CN102661941A - 基于拉曼活性纳米颗粒混合组装的循环肿瘤细胞的耦合增强sers高通量生物传感方法 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了一种基于拉曼活性纳米颗粒混合组装的循环肿瘤细胞的耦合增强SERS高通量生物传感方法，制备了能与CTC特异性结合的拉曼染料修饰的金纳米棒探针和核酸功能化的金纳米颗粒探针，分别修饰有不同aptamer的金纳米棒探针各自与其相对应的CTC结合，通过离心去除多余的金纳米棒探针，再加入能与金纳米棒探针杂交的金纳米颗粒探针，纳米颗粒发生团聚，产生电磁场耦合增强。同时，结合拉曼光谱自身所具有的特点，即谱图信息丰富且具有唯一性，实现了循环肿瘤细胞的高通量SERS检测。该方法操作过程简单、快速，无需对样品进行分离和富集，灵敏度高，特异性好，有望成为研究肿瘤的化疗药物的疗效评估以及筛选的一种新方法。
Description
技术领域
本发明属于一种循环肿瘤细胞的高通量检测方法，具体是指核酸适体(aptamer)与肿瘤细胞膜蛋白的特异性结合，纳米颗粒表面的功能化修饰，表面增强拉曼共振(SERS)分析技术。
背景技术
循环肿瘤细胞(Circulating Tumor Cell，CTC)是指自发或诊疗操作时进入外周血中的肿瘤细胞，具有高度活力和高度转移潜能的CTC可以在循环系统中存活，并在合适的环境中增值，导致肿瘤的复发和转移。目前对于CTC的检测技术有免疫磁珠分离法，分离效率低，且易受白细胞的干扰，产生假阳性信号；有反转录-聚合酶链反应方法，无法实现对外周血肿瘤细胞的定量分析；还有流式细胞仪分选法，这种方法需要荧光标记，操作复杂、费时，且仪器价格昂贵。目前来说，实现全血中痕量CTC的高灵敏度和高特异性的定量分析还是一个巨大的挑战。
发明内容
本发明针对现有技术存在的不足，提出了一种基于拉曼活性纳米颗粒混合组装的循环肿瘤细胞的耦合增强SERS高通量生物传感方法，操作过程简单、快速，无需对样品进行分离和富集，灵敏度高，特异性好。
金属纳米颗粒存在表面等离子体共振现象，当表面等离子体受到激发，在颗粒表面产生电磁场，显著增强了表面吸附分子的拉曼信号，而当纳米颗粒出现团聚时，表面等离子体发生耦合作用，在颗粒之间产生了更强的电磁场，对表面吸附分子的拉曼信号能达到1012倍的增强作用。
本发明所述的基于拉曼活性纳米颗粒混合组装的循环肿瘤细胞的耦合增强SERS高通量生物传感方法，包括核酸适体修饰的拉曼活性纳米颗粒探针捕获循环肿瘤细胞；核酸杂交介导纳米颗粒混合有序组装；基于耦合增强热点的循环肿瘤细胞的SERS高通量检测。其中，所述的纳米颗粒混合有序组装是指金纳米棒探针与金纳米球探针通过核酸杂交形成有序的空间结构，产生耦合增强热点。
本发明制备了能与CTC特异性结合的拉曼染料修饰的金纳米棒探针和核酸功能化的金纳米颗粒探针，分别修饰有不同aptamer的金纳米棒探针各自与其相对应的CTC结合，通过离心去除多余的金纳米棒探针，再加入能与金纳米棒探针杂交的金纳米颗粒探针，纳米颗粒发生团聚，产生电磁场耦合增强，实现循环肿瘤细胞的高通量SERS检测。
本发明所述循环肿瘤细胞的SERS高通量检测包括如下步骤：
(1)制备能与CTC特异性结合的金纳米棒探针；
(2)制备能与步骤(1)所述的金纳米棒探针杂交的金纳米颗粒探针；
(3)将步骤(1)所述的金纳米棒探针加入到含有CTC的样品溶液中，与CTC进行特异性结合反应；
(4)离心去除未与CTC特异性结合的金纳米棒探针；
(5)在经步骤(4)离心后的溶液中加入步骤(2)所述的金纳米颗粒探针；
(6)对反应后的样品溶液进行检测。
其中，步骤(1)所述的金纳米棒探针表面修饰有拉曼染料(raman dye)、核酸适体(aptamer)和任意序列的核酸探针(DNA-1)；
其中，步骤(1)所述的金纳米棒表面修饰有一种拉曼染料，且不同的金纳米棒表面分别修饰不同的拉曼染料；
其中，步骤(1)所述的金纳米棒表面修饰有一种核酸适体，且不同的金纳米棒表面分别修饰不同的核酸适体；
其中，步骤(2)所述的金纳米颗粒探针表面修饰有与DNA-1序列完全互补的核酸探针(DNA-2)；
其中，步骤(3)所述的特异性结合反应是指分别修饰有不同aptamer的金纳米棒探针各自与其相对应的CTC结合；
其中，步骤(6)所述的检测手段是利用SERS分析技术对反应后的产物溶液进行定量分析。
以下结合具体操作步骤对本发明做进一步的说明：
(1)分别制备两种能与CTC特异性结合的金纳米棒探针1和2，通过混合自组装的方式对金纳米棒表面进行修饰。金纳米棒探针1的表面修饰了raman dye-1、aptamer-1和DNA-1，金纳米棒探针2的表面修饰了raman dye-2、aptamer-2和DNA-1；
(2)制备能与步骤(1)所述的金纳米棒探针杂交的核酸功能化的金纳米颗粒探针，在其表面修饰了与DNA-1序列完全互补的DNA-2；
(3)将步骤(1)所述的金纳米棒探针加入到含有CTC的样品溶液中，表面修饰有aptamer的金纳米棒探针1和2分别与相对应的两种CTC结合；
(4)通过离心去除多余的金纳米棒探针，将离心下来的结合了CTC的金纳米棒溶液用缓冲溶液定容；
(5)在经步骤(4)离心处理后的溶液中加入步骤(2)所述的金纳米颗粒探针，修饰有DNA-2的金纳米颗粒探针分别与修饰有DNA-1的两种金纳米棒探针杂交，导致纳米颗粒团聚，产生电磁场耦合增强；
(6)利用SERS分析技术对反应后的样品溶液进行检测。
对于循环肿瘤细胞的高通量检测，操作过程是：取金纳米棒探针1和2的储备液以及缓冲溶液于微量管中，加入包含有待测物的样品溶液，37℃培育2小时，然后离心去除上层溶液，再加入缓冲溶液以及金纳米颗粒探针的储备液，继续在37℃培育30分钟，反应结束后，取一定体积的样品进行SERS检测。
本发明中，制备修饰有raman dye-1(5，5′-二硫双(2-硝基苯甲酸))，aptamer-1以及DNA-1的金纳米棒探针1的具体步骤是：取长径比为2.3左右的金纳米棒溶液50mL，10000r/min离心15min，用灭菌水定容为5mL，边搅拌边加入150μL 50μM raman dye-1，30分钟后，继续加入100μL 10μM aptamer-1和400μL 10μM DNA-1，室温条件下持续搅拌，24小时后取出溶液，用灭菌水离心洗涤三次，转速15000r/min，离心时间5min，最后定容为5mL，置于4℃冰箱备用。制备修饰有raman dye-2(硫尿嘧啶)，aptamer-2以及DNA-1的金纳米棒探针2的步骤与1完全一样。
制备核酸功能化的金纳米颗粒探针的具体步骤是：取0.3nM纳米金溶液1mL，10000r/min离心10min，用灭菌水定容为300μL，边搅拌边加入280μL 10μM DNA-2；24小时后，进行第一次老化，边搅拌边加入PB(100mM，PH 7.4)64μL，10分钟后，再加入PBS(10mM，含2M NaCl)34μL，使溶液中NaCl的终浓度达到0.1M；48小时后，进行第二次老化，边搅拌边加入PBS 80μL，使溶液中NaCl的终浓度达到0.3M；24小时后，用灭菌水离心洗涤三次，最后定容为300μL，置于4℃冰箱备用。
本发明中，选用CEM cells和Ramos cells两种肿瘤细胞作为模型目标物，修饰有aptamer-1的金纳米棒探针1与CEM cells膜蛋白特异性结合，修饰有aptamer-2的金纳米棒探针2与Ramos cells膜蛋白特异性结合。具体的检测步骤是：1mL反应体系中，取10×Dulbecco’s PBS(含有45g/L glucose，50mM MgCl2和10mg/mL BSA)缓冲溶液100μL和上述制备的金纳米棒探针1和2各100μL于微量管中，再加入包含有CEM cells和Ramoscells两种肿瘤细胞的样品溶液，充分混匀后，放入37℃恒温水浴中培育2小时。反应结束后，取出样品溶液进行离心，转速2000rpm，离心时间3min，将离心下来的结合了肿瘤细胞的金纳米棒溶液用缓冲溶液定容为50μL，再加入已经制备好的金纳米颗粒探针10μL，充分混匀后，放入37℃恒温水浴中继续反应30分钟。反应结束后，取产物溶液20μL滴在硅片上，使用激光共聚焦拉曼光谱仪对样品进行扫描，得到样品的拉曼光谱数据。
注意，以上反应条件为最优条件，所述溶液体积均可成倍变化不改变最优结果。改变比例或试剂加入顺序可使信号的变化程度在1％～100％内变化。
本发明提出了一种基于纳米颗粒团聚的循环肿瘤细胞的高通量检测方法，制备了能与CTC特异性结合的拉曼染料修饰的金纳米棒探针和核酸功能化的金纳米颗粒探针，分别修饰有不同aptamer的金纳米棒探针各自与其相对应的CTC结合，通过离心去除多余的金纳米棒探针，再加入能与金纳米棒探针杂交的金纳米颗粒探针，纳米颗粒发生团聚，产生电磁场耦合增强。同时，结合拉曼光谱自身所具有的特点，即谱图信息丰富且具有唯一性，实现了循环肿瘤细胞的高通量SERS检测。该方法操作过程简单、快速，无需对样品进行分离和富集，灵敏度高，特异性好，有望成为研究肿瘤的化疗药物的疗效评估以及筛选的一种新方法。
具体实施方式
实施例1：循环肿瘤细胞的高通量检测
选取两种肿瘤细胞(CEM cells和Ramos cells)作为模型体系，实验中用到的核酸序列分别是：DNA-1：5’-HS-TTTTTGGCTTAGGGAAACG；DNA-2：5’-HS-TTTTTCGTTTCCCTAAGCC；aptamer-1：5’-HS-TTTTTTTTTTATCTAACTGCTGCGCCGCCGGGAAAATACTGTACGGTTAGA；aptamer-2：5’-HS-TTTTTTTTTTACCGGGAGGATAGTTCGGTGGCTGTTCAGGGTCTCCTCCCGGTG
具体的操作步骤是：
(1)制备能与肿瘤细胞特异性结合的拉曼染料标记的金纳米棒探针1和2
金纳米棒探针1与CEM cells膜蛋白特异性结合，金纳米棒探针2与Ramos cells膜蛋白特异性结合，能特异性结合CEM cells和Ramos cells膜蛋白的核酸适体分别标记为aptamer-1和aptamer-2。
修饰有raman dye-1(5，5′-二硫双(2-硝基苯甲酸))，aptamer-1以及DNA-1的金纳米棒探针1的制备方法：取长径比为2.3左右的金纳米棒溶液50mL，10000r/min离心15min，用灭菌水定容为5mL，边搅拌边加入150μL 50μM raman dye-1，30分钟后，继续加入100μL10μM aptamer-1和400μL 10μM DNA-1，室温条件下持续搅拌；24小时后取出溶液，用灭菌水离心洗涤三次，转速15000r/min，离心时间5min，最后定容为5mL，置于4℃冰箱备用。
修饰有raman dye-2(硫尿嘧啶)，aptamer-2以及DNA-1的金纳米棒探针2的步骤与1完全一样。
(2)制备核酸功能化的金纳米颗粒探针
取0.3nM纳米金溶液1mL，10000r/min离心10min，用灭菌水定容为300μL，边搅拌边加入280μL 10μM DNA-2；24小时后，进行第一次老化，边搅拌边加入PB(100mM，PH 7.4)64μL，10分钟后，加入PBS(10mM，含2M NaCl)34μL，使溶液中NaCl的终浓度达到0.1M；48小时后，进行第二次老化，边搅拌边加入PBS 80μL，使溶液中NaCl的终浓度达到0.3M；24小时后，用灭菌水离心洗涤三次，最后定容为300μL，置于4℃冰箱备用。
(3)两种肿瘤细胞(CEM cells和Ramos cells)的高通量检测
取浓度为107cells/mL CEM cells和Ramos cells两种细胞，分别用1×Dulbecco’sPBS(含有4.5g/L glucose，5mM MgCl2)缓冲溶液依次稀释到106cells/mL，105cells/mL，104cells/mL，103cells/mL，102cells/mL，50cells/mL，10cells/mL。对不同浓度的两种细胞以等体积比例混合，得到一系列样品溶液。
具体的反应步骤是：1mL反应体系中，取10×Dulbecco’s PBS(含有45g/L glucose，50mM MgCl2和10mg/mL BSA)缓冲溶液100μL和上述制备的金纳米棒探针1和2各100μL于微量管中，再加入上述配制的样品溶液，充分混匀后，放入37℃恒温水浴中培育2小时。反应结束后，取出样品溶液进行离心，转速2000rpm，离心时间3min，将离心下来的结合了肿瘤细胞的金纳米棒溶液用缓冲溶液定容为50μL，再加入已经制备好的金纳米颗粒探针10μL，充分混匀后，放入37℃恒温水浴中继续反应30分钟。反应结束后，取产物溶液20μL滴在硅片上，使用激光共聚焦拉曼光谱仪对样品进行扫描，得到样品的拉曼光谱数据。
(4)利用SERS分析技术对产物溶液进行检测
取产物溶液20μL滴在硅片上，利用激光共聚焦拉曼光谱仪对溶液进行扫描，选用632nmHe-Ne激发器，曝光时间10秒，扫描圈数1圈，扫描范围200nm-2000nm。
实验结果：
待测物CEM cells的浓度与响应呈现良好的线性关系，线性范围是2cells/mL～106cells/mL，能达到6个数量级，检测下限是1.2cells/mL；Ramos cells的浓度与响应呈现良好的线性关系，线性范围是15cells/mL～106cells/mL，能达到5个数量级，检测下限是10cells/mL。
实施例2：人全血中循环肿瘤细胞的高通量检测
选取两种肿瘤细胞(CEM cells和Ramos cells)作为模型体系，实验中用到的核酸序列分别是：DNA-1：5’-HS-TTTTTGGCTTAGGGAAACG；DNA-2：5’-HS-TTTTTCGTTTCCCTAAGCC；aptamer-1：5’-HS-TTTTTTTTTTATCTAACTGCTGCGCCGCCGGGAAAATACTGTACGGTTAGA；aptamer-2：5’-HS-TTTTTTTTTTACCGGGAGGATAGTTCGGTGGCTGTTCAGGGTCTCCTCCCGGTG
具体的操作步骤是：
(1)制备能与肿瘤细胞特异性结合的拉曼染料标记的金纳米棒探针1和2
金纳米棒探针1与CEM cells膜蛋白特异性结合，金纳米棒探针2与Ramos cells膜蛋白特异性结合，能特异性结合CEM cells和Ramos cells膜蛋白的核酸适体分别标记为aptamer-1和aptamer-2。
修饰有raman dye-1(5，5′-二硫双(2-硝基苯甲酸))，aptamer-1以及DNA-1的金纳米棒探针1的制备方法：取长径比为2.3左右的金纳米棒溶液50mL，10000r/min离心15min，用灭菌水定容为5mL，边搅拌边加入150μL 50μM raman dye-1，30分钟后，继续加入100μL10μM aptamer-1和400μL 10μM DNA-1，室温条件下持续搅拌；24小时后取出溶液，用灭菌水离心洗涤三次，转速15000r/min，离心时间5min，最后定容为5mL，置于4℃冰箱备用。
修饰有raman dye-2(硫尿嘧啶)，aptamer-2以及DNA-1的金纳米棒探针2的步骤与1完全一样。
(2)制备核酸功能化的金纳米颗粒探针
取0.3nM纳米金溶液1mL，10000r/min离心10min，用灭菌水定容为300μL，边搅拌边加入280μL 10μM DNA-2；24小时后，进行第一次老化，边搅拌边加入PB(100mM，PH 7.4)64μL，10分钟后，加入PBS(10mM，含2M NaCl)34μL，使溶液中NaCl的终浓度达到0.1M；48小时后，进行第二次老化，边搅拌边加入PBS 80μL，使溶液中NaCl的终浓度达到0.3M；24小时后，用灭菌水离心洗涤三次，最后定容为300μL，置于4℃冰箱备用。
(3)人全血中两种肿瘤细胞(CEM cells和Ramos cells)的高通量检测
取浓度为107cells/mL CEM cells和Ramos cells的两种细胞加入到人全血中，分别用全血依次稀释到106cells/mL，105cells/mL，104cells/mL，103cells/mL，102cells/mL，50cells/mL，10cells/mL。对不同浓度的两种细胞以等体积比例混合，得到一系列样品溶液。
具体的反应步骤是：1mL反应体系中，取10×Dulbecco’s PBS(含有45g/L glucose，50mM MgCl2和10mg/mL BSA)缓冲溶液100μL和上述制备的金纳米棒探针1和2各100μL于微量管中，再加入上述配制的样品溶液，充分混匀后，放入37℃恒温水浴中培育2小时。反应结束后，取出样品溶液进行离心，转速2000rpm，离心时间3min，将离心下来的结合了肿瘤细胞的金纳米棒溶液用缓冲溶液定容为50μL，再加入已经制备好的金纳米颗粒探针10μL，充分混匀后，放入37℃恒温水浴中继续反应30分钟。反应结束后，取产物溶液20μL滴在硅片上，使用激光共聚焦拉曼光谱仪对样品进行扫描，得到样品的拉曼光谱数据。
(4)利用SERS分析技术对产物溶液进行检测
取产物溶液20μL滴在硅片上，利用激光共聚焦拉曼光谱仪对溶液进行扫描，选用632nmHe-Ne激发器，曝光时间10秒，扫描圈数1圈，扫描范围200nm-2000nm。
实验结果：
待测物CEM cells的浓度与响应呈现良好的线性关系，线性范围是10cells/mL～106cells/mL，能达到5个数量级，检测下限是6cells/mL；Ramos cells的浓度与响应呈现良好的线性关系，线性范围是75cells/mL～106cells/mL，能达到4个数量级，检测下限是45cells/mL。
Claims (4)
1.一种基于拉曼活性纳米颗粒混合组装的循环肿瘤细胞的耦合增强SERS高通量生物传感方法，包括核酸适体修饰的拉曼活性纳米颗粒探针捕获循环肿瘤细胞；核酸杂交介导纳米颗粒混合有序组装；基于耦合增强热点的循环肿瘤细胞的SERS高通量检测。
2.根据权利要求1所述的生物传感方法，其特征在于，所述纳米颗粒混合有序组装是指金纳米棒探针与金纳米球探针通过核酸杂交形成有序的空间结构，产生耦合增强热点。
3.根据权利要求1或2所述的生物传感方法，其特征在于，所述循环肿瘤细胞的SERS高通量检测包括如下步骤：
(1)制备能与CTC特异性结合的金纳米棒探针；
(2)制备能与步骤(1)所述的金纳米棒探针杂交的金纳米球探针；
(3)将步骤(1)所述的金纳米棒探针加入到含有CTC的样品溶液中，与CTC进行特异性结合反应；
(4)离心去除未与CTC特异性结合的金纳米棒探针；
(5)在经步骤(4)离心后的溶液中，加入步骤(2)所述的金纳米球探针；
(6)对反应后的样品溶液进行SERS定量分析。
4.根据权利要求3所述的生物传感方法，其特征在于，步骤(1)所述的金纳米棒探针表面修饰有拉曼染料、核酸适体和DNA-1，其中，DNA-1为任意序列的核酸探针；步骤(2)所述的金纳米球探针表面修饰有DNA-2，其中，DNA-2是与DNA-1序列完全互补的核酸探针；步骤(3)所述的特异性结合反应是指分别修饰有不同核酸适体的金纳米棒探针各自与其相对应的CTC结合。
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