PL241051B1 - Sposób osadzania mikroorganizmów lub komórek nowotworowych na platformie SERS przy użyciu efektu dielektroforetycznego i oznaczania mikroorganizmów lub komórek nowotworowych na platformie SERS - Google Patents

Abstract

Przedmiotem wynalazku jest sposób osadzania komórek nowotworowych lub bakterii na platformie SERS, obejmujący: przygotowanie platformy SERS, wprowadzenie zawiesiny bakterii, komórek nowotworowych w nośniku albo drożdży, przesyłanie sygnału elektrycznego do platformy SERS w celu osadzenia bakterii lub komórek nowotworowych na platformie, osuszenie platformy SERS z osadzonymi bakteriami lub komórkami nowotworowymi, rejestrację widma SERS, znamienny tym, w etapie a) platformę SERS umieszcza się w naczyniu pomiarowym i wprowadza się do naczynia pomiarowego przynajmniej jedną elektrodę metalową SERS, i w etapie c) przesyła się sygnał elektryczny do przynajmniej jednej elektrody metalowej SERS i platformy SERS w celu uzyskania ujemnego efektu dielektroforetycznego, i sygnał elektryczny do elektrody metalowej SERS i platformy SERS przesyła się w czasie od 1 do 600 s, przy czym sygnał elektryczny ma częstotliwość od 1 kHz do 50 MHz, przy czym napięcie międzyszczytowe sygnału elektrycznego wynosi od 1 Vpp do 50 Vpp.

Description

PL 241 051 B1

Opis wynalazku

Przedmiotem wynalazku jest sposób osadzania mikroorganizmów lub komórek nowotworowych dzięki ujemnemu efektowi dielektroforetycznemu w celu ich oznaczenia za pomocą techniki powierzchniowo wzmocnionej spektroskopii ramanowskiej na platformie SERS. Wynalazek znajduje zastosowanie w laboratoriach mikrobiologicznych.

Stan techniki

Powierzchniowo wzmacniany efekt Ramana (ang. Surface EnhancedRaman Scattering - SERS) został odkryty na początku lat 70. XX wieku przez Fleischmanna i współpracowników, którzy zaobserwowali silne wzmocnienie sygnału ramanowskiego dla pirydyny osadzonej na chropowatej powierzchni elektrody wykonanej ze srebra [1]. Zainteresowanie techniką SERS w naukach przyrodniczych wzrasta bardzo szybko ze względu na jej nieniszczący charakter, szybkość przeprowadzenia pomiarów oraz niezwykle wysoką czułość, która umożliwia identyfikację substancji o stężeniu 10^-12 mol/dm³, jak również pojedynczych cząsteczek DNA, białek, bakterii, wirusów czy krążących komórek nowotworowych w krwi [2, 3].

Aby zaobserwować efekt SERS, potrzebne jest podłoże metaliczne, najczęściej jest to złoto oraz srebro (także w postaci ich stopów), które wzmacnia sygnał ramanowski. Ponadto powierzchnia metalu musi posiadać nierówności (pofałdowania, uskoki) lub agregaty w skali nanometrowej, najczęściej pomiędzy 10 nm a 100 nm [4, 5]. Wzmocnienie sygnału wynosi od 104 do 106, choć odnotowano wzmocnienia większe niż 10¹⁰ razy [6, 7]. Wielkość wzmocnionego sygnału SERS zależy m.in. od: częstotliwości promieniowania wzbudzającego (długości fali lasera), efektywnego ramanowskiego przekroju czynnego, rodzaju badanego analitu (związku chemicznego lub materiału biologicznego), właściwości elektrycznych metalu, odległości cząsteczki od powierzchni oraz morfologii powierzchni (rozmiaru krystalitów i ich geometrii). Podłoża wykorzystywane do badań SERS można otrzymać m.in. poprzez metody elektrochemiczne, litograficzne, „szablonowe” czy wariacje metod chemicznego (CVD) i fizycznego (PVD) osadzania z fazy gazowej [8, 9]. Podłoża do badań SERS można w ogólności podzielić na dwie główne grupy: nanostrukturyzowane powierzchnie z metalu szlachetnego (Ag, Au, a także Cu, Pt, Pd) oraz nanostruktury na bazie nanocząstek i koloidów metali. Należy podkreślić, aby uzyskać platformę SERS wystarczy pokryć nanometrową warstwą złota lub srebra odpowiednią powierzchnię.

W celu odseparowania/nałożenia odpowiedniej ilość mikroorganizmów lub komórek nowotworowych i agregowania ich w jednym miejscu na platformie SERS można zastosować następujące metody:

II) filtracja mechaniczna: polegająca na zastosowaniu membran o odpowiednich rozmiarach porów, które umożliwiają zatrzymanie mikroorganizmów lub komórek nowotworowych na ich powierzchni, a które mogą jednocześnie stanowić podłoże SERS aktywne, jak również umożliwiać odprowadzenie zbędnych płynów [10],

III) separacja i/lub pułapkowanie magnetyczne: wykorzystujące nanocząstki magnetyczne, które dzięki odpowiedniej modyfikacji chemicznej są w stanie przyłączać się do bakterii lub komórek nowotworowych. Znajdujące się w zawiesinie nanocząstki złota lub srebra wzmacniają sygnał ramanowski [11], lub cząstki magnetyczne odpowiednio sfunkcjonalizowane mogą być jednocześnie separatorem i wzmacniać sygnał Ramana [12],

IIII) modyfikacje chemiczne powierzchni oraz samych mikroorganizmów: z wykorzystaniem powłok polimerowych, przeciwciał lub innych materiałów [13].

Możliwe jest również łączenie kilku metod separowania/osadzania mikroorganizmów lub komórek nowotworowych np. modyfikacja podłoża umożliwiająca celowane wyłapanie odpowiednich komórek, a następnie naniesienie ich dopiero na badane podłoże SERS [14, 15].

Jak już wspomniano wcześniej dielektroforeza może być uniwersalną techniką do wykrywania, analizy, separacji, frakcjonowania czy zagęszczania wszelkiego rodzaju materiałów w tym materiałów biologicznych. W odniesieniu do komórek nowotworowych pokazano możliwość zastosowania dielektroforezy do oceny oporności komórek nowotworowych na wybrane leki [20], odseparowywanie różnych rodzajów komórek nowotworowych od siebie np. prostaty i raka jelita grubego [21], piersi i okrężnicy [22] czy wyłapywanie krążących komórek nowotworowych z osocza krwi od pacjentów [17, 23].

PL 241 051 B1

W amerykańskim zgłoszeniu patentowym US2009/0229980A1 przedstawiono układ dielektroforetyczny, z odpowiednio zaprojektowanymi elektrodami, służący do charakterystyki i wykrywania zawieszonych cząstek stałych, w tym głównie materii biologicznej w tym m.in. wirusów, mikroorganizmów (np. bakterii) i komórek nowotworowych w małych objętościach bez konieczności stosowania znaczników chemicznych.

Pojawiają się już prace, które próbują połączyć osadzanie komórek bakteryjnych lub nowotworowych przy pomocy dielektroforezy, a następnie badanie ich przy pomocy spektroskopii Ramana lub powierzchniowo wzmacnianej spektroskopii Ramana.

W pracy l.-F. Cheng i innych przedstawiono układ mikroprzepływowy wykorzystujący zjawisko dielektroforezy z chropowatą metalową powierzchnią wykonaną na szkle do osadzania/detekcji/identyfikacji bakterii z próbek krwi przy pomocy SERS. Schropowacona metalowa powierzchnia (Cr/Au) wykonana na szkle stanowiła platformę SERS, a sortowanie i koncentracja bakterii wykonywana była za pomocą trójwymiarowej dielektroforezy. Pozwoliło to na uzyskanie dobrego wzmocnienia sygnału badanych bakterii gram-dodatnich i ujemnych, jaki i ich identyfikację [24].

W pracy H.-Y. Lin pokazano zintegrowane urządzenie mikroprzepływowe wykorzystujące efekt dielektroforetyczny oraz specjalnie przygotowane biosprzężone nanosondy SERS stanowiące platformę do wykrywania bakterii. Dzięki zastosowaniu takiego biosensora możliwa jest szybko identyfikacja nawet pojedynczej bakterii znajdującej się w zawiesinie [25].

W pracy U.-J. Schroder i inni przedstawili układ mikroprzepływowy łączący zjawisko dielektoforezy i spektroskopię Ramana. Po wstępnej filtracji próbek klinicznych pochodzących od pacjentów chorych na zakażenie dróg moczowych, zawieszoną próbkę pacjenta wstrzykuje się do układu mikroprzepływowego, w którym bakterie są wychwytywane przy użyciu siły dielektroforetycznej (co umożliwia bezpośrednią translacyjną manipulację bakteriami w zawiesinach z przestrzennymi niejednorodnymi polami elektrycznymi). W miejscach powstania skupisk bakterii rejestrowane są widma Ramana bezpośrednio z zawiesiny. Jak pokazano w tej pracy, ta konfiguracja może potencjalnie skrócić czas d iagnozy kluczowych parametrów o rzędy wielkości [26].

W pracy F.R. Madiyar i innych przedstawiono układ do określania stężenia, wykrywania i monitorowania patogenów, w szczególności bakterii, będący połączeniem zjawiska dielektroforezy z nanoznacznikami SERS, które przyłączały patogeny za pomocą immunochemii. Pozwoliło to na zarejestrowanie widma pojedynczej bakterii z czasem wychwytu bakterii przy pomocy DEP poniżej 60 sekund [27].

W polskim zgłoszeniu patentowym P.406900 opisano „matę polimerową wytworzoną metodą Forcespinningu, czyli wyciągania włókna polimerowego przy pomocy siły odśrodkowej, które następnie przy pomocy metody PVD zostały pokryte warstwą złota. Umożliwiło to bezpośrednie osadzenie bakterii z cieczy, a otrzymane widma SERS charakteryzowały się dużym wzmocnieniem sygnału ramanowskiego. Natomiast w polskim patencie PL232520B1 przedstawiono maty z włókien polimerowych napylone złotem, które stanowiły zarówno platformę SERS, jak również filtr, na które osadzono bakterii bezpośrednio z cieczy (woda, mocz, osocze czy sok z jabłek) przy wykorzystaniu podciśnienia.

Głównym wyzwaniem w przypadku podłoży SERS jest uzyskanie wysokiego współczynnika wzmocnienia (ang. Enhancement Factor- EF) przy zapewnieniu im jednorodnej, powtarzalnej struktury przy niskich kosztach samego procesu wytwarzania takiego podłoża, jak również jego stabilność przez określony czas (np. miesiąc). W przypadku osadzania materiałów biologicznych (m.in. bakterie, wirusy, komórki nowotworowe) problemem jest również sposób osadzenia/nakładania ich na podłożach do badań, który w przypadku materiałów biologicznych zapewniałby ich dużą gęstość, dzięki czemu otrzymany sygnał charakteryzowałby się dużym wzmocnieniem. W publikacjach naukowych i patentach/zgłoszeniach patentowych nie ma informacji o optymalnym sposobie nakładania bakterii na podłoże wykorzystywane w pomiarach SERS. W przypadku próbek klinicznych kolejną przeszkodą jest niskie stężenie mikroorganizmów w płynach ustrojowych, które utrudnia wykrycie ich bezpośrednio w zawiesinie, dlatego też istotne jest wyłapanie/odseparowanie i zwiększenie gęstości badanych mikroorganizmów lub komórek nowotworowych z roztworów, w których są zawieszone (sól fizjologiczna, osocze, krew, mocz, płyn mózgowo-rdzeniowy i inne). Dodatkowo znane rozwiązanie często wymagają stosowani filtrów, pułapkowania czy modyfikacji chemicznej/biochemicznej powierzchni naczyń pomiarowych lub mikroorganizmów. Niespodziewanie powyższe problemy rozwiązał prezentowany wynalazek.

Celem wynalazku jest opracowanie metody osadzania mikroorganizmów lub komórek nowotworowych na platformie SERS z wykorzystaniem ujemnego efektu dielektroforetycznego (n-DEP) i oznaczania mikroorganizmów lub komórek nowotworowych z wykorzystaniem tych platform.

PL 241 051 B1

Istota wynalazku

Przedmiotem wynalazku jest sposób osadzania mikroorganizmów lub komórek nowotworowych na platformie SERS przy użyciu efektu dielektroforetycznego i oznaczania mikroorganizmów lub komórek nowotworowych na platformie SERS, obejmujący:

a) przygotowanie platformy SERS,

b) wprowadzenie zawiesiny mikroorganizmów albo komórek nowotworowych w nośniku do naczynia pomiarowego,

c) przesyłanie sygnału elektrycznego do platformy SERS i elektrody metalowej SERS w celu osadzenia mikroorganizmów albo komórek nowotworowych na platformie SERS, d) osuszenie platformy SERS z mikroorganizmami albo komórkami nowotworowymi, e) rejestrację widma SERS, znamienny tym, w etapie a) platformę SERS umieszcza się w naczyniu pomiarowym i wprowadza się do naczynia pomiarowego przynajmniej jedną elektrodę metalową SERS, i w etapie c) przesyła się sygnał elektryczny do przynajmniej jednej elektrody SERS i platformy SERS w celu uzyskania ujemnego efektu dielektroforetycznego, i sygnał elektryczny do elektrody metalowej i platformy SERS przesyła się w czasie od 1 do 600 s, przy czym sygnał elektryczny ma częstotliwość od 1 kHz do 50 MHz, przy czym napięcie międzyszczytowe sygnału elektrycznego wynosi od 1 Vpp do 50 Vpp.

W korzystnej realizacji wynalazku nośnik stanowi woda, bufor PBS, płyn ustrojowy pochodzenia ludzkiego albo zwierzęcego wybrany z grupy obejmującej: krew, osocze, płyn mózgowo-rdzeniowy albo mocz.

W następnej korzystnej realizacji wynalazku napięcie międzyszczytowe wynosi od 5 Vpp do 30 Vpp, a najkorzystniej od 10 Vpp do 20 Vpp.

W kolejnej korzystnej realizacji wynalazku sygnał elektryczny ma częstotliwość korzystniej w zakresie od 10 kHz do 20 MHz, a najkorzystniej w zakresie od 100 kHz do 10 MHz.

W jeszcze innej korzystnej realizacji wynalazku sygnał elektryczny do elektrody metalowej SERS przesyła się w czasie od 10 s do 360 s, a najkorzystniej pomiędzy od 30 s do 60 s.

W kolejnej korzystnej realizacji wynalazku sygnał elektryczny do elektrody metalowej SERS przesyła się w czasie 60 s.

W następnej korzystnej realizacji wynalazku sygnał elektryczny przesyłany do przynajmniej jednej elektrody metalowej SERS i platformy SERS ma kształt sinusoidalny.

W innej korzystnej realizacji średnica przynajmniej jednej elektrody metalowej SERS ma średnicę od 10 μm do 2 mm, korzystniej od 20 μm do 1 mm, a najkorzystniej od 50 μm do 500 μm. Im mniejsza średnica tym większy gradient pola elektrycznego, ale średnicy nie można zmniejszać w nieskończoność, gdyż od elektrody wymagana jest pewna sztywność ułatwiająca jej montaż i zwiększająca wytrzymałość mechaniczną.

W innej korzystnej realizacji wynalazku średnica elektrody metalowej SERS wynosi 340 μm.

Korzystnie po osadzeniu mikroorganizmów lub komórek nowotworowych, wyjmuje się platformę i odparowuje nośnik w temperaturze pokojowej albo podwyższonej. Zaleca się, by w trakcie osadzania nośnik, w którym osadzone są mikroorganizmy lub komórki nowotworowe, przykrywał platformę.

W innej korzystnej realizacji wynalazku naczynie pomiarowe stanowi cylindryczny pojemnik z tworzywa sztucznego albo szkła, wybrany z grupy obejmującej: probówkę, fiolkę, tuleję.

W kolejnej innej korzystnej realizacji wynalazku naczynie pomiarowe stanowi układ mikrofluidyczny.

W kolejnej korzystnej realizacji wynalazku układ mikrofluidyczny obejmuje dwa wloty cieczy nośnika, połączone z mieszalnikiem, które są połączone z kanałem do separacji komórek nowotworowych lub bakterii z nośnika, połączonego z komorą platformy SERS.

W następnej korzystnej realizacji wynalazku do komory platformy SERS układu mikrofluidycznego wprowadza się cztery elektrody metalowe SERS, przy czym elektrody metalowe SERS wprowadza się przez kanały w komorze SERS prostopadłe względem siebie, i elektrody metalowe SERS wprowadza się powyżej platformy SERS.

W innej korzystnej realizacji wynalazku odległość pomiędzy końcami elektrod metalowych wprowadzonych do komory platformy SERS wynosi nie więcej niż 1 mm, korzystnie 0,5 mm. Im odległość jest mniejsza, tym efektywniej baterie/komórki nowotworowe osadzają się na platformie. Przy odległości mniejszej niż 0,5 mm pomiędzy elektrodami może dojść do zwarcia w układzie pomiarowym.

W kolejnej korzystnej realizacji wynalazku przynajmniej jedną elektrodę metalową SERS wprowadza się równolegle do przynajmniej jednej osi naczynia pomiarowego. Przez oś naczynia pomiarowego można rozumieć, w przypadku naczynia o kształcie cylindrycznym, oś, odpowiadającą osi symetrii

PL 241 051 Β1 obrotowej naczynia pomiarowego. Natomiast w przypadku, gdy naczyniem pomiarowym jest układ mikrofluidyczny, przez oś naczynia pomiarowego można rozumieć przynajmniej jedną oś równoległą i pokrywająca się z kanałem do wprowadzania elektrody metalowej SERS do komory platformy SERS.

W jeszcze kolejnej korzystnej realizacji wynalazku platformę SERS stanowi elastyczna folia poddana dielektrycznemu wyładowaniu barierowemu, korzystnie z poli(tereftalanu etylenu), pokrytego warstwą tlenku indowo-cynowego, na który została naniesiona warstwa srebra, złota albo stopu złoto-srebro.

W następnej korzystnej realizacji wynalazku sygnał elektryczny podaje się z generatora zmiennoprądowego.

W jeszcze następnej korzystnej realizacji wynalazku komórki nowotworowe są wybrane z grupy obejmującej komórki: K562 białaczki szpikowej, HT-29 gruczolakoraka jelita grubego (0,1 Sm^-1), BxPC3 raka trzustki, MCF7 raka piersi, HeLa raka szyjki macicy, LNCaP gruczolakoraka prostaty albo MBA-MD-231 raka piersi.

W kolejnej innej korzystnej realizacji wynalazku mikroorganizmy są wybrane z grupy obejmującej bakterie.

W następnej korzystnej realizacji wynalazku bakterie stanowią bakterie gram ujemne.

W jeszcze następnej korzystnej realizacji wynalazku bakterie gram ujemne są wybrane z grupy obejmującej: Escherichia coli K.38, Escherichia coli 5K albo Escherichia coli DoubleShell prolate.

W innej korzystnej realizacji wynalazku drożdże są wybrane z grupy obejmującej: Saccharomyces cerevisiae albo Saccharomyces cerevisiae.

W jeszcze innej korzystnej realizacji wynalazku platforma SERS ma kształt dopasowany do kształtu naczynia pomiarowego.

W następnej innej korzystnej realizacji wynalazku platforma SERS ma kształt litery „L”.

W celu osadzenia wybranych mikroorganizmów lub komórek nowotworowych wykorzystano w wynalazku zjawisko dielektroforezy (DEP), które stanowi podstawową technologię do separacji cząsteczek w oparciu o ich manipulację w niejednolitych polach elektrycznych.

Zjawisko dielektroforetyczne zostało opisane w latach 50. XX wieku przez Pohla, który opisał ruch cząsteczek w niejednorodnym polu elektrycznym [16]. Dielektroforeza polega na ruchu obiektów spowodowanym przyłożeniem niejednorodnego zmiennego pola elektrycznego. Pod wpływem działania tego pola obiekt porusza się w kierunku większego zagęszczenia linii pola elektrycznego (dielektroforeza dodatnia, p-DEP) lub w kierunku obszaru o mniejszym zagęszczeniu linii pola elektrycznego (dielektroforeza ujemna, n-DEP). Co istotne, w przypadku dielektroforezy, w odróżnieniu do elektroforezy, obiekt nie musi posiadać ładunku elektrycznego na swojej powierzchni. Bardziej szczegółowo zjawisko dielektroforezy można opisać następująco. Stacjonarne niejednorodne pole elektryczne E działające na sferyczną cząsteczkę umieszczoną w ciekłym medium o przenikalności elektrycznej e_m powoduje działanie siły dielektroforetycznej, którą opisujemy równaniem (1):

^dep = ^³£_mf_CM^\E\ , (1) gdzie f_CM jest rzeczywistą częścią czynnika Claussiusa-Mossottiego, który zawiera informację o właściwościach dielektrycznych, tj. przenikalności elektrycznej oraz przewodnictwie elektrycznym medium i obiektów w nich umieszczonych [17]:

gdzie:

E - natężenie pola elektrycznego (V/m), r - promień obiektu (np. bakterii lub komórki nowotworowej), ε_ρ - przenikalność elektryczna obiektu, e_s- przenikalność elektryczna cieczy, w której zawieszone są obiekty.

Pierwsze próby wykorzystania tego zjawisko dla materiałów biologicznych (drożdży) do segregacji komórek żywych i martwych zostały pomyślnie wykonane w latach 60. XX wieku przez Pohla [18]. W celu segregacji różnego rodzaju cząsteczek wykorzystuje się różnice w ich wielkość jak również właściwościach dielektrycznych (przewodnictwo i/lub przenikalność elektryczną) [19]. Należy w odpowiedni sposób dobrać parametry procesu w tym częstotliwość zmiennego pola elektrycznego, jego natężenie oraz przewodnictwo elektryczne medium, w którym zawieszone są obiekty.

PL 241 051 B1

Sposób wg wynalazku umożliwia uzyskanie dużej gęstości materiału badanego (komórki, mikroorganizmy) na podłożu SERS, przy niskim jego stężeniu w badanej próbce, przy czym samo podłoże SERS zapewnia duże wzmocnienie sygnału mierzonego. Ponadto rozwiązanie wg wynalazku umożliwia przeprowadzenie procesu osadzania w prosty i niskokosztowy sposób niezależnie od rodzaju próbki biologicznej. Przy czym do osadzenia nie jest konieczne wykorzystywanie dodatkowych środków (filtry, pułapkowanie czy modyfikacja chemiczna/biochemiczna powierzchni naczyń pomiarowych lub mikroorganizmów).

Wynalazek zostanie teraz bliżej przedstawiony w korzystnych przykładach wykonania, z odniesieniem do załączonego rysunku, przy czym w celu zobrazowania realizacji sposobu według wynalazku elementy zostały ponumerowane, tak by elementowi, pełniącemu tę samą funkcję w każdym przykładzie realizacji, odpowiadało podobne oznaczenie, np. w pierwszym przykładzie realizacji elektroda metalowa jest oznaczona jako 1-2, a w drugim przykładzie realizacji 2-2, z kolei w przykładzie trzecim elektrody metalowe są oznaczone jako 3-2 itd. Na rysunku przedstawiono:

Fig. 1 Wykres rzeczywistej części czynnika Claussiusa-Mossottiego (CM, wyrażenie 2.) w zależności od częstotliwości przemiennego pola elektrycznego. (a) Wykres dla komórki nowotworowej HeLa. Ujemny efekt dielektroforetyczny występuje dla częstotliwości poniżej 347 kHz; (b) wykres dla bakterii Escherichia coli. Ujemny efekt dielektroforetyczny występuje dla częstotliwości poniżej 304 kHz. Obliczenia zostały wykonane dla komórki nowotworowej HeLa i bakterii E. coli umieszczonej w 10-krotnie rozcieńczonym wodnym roztworze buforowanej fosforanem soli fizjologicznej (PBS) o pH = 7.4. Na wykresach zaznaczono pionową przerywaną linią częstotliwość przejścia pomiędzy ujemnym DEP (n-DEP) a dodatnim DEP (p-DEP);

Fig. 2 Schemat ideowy korzystnego wykorzystania zjawiska dielektroforezy do osadzania mikroorganizmów lub komórek nowotworowych w geometrii cylindrycznej. (a) Korzystna realizacja elastycznej elektrody będącej równocześnie platformą SERS, w kształcie litery L 1-1. W dolnej części znajduje się folia PET/ITO poddana wyładowaniu DBD, która jest aktywna SERS-owsko 1-1-1. Cześć górna 1-1-2 jest pokryta warstwą przewodzącego metalu, dzięki czemu możliwe jest podłączenie do niej sygnału z generatora funkcji (1-6). Szerokość a jest definiowana przez promień R cylindra 1-3, w którym są umieszczane elektrody. (b) Użycie platformy SERS do osadzania bakterii lub komórek nowotworowych. W osi cylindra jest włożona elektroda metalowa SERS 1-2, o średnicy znacznie mniejszej niż średnica użytego cylindra 1-3. Obie elektrody: elastyczna elektroda, będąca platformą SERS 1-1, i elektroda metalowa SERS 1-2, są podłączane do źródła zmiennego pola elektrycznego (generatora funkcyjny, SIGLENT, SDG 2042X) 1-6. Przy braku sygnału (OFF) (fig. 2a) bakterie lub komórki nowotworowe 1-4 są swobodnie zawieszone w cieczy 1-5. Po włączeniu pola elektrycznego (ON) (fig. 2b) siła DEP powoduje ich osadzenie na elastycznej elektrodzie 1-1, a konkretnie na części aktywnej SERS-owsko 1-1-1 znajdującej się na ściance cylindra. (c) Rozkład pola elektrycznego w geometrii cylindrycznej wyliczony numerycznie przy pomocy metody elementów skończonych (Vpp = 20 V);

Fig. 3 Zdjęcia zestawu eksperymentalnego z fig. 2. (a) Generator funkcyjny (SIGLENT, SDG 2042X) 1-6 będący źródłem zmiennego pola elektrycznego jest podłączony do układu eksperymentalnego, w którym znajdują się dwie elektrody: elektroda metalowa SERS 1-2 w osi fiolki oraz elektroda elastyczna (folia PET/ITO/Ag) będąca platformą SERS 1-1. (b) Fiolka 1-3 wypełniona cieczą zawierającymi bakterie. Do elektrod poprzez zaciski elektryczne jest podłączony generator funkcji 1-6;

Fig. 4 Uśrednione widma komórek LNCaP (gruczolakoraka prostaty pochodzącymi z przerzutów do lewego nadobojczykowego węzła chłonnego 50-letniego mężczyzny), uzyskanej na elastycznej folii PET/ITO poddanej dielektrycznemu wyładowaniu barierowemu, a następnie pokrytej warstwą srebra o grubości 70 nm, dla przykładu pierwszej korzystnej realizacji wynalazku geometria cylindryczna; LNCAp - linia ludzkich komórek gruczolakoraka prostaty pochodzącymi z przerzutów do lewego nadobojczykowego węzła chłonnego 50-letniego mężczyzny (pobrane w 1977 r.);

Fig. 5 Schemat ideowy korzystnego wykorzystania zjawiska dielektroforezy do osadzania mikroorganizmów lub komórek nowotworowych na platformie SERS o powierzchni ograniczonej cylindrem 2-3, pustym w środku o wysokości kilku mm. (a) Podłoże stanowi folia PET/ITO/Ag 2-1, jako drugą elektrodę wykorzystuje się ostro zakończoną elektrodę metalową SERS 2-2. Do obu elektrod doprowadzony jest sygnał elektryczny z generatora funkcji 2-6. Gdy napięcie jest

PL 241 051 B1 wyłączone (OFF) (fig. 5) w obszarze ograniczonym ściankami cylindra 2-3 znajdują się swobodnie zawieszone bakterie 2-4 lub komórki nowotworowe 2-4. Po włączeniu napięcia (ON) (fig. 5) siła DEP powoduje przesunięcie bakterii lub komórek nowotworowych na powierzchnię platformy SERS 2-1. (b) Rozkład pola elektrycznego pomiędzy ostro zakończoną elektrodą metalową SERS 2-2 a platformą SERS 2-1 obliczony numerycznie przy pomocy metody elementów skończonych (Vpp = 20 V);

Fig. 6 (a) Zdjęcie zestawu eksperymentalnego pokazanego na fig. 5. (b) Zbliżenie na platformę SERS

2-1, cylinder ograniczającą wypływ cieczy (2-3) oraz ostro zakończoną metalową elektrodę SERS 2-2. Zmienny sygnał elektryczny jest podawany poprzez zaciski elektryczne z generatora funkcji 2-6. (c) Zdjęcie wykonane przy pomocy Skaningowego Mikroskopu Elektronowego (SEM) końca metalowej elektrody SERS 2-2;

Fig. 7 Uśrednione widma SERS komórek nowotworowych raka szyjki macicy HeLa, uzyskane na elastycznej folii PET/ITO poddanej dielektrycznemu wyładowaniu barierowemu, a następnie pokrytej warstwą srebra o grubości 70 nm dla przykładu drugiego korzystnej realizacji wynalazku platforma SERS z ograniczoną geometrią;

Fig. 8 Zdjęcie układu mikroprzepływowego zawierającego: 3-3 - komorę pomiarową, 3-7 - kanały na metalowe elektrody (dielektroforetyczne osadzanie bakterii lub komórek nowotworowych na powierzchni platformy SERS), 3-8 - wloty do podawania cieczy, 3-9 - mieszalnik mikroprzepływowy, 3-10 - kanały na metalowe elektrody wstępne (wstępna separacja bakterii lub komórek nowotworowych przy pomocy efektu DEP), 3-11 - wylot cieczy z układu mikroprzepływowego, 3-12 - wylot cieczy z komory pomiarowej, 3-13 - kanał łączący kanał wstępnej separacji z komorą pomiarową, 3-14 - kanał do wstępnej separacji bakterii lub komórek nowotworowych przy pomocy efektu DEP);

Fig. 9 Schemat ideowy korzystnego wykorzystania zjawiska dielektroforezy do osadzania mikroorganizmów lub komórek nowotworowych z pułapki dielektoforetyczej. (a) Pułapka składa się z płytki poliwęglanowej, w której wyfrezowana jest komora 3-3 oraz cztery kanały 3-7 doprowadzające do niej metalowe elektrody 3-2. Na dnie komory znajduje się platforma SERS 3-1 (folia PET/ITO/Ag), nad nią znajdują się cztery ostro zakończone elektrody metalowe SERS 3-2 (patrz fig. 5b). Do elektrod doprowadzany jest sygnał z dwóch generatorów funkcyjnych 3-6 lub z jednego generatora posiadającego dwa niezależne kanały. (b) Przekrój przez układ ukazujący komorę 3-3 z platformą SERS 3-1 oraz elektrodami metalowymi 3-2 znajdującymi się nad platformą SERS. Odległość między elektrodą metalową a platformą SERS powinna wynosić 0,5 mm lub więcej. (c) Na skutek zmiennego pola elektrycznego o odpowiedniej częstotliwości na bakterie lub komórki nowotworowe działa siła dielektroforetyczna (n-DEP) skierowana w obszar pomiędzy ostro zakończonymi elektrodami 3-2, gdzie bakterie/komórki nowotworowe się gromadzą 3-4. (d) Rozkład pola elektrycznego pomiędzy elektrodami obliczony numerycznie przy pomocy metody elementów skończonych (Vpp = 20 V);

Fig. 10 (a) Zdjęcie zestawu eksperymentalnego zawierającego układ mikroprzepływowy z fig. 9, metalowe elektrody oraz zaciski elektryczne biegnące do wyjścia generatora funkcyjnego. (b) Fragment układu mikroprzepływowy z fig. 8, zawiera kanał 3-13, w którym płynie ciecz z zawieszonymi bakteriami lub komórkami nowotworowymi. Wpływa ona do komory 3-3, do której doprowadzone są cztery kanały 3-7 służące do wprowadzania metalowych elektrod 3-1. (c) W celu pomiaru na dnie komory 3-3 umieszcza się platformę SERS 3-1 w postaci folii PET/ITO pokrytej warstwą srebra, a przez kanały wprowadza się metalowe elektrody SERS 3-2. Do komory wpływa roztwór zawierający bakterie lub komórki nowotworowe, a wypływa poprzez wylot (3-12). Po włączeniu zmiennego pola elektrycznego bakterie gromadzą się na powierzchni platformy SERS 3-1, pomiędzy końcami elektrod (patrz fig. 9c) na skutek odziaływania siły dielektroforetycznej;

Fig. 11 Uśrednione widma bakterii Escherichia coli gram (-), uzyskanej na elastycznej folii PET/ITO poddanej dielektrycznemu wyładowaniu barierowemu, a następnie pokrytej warstwą srebra o grubości 70 nm dla przykładu trzeciego korzystnej realizacji wynalazku układ czterech elektrod (pułapka dielektroforetyczna).

Przykład 1: geometria cylindryczna

Sposób przygotowania elastycznych platform SERS na bazie foli PET o grubości 125 μm pokrytej warstwą ITO o grubości 5 μm, poddanej dielektrycznemu wyładowaniu barierowemu (DBD) i pokrytej cienką warstwą metalu (srebra, złota, miedzi, srebra pokrytego warstwą złota, stopu srebra ze złotem

PL 241 051 Β1 lub miedzi pokrytej warstwą złota). Platforma SERS jest przedmiotem polskiego zgłoszenia patentowego o numerze P.430767.

Sposób osadzania mikroorganizmów lub komórek nowotworowych opiera się na wykorzystaniu platformy SERS w postaci elastycznej folii na bazie PET/ITO pokrytej warstwą srebra, umożliwiający umieszczenie jej w pojemniku o kształcie cylindrycznym (szklana fiolka lub mata probówka). Po przyłożeniu zmiennego pola elektrycznego między platformę SERS, a drugą elektrodę będącą w osi pojemnika, na obiekty działa ujemny efekt dielektroforetyczny (n-DEP), czyli siła dielektroforetyczna skierowana w kierunku platformy SERS. Powoduje ona ruch bakterii lub komórek nowotworowych w kierunku platformy SERS, a w konsekwencji ich tam osadzenie. Częstotliwość przejścia (/przejścia), gdzie /przejścia to Re[CM(f)] = 0, wylicza sieją numerycznie, korzystając z zależności części rzeczywistej czynnika Claussiusa-Mossottiego od częstotliwości przykładanego zmiennego pola elektrycznego (fig. 1). Przykładowy wykres wartości rzeczywistej czynnika Claussiusa-Mossottiego dla komórki nowotworowej HeLa pokazany jest na fig. 1a. Częstotliwość przejścia pomiędzy ujemnym efektem DEP a dodatnim efektem DEP dla komórek HeLa to 347 kHz. By uzyskać ujemny efekt dielektroforetyczny (n-DEP) w układzie musimy zastosować częstotliwość niższą niż 347 kHz. W przypadku komórek nowotworowych LNCaP częstotliwość 1 MHz zapewniała zaistnienie efektu n-DEP. Częstotliwość przejścia /przejścia została zaczerpnięta z literatury, pozycja [21]. Przykładowe, obliczone częstotliwości przejścia dla różnych mikroorganizmów przedstawiono w tabelach poniżej.

Tabela 1

Częstotliwości przejścia dla linii nowotworowych wyliczone dla x10 rozcieńczonego PBS, wyliczenia przeprowadzone przy pomocy programu myDEP

Linie nowotworowe	Częstotliwość przejścia /przejścia {kHz)
K562 białaczka szpikowa	716
HT-29 gruczolakorak jelita grubego (0,1 Sm1)	897
BxPC3 komórki raka trzustki	182
MCF7 komórki raka piersi	197
HeLa komórki raka szyjki macicy	348
LNCaP komórki gruczolakoraka prostaty	20 000*
MBA-MD-231 komórki raka piersi	228

* częstotliwość przejścia dla linii komórkowej LNCaP została zaczerpnięta z pozycji [21]

Tabela 2

Częstotliwości przejścia dla bakterii wyliczone dla x10 rozcieńczonego PBS, wyliczenia przeprowadzone przy pomocy programu myDEP

Bakterie	Częstotliwość przejścia /przejścia (^Hz)
Escherichia coli K.38	305
Escherichia coli 5K	1590
Escherichia coli (DoubleShell prolate)	1130

PL 241 051 Β1

Tabela 3

Częstotliwości przejścia dla drożdży wyliczone dla x10 rozcieńczonego PBS, wyliczenia przeprowadzone przy pomocy programu myDEP

Drożdże	Częstotliwość przejścia /przejścia (kHz)
Saccharomyces cerevisiae	4790
Saccharomyces cerevisiae expressing 5te2p	4250

Platforma SERS ma kształt litery L 1-1 i jest przedstawiona na fig. 2a. Górna część folii PET/ITO 1-1-2 stanowi jedną z elektrod, do której przykłada się pole elektryczne, natomiast dolna część 1-1-1 stanowi właściwą platformę SERS, na którą osadzane będą mikroorganizmy/komórki nowotworowe. Proces osadzania bakterii lub komórek nowotworowych jest schematycznie pokazany na fig. 2b. Długość dolnej części platformy a jest wyliczana na podstawie promienia R cylindrycznego pojemnika (a = 2kR). Druga elektroda (elektroda metalowa SERS) w postaci cienkiego stalowego drutu (1 -2) umieszczana jest wzdłuż osi cylindrycznego naczynia. Pomiędzy elektrodami tworzy się duży gradient pola elektrycznego, wymagany w procesie dielektroforezy. Rozkład pola elektrycznego wyliczony numerycznie prezentuje fig. 2c.

Komórki nowotworowe LNCaP zostały zawieszone w 10-krotnie rozcieńczonym roztworze PBS o przewodności 156 mS m^-1. Do cylindrycznej szklanej probówki o średnicy 9,5 mm włożono folię PET/ITO w kształcie litery L dłuższym boku o wymiarach 30,0 mm χ 3,0 mm. Krótszy bok, stanowiący właściwą platformę SERS miał wymiary 7,0 mm χ 7,0 mm. Do probówki wprowadzono 250 pi 10-krotnie rozcieńczony wodny roztwór PBS-u zawierającego komórki nowotworowe. Objętość cieczy była tak dobrana, by całkowicie zakryć platformę SERS.

W celu osadzenia komórek nowotworowych LNCaP na platformie SERS pomiędzy elektrodę będącą platformą SERS a elektrodą ze stalowego drutu w osi probówki podano zmienny sygnał elektryczny. Elektroda stalowa może mieć średnicę od 10 pm do 2 mm, przy czym korzystniej gdy ta średnica wynosi od 20 pm do 1 mm, a najkorzystniej od 50 pm do 500 pm. W eksperymencie stosowano elektrodę stalową o średnicy 340 pm. Sygnał sinusoidalny o częstotliwości 1 MHz (wartość wyliczono numerycznie dla konkretnych wartości fizykochemicznych komórek nowotworowych LNCaP oraz przewodności elektrycznej buforu) oraz napięciu międzyszczytowe wynoszącym 10 V_PP. Optymalny czas osadzania (dobrany eksperymentalnie) wynosił 60 sekund. Układ eksperymentalny wraz z generatorem funkcyjnym Siglent SDG 2042Χ (1-6) użytym do osadzania komórek nowotworowych LNCaP przedstawiony jest na fig. 3.

Po 60 sekundach platformę wyjęto z probówki, osuszono w temperaturze pokojowej albo podwyższonej (T > 30°C) i poddano rejestracji widma SERS. W celu przeprowadzenia pomiarów wykorzystano spektrometr ramanowski Bruker Bravo wyposażony w technologię Duo Laser™. Długość fali lasera wynosiła pomiędzy 700 nm a 1100 nm, a moc poniżej 100 mW. Widma zarejestrowano, stosując 3 akumulacje po 6000 ms każda, po czym je uśredniono.

Tabela 4

Wpływ czasu osadzania na intensywność sygnałów ramanowskich dla bakterii E. coli i komórki nowotworowej LNCaP

Badane układy	Czas osadzania (sekundy)	Intensywność pasma diagnostycznego 731 cm1 dla E. coli i 650 cm1 dla LNCaP (liczba zliczeń)
Escherichia coli K.38	30	18500
60	15400
180	10200
LNCaP komórki gruczolakoraka prostaty	30	12000
60	8500
180	4700

PL 241 051 B1

Uśrednione widmo komórek nowotworowych LNCaP osadzonych na platformie SERS przy pomocy efektu dielektroforetycznego (n-DEP) przedstawione jest na fig. 4.

Przykład 2: platforma SERS z ograniczoną geometrią

W przypadku próbek o małej objętości zawierających bakterie lub komórki nowotworowe zaproponowano inną metodę ich osadzania przy wykorzystaniu efektu dielektroforetycznego.

Metoda polega na wykorzystaniu folii PET/ITO/Ag, na której od strony warstwy srebra przymocowano tuleję z tworzywa sztucznego o średnicy 5 mm i grubości ścianki 1 mm. Tuleję z zewnątrz uszczelnia się małą ilością dwuskładnikowego kleju. Do wnętrza tulei wprowadza się ciecz z zawieszonymi bakteriami lub komórkami nowotworowymi 2-4, a od góry, w osi tulei, ostro zakończoną, elektrodę metalową SERS 2-2. Elektroda musi zostać wprowadzona do cieczy, lecz nie może dotykać warstwy srebra. Schemat ideowy przedstawionego rozwiązania ukazany jest na fig. 5. Do dolnej elektrody (platforma SERS) 2-1 oraz ostro zakończonej elektrody metalowej SERS 2-2 podłącza się generator funkcyjny 2-6. Gdy wyjście generatora nie jest aktywne (fig. 5a, OFF) w cieczy są swobodnie zawieszone bakterie lub komórki nowotworowe. Gdy wyjście generatora jest aktywne (fig. 5a, ON), pomiędzy platformą SERS 2-1 a ostro zakończoną metalową elektrodą SERS 2-2 (zdjęcie SEM pokazane na fig. 6c) występuje zmienne pole elektryczne o dużym gradiencie. Za gradient ten odpowiada ostro zakończona elektroda metalowa (rozkład pola elektrycznego wyliczony numerycznie przy pomocy metody elementów skończonych przedstawia fig. 5b). Dzięki temu na bakterie lub komórki nowotworowe działa siła dielektroforetyczna skierowana w kierunku platformy SERS (n-DEP), powodująca ruch i osadzenie obiektów na powierzchni platformy.

W eksperymencie na elastycznej platformie SERS o wymiarach 7,0 mm χ 7,0 mm przymocowano tuleję ograniczającą 2-3 o średnicy 5 mm. Do tulei wprowadzono 70 μl roztworu 10-krotnie rozcieńczonego roztworu PBS-u zawierającego komórki nowotworowe HeLa. Zestaw eksperymentalny prezentuje fig. 6a i 6b. Przewodnictwo roztworu wynosiło 156 mSm^-1. W celu osadzenia komórek nowotworowych HeLa przy wykorzystaniu zjawiska n-DEP zastosowano sinusoidalny sygnał o częstotliwości 300 kHz oraz napięcie międzyszczytowe wynoszące 10 Vpp. Optymalny czas osadzania (ustalony eksperymentalnie) wynosił 60 sekund.

Częstotliwość, dla której zachodzi n-DEP, wyznaczono na podstawie wykresu rzeczywistej części czynnika Claussiusa-Mossottiego (CM) w zależności od częstotliwości przyłożonego prądu przemiennego działającą na komórkę HeLa umieszczone w wodnym roztworze buforowanej fosforanem soli fizjologicznej pH = 7.4 (PBS, rozcieńczony χ10). Wykres ten prezentuje fig. 1a. Zaznaczono na nim częstotliwość przejścia pomiędzy ujemnym DEP (n-DEP) a dodatnim DEP (p-DEP), który dla tego układu wynosi 347 kHz. Zastosowanie częstotliwości 300 kHz zapewnia zatem, że na obiekty zadziała n-DEP kierujący je na platformę SERS.

Po 60 sekundach platformę osuszono i poddano rejestracji widma SERS. W celu przeprowadzenia pomiarów wykorzystano spektrometr ramanowski Bruker Bravo wyposażony w technologię Duo Laser™. Długość fali lasera wynosiła pomiędzy 700 nm a 1100 nm, a moc poniżej 100 mW. Widma zarejestrowano stosując 3 akumulacje po 6000 ms każda, po czym je uśredniono.

Uśrednione widmo komórek nowotworowych HeLa osadzonych na platformie SERS przy pomocy efektu dielektroforetycznego (n-DEP) przedstawione jest na fig. 7.

Zaproponowany sposób może zostać zastosowany do dowolnej platformy SERS: na bazie krzemu, paneli fotowoltaicznych, membran etc.

W przypadku materiału, który będzie hydrofobowy nie będzie konieczne stosowanie ścianek ograniczających ciecz, gdyż sformuje ona sferyczną kroplę.

Przykład 3: układ z czterema elektrodami - pułapka dielektroforetyczna

Efekt dielektroforetyczny jest atrakcyjnym mechanizmem do separacji bakterii lub komórek nowotworowych z wody, moczu, krwi czy osocza, przez co często stosuje się go w połączeniu z technikami mikroprzepływowym i (mikrofluidycznymi).

W niniejszym przykładzie demonstrujemy układ mikroprzepływowy (fig. 8), który obejmuje: komorę pomiarową 3-3, kanał na metalowe elektrody 3-7 służące do dielektroforetycznego osadzania bakterii lub komórek nowotworowych na powierzchni platformy SERS, wloty do podawania cieczy 3-8, mieszalnik mikroprzepływowy 3-9, kanał na metalowe elektrody 3-10 służący do wstępnej separacji bakterii lub komórek nowotworowych przy pomocy efektu DEP, wylot cieczy z układu mikroprzepły

PL 241 051 B1 wowego 3-11, wylot cieczy z komory pomiarowej 3-12, kanał łączący kanał wstępnej separacji z komorą pomiarową 3-13, kanał do wstępnej separacji bakterii lub komórek nowotworowych przy pomocy efektu DEP 3-14.

W ściankach bocznych komory pomiarowej 3-3 znajdują się cztery kanały 3-7 do wprowadzania metalowych elektrod SERS 3-2. Elektrody metalowe SERS 3-2, mające ostre zakończenia (fig. 6c) są ustawione względem siebie radialnie i pod kątem prostym względem elektrody sąsiedniej, z przerwą miedzy końcami elektrod wynoszącą ok. 1 mm. Elektrody 3-2 znajdują się nad powierzchnią platformy SERS 3-1, a ich końce dokładnie w centrum platformy i komory 3-3 (fig. 9a i fig. 9b). Elektrody 3-2 są połączone z wyjściami generatora funkcyjnego 3-6; każda para elektrod 3-2 do osobnego kanału tak jak prezentuje fig. 9a. Po włączeniu zmiennego pola elektrycznego o odpowiedniej częstotliwości na bakterie działa siła dielektroforetyczna (n-DEP), skierowana w kierunku przestrzeni pomiędzy elektrodami (fig. 9c). Rozkład pola elektrycznego prezentuje fig. 9d. Geometria elektrod, a przez to rozkład pola elektrycznego powoduje, że na obiekty działa negatywna siła dielektroforetyczna, gromadząca bakterie lub komórki nowotworowe w centrum, dokładnie pomiędzy końcówkami elektrody (fig. 9c, 3-4). Jest to tzw. pułapka dielektroforetyczna. W naszym przypadku, pod elektrodami znajduje się platforma SERS, dzięki czemu obiekty (komórki nowotworowe lub bakterie) osadzają się na niej w jednym miejscu.

Układ mikrofluidyczny wyfrezowany w poliwęglanie z podłączonymi wężykami oraz elektrodami pokazany jest na fig. 10a. Rozmiar komory, zaprezentowanej na fig. 10b, wynosi: 5,0 mm χ 5,0 mm χ 2,5 mm (3-3). Platformę SERS stanowi folia PET/ITO/Ag 3-1 o rozmiarach 4,5 mm χ 4,5 mm. Elektrody 3-2 włożono tak, żeby odległość pomiędzy ich końcami wynosiła nie więcej niż 1 mm (fig. 9b i fig. 9c). Znajdują się one też nad powierzchnią platformy SERS 3-1, ich wysokość ustala się poprzez odpowiednią średnicę elektrod 3-2 oraz umiejscowienie kanałów w bocznych ścianach komory 3-7 (fig. 9b).

Na tak przygotowany układ naniesiono roztwór PBS (rozcieńczony χ 10) zawierający bakterie Escherichia coli. Dla osadzenia E. coli na platformie SERS zastosowano częstotliwość sygnału sinusoidalnego wynoszącą 200 kHz oraz napięcie międzyszczytowe wynoszące 15 Vpp. Czas osadzania wynosił 60 sekund.

Po 60 sekundach platformę wyjęto z komory, osuszono i poddano rejestracji widma SERS. W celu przeprowadzenia pomiarów wykorzystano spektrometr ramanowski Bruker Bravo wyposażony w technologię Duo Laser™. Długość fali lasera wynosiła pomiędzy 700 nm, a 1100 nm, a moc poniżej 100 mW. Widma zarejestrowano stosując 3 akumulacje po 6000 ms każda, po czym je uśredniono.

Uśrednione widmo bakterii Escherichia coli osadzonych na platformie SERS przy pomocy efektu dielektroforetycznego (n-DEP) jest przedstawione na fig. 11.

Zaproponowany sposób może zostać zastosowany do dowolnej platformy SERS: na bazie krzemu, paneli fotowoltaicznych, membran etc. W przypadku platform SERS o grubości większej niż folia PET/ITO należy zmienić wysokość, na której znajdują się kanały przeznaczone dla elektrod metalowych (należy dobrać wysokość eksperymentalnie, by nie następowało zwarcie pomiędzy elektrodami).

Literatura:

[1] M. Fleischmann, Raman spectra of pyridine adsorbed at silver electrode, Chem. Phys. Lett.

(1974) 2-5. doi:https://doi.org/10.1016/0009-2614(74)85388-1.

[2] Y. Kitahama, T. Itoh, P. Pienpinijtham, X, S. Ekgasit.X. Han, Y. Ozaki, Biological Applications of SERS Using Functional Nanoparticles, 2 (2012).

[3] D.W. Shipp, F. Sinjab, I. Notingher, Raman spectroscopy: techniques and applications in the life sciences, Adv. Opt. Photonics. 9 (2017) 315. doi:10.1364/aop.9.000315.

[4] W.R. Premasiri, Y. Chen, J. Fore, A. Brodeur, L.D. Ziegler, SERS Biomedical Applications: Diagnostics, Forensics, and Metabolomics, Elsevier Inc., 2017. doi:10.1016/B978-0-12811220-5.00010-1.

[5] K. Girel, S. Zavatski, S. Terekhov, H. Bandarenka, A. Panarin, Progress in the Development of SERS-Active Substrates Based on Metal-Coated Porous Silicon, Materials (Basel). 11 (2018) 852. doi:10.3390/ma11050852.

[6] U.K. Sur, Surface-Enhanced Raman Scattering, in: K. Maaz (Ed.), Raman Spectrosc. Appl., IntechOpen, 2016: p. 13. doi:http://dx.doi.org/10.5772/57353.

[7] E.C. Le Ru, E. Blackie, M. Meyer, P.G. Etchegoint, Surface enhanced raman scattering enhancement factors: A comprehensive study, J. Phys. Chem. C. 111 (2007) 13794-13803. doi:10.1021/jp0687908.

PL 241 051 B1

[8] P.A. Mosier-Boss, Review of SERS substrates for Chemical sensing, Nanomaterials. 7 (2017). doi:10.3390/nano7060142.

[9] B.H. Nguyen, V.H. Nguyen, H.N. Tran, Rich variety of substrates for surface enhanced Raman spectroscopy, Adv. Nat. Sci. Nanosci. Nanotechnol. 7 (2016) 033001.

[10] A. Kamińska, T. Szymborski, E. Witkowska, E. Kijeńska-Gawrońska, W. Świeszkowski, K. Niciński, J. Trzcińska-Danielewicz, A. Girstun, Detection of circulating tumor cells using membrane-based sers platform: A new diagnostic approach for ‘liquid biopsy’, Nanomaterials. 9 (2019). doi:10.3390/nano9030366.

[11] W. Shi, R.J. Paproski, R. Moore, R. Zemp, Detection of circulating tumor cells using targeted surface-enhanced Raman scattering nanoparticles and magnetic enrichment, J. Biomed. Opt. 19 (2014) 056014. doi:10.1117/1.jbo.19.5.056014.

[12] B.H. Jun, M.S. Noh, J. Kim, G. Kim, H. Kang, M.S. Kim, Y.T. Seo, J. Baek, J.H. Kim, J. Park, S. Kim, Y.K. Kim, T. Hyeon, M.H. Cho, D.H. Jeong, Y.S. Lee, Multifunctional silver-embedded magnetic nanoparticles as SERS nanoprobes and their applications, Small. 6 (2010) 119-125. doi:10.1002/smll.200901459.

[13] L. Guerrini, R.A. Alvarez-Puebla, Surface-Enhanced Raman Spectroscopy in Cancer Diagnosis, Prognosis and Monitoring, Cancers (Basel). 11 (2019) 748. doi:10.3390/can- cers11060748.

[14] Y. Zhang, X. Mi, X. Tan, R. Xiang, Recent Progress on Liquid Biopsy Analysis using Surface-Enhanced Raman Spectroscopy, Theranostics. 9 (2019) 491-525. doi:10.7150/thno.29875.

[15] C. Wang, M.M. Meloni, X. Wu, M. Zhuo, T. He, J. Wang, C. Wang, P. Dong, Magnetic plasmonic particles for SERS-based bacteria sensing: A review, AIP Adv. 9 (2019).

doi:10.1063/1.5050858.

[16] H.A. Pohl, The Motion and Precipitation of Suspensoids in Divergent Electric Fields, J. Appl. Phys. 22 (1951) 869-871. doi:10.1063/1.1700065.

[17] P.R.C. Gascoyne, S. Shim, Isolation of Circulating Tumor Cells by Dielectrophoresis, Cancers (Basel). 6 (2014) 545-579. doi:10.3390/cancers6010545.

[18] H.A. Pohl, I. Hawk, Separation of Living and Dead Cells by Dielectrophoresis, Science (80-. ). 152 (1966) 647-649.

[19] R. Pethig, Review Article - Dielectrophoresis : Status of the theory, technology, and applications, Biomicrofluidics. 4 (2010) 1-35. doi:10.1063/1.3456626.

[20] F.H. Labeed, H.M. Coley, H. Thomas, M.P. Hughes, Assessment of Multidrug Resistance Reversal Using Dielectrophoresis and Flow Cytometry, Biophys. J. 85 (2003)2028-2034.

[21] F. Yang, X. Yang, H. Jiang, W.M. Butler, G. Wang, Dielectrophoretic separation of prostate cancer cells, Technol. Cancer Res. Treat. 12 (2013) 61-70. doi:10.7785/tcrt. 2012.500275.

[22] M. Alshareef, N. Metrakos, E. Juarez Perez, F. Azer, F. Yang, X. Yang, G. Wang, Separation of tumor cells with dielectrophoresis-based microfluidic chip, Biomicrofluidics. 7 (2013) 1-12. doi:10.1063/1.4774312.

[23] I.F. Cheng, W.L. Huang, T.Y. Chen, C.W. Liu, Y. De Lin, W.C. Su, Antibody-free isolation of rare cancer cells from blood based on 3D lateral dielectrophoresis, Lab Chip. 15 (2015) 2950-2959. doi:10.1039/c5lc00120j.

[24] l.-F. Cheng, C.-C. Lin, D.-Y. Lin, H.-C. Chang, A dielectrophoretic chip with a roughened metal surface for on-chip surface-enhanced Raman scattering analysis of bacteria, Biomicrofluidics. 4 (2010) 034104. doi:10.1063/1.3474638.

[25] H.Y. Lin, C.H. Huang, W.H. Hsieh, L.H. Liu, Y.C. Lin, C.C. Chu, S.T. Wang, I.T. Kuo,

L.K. Chau, C.Y. Yang, On-line SERS detection of single bacterium Using Novel SERS Nanoprobes and a microfluidic Dielectrophoresis device, Small. 10 (2014) 4700-4710.

doi:10.1002/smll.201401526.

[26] U.C. Schroder, A. Ramoji, U. Glaser, S. Sachse, C. Leiterer, A. Csaki, U. Hubner,

W. Fritzsche, W. Pfister, M. Bauer, J. Popp, U. Neugebauer, Combined dielectrophoresis-Raman setup for the classification of pathogens recovered from the urinary tract, Anal. Chem. 85 (2013) 10717-10724. doi:10.1021/ac4021616.

[27] F.R. Madiyar, S. Bhana, L.Z. Swisher, C.T. Culbertson, X. Huang, J. Li, Integration of a nanostructured dielectrophoretic device and a surface-enhanced Raman probe for highly sensitive rapid bacteria detection, Nanoscale. 7 (2015) 3726-3736. doi:10.1039/c4nr07183b.

Claims (25)

1. PL 241 051 B1

   Zastrzeżenia patentowe

   1. Sposób osadzania mikroorganizmów lub komórek nowotworowych na platformie SERS przy użyciu efektu dielektroforetycznego i oznaczania mikroorganizmów lub komórek nowotworowych na platformie SERS, obejmujący:

   a) przygotowanie platformy SERS,

   b) wprowadzenie zawiesiny mikroorganizmów albo komórek nowotworowych w nośniku do naczynia pomiarowego,

   c) przesyłanie sygnału elektrycznego do platformy SERS i elektrody metalowej w celu osadzenia mikroorganizmów albo komórek nowotworowych na platformie SERS,

   d) osuszenie platformy SERS z mikroorganizmami albo komórkami nowotworowymi,

   e) rejestrację widma SERS w celu oznaczenia mikroorganizmów albo komórek nowotworowych, znamienny tym, w etapie a) platformę SERS umieszcza się w naczyniu pomiarowym i wprowadza się do naczynia pomiarowego przynajmniej jedną elektrodę metalową SERS, i w etapie c) przesyła się sygnał elektryczny do przynajmniej jednej elektrody metalowej SERS i platformy SERS w celu uzyskania ujemnego efektu dielektroforetycznego, i sygnał elektryczny do elektrody metalowej SERS i platformy SERS przesyła się w czasie od 1 do 600 s, przy czym sygnał elektryczny ma częstotliwość od 1 kHz do 50 MHz, przy czym napięcie międzyszczytowe sygnału elektrycznego wynosi od 1 Vpp do 50 Vpp.
2. 2. Sposób wg zastrz. 1, znamienny tym, że nośnik stanowi woda, bufor PBS, płyn ustrojowy pochodzenia ludzkiego albo zwierzęcego wybrany z grupy obejmującej: krew, osocze, płyn mózgowo-rdzeniowy albo mocz.
3. 3. Sposób wg zastrz. 1, znamienny tym, że napięcie międzyszczytowe sygnału elektrycznego, wynosi od 5 Vpp do 30 Vpp, a najkorzystniej od 10 Vpp do 20 Vpp.
4. 4. Sposób wg zastrz. 1 albo 3, znamienny tym, że sygnał elektryczny ma częstotliwość w zakresie od 10 kHz do 20 MHz, a najkorzystniej w zakresie od 100 kHz do 10 MHz.
5. 5. Sposób wg zastrz. 1,3 albo 4, znamienny tym, że sygnał elektryczny do elektrody metalowej SERS przesyła się w czasie od 10 s do 360 s, a najkorzystniej pomiędzy od 30 s do 60 s.
6. 6. Sposób wg zastrz. 1, 3, 4 albo 5, znamienny tym, że sygnał elektryczny do elektrody metalowej SERS przesyła się w czasie 60 s.
7. 7. Sposób wg zastrz. 1, 3, 4, 5 albo 6, znamienny tym, że sygnał elektryczny przesyłany do przynajmniej jednej elektrody metalowej SERS i platformy SERS ma kształt sinusoidalny.
8. 8. Sposób wg zastrz. 1, znamienny tym, że średnica przynajmniej jednej elektrody metalowej SERS ma średnicę od 10 μm do 2 mm, korzystniej od 20 μm do 1 mm, a najkorzystniej od 50 μm do 500 μm.
9. 9. Sposób wg zastrz. 8, znamienny tym, że średnica elektrody metalowej SERS wynosi 340 μm.
10. 10. Sposób wg zastrz. 1, znamienny tym, że po osadzeniu mikroorganizmów lub komórek nowotworowych wyjmuje się platformę SERS i odparowuje nośnik w temperaturze pokojowej albo podwyższonej.
11. 11. Sposób wg zastrz. 1, znamienny tym, że naczynie pomiarowe stanowi cylindryczny pojemnik z tworzywa sztucznego albo szkła, wybrany z grupy obejmującej: probówkę, fiolkę, tuleję.
12. 12. Sposób wg zastrz. 1, znamienny tym, że naczynie pomiarowe stanowi układ mikrofluidyczny.
13. 13. Sposób wg zastrz. 12, znamienny tym, że układ mikrofluidyczny obejmuje dwa wloty cieczy nośnika (3-8), połączone z mieszalnikiem (3-9), które są połączone z kanałem do wstępnej separacji komórek nowotworowych lub bakterii z nośnika (3-14), połączonego poprzez wylot cieczy nośnika (3-10) kanałem (3-13) z komorą platformy SERS (3-3), przy czym komora do umieszczania platformy SERS (3-3) zawiera kanały (3-7) do wprowadzenia elektrod metalowych SERS (3-2).
14. 14. Sposób wg zastrz. 12 albo 13, znamienny tym, że do komory platformy SERS (3-3) układu mikrofluidycznego wprowadza się cztery elektrody metalowe SERS (3-2), przy czym elektrody metalowe SERS (3-2) wprowadza się przez kanały (3-7) w komorze platformy SERS (3-3) prostopadłe względem siebie, i elektrody metalowe SERS (3-2) wprowadza się powyżej platformy SERS (3-1) w komorze platformy SERS (3-1).

    PL 241 051 B1
15. 15. Sposób wg zastrz. 14, znamienny tym, że odległość pomiędzy końcami elektrod metalowych SERS (3-2) wprowadzonych do komory platformy SERS (3-3) wynosi nie więcej niż 1 mm, korzystnie 0,5 mm.
16. 16. Sposób wg zastrz. 1, znamienny tym, że przynajmniej jedną elektrodę metalową SERS wprowadza się równolegle do przynajmniej jednej osi naczynia pomiarowego.
17. 17. Sposób wg zastrz. 1, znamienny tym, że platformę SERS stanowi elastyczna folia poddana dielektrycznemu wyładowaniu barierowemu, korzystnie z poli(tereftalanu etylenu), pokrytego warstwą tlenku indowo-cynowego, na który została naniesiona warstwa srebra, złota albo stopu złoto-srebro.
18. 18. Sposób wg zastrz. 1, 3, 4, 5, 6 albo 7, znamienny tym, że sygnał elektryczny podaje się z generatora zmiennoprądowego.
19. 19. Sposób wg zastrz. 1, znamienny tym, że komórki nowotworowe są wybrane z grupy obejmującej komórki: K562 białaczki szpikowej, HT-29 gruczolakoraka jelita grubego (0,1 Sm^-1), BxPC3 raka trzustki, MCF7 raka piersi, HeLa raka szyjki macicy, LNCaP gruczolakoraka prostaty albo MBA-MD-231 raka piersi.
20. 20. Sposób wg zastrz. 1, znamienny tym, że mikroorganizmy są wybrane z grupy obejmującej bakterie albo drożdże.
21. 21. Sposób wg zastrz. 20, znamienny tym, że bakterie są stanowią bakterie gram ujemne.
22. 22. Sposób wg zastrz. 21, znamienny tym, że bakterie gram ujemne są wybrane z grupy obejmującej: Escherichia coli K.38, Escherichia coli 5K albo Escherichia coli DoubleShell prolate.
23. 23. Sposób wg zastrz. 20, znamienny tym, że drożdże są wybrane z grupy obejmującej: Saccharomyces cerevisiae albo Saccharomyces cerevisiae.
24. 24. Sposób wg zastrz. 1, znamienny tym, że platforma SERS ma kształt dopasowany do kształtu naczynia pomiarowego.
25. 25. Sposób wg zastrz. 24, znamienny tym, że platforma SERS ma kształt litery „L”.