆盖率为38％，得到每个银纳米团簇区域的EF为1×10⁶。相比之下，海洋光学基板获得2×10⁴的EF，这与本领域研究人员生产和/或使用的其他SERS基板相当[31]-[33]。

为了证明AgNP实施方案的定量检测能力，使用浓度为0.1mM至1nM的R6G进行校准。使用1360cm^-1峰的强度进行定量。结果如图5所示。数据显示出超过6个数量级的良好线性，其中R²值为0.98824。

通过被动表面吸附进行化学传感

通过对三种生化分析物的被动表面吸附，使用AgNP SERS装置进行化学传感，与流体传感相关：(1)三聚氰胺，(2)可卡因，和(3)福美双。三聚氰胺是一种用于生产树脂和肥料的含氮工业化学品，在摄入和代谢后，可能在肾脏中形成不溶性晶体，导致肾功能衰竭。由于三聚氰胺的氮含量很高(按质量计为66.7％)，因此已将其添加到乳制品、婴儿配方食品或宠物食品中，以提高表观蛋白质含量。这种使用导致2007年美国数百只猫和狗的死亡，2008年中国超过50,000名婴儿住院。世界卫生组织规定，牛奶中三聚氰胺的安全允许浓度为百万分之2.5(ppm)，婴儿配方奶粉浓度为1ppm，加拿大卫生部将其浓度降至0.5ppm或以下。SERS装置检测三聚氰胺的结果如图6A所示。三聚氰胺的最强拉曼峰值为685cm^-1，其被指定为环形呼吸II模式，其特征在于三嗪环的平面内变形。由于该实施方案的强的SERS性能，在低至1ppb的浓度下检测到三聚氰胺。目前的实验正在寻求更复杂的食品基质中的三聚氰胺检测，例如牛奶和婴儿配方食品。

可卡因是一种与多种有害健康影响有关的非法药物，可能需要紧急护理。例如，2011年在美国，可卡因与40.3％的非法药物相关的急诊室就诊有关。显然需要一种快速和微创技术的可卡因检测方法，以便规定适当的护理和/或预防与药物有关的事故。基于SERS的检测与唾液药物检测尤其兼容，因为唾液中99.5％是水，这为化学分析提供可忽略的背景拉曼信号。联邦工作场所可卡因检测的临界浓度在120-150ppb之间，而临床应用的临界浓度为10-50ppb。使用SERS装置实施方案的可卡因检测结果显示在图6B中。将水中的可卡因溶液直接滴在SERS装置上，并且使用1003cm^-1处的最显著的峰来鉴定分析物的存在。获得的检测限为10ppb，远低于工作场所检测限值，并且在临床应用限制的范围下限。

福美双是一种有机硫化合物，通常用作工业和农业中的杀菌剂或动物驱避剂。在代谢过程中，福美双产生二硫化碳，对肝脏有毒。美国环境保护局规定食品中福美双的最大残留限量为7ppm。目前大多数监测水果和蔬菜中农药浓度的方法都使用HPLC。如图6C所示，福美双在丙酮中的检测限为10ppb。

通过电动放大局部分析物浓度进行生物传感

在上述实验中，SERS装置显示出通过被动吸附提供超低浓度化学分析物的灵敏检测。然而，如果在分析物存在下维持电场，则纳米粒子枝晶的电场诱导组装(具有DC偏移)作为微电极上的电连接延伸可以提供活性分析物浓度放大的附加功能。更具体地说，通过桥接微电极之间的间隙，具有树枝状纳米颗粒结构的SERS装置可以产生更高强度的电场(E＝V/d)。产生的强大力量吸收大量样品中的分析物，并将其局部集中在检测点上。在没有树枝状纳米颗粒结构的情况下，单独的介电电泳(用r3标度)将仅能够吸引大的生物物体，例如细菌和病毒。然而，在存在树枝状纳米颗粒结构的情况下，这种能力可以扩展到较小的物体，例如生物分子(如蛋白质、DNA)。为了证明此处活性分析物浓度扩增的原理，该技术应用于检测BSA(一种丰富的血浆蛋白)以及大肠杆菌K12(一种革兰氏阴性棒状细菌)。

BSA是一种球状水溶性蛋白质，具有众所周知的一级结构(分子量66267Da)。将BSA以0.5wt％溶解在水中，并将5μL蛋白质溶液沉积在AgNP SERS活性微电极表面上。BSA的检测结果如图7A所示(基于文献中的报告指定了峰值)。在被激活的微电极间隙中，微电极对蛋白质分子施加介电电泳力，测量不同的SERS光谱，扩增来自两个来源：(1)SERS增强，和(2)分析物电动力学浓度。观察到的峰与BSA的富含α-螺旋的结构很好地吻合。在允许被动蛋白质吸附的微电极间隙处，会产生不太明显的光谱。该光谱仍然经历来自SERS装置的扩增，但不能吸附足够的蛋白质以提供用于分析的独特光谱。化学计量光谱分析仍然可以进行识别，但这需要进行多次光谱测量和模型训练。在未修饰的硅表面上，没有观察到来自蛋白质的信号，即，传统的拉曼光谱不足以进行检测。

对于大肠杆菌K12，通过电极活化获得了与BSA相似的检测结果。分析了一个较窄的光谱区域，鉴定了氨基酸的峰，以及CH变形和CHO拉伸。由于大肠杆菌是比BSA更大的分析物(其长度为～2μm)，所以它经历更大的介电电泳力(∝r3)和增强的检测区域的电动力学浓度。因此，图7B中较小的“无电场”光谱强度可能是由于这些区域中分析物浓度显著下降，即大多数(如果不是全部)细菌已经浓缩到单一微电极间隙。在此，检测到浓度为10⁶个细菌/mL的大肠杆菌；然而，预计在电动力学浓度和SERS增强的组合下，LOD将超过10²个细菌/mL。

实施例2

进行实验以检查石墨烯表面处理纳米颗粒结构对SERS性能的影响。准备了两个SERS装置。如上文所述，使用Ag纳米颗粒制备一种SERS装置，而不对纳米颗粒结构(未涂覆的树枝状结构)进行表面处理。以相同的方式制备另一种SERS装置，然后树枝状晶体接受石墨烯的表面处理。通过使用分散在NMP(N-甲基吡咯烷酮)中的石墨烯悬浮液喷涂树枝状晶体来实现石墨烯涂层。在这种情况下，石墨烯是通过在表面活性剂溶液中超声处理从石墨的内部剥离方法获得的多层石墨烯。图8显示从罗丹明6G(R6G)获得的SERS信号，该信号从乙醇溶液(浓度为10^-5M)滴落到未涂覆的树枝状晶体(下部迹线)和石墨烯涂覆的树枝状晶体(上部迹线)上。总体而言，观察到2至5倍的SERS信号增强。

通过参考文献的并入

所有引用的出版物均通过引用整体并入本文。

等价物

虽然已经关于本发明的说明性实施方案描述了本发明，但是应该理解，在不脱离本发明的范围的情况下，可以对实施方案进行各种改变。因此，所描述的实施方案仅被视为示例性的，并且本发明不限于此。

Claims

1.一种表面增强拉曼光谱(SERS)装置，其包括：

非导电基板；

至少两个电极，其以间隔关系设置在基板上，使得沿着电极的边缘和/或相对边缘形成检测位点；以及

纳米颗粒结构，其包括设置在所述检测位点中的多个金属纳米颗粒。

2.根据权利要求1所述的SERS装置，其中所述的金属纳米颗粒包括选自银、金、铜和铂的金属，或其两种或多种的组合。

3.根据权利要求1所述的SERS装置，其中所述的纳米颗粒结构由所述至少两个电极之间的电场引导。

4.根据权利要求3所述的SERS装置，其中所述电场包括AC电场、DC电场、具有DC分量的AC电场，和静电场。

5.根据权利要求1所述的SERS装置，其中所述纳米颗粒结构包括分支、成簇、聚集、分形和树枝状结构中的至少一种。

6.根据权利要求1所述的SERS装置，其中所述纳米颗粒结构为树枝状结构。

7.根据权利要求1所述的SERS装置，其中所述的纳米颗粒是官能化的。

8.根据权利要求7所述的SERS装置，其中所述官能化的纳米颗粒包括表面改性。

9.根据权利要求8所述的SERS装置，其中所述表面改性包括设置在至少一个纳米颗粒上的至少一种蛋白质、核酸、功能分子或其片段或衍生物，或其组合。

10.根据权利要求8所述的SERS装置，其中所述的表面改性包括石墨烯或其衍生物。

11.根据权利要求1所述的SERS装置，其中所述纳米颗粒结构在检测位点处浓缩分析物。

12.根据权利要求1所述的SERS装置，其中所述的纳米颗粒结构可移除地组装在所述检测位点中。

13.根据权利要求1所述的SERS装置，其中所述至少两个电极以2D配置设置在所述的基板上。

14.根据权利要求1所述的SERS装置，其中所述至少两个电极以3D配置设置在所述的基板上。

15.一种制备SERS装置的方法，其包括：

提供非导电基板，所述非导电基板具有至少两个电极，其以间隔关系设置在所述基板上，使得沿着所述电极的边缘和/或相对边缘形成检测位点；以及

在诱导、引导或影响金属纳米颗粒组装成检测位点的纳米颗粒结构的条件下，在检测位点上设置多个金属纳米颗粒。

16.根据权利要求15所述的方法，其中所述的金属纳米颗粒包括选自银、金、铜、铂中的至少一种金属及其两种或更多种的组合。

17.根据权利要求15所述的方法，其中所述诱导、引导或影响金属纳米颗粒组装成检测位点的纳米颗粒结构的条件包括电场。

18.根据权利要求17所述的方法，包括AC电场、DC电场、具有DC分量的AC电场或静电场。

19.根据权利要求15所述的方法，其中所述纳米颗粒结构包括分支、成簇、聚集、分形和树枝状结构中的至少一种。

20.根据权利要求15所述的方法，其中所述的纳米颗粒结构式树枝状结构。

21.根据权利要求15所述的方法，包括使用官能化的纳米颗粒。

22.根据权利要求21所述的方法，其中官能化的纳米颗粒包括所述纳米颗粒的表面改性。

23.根据权利要求22所述的方法，其中官能化的纳米颗粒包括在至少一个纳米颗粒上的至少一种蛋白质、核酸、功能分子或其片段或衍生物，或其组合。

24.根据权利要求22所述的方法，其中所述的表面改性包括石墨烯或其衍生物。

25.根据权利要求15所述的方法，包括使用所述纳米颗粒结构在检测位点处浓缩分析物。

26.根据权利要求25所述的方法，进一步包括使用官能化的纳米颗粒和电场的至少其中之一在检测位点处浓缩分析物。

27.根据权利要求15所述的方法，包括将所述纳米颗粒结构可移除地组装到所述的检测位点。

28.一种使用SERS分析样品的方法，其包括：

提供非导电基板，所述非导电基板具有以间隔关系设置在所述基板上的至少两个电极，使得沿着所述电极的边缘和/或相对边缘之间形成检测位点；

在诱导、引导或影响金属纳米颗粒组装成检测位点的纳米颗粒结构的条件下，在检测位点上设置多个金属纳米颗粒；

将样品应用到所述检测位点上；以及

使用SERS在检测位点的一个或多个位置探测所述样品。

29.根据权利要求28所述的方法，其中所述诱导、引导或影响金属纳米颗粒组装成检测位点的纳米颗粒结构的条件包括电场。

30.根据权利要求29所述的方法，其中所述电场选自AC电场、DC电场、具有DC分量的AC电场和静电场。

31.根据权利要求29所述的方法，其中所述电场在所述纳米颗粒结构的组装期间是存在的。

32.根据权利要求29所述的方法，其中所述电场在所述纳米颗粒结构的组装及所述样品的应用期间是存在的。

33.根据权利要求28所述的方法，其中所述纳米颗粒用至少一种蛋白质、核酸、功能分子或其片段或其组合进行官能化。

34.根据权利要求28、32和33中任一项权利要求所述的方法，其中所述样品中的分析物在所述检测位点处被浓缩。

35.根据权利要求28所述的方法，包括移除所述的纳米颗粒结构和所述样品；以及

重新使用所述具有至少两个电极的非导电基板。