CN115932008A - 一种循环肿瘤细胞富集探针、其制备方法及在构建诊断传感器中的应用 - Google Patents
一种循环肿瘤细胞富集探针、其制备方法及在构建诊断传感器中的应用 Download PDFInfo
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Abstract
本发明公开一种循环肿瘤细胞富集探针、其制备方法及在构建诊断传感器中的应用。本发明筛选出高效的循环肿瘤细胞富集探针；合成GO@HMPB‑Pt‑Luminol‑Aptamer复合物修饰电极形成循环肿瘤细胞识别基底电极；利用H2O2作为Luminol电致发光共反应剂，多重信号放大的三明治型电化学发光免疫传感器，用于不同表型循环肿瘤细胞的定量分析。本申请具有取样方便、侵袭性低及ECL高灵敏的优势，开发一种通用型全血中高效磁分离及超灵敏ECL免疫传感检测循环肿瘤细胞，具有高效的细胞捕获效率、优异的抗干扰性能和较高的选择性，也避免了使用流式细胞仪等费用高、操作繁琐等问题。
Description
技术领域
本发明涉及循环肿瘤细胞检测方法技术领域，特别涉及一种筛选到的循环肿瘤细胞富集探针、其制备方法及在构建用于循环肿瘤细胞的诊断传感器中的应用，即诊断传感器的构建。
背景技术
恶性肿瘤是威胁人类生命健康的头号杀手，目前我国每年的发病和死亡人数均居世界较高水平。分子生物学和临床研究表明，肿瘤的侵袭和远端微转移很可能在肿瘤早期就已出现，临床上肿瘤的诊断和筛查高度依赖于影像学(B超、CT、MRI及放射性PET-CT)和血清中肿瘤标志物(AFP、CEA、CA-125、P53抑癌基因蛋白等)的诊断，难以在早期发现癌症的发生、转移及复发。研究数据表明，外周血中极少数流动的循环肿瘤细胞(CTC)是癌症急速转移、发展并迅速恶化甚至导致死亡的根源。CTC的检测被认为是对肿瘤患者的实时“液体活检”，能够为癌症早期筛查、追踪复发、疗效评估、新药开发及个性化治疗药物筛选等提供及时可靠的依据。目前商业化的循环肿瘤细胞检测技术主要是基于表面蛋白生物标志物EpCAM的检测，存在特异性低、间质型CTC漏检等缺点。
目前，临床上CTC的检测仍依赖于Veridex公司开发的CellSearch系统，利用上皮细胞粘附分子EpCAM抗体修饰磁珠识别血液中的CTC。国内外众多课题组已经通过物理分离、免疫标记及集成微流控系统对CTC的数量和形态进行了初步分析，然而目前的检测方法大多需要大型设备或高精密仪器，不能满足大量、急需、实时检测。而且随着上皮-间质转化(EMT)的发生，CTC失去具有细胞极性和与基底膜相连的上皮型而获得具有移行能力、抗凋亡与降解细胞外基质等能力的间质型，使得间质型CTC具有更强的侵袭性和转移潜能。然而，外周血中CTC数量极少，异质性大使CTC捕获效率不高，单一表型的CTC数量更少，因此筛选高效的CTC富集探针、开发多重信号放大策略的高灵敏微型传感器是实现肿瘤早期病变快速、便捷筛查亟需解决的问题。
细胞的富集效率取决于捕获探针的识别和分离能力，已有文献报道通过引入特异性抗体或核酸适配体提高探针对循环肿瘤细胞的捕获能力，同时磁分离技术具有操作简单、可控性好等特点已得到了国内外的公认。然而由于识别靶点单一使得细胞表面目标蛋白表达量少的细胞出现漏检，常规使用的四氧化三铁(Fe3O4 NPs)由于粒径小、磁性大，直接用于分离可能造成细胞的损伤，现有技术中，仍然没有能够同时引入大比表面积、高电导率、好生物相容性的方法；尚不能实现在加速电极表面电子的转移速率的同时实现多靶标分子负载量的提升、无法达到有效提高不同表型CTC的富集效率的目的。
电化学发光(ECL)技术由于检测速度快、灵敏度高、成本低易于微型化等优点已成功应用于医学、环境及食品安全检测等多领域。鲁米诺(Luminol)作为常用的电化学发光试剂，由于溶解性好常直接加入待测液与共反应剂H2O2反应作为信号输出检测目标分子。该过程虽然模式简单，但大量的Luminol会对活体待测物产生毒害、干扰电极、增加误差，而且鲁米诺的ECL强度的增强主要来自于H2O2分解生成强氧化性的活性自由基氧化，然而活性自由基的半衰期较短易分解造成损失，但是现有技术中，仍然没有能有效提高ECL传感器灵敏度的方法。
正因为上述问题的存在，亟需本领域技术人员提出一种新的方法用于解决现有技术CTC富集效率不高、检测操作繁琐、费用高等技术问题。
发明内容
针对现有技术中的不足之处，本申请提供了一种筛选获得的高效的循环肿瘤细胞富集探针、其制备方法以及在构建用于循环肿瘤细胞的诊断传感器中的应用，即本申请筛选了高效、多靶点修饰的PPy@Fe3O4-Au空心纳米管富集不同表型的CTC，结合GO@HMPB-Pt-Luminol多重信号放大电化学发光体及ECL技术灵敏度高、易于微型化的优势，构建的ECL免疫传感器能够实现短时间内对外周血中极少量不同表型的CTC灵敏检测。以解决现有技术CTC富集效率不高、检测操作繁琐、费用高等技术问题。
本发明第一方面提供了一种高效的循环肿瘤细胞富集探针的制备方法；所述探针为PPy@Fe3O4-Au空心管状磁性纳米复合物；其制备方法包括以下步骤：
(1)将钼酸铵溶解在硝酸稀释液中，经高温裂解、离心、洗涤、干燥合成三氧化钼(MoO3)纳米棒；其中，钼酸铵与硝酸的质量体积比为(0.5-1.5)g：(8-16)mL；
优选的，步骤(1)中，钼酸铵与硝酸的质量体积比为(0.9-1.1)g：(11-13)mL；更为优选的，钼酸铵与硝酸的质量体积比为1g：12mL；
优选的，步骤(1)中，温度为140-220℃，反应时间为15-25h；更为优选的，温度为180℃，反应时间为20h。
优选的，步骤(1)中，干燥温度为50-80℃；更为优选的，干燥温度为60℃。
(2)室温下，将步骤(1)制得的MoO3纳米棒作为模板分散在水中，加入吡咯单体，搅拌，形成溶液A，再将HAuCl4和无水氯化铁溶解在水中形成溶液B；其中，溶液A中MoO3纳米棒、吡咯单体和水的比例为(30-70)mg：(60-140)μL：(30-60)mL；溶液B中HAuCl4、无水氯化铁和水的比例为(0.6-1.4)mL：(18-42)mg：(3-7)mL；
优选的，溶液A中MoO3纳米棒、吡咯单体和水的比例为(45-55)mg：(90-110)μL：(30-60)mL；溶液B中HAuCl4、无水氯化铁和水的比例为(0.8-1.2)mL：(28-32)mg：(4-6)mL；
更为优选的，溶液A中MoO3纳米棒、吡咯单体和水的比例为50mg：100μL：45mL；溶液B中HAuCl4、无水氯化铁和水的比例为1mL：30mg：5mL；
(3)常温下将溶液B逐滴加入到溶液A中，继续反应使得Py聚合的同时将Au3+和Fe3+还原为Au NPs和Fe3O4 NPs，氮气保护下，慢慢滴加浓氨水，进一步反应除去PPy，磁分离、洗涤、干燥，即得PPy@Fe3O4-Au空心纳米管。
优选的，步骤(3)中，溶液A和溶液B的混合比例以MoO3纳米棒和无水氯化铁的质量比为(30-70)：(18-42)计；更为优选的，溶液A和溶液B的混合比例以MoO3纳米棒和无水氯化铁的质量比为(45-55)：(28-32)计；最为优选的，溶液A和溶液B的混合比例以MoO3纳米棒和无水氯化铁的质量比为5:3计；
优选的，步骤(3)中，浓氨水的添加比例以HAuCl4和浓氨水的体积比为(0.6-1.4)：(3-7)；更为优选的，HAuCl4和浓氨水的体积比为(0.8-1.2)：(4-6)；最为优选的，HAuCl4和浓氨水的体积比为1：5。
优选的，步骤(3)中，溶液B逐滴加入溶液A后继续反应5-9h，最优选的反应时间为7h。
优选的，步骤(3)中，干燥温度为50-80℃，最优选的干燥温度为60℃。
优选的，步骤(3)中，加入浓氨水后继续反应2-6h，最优选的反应时间为4h。
(4)将步骤(3)制得的PPy@Fe3O4-Au空心纳米管分散在缓冲液中，制得悬浮液浓度为0.5-1.5mg/mL；向悬浮液中加入巯基修饰的核酸适配体或特异性抗体，两者比例为(0.5-1.5mg/mL):(0.6-1.4μM)，常温搅拌，磁分离，洗涤重新分散在缓冲液中，制得PPy@Fe3O4-Au-巯基修饰的核酸适配体或特异性抗体复合物；
优选的，步骤(4)中，PPy@Fe3O4-Au空心纳米管分散在缓冲溶液制得悬浮液浓度为0.5-1.5mg/mL；取6-14μL浓度为3-7μM的巯基修饰的核酸适配体或特异性抗体，加入到30-70μL上述溶液，15-40℃搅拌1-3h、磁分离，洗涤重新分散在30-70μL缓冲液中；其中，缓冲液一般使用的是PBS缓冲溶液，其pH为6-8，浓度为5-15mM；更优选为pH 7.4，浓度10mM。
更为优选的，步骤(4)中，PPy@Fe3O4-Au空心纳米管质量为1mg/mL，取10μL浓度为5μM的巯基修饰的核酸适配体NC3S或特异性抗体，加入到50μL上述溶液，25℃搅拌2h、磁分离，洗涤重新分散在50μL缓冲液中。
优选的，步骤(4)中，所述的核酸适配体选自NC3S或SYL3，其中：
NC3S序列：5’-TTGCACTATGTTTTAGCTAGGGTTCCCTCCGGAGATAGTAAGTGCAA-3’；
SYL3序列：5’-CACTACAGAGGTTGCGTCTGTCCCACGTTGTCATGGGGGGTTGGCCTG-3’；
根据文献报道，本申请除了使用具有CTC靶向识别能力的核酸适配体NC3S和SYL3C外，所述的特异性抗体选自N-Cadherin和EpCAM抗体及其他CTC表面特异性抗原对应的抗体；
本发明第二方面提供了由上文所述方法制备获得的循环肿瘤细胞富集探针；该探针加入到相应的细胞稀释液中，室温搅拌、磁分离、洗涤、重新分散在缓冲溶液中完成细胞的富集。
本实施例构建的ECL免疫传感器除了使用具有CTC靶向识别能力的核酸适配体NC3S可检测Hela细胞外，还可以针对不同的CTC表型，如上皮型(EpCAM蛋白过表达的人乳腺癌MCF-7细胞)设计并合成其对应的核酸适配体SYL3C序列，从而可以检测上皮型、间质型及双靶捕获全型CTC。
将步骤(4)制得的PPy@Fe3O4-Au-NC3S探针加入到不同浓的细胞稀释液中，室温搅拌、磁分离、洗涤、重新分散在PBS缓冲溶液中完成细胞的富集。
优选的，将6-14μLPPy@Fe3O4-Au-NC3S探针加入到1-1000cell/mL的细胞稀释液中，室温搅拌15-45分钟，磁分离、洗涤、重新分散在6-14μL的PBS中。
优选的，将10μLPPy@Fe3O4-Au-NC3S探针加入到1，5，10，20，40，60，100，250，500，1000cell/mL的细胞稀释液中，室温搅拌30分钟，磁分离、洗涤、重新分散在10μL的PBS中。
本发明第三方面提供了上述探针在构建用于循环肿瘤细胞的诊断传感器中的应用，所述应用为基于PPy@Fe3O4-Au空心管状磁性纳米复合物探针富集目标物，GO@HMPB-Pt纳米复合物固载电化学发光体Luminol构建电化学免疫发光传感器，用以检测循环肿瘤细胞。包括以下步骤：
(1)根据现有的电化学法，在草酸和H2O2电解质中，以石墨箔为阳极，铂箔为阴极，电解、洗涤、干燥、剥离合成厚度为1-2nm的层状氧化石墨烯(GO)；
(2)依据现有的溶剂热法合成粒径为60-100nm左右立方体的实心普鲁士蓝纳米颗粒(PB)，再以PVP为模板和保护剂通过酸性刻蚀合成空心介孔的普鲁士蓝纳米颗粒(HMPB)。
具体而言，上文所述的空心普鲁士蓝纳米颗粒(HMPB)的制备方法为：
步骤(1)中，取0.15-0.35mol的草酸和0.25-0.75mol H2O2加入100-300mL高纯水中。以石墨箔(0.5-1.5mm×0.5-1.5mm×0.25-0.75mm)为阳极，铂箔为阴极，距离为1-3cm，在15-37℃，调节电压为5-15V，反应0.5-1.5h，离心、高纯水洗涤，冻干36-60h。取3-7mg合成的GO，加入到3-7mL的二甲基甲酰胺溶液中(DMF)，以50-100W的功率超声0.5-1.5h，用无水乙醇和高纯水洗涤多次，真空干燥36-60h，剥离为1-2nm厚的片层结构。更优选的，步骤(1)中，取0.28mol的草酸和0.5mol的H2O2加入到200mL的高纯水中。以石墨箔(1mm×1mm×0.5mm)为阳极，铂箔为阴极，距离为2cm，在25℃，电压为10V，反应0.5-1.5h，用高纯水离心洗涤，冻干48h，即得GO。取5mg合成的GO，加入到5mL的DMF中，以70W的功率超声1h，用无水乙醇和高纯水洗涤三次，真空干燥48h，剥离为1-2nm厚的片层结构。
步骤(2)中，将0.3-0.75g K3[Fe(CN)6]·3H2O和8-16g PVP加入到100-220mL HCL水溶液中(0.01M)中，室温下搅拌0.5-1.5h，将混合物转移到反应釜中60-100℃，反应15-25h，用高纯水和乙醇多次洗涤，真空干燥，即得PB纳米颗粒。再取40-80mg的PB，200-400mg的PVP加入到40-80mLHCL(0.1M)，搅拌0.25-0.75h，转移至反应釜中120-160℃下反应3-5h，最后将产物离心、高纯水和乙醇洗涤，50-80℃干燥得到空心普鲁士蓝纳米颗粒(HMPB)。更为优选的，步骤(2)中，将0.528g K3[Fe(CN)6]·3H2O和12g PVP加入到160mLHCL水溶液中(0.01M)中，室温下搅拌1h，将混合物转移到反应釜中80℃，反应20h，用高纯水和乙醇洗涤3次，真空干燥，即得PB纳米颗粒。再取60mg的PB，300mg的PVP加入到60mLHCL(0.1M)，搅拌0.5h，转移至反应釜中140℃下反应4h，最后将产物离心、高纯水和乙醇洗涤，60℃干燥得到HMPB。
(3)以HMPB为载体，氯亚铂酸钾为铂源，硼氢化钠与柠檬酸钠原位还原、室温反应、离心、洗涤、干燥得到HMPB-Pt复合物。
优选的，步骤(3)中，取HMPB加入到氯亚铂酸钾溶液中混匀后离心收集，再将其加入硼氢化钠与柠檬酸的混合溶液中，且HMPB：氯亚铂酸钾：硼氢化钠：柠檬酸的比例为5-15mg：0.1-0.3mmol：0.02-0.06mmol：0.002-0.006mmol。
优选的，称取5-15mg的HMPB，加入到5-15mL氯亚铂酸钾溶液(20mM)中，15-40℃下，搅拌8-16h，离心收集，再将其加入5-15mL硼氢化钠(4mM)与柠檬酸(0.4mM)的混合溶液中，15-40℃下搅拌1-3min，离心，洗涤，50-80℃干燥的HMPB-Pt复合物。
优选的，步骤(3)中，称取10mg的HMPB，加入到10mL的氯亚铂酸钾溶液里(20mM)，25℃下，搅拌8-16h，离心收集后，再将其加入到10mL硼氢化钠(4mM)与柠檬酸(0.4mM)的混合溶液中，在25℃下搅拌2min。
(4)以HMPB-Pt为载体和电化学发光体Luminol混合，再加入层状氧化石墨烯溶液后，离心、洗涤得到GO@HMPB-Pt-Luminol复合物，其中，HMPB-Pt、Luminol和层状氧化石墨烯的比例范围是5-15ug：0.006-0.042umol：5-15ug。
优选的，步骤(4)中，取5-15μL浓度为1mg/mL的HMPB-Pt混合物，加入到20-60μL浓度为0.3-0.7mM鲁米诺溶液中，避光混匀，得到HMPB-Pt-Luminol复合物。取5-15μL浓度为1mg/mL的石墨烯溶液加入20-60μLHMPB@Pt@Luminol复合物溶液中，黑暗下混匀，离心、洗涤得到GO@HMPB-Pt-Luminol复合物，重新分散在20-60μL缓冲溶液中。
优选的，步骤(4)中，取10μL浓度为1mg/mL的HMPB-Pt混合物，加入到40μL浓度为0.5mM鲁米诺溶液中，避光搅拌12h，得到HMPB-Pt-Luminol复合物。取10μL浓度为1mg/mL的石墨烯溶液加入40μL HMPB@Pt@Luminol复合物溶液中，黑暗下震荡1-3h，离心、洗涤得到GO@HMPB-Pt-Luminol复合物，重新分散在50μL缓冲溶液中。
(5)通过Pt-S键将Hela、MCF-7细胞表面过表达的N-Cadherin蛋白和EpCAM蛋白的核酸适配体(NC3S)和SYL3及特异性抗体修饰在GO@HMPB-Pt-Luminol上制得免疫发光探针。
优选的，步骤(5)中，GO@HMPB-Pt-Luminol-NC3S免疫发光探针按下述比例制备：取5-15μL，浓度5μM的NC3S，加入到20-60μL GO@HMPB-Pt-Luminol-NC3S复合物中充分结合，离心，洗涤，制得GO@HMPB-Pt-Luminol-NC3S免疫发光探针。
优选的，步骤(5)中，GO@HMPB-Pt-Luminol-NC3S免疫发光探针按下述比例制备：取10μL，浓度为5μM的核酸适配体(NC3S)，加入到40μL GO@HMPB-Pt-Luminol-NC3S复合物中充分结合，离心，洗涤，制得GO@HMPB-Pt-Luminol-NC3S免疫发光探针。
(6)将GO@HMPB-Pt-Luminol-NC3S免疫发光探针的悬浮液修饰在处理好的电极表面，通过细胞(Hela)与NC3S结合将一系列不同浓度富集好的PPy@Fe3O4-Au-NC3S-Hela滴加在电极表面构建夹心免疫ECL传感器，最后在缓冲液中测定ECL信号，分析细胞浓度与ECL强度之间的线性关系，用以计算未知样品中的Hela细胞浓度。
优选的，取5-10μL的GO@HMPB-Pt-Luminol-NC3S悬浮液，滴加在预处理后的玻碳电极表面，室温黑暗下放置1-3h；取5-10μL本发明一步骤(5)富集的一系列不同浓度的细胞复合物PPy@Fe3O4-Au-NC3S-Hela滴加到已修饰GO@HMPB-Pt-Luminol-NC3S的玻碳电极表面通过Hela细胞与NC3S结合构建夹心免疫ECL传感器，将电极在25-40℃的暗箱里孵育1-3h，洗掉未结合的PPy-Fe3O4-Au-NC3S-Hela；再将电极置于含有1-3mM H2O2的PBS缓冲液中，设置电压为-0.1-0.6V，光电倍增管高压为400-800V测定ECL信号。
优选的，取7.5μL的GO@HMPB-Pt-Luminol-NC3S悬浮液，滴加在预处理后的玻碳电极表面，室温黑暗下放置2h；取7.5μL本发明一步骤(5)富集的一系列不同浓度的细胞复合物PPy@Fe3O4-Au-NC3S-Hela滴加到已修饰GO@HMPB-Pt-Luminol-NC3S的玻碳电极表面通过Hela细胞与NC3S结合构建夹心免疫ECL传感器，将电极在37℃的暗箱里孵育2h，用PBS洗掉未结合的PPy-Fe3O4-Au-NC3S-Hela；再将电极置于含有2mM H2O2的PBS(0.01M)中，设置电压为0-0.5V，光电倍增管高压为600V测定ECL信号。
与现有技术相比，本发明具有如下有益效果：
(1)本申请合成了一系列不同形貌及组成的聚吡咯-四氧化三铁-金(PPy-Fe3O4-Au)磁性纳米复合物，结合靶向识别核酸适配体(Aptamer)或特异性抗体形成CTC磁免疫富集探针，通过电化学法筛选出细胞富集效率高、磁性强(饱和磁化强度为28.4emu/g)、导电性好的探针用于全血中不同表型CTC的高效富集。
(2)本申请电致化学发光免疫传感器利用常见的Luminol-H2O2共反应ECL体系，通过设计导电性好、催化效率高的空心复合结构作为Luminol的载体及共反应促进剂(GO@HMPB-Pt)高效负载Luminol形成固态发光薄膜(负载效率高达89％)，结合目标CTC形成三明治型ECL免疫传感器，用于CTC的定量分析(可检测到1cell/mL)，具有优异的抗干扰性能和较高的选择性，避免了常规分析中样品前处理及利用大型流式细胞仪操作繁琐、费用高等问题。
(3)本申请通过筛选CTC富集探针，设计优化固态Luminol发光复合物，从富集到检测多重信号放大，构建快速、灵敏、微型化的通用型CTC检测传感器，有望用于液体活检癌症早筛及疗效监测。
附图说明
为了更清楚地说明本申请实例或现有技术中的技术方案，下面将对实施实例所需的附图作简单地介绍。
图1为本申请实例构建的ECL免疫传感器原理图。
图2为不同形貌PPy-Fe3O4-Au、PPy、Fe3O4、Au NPs等电镜表征图：(A)PPy NPs；(B)PSA微球；(C)Fe3O4 NPs；(D)AuNPs；(E)MoO3纳米棒；(F)PPy@Fe3O4-Au NPs空心纳米管，内插图为TEM放大图；(G)GO；(H)HMPB；(I)GO@HMPB-Pt纳米复合物。
图3为不同形貌及组成的PPy-Fe3O4-Au磁滞回线图：(A)Fe3O4；(B)PPy@Fe3O4-Au空心纳米管；(C)PPy@Fe3O4-Au实心球；(D)PPy-Fe3O4@Au空心胶囊；(E)PPy@Fe3O4-Au空心纳米管磁分离图。
图4为GO@HMPB-Pt-Luminol作为ECL信号探针构建过程表征图：(A)Zeta电位图；(B)ECL响应图。
图5为电化学发光测试条件优化图：(A)Luminol浓度优化；(B)氧化石墨烯浓度优化。
图6为不同形貌PPy-Fe3O4-Au捕获100cell/mL细胞的ECL强度变化对比图，(a)PPy@Fe3O4-Au实心球；(b)PPy-Fe3O4@Au空心胶囊；(c)PPy@Fe3O4-Au空心纳米管。
图7为ECL免疫传感器可行性测试图。
图8为本申请实例构建免疫传感器：(A)ECL强度与不同浓度CTC的响应曲线，Hela细胞浓度从a到k依次为0，1，5，10，20，40，60，100，250，500，1000cell/mL；(B)ECL强度与不同浓度CTC线性关系分析。
具体实施方式
下面结合附图，对本申请实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述，显然，所描述的实施例仅仅是本申请一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本申请中的实施例，本领域普通技术人员在没有做创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都属于本申请保护的范围。
本发明中，除非另有其他明确说明，否则百分比、百分含量均以质量计。如无特殊说明，所使用的实验方法均为常规方法，所用材料、试剂等均可从商业途径购买。
以下实施例的核酸适配体(Aptamer)为已报道的间质型循环肿瘤细胞模型Hela细胞表面过表达的N-黏蛋白(N-Cadherin，Aptamer为NC3S，序列：5’-TTGCACTATGTTTTA GCTAGGGTTCCCTCCGGAGATAGTAAGTGCAA-3’)和上皮型循环肿瘤细胞MCF-7细胞表面过表达的上皮细胞粘附分子(EpCAM，Aptamer为SYL3，序列：5’-CACTACAGAG GTTGCGTCTGTCCCACGTTGTCATGGGGGGTTGGCCTG-3’)的特异性识别端末端经巯基修饰作为Au-S键结合端，该DNA序列由生工生物工程(上海)股份有限公司合成。该N-Cadherin和EpCAM仅在间质型和上皮型肿瘤细胞中高表达，而在多数正常细胞及血红细胞中都为低表达。这保证了在本申请实例检测环境中，PPy@Fe3O4-Au空心纳米管状复合物探针具有特异性的识别能力，可更高效的检测Hela细胞、MCF-7细胞及全型循环肿瘤细胞，提高纳米材料在传感环境中的利用率。
实施例1
本实施例公开了不同形貌及组成的循环肿瘤细胞免疫富集探针PPy-Fe3O4-Au NPs和固体电化学发光体GO@HMPB-Pt-Luminol的合成路线及以Hela细胞为模型筛选出高效的免疫富集探针。
1、PPy-Fe3O4-Au磁性复合纳米材料合成及磁性表征：
(1)聚苯乙烯微球(PSA)的合成：合成粒径为20-50nm羧基修饰的PSA，具体步骤如下，在100mL圆底烧瓶中加入70mL高纯水，70℃加热5min后，通氮气10min除去水中的氧气，以防止氧气引发随机的聚合反应，终止自由基的形成，降低产率。在磁力搅拌下，加入1.6399g聚乙烯吡咯烷酮，搅拌10min；再加入1084μL苯乙烯和34μL丙烯酸，继续搅拌10min；将0.2633g过硫酸钾均匀分散于7mL高纯水，在氮气保护下，逐滴加入反应体系，然后迅速升温至90℃，反应直至无回流，冷却至室温后转移至烧杯；在搅拌下，加入饱和氯化钠溶液破乳，离心，最后用分别高纯水、乙醇多次洗涤，60℃烘干备用。
(2)金纳米颗粒(Au NPs)的合成：合成粒径为5-13nm带负电荷的Au NPs，具体步骤如下，将反应所需要的容器在王水(盐酸与硝酸按体积比3：1混合配置)中浸泡24h；在100mL圆底烧瓶中加入60mL高纯水，沸腾后，加入500μL氯金酸(1wt％)继续加热至140℃，再将1.5mL柠檬酸钠溶液(2wt％)快速加入上述混合液，当溶液变为酒红色时，反应结束；移除加热装置，自然冷却至室温，将溶液储存于棕色瓶中。
(3)四氧化三铁纳米颗粒(Fe3O4NPs)的合成：合成粒径为50-80nm羧基化的Fe3O4NPs，具体步骤如下，将0.8104g无水FeCl3、5.3058g三水合醋酸钠、500μL聚丙烯酸(PAA)在磁力搅拌下溶解到38mL乙二醇(EG)中，将混合液转移至反应釜中200℃反应6h；对产品进行磁分离，得到的黑色沉淀，乙醇洗涤3次，60℃烘干备用。
(4)聚吡咯纳米颗粒的合成(PPyNPs)：合成粒径为100-200nm的PPyNPs，具体步骤如下，将0.75g聚乙烯醇(PVA)溶解在10mL高纯水中，再加入0.373g无水氯化铁，反应1h；冰浴下缓慢加入67.2μL吡咯，反应4h，即得PPyNPs。
(5)PPy-Fe3O4@Au空心胶囊的合成：在20mL高纯水中加入0.1g上述合成Fe3O4磁性纳米颗粒、2mmoL柠檬酸钠和1.7mL 1wt％HAuCl4溶液，40℃下搅拌2h；将混合物加热至沸(约120℃)，煮沸15min，再加入5mL 2wt％柠檬酸钠溶液，冷却至室温，磁铁分离，高纯水洗、乙醇洗分别洗三次，60℃干燥得到Fe3O4@Au。称取13.75mg上述合成的PSA和5mL 5wt％聚乙烯亚胺，室温搅拌反应2h，水洗3次；加入50mg Fe3O4@Au，搅拌反应4h；再加入10mL上述合成的PPyNPs溶液，反应4h；最后将混合物分散于20mL四氢呋喃中，磁力搅拌过夜出去PSA模板，磁铁分离，水高纯洗、乙醇各洗三次，干燥，即得PPy-Fe3O4@Au空心胶囊。
(6)Fe3O4@PPy-Au实心球：将0.066g十二烷基苯磺酸钠溶解在50mL高纯水中，转移到100mL圆底烧瓶中，通氮气20min，搅拌直至溶解；向其中加入0.025g Fe3O4，搅拌30min，加500μL吡咯，搅拌1h；将0.28g FeCl3溶于5mL水中，逐滴加入反应液中；室温下搅拌12h，磁分离，洗涤，直至上清液呈中性，合成Fe3O4@PPy。在搅拌下，将Fe3O4@PPy复合物溶液加入到金胶体中，当溶液的颜色由酒红色变为无色，添加金胶体直至溶液颜色不再改变；磁铁分离，将产品用高纯水和乙醇洗涤3次，干燥得到Fe3O4@PPy-Au实心球。
(7)PPy@Fe3O4-Au空心纳米管：称取1g钼酸铵溶于12mL 11wt％硝酸溶液中，搅拌，直至全部溶解，转移至反应釜中，在180℃下反应20h，离心得固体产品，多次水洗、乙醇洗，60℃干燥，即得三氧化钼(MoO3)纳米棒。称取50mg MoO3纳米棒和100L吡咯单体，溶于45mL去离子水中并进行磁体搅拌，形成溶液A；1mL 1wt％HAuCl4和30mg无水氯化铁溶于5mL高纯水中，形成溶液B，将溶液B逐滴加入到溶液A中，常温下反应7h；在氮气保护下，慢慢滴加5mL浓氨水，常温下反应4h；磁铁分离，高纯水洗、乙醇洗，60℃干燥，即得PPy@Fe3O4-Au空心纳米管。其中，浓氨水的浓度为22-25％均可。
(8)通过扫描电子显微镜(SEM)和透射电子显微镜(TEM)表征复合物纳米材料的合成，如图2所示，PSA(A)，PPy(B)，Fe3O4(C)，Au(D)为均匀的纳米颗粒，MoO3(E)为均匀的纳米棒状结构，(F)为PPy@Fe3O4-Au空心纳米管的SEM图，内插图为TEM放大图，从图中可以看出PPy@Fe3O4-Au为内径约200nm的空心管状结构，表面负载大量的纳米颗粒，以上数据表明材料的成功合成。
2、PPy-Fe3O4-Au免疫磁性复合探针的合成及磁富集Hela细胞：
(1)称取5mg以上(5)(6)(7)步骤合成的PPy-Fe3O4-Au复合物均匀分散在5mL pH为7.4的PBS(10mM)中，取10μL浓度为5μM的核酸适配体(NC3S)，加入到50μL浓度为1mg/mL的PPy-Fe3O4-Au复合物中，25℃下搅拌2h。产物经磁铁分离，高纯水多次洗涤，重新分散在50μL的PBS(PH＝7.4)缓冲溶液中，分别合成了不同形貌的PPy-Fe3O4-Au-NC3S。
(2)将细胞用细胞培养基稀释成不同浓度，分别为1，5，10，20，40，60，100，250，500，1000cell/mL。取10μL合成的不同形貌的PPy-Fe3O4-Au-NC3S免疫探针分别加入到1mL不同的稀释倍数的细胞溶液中，在室温下搅拌0.5h后，磁铁分离，用PBS溶液洗涤多次，重新分散在10μL的PBS缓冲溶液中完成Hela细胞的富集。
(3)图3为不同形貌磁性复合物(A)为Fe3O4纳米颗粒，(B)为PPy@Fe3O4-Au空心纳米管，(C)为PPy@Fe3O4-Au实心球，(D)为PPy-Fe3O4@Au空心胶囊的磁滞回线图及(E)为PPy@Fe3O4-Au空心纳米管的磁分离效果图，以上数据表明Fe3O4纳米颗粒和PPy@Fe3O4-Au空心纳米管具有较大的磁性，能够在5s内分离完全。
3、GO@HMPB-Pt-Luminol合成及表征：
(1)氧化石墨烯的合成：根据现有的方法通过调控电压及电解质浓度合成1-2nm厚层状氧化石墨烯(GO)，具体步骤如下，称取25.2g的草酸加入含有100mL的H2O2(5M)和100mL的高纯水的混合溶液。以石墨箔(1mm×1mm×0.5mm)为阳极，铂箔为阴极，两电极之间的距离是2cm，控制反应的温度为25℃，调节电压为10V，1min后阳极的石墨箔上面产生许多气泡，大量的石墨烯从石墨箔表面脱落，反应60min结束之后，得到黑色的絮状产物，用高纯水离心洗涤6次，将产物冻干48h，即得层状的GO。称取5mg合成的石墨烯，加入到5mL的二甲基甲酰胺溶液中(DMF)，以70W的功率超声1h，用无水乙醇和高纯水洗涤三次，真空干燥48h，剥离为1-2nm厚的片层结构。
(2)HMPB的合成：根据现有的方法通过调控模板、铁源及刻蚀时间合成粒径为50-80nm的空心介孔普鲁士蓝，具体步骤如下，将0.528g K3[Fe(CN)6]·3H2O和12g聚乙烯吡咯烷酮(PVP)加入到160mLHCL水溶液中(0.01M)中，室温下搅拌1h，将混合物转移到反应釜中80℃，反应20h，得到蓝色沉淀，用高纯水和乙醇多次洗涤，真空干燥，即得普鲁士蓝(PB)纳米颗粒。再取60mg的PB，300mg的PVP加入到60mLHCL(0.1M)，搅拌0.5h，转移至反应釜中140℃下反应4h，最后将产物离心、高纯水和乙醇洗涤，60℃干燥得到空心普鲁士蓝纳米颗粒(HMPB)。
(4)HMPB-Pt复合物的制备：通过调控Pt源的量合成大量负载Pt NPs的HMPB-Pt复合物，具体步骤如下，称取10mg的HMPB，加入到10mL的氯亚铂酸钾溶液里(20mM)，25℃下，搅拌12h，离心收集后，再将其加入到10mL硼氢化钠(4mM)与柠檬酸(0.4mM)的混合溶液中，在室温下搅拌2min，离心，高纯水和乙醇多次洗涤，60℃干燥的HMPB-Pt复合物。
(5)GO@HMPB-Pt-Luminol复合物的合成：称取10mg的HMPB-Pt复合物，配置成浓度为1mg/mL的溶液。取10μLHMPB-Pt混合物，加入到体积为40μL，浓度为0.5mM鲁米诺溶液中，避光搅拌12h，得到HMPB-Pt-Luminol复合物。配制浓度为1mg/mL的石墨烯溶液，取10μL配好的石墨烯溶液加入40μLHMPB@Pt@Luminol复合物溶液中，黑暗下震荡2h，得到GO@HMPB-Pt-Luminol复合物。
(6)GO@HMPB-Pt-Luminol-NC3S免疫探针的制备：取10μL，浓度为5μM的核酸适配体(NC3S)，加入到40μL GO@HMPB-Pt-Luminol-NC3S复合物中。室温25℃，搅拌12h，将产物离心，洗涤一次，出去多余的核酸适配体。
(7)如图2(E)为电化学法合成的GO表现出非常薄的片层结构，(H)为PB纳米颗粒粒径相对均匀立方结构，(I)为GO@HMPB-Pt-Luminol表明HMPB大量而均匀地负载在其表面，由于HMPB的空心介孔及GO大的二维片层结构能够负载大量的Luminol提高传感器的灵敏度。
(8)GO@HMPB-Pt-Luminol表征：如图4A所示，通过测定Luminol、Pt、HMPB、GO及GO@HMPB、GO@HMPB-Pt和GO@HMPB-Pt-Luminol等复合物的Zeta电位，结果表明Luminol和Pt带有较少的负电荷，HMPB和GO带有较多的负电荷，随着进一步的复合GO@HMPB、GO@HMPB-Pt和GO@HMPB-Pt-Luminol所带的负电荷逐渐增多，表明该结构的成功合成。同时本申请通过ECL测试进一步验证了GO@HMPB-Pt-Luminol复合物的合成(如图4B)，单独的Luminol表现出较弱的ECL信号，HMPB和GO载体及共反应促进剂Pt的引入能够显著增强其ECL强度。
实施例2
本实施例公开了一种电致化学发光免疫传感器的构建及其测定循环肿瘤细胞的方法。ECL传感器的测定原理如图1所示，包括如下步骤：
(1)修饰电极：将玻碳电极分别用0.05和0.3m的Al2O3抛光粉打磨成镜面，依次用无水乙醇和高纯水各超声清洗2min，用N2吹干获得预处理后的玻碳电极；用移液枪移取7.5μL的GO@HMPB-Pt-Luminol-NC3S悬浮液，滴加在预处理后的玻碳电极表面，室温黑暗下放置2h干燥，用PBS溶液清洗为结合的复合材料。
(2)细胞富集：将细胞用细胞培养基稀释成不同浓度，分别为1，5，10，20，40，60，100，250，500，1000cell/mL。取10μL合成的不同形貌的PPy-Fe3O4-Au-NC3S免疫探针分别加入到1mL不同的稀释倍数的细胞溶液中，在室温下搅拌0.5h后，磁铁分离，用PBS溶液洗涤多次，重新分散在10μL的PBS缓冲溶液中完成Hela细胞的富集。
(3)夹心法免疫传感器构建：取7.5μL步骤(2)得到的细胞复合物滴加已修饰GO@HMPB-Pt-Luminol-NC3S的玻碳电极表面(如图1所示)，通过核酸适配体与Hela细胞表面过表达的N-Cadherion蛋白特异性识别，构建夹心免疫ECL传感器，将修饰好的电极放在37℃的暗箱里面孵育2h，用PBS洗掉未结合的PPy-Fe3O4-Au-NC3S-Hela。
(4)ECL信号检测：将步骤(3)修饰后的玻碳电极置于含有2mM H2O2的PBS(0.01M)电解液中，设置电压为0-0.5V，光电倍增管高压(PMT)为600V进行ECL测定，，记录ECL强度，分析结果。
实施例3
本实施例以间质型CTC人宫颈癌细胞Hela为模型，筛选高效的CTC富集探针，优化本申请的测试条件，进行该ECL免疫传感器的可行性分析。
(1)取10μL不同形貌的PPy-Fe3O4-Au-NC3S免疫探针分别加入到1mL浓度为100cell/mL的溶液中，按照实施例2中构建的ECL免疫传感器测定ECL信号，如图6所示，PPy@Fe3O4-Au空心纳米管捕获细胞后对应的电化学发光信号下降最多，表明PPy@Fe3O4-Au空心纳米管对细胞的捕获效率最高，而且相比于高磁性的Fe3O4纳米颗粒，PPy@Fe3O4-Au空心纳米管具有较高的磁性和丰富的修饰位点对Hela细胞表面出最佳的富集能力。
(2)Luminol浓度优化及负载量计算：用0.1M的NaOH将Luminol配制成10mM的溶液，在4℃冰箱冷藏7天后使用。取40μL一系列不同浓度(0.1mM，0.2mM，0.3mM，0.5mM，0.7mM，1mM)的鲁米诺溶液与10μL浓度为1mg/mL的HMPB-Pt混合，避光搅拌12h，离心洗涤一次，再重新分散在50μL的高纯水中，得到不同Luminol负载量的HMPB-Pt-Luminol复合物。按照实施例2中电极修饰步骤将一系列不同Luminol负载量的复合物修饰在玻碳电极表面，进而检测ECL信号。如图5A所示，随着Luminol浓度的增大，ECL信号显著增强，在0.5mM出现拐点，表明0.5mM为最优浓度。进一步通过紫外吸收光谱法绘制Luminol的线性曲线，计算出线性拟合方程，计算出Luminol的负载量高达89％。
(3)电极表面GO量的优化：将上述步骤2中已优化的HMPB-Pt-Luminol溶液依次加入到不同浓度的GO溶液中(0.01mg/mL，0.044mg/mL，0.1mg/mL，0.2mg/mL，0.25mg/mL)，避光搅拌2h，再按照实施例2中步骤修饰电极，进行ECL测试，结果如图5B所示，随着GO浓度的增大，ECL信号显著增强，在0.2mg/mL出现拐点，表明0.2mg/mL为最优浓度。
(4)ECL免疫传感器可行性分析：根据已优化的最佳测试条件，按照实施例2中ECL免疫传感器的构建步骤，分别测定不同浓度的Hela细胞溶液。如图7所示，随着细胞浓度的增大，该传感器的ECL强度逐渐降低，表明该传感器对于Hela细胞的测定是可行的。
实施例4
本申请依据最优的测试条件构建ECL免疫传感器测定Hela细胞。
具体的测试步骤：配制一系列不同浓度的Hela细胞悬浮液，按照实施例2中电化学发光免疫传感器的构建方法，选用最优的PPy@Fe3O4-Au空心纳米管富集Hela细胞，按照最佳的GO和Luminol浓度合成高灵敏度的GO@HMPB-Pt-Luminol发光探针，对1-1000cell/mL的细胞悬浮液进行检测，每个结果平行对照三次。测试结果如图8所示，由于细胞导电性不好抑制了Luminol与电极表面电荷的转移，随着细胞浓度的增大，ECL强度逐渐减弱，且ECL强度的与细胞浓度的对数成线性关系，该传感器最低能检测到1cell/mL，表明本发明具有较高的灵敏度。
以上所述，仅为本发明较佳的具体实施方式，但本发明的保护范围并不局限于此，本领域的技术人员在本发明披露的技术范围内，可轻易想到的变化或替换，都应涵盖在本发明的保护范围之内。因此，本发明的保护范围应该以权利要求书的保护范围为准。
Claims (10)
1.一种循环肿瘤细胞富集探针的制备方法，其特征在于，
(1)将钼酸铵溶解在硝酸稀释液中，经高温裂解、离心、洗涤、干燥合成MoO3纳米棒；其中，钼酸铵与硝酸的质量体积比为(0.5-1.5)g：(8-16)mL；
(2)室温下，将步骤(1)制得的MoO3纳米棒作为模板分散在水中，加入吡咯单体，搅拌，形成溶液A；再将HAuCl4和无水氯化铁溶解在水中形成溶液B；其中，溶液A中MoO3纳米棒、吡咯单体和水的比例为(30-70)mg：(60-140)μL：(30-60)mL；溶液B中HAuCl4、无水氯化铁和水的比例为(0.6-1.4)mL：(18-42)mg：(3-7)mL；
(3)常温下将溶液B逐滴加入到溶液A中，继续反应，氮气保护下，慢慢滴加浓氨水，进一步反应，磁分离、洗涤、干燥，得PPy@Fe3O4-Au空心纳米管；
(4)将步骤(3)制得的PPy@Fe3O4-Au空心纳米管分散在缓冲液中，制得悬浮液浓度为0.5-1.5mg/mL；向悬浮液中加入巯基修饰的核酸适配体或特异性抗体，两者比例为(0.5-1.5mg/mL):(0.6-1.4μM)，磁分离，制得PPy@Fe3O4-Au-巯基修饰的核酸适配体或特异性抗体复合物。
2.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述步骤(1)中，钼酸铵与硝酸的质量体积比为(0.9-1.1)g：(11-13)mL。
3.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述步骤(3)中，溶液A和溶液B的混合比例以MoO3纳米棒和无水氯化铁的质量比为(30-70)：(18-42)计。
4.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述步骤(3)中，浓氨水的添加比例，以HAuCl4和浓氨水的体积比为(0.6-1.4)：(3-7)。
5.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述步骤(4)中，所述的核酸适配体选自NC3S或SYL3。
6.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述步骤(4)中，所述的特异性抗体选自N-Cadherin或EpCAM抗体。
7.如权利要求1所述方法制备获得的循环肿瘤细胞富集探针；所述探针为PPy@Fe3O4-Au空心管状磁性纳米复合物；该探针加入到相应的细胞稀释液中，室温搅拌、磁分离、洗涤、重新分散在缓冲溶液中完成细胞的富集；所述细胞包括检测上皮型、间质型或双靶捕获全型CTC细胞中的一种。
8.如权利要求7所述的探针在构建用于循环肿瘤细胞的诊断传感器中的应用，其特征在于：所述应用为基于PPy@Fe3O4-Au空心管状磁性纳米复合物探针富集目标物，GO@HMPB-Pt纳米复合物固载电化学发光体Luminol构建电化学免疫发光传感器，用以检测循环肿瘤细胞。
9.根据权利要求8所述的应用，其特征在于：包括以下步骤：
(1)根据电化学法，在草酸和H2O2电解质中，以石墨箔为阳极，铂箔为阴极，电解、洗涤、干燥、剥离合成厚度为1-2nm的层状氧化石墨烯；
(2)依据溶剂热法合成粒径为60-100nm立方体的实心普鲁士蓝纳米颗粒，再以PVP为模板和保护剂通过酸性刻蚀合成空心介孔的普鲁士蓝纳米颗粒HMPB；
(3)以HMPB为载体，氯亚铂酸钾为铂源，硼氢化钠与柠檬酸钠原位还原、室温反应、离心、洗涤、干燥得到HMPB-Pt复合物；
(4)以HMPB-Pt复合物为载体和电化学发光体Luminol混合，再加入石墨烯溶液后，离心、洗涤得到GO@HMPB-Pt-Luminol复合物，其中，HMPB-Pt、Luminol和石墨烯的比例范围是5-15ug：0.006-0.042umol：5-15ug；
(5)通过Pt-S键将Hela、MCF-7细胞表面过表达的N-Cadherin蛋白和EpCAM蛋白的核酸适配体NC3S和SYL3及特异性抗体修饰在GO@HMPB-Pt-Luminol上制得免疫发光探针；
(6)将GO@HMPB-Pt-Luminol-NC3S免疫发光探针的悬浮液修饰在处理好的电极表面，通过细胞与NC3S结合将不同浓度富集好的PPy@Fe3O4-Au-NC3S-细胞滴加在电极表面构建夹心免疫ECL传感器，最后在缓冲液中测定ECL信号，分析细胞浓度与ECL强度之间的线性关系，用以计算未知样品中的细胞浓度。
10.根据权利要求9所述的应用，其特征在于：步骤(3)中，取HMPB加入到氯亚铂酸钾溶液中混匀后离心收集，再将其加入硼氢化钠与柠檬酸的混合溶液中，且HMPB：氯亚铂酸钾：硼氢化钠：柠檬酸的比例为5-15mg：0.1-0.3mmol：0.02-0.06mmol：0.002-0.006mmol；
优选的，步骤(4)中，HMPB-Pt-Luminol复合物按下述比例制备：取5-15μL浓度为1mg/mL的HMPB-Pt混合物，加入到20-60μL浓度为0.3-0.7mM鲁米诺溶液中，避光混匀，制得；
优选的，步骤(5)中，GO@HMPB-Pt-Luminol-NC3S免疫发光探针按下述比例制备：取5-15μL，浓度5μM的NC3S，加入到20-60μL GO@HMPB-Pt-Luminol-NC3S复合物中充分结合，离心，洗涤，制得；
优选的，步骤(6)中，取5-10μL的GO@HMPB-Pt-Luminol-NC3S悬浮液，滴加在预处理后的玻碳电极表面，室温黑暗下放置1-3h；取5-10μL不同浓度的细胞复合物PPy@Fe3O4-Au-NC3S-细胞滴加到已修饰GO@HMPB-Pt-Luminol-NC3S的玻碳电极表面通过细胞与NC3S结合构建夹心免疫ECL传感器，将电极在25-40℃的暗箱里孵育1-3h，洗掉未结合的PPy-Fe3O4-Au-NC3S-细胞；再将电极置于含有1-3mM H2O2的缓冲液中，设置电压为-0.1-0.6V，光电倍增管高压为400-800V测定ECL信号。
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|---|---|---|---|---|
| CN116930481A (zh) * | 2023-09-12 | 2023-10-24 | 重庆医科大学绍兴柯桥医学检验技术研究中心 | 一种磁场驱动微纳米马达的跨分子检测方法 |
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| PB01 | Publication | ||
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| SE01 | Entry into force of request for substantive examination | ||
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