TW201413230A - 可選擇地濃縮分離待測粒子的方法與晶片 - Google Patents

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Abstract

一種可選擇地濃縮分離待測粒子的晶片，包含一具有容置溶液的分離空間的晶片本體、一設置於晶片本體並位於該分離空間的內電極、一設置於晶片本體並位於該分離空間且具有第一外電極和第二外電極的外電極單元，及一動力源，第一外電極環圍內電極，第二外電極環圍第一外電極，動力源電連接內電極和第一、二外電極並可被控制地提供產生104~108V/m電場的交流電，而使含有不同粒徑的微粒、奈米粒於溶液中受介電泳力與電流體動力作用分離並集中於該內電極。

Description

可選擇地濃縮分離待測粒子的方法與晶片
本發明是有關於一種生物晶片，特別是關於一種用於分離溶液中粒徑是微米尺度且比值不小1.5的微粒，奈米尺度且比值不小於10的可選擇地濃縮分離待測粒子的晶片。
以拉曼光譜法進行微生物的檢測，由於不需要技術熟練的專門技術人員操作例如打破細胞抽取DNA進行核酸檢測、或是進行螢光標定，或是生化分析等等，而可直接藉由得到的微生物光譜指紋直接進行菌種鑑定的比對，是近年來熱門的微生物檢測研究領域。
初期，以拉曼光譜檢測法進行微生物鑑定時，細菌濃度需高達1012CFU/ml，但即便如此，仍只能得到偏弱的光譜訊號，此外，未經處理的樣本以拉曼光譜檢測無法得到混合樣本中的致病菌光譜訊號，仍必須進行純化後才可進行特定細菌光譜訊號；相關文獻如R.M.Jarvis,A.Brooker,and R.Goodacre,Surface-enhanced Raman scattering for the rapid discrimination of bacteria,Faraday Discuss.,2006,132,281.，以及R.M.Jarvis and R.Goodacre,Discrimination of bacteria using surface-enhanced Ramanspectroscopy,Anal.Chem.,2004,76,40.。
之後，H.-H.Wang等人以具有粗糙表面的基板集中檢測樣品中的微生物以產生表面增顯拉曼光譜，用增加訊號強度的方式提高辨識度、達到提升各種菌種檢測的可能性，但 此方式仍無法檢測混合的實際樣本；相關文獻為H.-H.Wang,C.-Y.Liu,S.-B.Wu,N.-W.Liu,C.-Y.Peng,T.-H.Chan,C.-F.Hsu,J.-K.Wang,and Y.-L.Wang,Highly R aman-Enhancing Substrates Based on Silver Nanoparticle Arrays with Tunable Sub-10 nm Gaps,Adv.Mater.,18,491-495.。
另外，配合用滴定方式自然蒸發檢測樣本以產生咖啡環(Coffee ring)，是目前配合以拉曼光譜進行微生物鑑定最常用的方法，其中，咖啡環是於蒸發乾燥樣本時因溶液的表面張力與內聚力的作用而使微生物聚集形成，此方式可以降低樣本中微生物的濃度至109CFU/ml即可得到光譜訊號，但缺點仍在於無法檢測混合的實際樣本；相關文獻如R.D.Deegan,O.Bakajin,T.F.Dupont,G.Huber,S.R.Nagel and T.A.Witten,Capillary flow as the cause of ring stains from dried liquid drops,Nature,1997,389,827-829.、J.Filik and N.Stone,Drop coating deposition Raman spectroscopy of protein mixtures,Analyst,2007,132,544-550.、和M.Harz,M.Kiehntopf,,S.Stockel,P.Rosch,E.Straube,T.Deufel,and J.Popp,Direct analysis of clinical relevant single bacterial cells from cerebrospinal fluid during bacterial meningitis by means of micro-Raman spectroscopy,J.Biophoton.,2009,2,70-80.。
由上述說明可知，目前用拉曼光譜法進行微生物的檢測，仍存在有無法檢測混合的實際樣本的問題-就此，申請人認為問題並不在於用拉曼光譜分析待檢測樣本的過程，而 是在於無法快速、有效地選擇性分離欲檢測的混合實際樣本中的微生物、細胞、或其它物質等，導致無法得到可用、足以區分微生物、細胞等的光譜指紋，也就是說，若能快速、正確地選擇性分離欲檢測的混合實際樣本中的微生物、細胞、或其它物質等至預定區域，即能有效地配合拉曼光譜分析該等分別集中有微生物、細胞的預定區域而得到特定微生物的光譜指紋，進而正確快速分析得到例如病患血液中的病菌種類，施以正確地投藥與治療，而達到減輕病患痛苦、治療，避免遺憾的結果。
最新地，Prof.Liu於Nature communications中發表使用Ag/AAO基材，修飾上適當劑量的萬古黴(Vancomycin)對細菌進行捕捉、增加細菌與基材的貼附，而不對血液中的血球或其他物質進行吸附，減少干擾、增強拉曼訊號，進而以拉曼光譜鑑定細菌的種類；相關論文為T.-Y.Liu,K.-T.Tsai,H.-H.Wang,Y.Chen,Y.-H.Chen,Y.-C.Chao,H.-H.Chang,C.-H.Lin,J.-K.Wang and Y.-L.Wang,Functionalized arrays of Raman-enhancing nanoparticles for capture and culture-free analysis of bacteria in human blood,Nat.Commun.,2011,2：538 doi：10.1038/ncomms1546.。此篇論文是目前全世界第一篇自血液(即混合的實際樣本)中以萬古黴素吸附住細菌並用拉曼光譜分析菌種鑑定的技術文獻；然而，此篇技術文獻仍存在萬古黴素與細菌接合需要至少耗費數小時的化學修飾與至少一小時的相互接合的反應時間，且並非所有菌種皆可與萬古黴素作用，因此，此技術仍需要加 以研究改進。
綜上述，申請人認為採用可分離混合實際樣本中的微生物、細胞、或其它物質的可選擇地濃縮分離待測粒子的晶片，再配合拉曼光譜分析菌種鑑定，應是目前發展快速且能正確分析鑑定待測的實際混合樣本的技術的正確方向；但，再分析例如台灣第100110372號申請案、第098123205號申請案、第099100678號申請案、第095139596號申請案揭示的檢測基板、微流體晶片、濃縮器，乃至於傳送液體樣品致感應器陣列的系統等等關於晶片或生物晶片的技術方案，均存在有例如樣品檢測濃度極限較高、且無法檢測混合樣本、或作用待測樣本範圍僅為數百微米、檢測極限約在106~107CFU/ml、或傳送目標物無選擇性、仍無法取得特定菌種光譜指紋等等問題，而無法滿足微生物技術鑑定檢測的需要。
因此，本發明之目的，即在提供一種可選擇地有效分離溶液中粒徑範圍不同的生物粒子或分子並聚集於特定區域，特別適用於分離血液樣本中的微生物與細胞、或其他物質，例如病毒、蛋白分子、核酸等，集中於不同的特定區域，進而配合以拉曼光譜分析鑑定微生物種類的可選擇地濃縮分離待測生物粒子或分子的晶片。
此外，本發明之目的，即在提供一種可選擇地有效分離溶液中粒徑範圍不同的粒子並集中於特定區域，進而配合各式分析鑑定粒子種類的可選擇地濃縮分離待測粒子的方法。
於是，本發明一種可選擇地濃縮分離待測粒子的晶片，包含一晶片本體、一內電極、一外電極單元，及一動力源。
該晶片本體具有一可容置溶液的分離空間。
該內電極設置於晶片本體上並位於該分離空間中。
該外電極單元設置於該晶片本體上並具有一位於該分離空間中並與該內電極相間隔地環圍該內電極的第一外電極，及一位於該分離空間中並與該第一外電極相間隔地環圍該第一外電極的第二外電極。
該動力源與該內電極、該第一外電極和該第二外電極電連接。
再者，本發明一種可選擇地濃縮分離待測粒子的晶片，包含一晶片本體、一內電極、一外電極單元，及一動力源。
該外電極單元環圍該內電極並具有一第一外電極，及一第二外電極，第一外電極及一第二外電極是以同心環的方式向外延伸且具不同寬度。
該動力源與該內電極、該第一外電極和該第二外電極電連接，並提供相鄰電極的電場介於104~108V/m。
又，本發明一種可選擇地濃縮分離待測微粒的晶片，將一包括多數第一微粒，及多數第二微粒的溶液中的該等第一微粒與第二微粒分離並集中於預定區域，其中，該第一微粒和第二微粒的平均粒徑是微米尺度等級且比值不小於1.5，及該第二微粒的平均粒徑是奈米尺度等級且該第一、二微粒的平均粒徑比值不小於10二者其中之一，該晶片包含一晶片本體、一內電極、一外電極單元，及一動力源。
該晶片本體具有一容置該溶液的分離空間。
該內電極設置於晶片本體上並位於該分離空間中。
該外電極單元設置於該晶片本體上並具有一位於該分離空間中並與該內電極相間隔地環圍該內電極的第一外電極，及一位於該分離空間中並與該第一外電極相間隔地環圍該第一外電極的第二外電極。
該動力源與該內電極、該第一外電極和該第二外電極電連接，並可被控制地提供產生預定電場的交流電於該內電極和該外電極單元，而使所述的第一微粒和第二微粒受介電泳力與電流體動力作用分離並使所述第二微粒對應聚集於該內電極。
另，本發明一種可選擇地濃縮分離待測粒子的方法，包含：
(a)提供一包括多數第一粒子，及多數第二粒子的溶液。
(b)將該溶液置於一晶片的一分離空間中。
(c)提供預定頻率和電壓的交流電於該晶片的一內電極，及一外電極單元的一第一外電極和一第二外電極，使所述的第一粒子和第二粒子其中一種受介電泳力與電流體動力作用分離並主要集中於該內電極。
本發明之功效在於：提供一種適用於分離混合實際樣本中的微生物、細胞、或其它物質的可選擇地濃縮分離待測粒子的晶片，藉由內電極和外電極單元的形狀設計與配置，以及動力源施予的預定高頻的交流電，而可以讓包含不同粒徑之分子或粒子的溶液中的分子或粒子受介電泳力與電流體 動力作用而分離並聚集在預定區域，進而配合拉曼光譜分析，快速、毋須繁複的前置作業工序地鑑定出粒子，特別是菌種的光譜指紋，特別適用於準確的鑑別血液樣本中的致病菌。
有關本發明之前述及其他技術內容、特點與功效，在以下配合參考圖式之二個較佳實施例的詳細說明中，將可清楚的呈現。
在本發明被詳細描述之前，要注意的是，在以下的說明內容中，類似的元件是以相同的編號來表示。
參閱圖1、圖2，本發明一種可選擇地濃縮分離待測粒子的晶片的一第一較佳實施例包含一晶片本體11、一內電極12、一外電極單元13，及一動力源14，適用於將一包括多數第一微粒，及多數第二微粒的溶液中的該等第一微粒與第二微粒分離並聚集於預定區域，其中，該第一微粒和第二微粒的平均粒徑是微米尺度等級且比值不小於1.5，或是該第二微粒的平均粒徑是奈米尺度等級且該第一、二微粒的平均粒徑比值不小於10。
該晶片本體11大致成薄板狀，具有一容置該溶液的分離空間111。
該內電極12是金所構成的圓形箔片，設置於晶片本體11上並位於該分離空間111中。
該外電極單元13設置於該晶片本體11上並具有一位於該分離空間111中並與該內電極12相間隔地環圍該內電極 12的第一外電極131，及一位於該分離空間111中並與該第一外電極131相間隔地環圍該第一外電極131的第二外電極132，其中，該第一外電極131和該第二外電極132分別是金或鉑所構成且寬度均一的圓環薄片，且該第一外電極131的寬度小於第二外電極132，較佳地，該第二外電極132和第一外電極131的寬度比不小於2.828，且該內電極12與第一外電極131的間距和該第一外電極131與第二外電極132的間距比值不小於2.828，避免形成後續施加電能而帶動分離所述的第一微粒和第二微粒時產生停滯點。
該動力源14與該內電極12、該第一外電極131和該第二外電極132電連接，並可被控制地提供產生104~108V/m電場的交流電(300Hz~20MHz、5~15Volt)於該內電極12、該第一外電極131和該第二外電極132，以血球與細菌之分離為例，該動力源提供105V/m的電場強度較佳。
配合參閱圖3，當自該動力源14提供產生預定電場的交流電(300Hz~20MHz、5~15Volt)於該內電極12、該第一外電極131和該第二外電極132時(即令相鄰電極產生介於104~108V/m電場)，該內電極12、該第一外電極131和該第二外電極132表面會吸引溶液中的相異離子而產生電雙層(electrical double layer)，且彼此之間會產生電場作用力而帶動離子產生遷移(charge migration)，進而帶動整個位於分離空間111中的溶液形成流場擾動；也就是以交流電滲流(AC electroosmosis)和交流電熱流(AC electrothermal)讓第一微粒、產生大範圍運送；同時，粒徑不同的第一微粒 和第二微粒在此非均勻電場中，受到極化而誘發不同的電偶極(induced dipole)，且由於第一微粒和第二微粒與其周遭懸浮液的極化程度不同而產生介電泳力(dielectrophoretic force)，從而驅使第二微粒(粒徑相對小於第一微粒)分別往不同大小的電場區域移動，進而分離並分別集中於該內電極12，進而可以用例如拉曼光譜針對該內電極12區域對該第二微粒進行例如光譜指紋分析，進而快速、毋須其它前置工序地得知關於第二微粒的光譜分析結果。
更具體而言，若該溶液是血液(也就是一種混合實際樣本)，所述第一微粒即為血球，第二微粒即為例如細菌-當溶液(即血液)導電度較低(1μS/cm~500μS/cm)、動力源12提供約在300Hz~100kHz的交流電時，血球和細菌在低頻低導電度主要受到正介電泳力、負介電泳力與交流電滲流作用，血球(粒徑相對大於細菌)呈現負介電泳力(即排斥力)，細菌呈現正介電泳力(吸附力)，但由於介電泳力與粒徑三次方成正比，故血球若其負介電泳力大於電流體力(electrohydrodynamics,EHD)作用，則被排斥於第一外電極131與內電極12之間的弱電場區(但由於有電流體力作用，仍會較偏向第一外電極131聚集)，細菌(粒徑相對小於血球)若其正介電泳力弱於電流體力而可被傳送至內電極12處聚集。當溶液導電度較高(0.5mS/cm~15mS/cm)，動力源14提供約在500kHz~20MHz的交流電時，血球和細菌在高頻高導電度主要受到正介電泳力(此時血球和細菌皆被誘發正介電泳力)與交流電滲流作用，由於介電泳力與粒徑三次方成 正比，故血球若其正介電泳力大於電流體力作用，則被吸附於第一外電極131、第二外電極132邊緣與內電極12邊緣的強電場區，細菌則被傳送至內電極12中心處聚集。此時，由於內電極12處的細菌濃度足夠高，而可以配合用拉曼光譜針對該內電極12處進行細菌光譜指紋分析，進而快速、毋須其它前置工序地完成血液中細菌的菌種鑑定。此外，若待分離之兩種粒子分別皆被誘發負介電泳力，而兩種微粒子尺寸有1.5倍的差異或兩種奈米微粒的尺寸有10倍以上的差異，亦可由此方法與機制分離。
參閱圖4、圖5，本發明一種可選擇地濃縮分離待測粒子的晶片的一第二較佳實施例是與該第一較佳實施例相似，不同處在於該第二較佳實施例還包含至少一延伸電極單元15，在本例與圖示中是以三延伸電極單元15作說明。
該延伸電極單元15設置於該晶片本體11上並具有一位於該分離空間111中並與該第二外電極132相間隔地環圍該第二外電極132的第三外電極151，及一位於該分離空間111中並與該第三外電極151相間隔地環圍該第三外電極151的第四外電極152，其中，該第三外電極151和該第四外電極152分別是金或鉑所構成且寬度均一的圓環薄片，且該第三外電極151的寬度小於第四外電極152，較佳地，該第四外電極152和第三外電極151的寬度比不小於2.828，且該第二外電極132和第三外電極151的間距與該第三外電極151和該第四外電極152的間距比值不小於2.828，且該動力源12與該第三外電極151和該第四外電極152電連接。 而當該動力源12可被控制地提供產生預定電場的交流電於該內電極12、該外電極單元13和該延伸電極單元15時，溶液中的第一微粒和第二微粒受介電泳力與電流體動力作用分離並使所述第二微粒對應聚集於該內電極12。
藉由該延伸電極單元15和內電極12、外電極單元13的配合，可以更大面積地作用容置於該分離空間111中的溶液，而令溶液中的微粒受到介電泳力與電流體動力作用而選擇性地分離並集中於該內電極12。
要再加以補充的是，上述第一、二較佳實施例說明的可選擇地濃縮分離待測粒子的晶片的該內電極12還可以包括一奈米等級的粗糙附著面，進而產生表面電漿共振(surface plasmon resonance)與電子轉移(electron transfer)而有效地增強拉曼光譜訊號強度、偵測到生物微粒的光譜訊號。該內電極12還可以選擇性地修飾與預定菌種、或是蛋白、核酸結合的抗體與核酸探針，藉此再進行例如血液中多樣細菌、蛋白、病毒與核酸的光譜鑑定，或於內電極12表面進行光、電性檢測時，更有效地藉由該抗體與生物微粒結合，而有效選擇性濃縮並藉由抗體、核酸捕捉其中一待測物，例如細菌、病毒、蛋白、核酸等而提更鑑別度與降低干擾。另外，該內電極12、該外電極單元13、該延伸電極單元15的形狀亦不以圓形、圓環為限，而可以作例如多邊形、多邊形環的變化，而得到預定的分離、濃縮微粒於預定區域的預定結果。
再者，動力源提供的電場範圍會因不同分離目標物而有 所設計與調整-可有效的阻擋不同的奈米、微米粒子進入的電場範圍約在104V/m~108V/m，以一個critical strength(E-critical)來講，病毒與蛋白分子的E-critical約108V/m、細菌約106V/m、真菌約105V/m，血球與細胞約104V/m，即例如當電場強度大於106V/m，細菌可被電場阻擋，小於細菌的粒子則進入內電極中心處。此外，若要把血球與細菌分離，血球排斥在外，細菌進入內電極中心處以供檢測時，動力源提供的電場作用範圍為104V/m至106V/m之間，若要分離血球與病毒則為104V/m至108V/m，若要分離細菌與病毒則為106V/m至108V/m之間，即以上機制必須同時符合動力源提供的電流體力(FEHD)大於粒徑較小的粒子受到的交流介電泳力(FDEP，DEP是dielectrophoresis之簡寫)且小於粒徑較大的粒子受到的交流介電泳力。
再者，該晶片較佳地是採用微機電技術製作，而令內電極12、第一外電極131、第二外電極132，乃至於該延伸電極單元15的第三外電極151和第四外電極152與該動力源12的連接視需要而分屬不同平面，也就是三維立體化，就此，可以讓經由內電極12、第一外電極131、第二外電極132，乃至於該延伸電極單元15作用於分離空間111中的溶液的受到無邊界效應影響的介電泳力與電流體動力作用，而快速、可選擇地分離並濃縮溶液中的預定微粒於預定區域，進而進行後續光譜鑑定。
此外，採用本發明可選擇地濃縮分離待測粒子的晶片，還可以選擇性地分離聚集例如細胞、細菌、真菌、病毒、 protein、核酸等等待測粒子，並搭配例如螢光標記、電阻抗/導電度、透光率(濁度)、雷射、光譜、質譜等技術進行定量分析、標的物鑑定、或是低干擾物快篩等。
【實際鑑定血液樣本中的致病菌】
申請人以上述第一較佳實施例揭示的可選擇地濃縮分離待測粒子的晶片，其中，內電極以金構成並包括奈米等級粗糙附著面，以對532μm波長的雷射光源產生的表面電漿共振產生良好的增顯效果，配合環繞於外寬度為25微米的第一外電極和寬度為100微米的第二外電極，內電極與第一外電極間距為25微米，第一外電極和第二外電極的間距為100微米，產生非均勻交流電滲漩渦，同時以動力源施加12Vpp於第二外電極、8Vpp於第一外電極，內電極接地且相對第一外電極和第二外電極皆有0.5V的直流偏壓，以產生非均勻的流場往內電極中心驅動至中央停滯點(stagnation point)，如此，即可大範圍地驅動位於分離空間中的血液所含的致病菌往內電極移動，也就是形成可進行大範圍交流電滲流傳輸檢體於內電極的粗糙附著面，於此，具選擇性的正介電泳力提供吸附力將致病菌吸附緊貼於內電極的粗糙附著面的中央停滯點，進而於後續進行拉曼光譜量測時，藉粗糙附著面得到較強的訊號增顯結果，而血球則被負介電泳力產生的排斥力推離而遠離內電極。
參閱附件1，為了方便觀察與驗證本發明晶片在不同電場條件下所產生的生物粒子操控與分佈現象，先以5×106CFU/ml之血球濃度與107CFU/ml之細菌濃度混合，當尚 未自動力源施加任何交流電產生電場時，細菌與血球皆呈現隨機分佈狀態，且由於細菌很小在散佈狀態幾乎無法看見，如附件1之(a)，故幾乎無法進行進一步的拉曼量測。
而當自動力源施加頻率為400Hz的交流電約一分鐘，由於細菌與血球分別被誘發的正負介電泳力均遠大於交流電滲流，故血球被阻擋在外，細菌亦被吸附於內電極、第一外電極、第二外電極之外緣，如附件1之(b)。
當自動力源施加頻率為3kHz的交流電約一分鐘時，此時交流電動流體力遠大於細菌與血球被誘發出的正負介電力，故血球與細菌皆被帶動到內電極處聚集，而無法達到有效的分離，如附件1之(c)。
當自動力源施加頻率為800Hz的交流電約一分鐘時，血球所誘發之負介電泳排斥力大於交流電動流力，造成血球被排斥於內電極之外，而細菌所誘發之正介電泳力則小於交流電動流力，形成可有效的被帶入內電極，其結果可達有效率的分離與選擇性的濃縮細菌於內電極處，如附件之(d)，證實本發明可選擇地濃縮分離待測粒子的晶片確實在動力源提供電場頻率為600Hz~2000Hz、電壓為8Volt與12Volt的交流電分別施加於第一、二外電極，內電極(接地端)加上0.5Volt的直流電，亦即產生105V/m的交流電電場時，快速、有效地選擇將粒徑小的細菌分離並聚集於內電極，而利於後續的增顯拉曼光譜鑒定。
再配合以拉曼光譜鑑定金黃色葡萄球菌(S.aureus)和綠膿桿菌(P.aeruginosa)為例作進一步地驗證，其中，滴 置於本發明晶片的是細菌濃度調配為106CFU/ml的檢測樣本，比較例是用細菌濃度調配為109CFU/ml的檢測樣本並配合用滴定方式自然蒸發檢測樣本產生的咖啡環。
參閱附件2，吸取50μl細菌濃度調配為106CFU/ml的檢測樣本滴置於本發明晶片上，以動力源提供電場頻率為800Hz、電壓為8Volt與12Volt的交流電分別施加於第一、二外電極，內電極(接地端)加上0.5Volt的直流電，亦即產生105V/m的交流電電場，作用2分鐘後，直接進行拉曼檢測，得到標示為I(金黃色葡萄球菌)、III(綠膿桿菌)圖譜：同時，用細菌濃度調配為109CFU/ml的檢測樣本滴於平滑金屬表面上，約靜置15分鐘左右形成咖啡環後進行拉曼檢測，得到標式為II(金黃色葡萄球菌)、IV(綠膿桿菌)圖譜。由得到的細菌圖譜結果評估計算，可知本發明晶片可以得到明確的細菌圖譜，而傳統上用咖啡環濃縮減測樣本的方式僅能得到微弱的特徵峰，相較後本發明晶片可增顯拉曼訊號約5倍到30倍(視菌種不同而有差異)。
此外，由於用滴定方式自然蒸發檢測樣本產生的咖啡環所需的等待蒸發的時間長，當檢測樣本超過10μl時，需超過半小時以上才有辦法達到濃縮效果，且當檢測樣本的細菌濃度低(例如低於104CFU/ml)時，數μl的檢測樣本可能連10隻細菌都不到，幾乎無法進行拉曼檢測，參閱附件3，附件3之(a)是為細菌濃度為109CFU/ml的檢測樣本產生的咖啡環，事實上，當細菌濃度低到107CFU/ml時，幾乎無法產生明顯的咖啡環以供後續檢測。
參閱附件3之(b)、(c)，由於本發明晶片可有效且大範圍的對檢測樣本中的微粒(細菌)進行選擇性地聚集，以細菌濃度分別是3×104CFU/ml與5×103CFU/ml各50μl的檢測樣本經動力源提供電場頻率為800Hz、電壓為8Volt與12Volt的交流電分別施加於第一、二外電極，內電極(接地端)加上0.5Volt的直流電，亦即產生105V/m的交流電電場作用2分鐘後得到如附件3之(b)、(c)的高密度聚集細菌團的結果，相較於目前常用的咖啡環濃縮減測樣本的方式，本發明晶片的檢測極限大幅降低了105倍，且花費時間也從近一小時縮短至兩分鐘。
參閱附件4，再以本發明晶片對不同濃度之菌液的檢測樣本得到的光譜訊號進行探討，附件4之(a)為不同濃度的綠膿桿菌於本發明晶片提供交流電動力分離並聚集後進行拉曼量測後所得之光譜訊號，無論高濃度或低濃度的原始菌液，經由本發明晶片分離聚集成高密度的細菌團後，其細菌團的密度都相差不大，如附件3之(b)、(c)所示，結果亦顯示原始菌液濃度在5×104CFU/ml以上其所測得的拉曼訊號強度都差不多，並無明顯衰減。
附件4之(b)為不同濃度之金黃色葡萄球菌經本發明晶片分離聚集後進行拉曼量測後所得之光譜訊號，亦呈現類似上述的趨勢，只有當菌液的濃度降到5×103CFU/ml以下才會有較明顯的訊號強度衰減，但其訊號強度與各菌種各自的特徵峰依然相當清楚且可供辨識與判別，如附件4之(a)、(b)所示，如此可以驗證本發明晶片的穩定性與高靈敏性- 即使極低濃度之檢體經由本發明晶片分離並聚集後，依然可以得到相當明顯且可供辨識的拉曼光譜。
再針對動力源施加不同頻率的交流電的作用條件對於三種最常見之菌血症致病菌的檢測極限探討，經實驗結果可驗證本發明晶片的有效分離與聚集的最佳頻率範圍在600Hz-2000Hz皆可。由於菌血症感染通常90%以上都是單一菌種感染，交叉感染的機率不到10%，為了日後可以直接應用於未知樣本之檢測，必須無論是任何細菌在血液中皆可經由本發明晶片由同樣的電訊號條件有效的被分離並聚集，再經由拉曼光譜鑑定，故進行三種最常見之致病菌的最佳分離並聚集的動力源施加交流電頻率的測試，得到最佳頻率為800Hz，於此條件下，三種菌種都可由血球中分離濃縮，且檢測極限幾乎都可達103CFU/ml等級，如表中所是，非但可用於血液中未知致病菌，且非常接近實際菌血症病人中血液的稀少致病菌濃度。
參閱附件5，另外，本發明晶片除了可分離並聚集極稀少的待測檢體，最大貢獻為是提供分離純化平台而使得拉曼檢測得以實際的應用於菌血症之感染檢測。若以形成咖啡環方式將混合的血球與細菌進行蒸發式濃縮，2μl的血球細 菌混合液經15分鐘自然蒸發後，結果如附件5之(a)，可見血球與細菌仍然混合並互相聚集在一起，而無法以拉曼光譜進行檢測而得到純菌的訊號。
如附件5之(b)，以本發明晶片則可從高濃度的血球細胞(3×108cells/ml)中單純分離聚集稀少的細菌(1×105CFU/ml)於檢測區域(內電極處)，且僅需2分鐘左右就可把50μl約60%的細菌聚集於中央的檢測區(即內電極處)。
附件5之(c)中，紅色圖譜為紅血球細胞的增顯拉曼光譜圖，綠色圖譜為紅血球(107cells/ml)與高濃度細菌(109CFU/ml)混合後以咖啡環方式聚集後所測得之增顯拉曼光譜圖，由此圖譜可知，血球的訊號較明顯且細菌的訊號幾乎被血球訊號蓋掉，故血球-細菌之混合團所測得之訊號幾乎與血球訊號類似，而幾乎不可能進行血液中致病菌的鑑定。而經本發明晶片分離並聚集後新測得之訊號即可得到純菌之訊號(以金黃色葡萄球菌為例)-藍色圖譜為高濃度血球細胞(3×108cells/ml)與低濃度之細菌(1×10×5CFU/ml)混合後，經由晶片分離後測得之金黃色葡萄球菌之增顯拉曼光譜圖，可有效測得純菌訊號以供快速辨識鑑定，如附件5之(c)。附件5之(d)為經由分離並聚集後所測得之金黃色葡萄球菌、大腸桿菌、綠膿桿菌(感染菌血症最常出現約三種致病菌)的光譜訊號，由所測得的訊號可明顯看出，三種菌的增顯拉曼圖譜有很大的差異，各菌種訊號皆有許多其各自的特徵峰，可輕易的進行比對與鑑定。
綜上所述，本發明可選擇地濃縮分離待測粒子的晶片， 是利用內電極、外電極單元的設計，並配合動力源提供適切的電場的交流電，而使溶液中不同的微粒，特別是例如血液中的血球、細胞、細菌，受到介電泳力與電流體動力作用而分離並聚集在預定區域，進而配合進行例如拉曼光譜分析，或是例如螢光標定、電阻抗/導電度量測、透光率(濁度)檢測、雷射、光譜、質譜鑑定等，而可快速、毋須繁複的前置作業工序地對分離聚集的微粒進行鑑定，特別適用於以拉曼光譜準確的鑑別血液樣本中的致病菌。
進一步地歸納分析，本發明可選擇地濃縮分離待測粒子的晶片具有以下技術特點：
1.不需樣本前處理-本發明晶片可以直接分離聚集待測樣本中的特定粒子、細胞，或細菌，不需如現有的生物晶片必須先進行昂貴抗體或核酸探針修飾，所以可以大幅縮短檢測時間、成本花費。
2.本發明晶片的製作、使用成本低-由於本發明晶片結構簡單，可以微縮化並配合以微機電技術製作，且不需例如較貴的抗體修飾，所以製作、使用成本低廉。
3.具可攜性。
4.靈敏度高只需少量檢體。
5.大幅縮短整體檢測時間-由於不需要進行昂貴耗時的表面修飾、不需要抗原抗體反應、不需要進行DNA抽取放大雜交等耗時反應，可以大幅縮短檢測與鑑定時間至5分鐘內。
6.非標記式(label-free)檢測-有別於一般檢體進行的光 學測量，本發明晶片毋須再進行例如螢光或其他標記，即可進行後續檢測。
申請人以晶片設計，使待測溶液，特別是含有血球、細菌的血液，藉由動力源提供產生預定電場的交流電於內電極、外電極單元，而受介電泳力，和交流電流體動力作用而分離並聚集在預定區域，由於不需打破細胞，或進行標定，或修飾抗體，或修飾化學物質進行結合反應即可進行檢測鑑定，不但大幅縮短原本數天或近10小時的檢測過程於5分鐘內，且實施過程更加簡單，成本也更低廉，更使得現有的拉曼光譜於鑑定微生物之技術更趨近於實際的檢測應用，達到針對菌血症病患進行快速篩檢檢測的目的，確實達成本發明的創作目的。
惟以上所述者，僅為本發明之較佳實施例而已，當不能以此限定本發明實施之範圍，即大凡依本發明申請專利範圍及發明說明內容所作之簡單的等效變化與修飾，皆仍屬本發明專利涵蓋之範圍內。
11‧‧‧晶片本體
111‧‧‧分離空間
12‧‧‧內電極
13‧‧‧外電極單元
131‧‧‧第一外電極
132‧‧‧第二外電極
14‧‧‧動力源
15‧‧‧延伸電極單元
151‧‧‧第三外電極
152‧‧‧第四外電極
圖1是一俯視圖，說明本發明可選擇地濃縮分離待測粒子的晶片的一第一較佳實施例；圖2是一側視圖，輔助圖1說明本發明可選擇地濃縮分離待測粒子的晶片的第一較佳實施例；圖3是一示意圖，說明本發明可選擇地濃縮分離待測粒子的晶片的第一較佳實施例在使用時，使所述的第一微粒和第二微粒受介電泳力與電流體動力作用分離，並使所述第二 微粒對應聚集於內電極；圖4是一俯視圖，說明本發明可選擇地濃縮分離待測粒子的晶片的一第二較佳實施例；及圖5是一側視圖，輔助圖4說明本發明可選擇地濃縮分離待測粒子的晶片的第二較佳實施例。
【附件簡單說明】
附件1是一微觀照片圖，(a)是尚未施加任何電場時細菌與血球皆呈現隨機分佈狀態，且由於細菌很小，在散佈狀態幾乎無法看見。(b)是施加交流電頻率為400Hz時，由於介電泳力大於交流電滲流，故血球被阻擋在外，細菌亦被吸附於外圈。(c)是施加交流電頻率3000Hz時，交流電動力大於介電泳力，故血球與細菌皆被帶動到中央處。(d)是施加交流電頻率800Hz時，血球所誘發之負介電泳排斥力大於交流電動流力，而細菌所誘發之正介電泳力小於交流電動流力，而使細菌相對血球分離且聚集於內電極處。
附件2是一拉曼光譜圖，I是以本發明晶片處理金黃色葡萄球菌之檢測樣本後直接進行拉曼檢測得到的圖譜，II是滴定金黃色葡萄球菌之檢測樣本形成咖啡環後進行拉曼檢測得到的圖譜，III是以本發明晶片處理綠膿桿菌之檢測樣本後直接進行拉曼檢測得到的圖譜，IV是滴定綠膿桿菌之檢測樣本形成咖啡環後進行拉曼檢測得到的圖譜。
附件3是微觀照片圖，(a)是高濃度的菌液(109CFU/ml)形成咖啡環的細菌團結果。(b)是以本發明晶片處理3×104CFU/ml的菌液2分鐘後得到的結果。(c)是以本發明晶片 處理5×103CFU/ml的菌液2分鐘後得到的結果。
附件4是一拉曼光譜圖，(a)是含有不同濃度之綠膿桿菌的菌液經本發明晶片作用後所得之拉曼光譜訊號。(b)是含有不同濃度之金黃色葡萄球菌的菌液經本發明晶片作用後所得之拉曼光譜訊號。
附件5之(a)是微觀照片，將混合的血球與細菌的檢測樣本進行蒸發式濃縮，結果可見血球與細菌仍然混合並聚集在一起。(b)是微觀照片，是經本發明晶片作用將高濃度的血球細胞(3×108cells/ml)中的細菌(1×105CFU/ml)分離集中於檢測區域(內電極)。(c)是拉曼光譜圖，其中，紅色圖譜為紅血球細胞之增顯拉曼光譜圖、綠色圖譜為紅血球與高濃度細菌混合後以形成咖啡環方式聚集後所測得之增顯拉曼光譜圖，藍色圖譜則是為高濃度細胞與低濃度之細菌混合後經由本發明晶片作用分離後測得的金黃色葡萄球菌的增顯拉曼光譜圖。(d)是拉曼光譜圖，可得知經本晶片作用後光譜訊號於細菌非常低的濃度下依然有很明顯的特徵峰以供辨識。
11‧‧‧晶片本體
111‧‧‧分離空間
12‧‧‧內電極
13‧‧‧外電極單元
131‧‧‧第一外電極
132‧‧‧第二外電極
14‧‧‧動力源

Claims (38)

  1. 一種可選擇地濃縮分離待測粒子的晶片，包含：一晶片本體，具有一可容置溶液的分離空間；一內電極，設置於晶片本體上並位於該分離空間中；一外電極單元，設置於該晶片本體上並具有一位於該分離空間中並與該內電極相間隔地環圍該內電極的第一外電極，及一位於該分離空間中並與該第一外電極相間隔地環圍該第一外電極的第二外電極；及一動力源，與該內電極、該第一外電極和該第二外電極電連接。
  2. 依據申請專利範圍第1項所述之可選擇地濃縮分離待測粒子的晶片，用於將一包括多數第一粒子，及多數第二粒子的溶液中的該等第一粒子與第二粒子分離，其中，該第一微粒和第二微粒的平均粒徑是微米尺度等級且比值不小於1.5，及該第二微粒的平均粒徑是奈米尺度等級且該第一、二微粒的平均粒徑比值不小於10二者其中之一。
  3. 依據申請專利範圍第1項所述之可選擇地濃縮分離待測粒子的晶片，其中，該內電極是環形箔片，該第一外電極等間距地環圍該內電極，該第二外電極等間距地環圍該第一外電極。
  4. 依據申請專利範圍第2項所述之可選擇地濃縮分離待測粒子的晶片，其中，該第一外電極和第二外電極分別是寬度均一的圓環箔片，且該第一外電極的寬度小於第二外電極。
  5. 依據申請專利範圍第3項所述之可選擇地濃縮分離待測粒子的晶片，其中，該第二外電極和第一外電極的寬度比不小於2.828，且該內電極與第一外電極的間距和該第一外電極與第二外電極的間距比值不小於2.828。
  6. 依據申請專利範圍第1項所述之可選擇地濃縮分離待測粒子的晶片，其中，該內電極包括一奈米等級的粗糙附著面。
  7. 依據申請專利範圍第1項所述之可選擇地濃縮分離待測粒子的晶片，其中，該內電極包括一與預定菌種結合的抗體。
  8. 依據申請專利範圍第1項所述之可選擇地濃縮分離待測粒子的晶片，其中，該動力源可被控制地提供產生104~108V/m電場的交流電於該內電極和該外電極單元。
  9. 依據申請專利範圍第8項所述之可選擇地濃縮分離待測粒子的晶片，還包含至少一延伸電極單元，設置於該晶片本體上並具有一位於該分離空間中並與該第二外電極相間隔地環圍該第二外電極的第三外電極，及一位於該分離空間中並與該第三外電極相間隔地環圍該第三外電極的第四外電極，且該動力源與該第三外電極和該第四外電極電連接，並可被控制地提供產生104~108V/m電場的交流電於該內電極、外電極單元和該延伸電極單元。
  10. 依據申請專利範圍第9項所述之可選擇地濃縮分離待測粒子的晶片，其中，該內電極、外電極單元、延伸電極單元以陣列方式排列。
  11. 一種可選擇地濃縮分離待測粒子的方法，包含：(a)提供一包括多數第一粒子，及多數第二粒子的溶液；(b)將該溶液置於一晶片的一分離空間中；及(c)提供預定頻率和電壓的交流電於該晶片的一內電極，及一外電極單元的一第一外電極和一第二外電極，使所述的第一粒子和第二粒子其中一種受介電泳力與電流體動力作用分離並主要集中於該內電極。
  12. 依據申請專利範圍第11項所述之可選擇地濃縮分離待測粒子的方法，其中，該步驟(a)提供的溶液中，該第一微粒和第二微粒的平均粒徑是微米尺度等級且比值不小於1.5，及該第二微粒的平均粒徑是奈米尺度等級且該第一、二微粒的平均粒徑比值不小於10二者其中之一。
  13. 依據申請專利範圍第11項所述之可選擇地濃縮分離待測粒子的方法，其中，該步驟(b)中放置該溶液的該晶片的內電極、第一外電極，及第二外電極以同心環方式設置。
  14. 依據申請專利範圍第13項所述之可選擇地濃縮分離待測粒子的方法，其中，該步驟(b)中放置該溶液的該晶片的第一外電極，及第二外電極的寬度不相同。
  15. 依據申請專利範圍第13項所述之可選擇地濃縮分離待測粒子的方法，其中，該步驟(b)中放置該溶液的該晶片的內電極包括一奈米等級的粗糙附著面。
  16. 依據申請專利範圍第13項所述之可選擇地濃縮分離待測粒子的方法，其中，該步驟(b)中放置該溶液的該晶片 的內電極包括一與預定菌種結合的抗體。
  17. 依據申請專利範圍第13項所述之可選擇地濃縮分離待測粒子的方法，其中，該步驟(c)以一與該晶片電連接的動力源提供產生104~108V/m電場的交流電於該內電極和該外電極單元。
  18. 一種可選擇地濃縮分離待測粒子的晶片，包含：一晶片本體；一內電極；一外電極單元，環圍該內電極並具有一第一外電極，及一第二外電極，第一外電極及一第二外電極是以同心環的方式向外延伸且具不同寬度；及一動力源，與該內電極、該第一外電極和該第二外電極電連接，並提供相鄰電極的電場介於104~108V/m。
  19. 依據申請專利範圍第18項所述之可選擇地濃縮分離待測粒子的晶片，使一溶液中的第一微粒和第二微粒受介電泳力與電流體動力作用分離並主要集中於該內電極單元。
  20. 依據申請專利範圍第19項所述之可選擇地濃縮分離待測粒子的晶片，依據申請專利範圍第1項所述之可選擇地濃縮分離待測粒子的晶片，其中，該內電極是環形箔片，該第一外電極等間距地環圍該內電極，該第二外電極等間距地環圍該第一外電極。
  21. 依據申請專利範圍第20項所述之可選擇地濃縮分離待測粒子的晶片，其中，該第二外電極和第一外電極的寬度比不小於2.828，且該內電極與第一外電極的間距和該第一 外電極與第二外電極的間距比值不小於2.828。
  22. 依據申請專利範圍第21項所述之可選擇地濃縮分離待測粒子的晶片，其中，該內電極包括一奈米等級的粗糙附著面。
  23. 依據申請專利範圍第22項所述之可選擇地濃縮分離待測粒子的晶片，其中，該內電極包括一與預定菌種結合的抗體。
  24. 依據申請專利範圍第23項所述之可選擇地濃縮分離待測粒子的晶片，其中，該動力源可被控制地提供產生104~108V/m電場的交流電於該內電極和該外電極單元。
  25. 依據申請專利範圍第24項所述之可選擇地濃縮分離待測粒子的晶片，還包含至少一延伸電極單元，設置於該晶片本體上並環圍該外電極單元並包括一第三外電極，及一第四外電極，該第三、四外電極是以同心環的方式向外延伸且具不同寬度。
  26. 依據申請專利範圍第25項所述之可選擇地濃縮分離待測粒子的晶片，其中，該內電極、外電極單元、延伸電極單元以陣列方式排列。
  27. 一種可選擇地濃縮分離待測微粒的晶片，將一包括多數第一微粒，及多數第二微粒的溶液中的該等第一微粒與第二微粒分離並集中於預定區域，其中，該第一微粒和第二微粒的平均粒徑是微米尺度等級且比值不小於1.5，及該第二微粒的平均粒徑是奈米尺度等級且該第一、二微粒的平均粒徑比值不小於10二者其中之一，該晶片包含： 一晶片本體，具有一容置該溶液的分離空間；一內電極，設置於晶片本體上並位於該分離空間中；一外電極單元，設置於該晶片本體上並具有一位於該分離空間中並與該內電極相間隔地環圍該內電極的第一外電極，及一位於該分離空間中並與該第一外電極相間隔地環圍該第一外電極的第二外電極；及一動力源，與該內電極、該第一外電極和該第二外電極電連接，並可被控制地提供產生預定電場的交流電於該內電極和該外電極單元，而使所述的第一微粒和第二微粒受介電泳力與電流體動力作用分離並使所述第二微粒對應聚集於該內電極。
  28. 依據申請專利範圍第27項所述之可選擇地濃縮分離待測粒子的晶片，其中，該內電極是環形箔片，該第一外電極等間距地環圍該內電極，該第二外電極等間距地環圍該第一外電極。
  29. 依據申請專利範圍第28項所述之可選擇地濃縮分離待測粒子的晶片，其中，該第一外電極和第二外電極分別是寬度均一的圓環箔片，且該第一外電極的寬度小於第二外電極。
  30. 依據申請專利範圍第29項所述之可選擇地濃縮分離待測粒子的晶片，其中，該第二外電極和第一外電極的寬度比不小於2.828，且該內電極與第一外電極的間距和該第一外電極與第二外電極的間距比值不小於2.828。
  31. 依據申請專利範圍第30項所述之可選擇地濃縮分離待測 粒子的晶片，其中，該內電極包括一奈米等級的粗糙附著面。
  32. 依據申請專利範圍第31項所述之可選擇地濃縮分離待測粒子的晶片，其中，該內電極、該第一外電極，及該第二外電極其中至少一包括與預定菌種結合的抗體。
  33. 依據申請專利範圍第32項所述之可選擇地濃縮分離待測粒子的晶片，其中，該動力源可被控制地提供產生104~108V/m電場的交流電。
  34. 依據申請專利範圍第33項所述之可選擇地濃縮分離待測粒子的晶片，還包含至少一延伸電極單元，設置於該晶片本體上並具有一位於該分離空間中並與該第二外電極相間隔地環圍該第二外電極的第三外電極，及一位於該分離空間中並與該第三外電極相間隔地環圍該第三外電極的第四外電極，且該動力源與該第三外電極和該第四外電極電連接，並可被控制地提供產生預定電場的交流電於該內電極、該外電極單元和該延伸電極單元，而使所述第一微粒和第二微粒受介電泳力與電流體動力作用分離並使所述第二微粒對應聚集於該內電極。
  35. 依據申請專利範圍第34項所述之可選擇地濃縮分離待測粒子的晶片，其中，該第三外電極等間距地環圍該第二外電極，該第四外電極等間距地環圍該第三外電極。
  36. 依據申請專利範圍第35項所述之可選擇地濃縮分離待測粒子的晶片，其中，該第三外電極和第四外電極分別是寬度均一的圓環箔片，且該第三外電極的寬度小於第四外電 極。
  37. 依據申請專利範圍第36項所述之可選擇地濃縮分離待測粒子的晶片，其中，該第四外電極和第三外電極的寬度比不小於2.828，且該第二外電極和第三外電極的間距與該第三外電極和該第四外電極的間距比值不小於2.828。
  38. 依據申請專利範圍第37項所述之可選擇地濃縮分離待測粒子的晶片，其中，該第三外電極，及該第四外電極其中至少一包括與預定菌種結合的抗體。
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