CN106755590A - 一种用于检测传单患者eb病毒fish检测探针 - Google Patents

Abstract

本发明涉及医学诊断技术领域，具体而言，涉及一种用于检测传单患者EB病毒FISH检测探针；所述探针为EB病毒BamHI‑W片段经过标记得到；所述BamHI‑W片段的核苷酸序列为EBV基因组13232‑16189所示。该探针灵敏度和特异性较常规的传单检测方法检测EBV的病毒拷贝数都要高，而且病毒的细胞内定位准确，也能非常直观的判断病毒载量。

Description

一种用于检测传单患者EB病毒FISH检测探针

技术领域

本发明涉及医学诊断技术领域，具体而言，涉及一种用于检测传单患者EB病毒FISH检测探针及其制备方法。

背景技术

自从1964年Epstein和Barr等在淋巴瘤细胞系中发现了EB病毒颗粒以来，人们对EBV的认识进入了崭新的阶段。EBV与人类多种感染性疾病如传染性单核细胞增多症、慢性活动性EBV感染、EBV相关的噬血细胞增多综合征、移植后淋巴组织增生症及淋巴瘤、鼻咽癌及胃癌等多种恶性肿瘤密切相关。

传染性单核细胞增多症(infectious mononucleosis,IM)是一种急性全身淋巴细胞增生性疾病，常在儿童期或青春期初期感染较大量的EBV时发病，主要由飞沫与唾液经呼吸道传播，其次通过密切接触传播，潜伏期约40天。IM的典型特征包括不规则发热，咽喉炎，淋巴结肿大，全身乏力，以及外周血非典型淋巴细胞增多。脾肝肿大，黄疸和脾破裂等并发症十分罕见。其病程通常持续数天至数周，临床常认为其呈自限性。有文献称，近年来EBV感染儿童逐年增多，夏秋较冬春季节常见，且半数儿童感染EBV后表现为IM，且临床表现趋于多样化。一般情况下IM以抗病毒及对症支持治疗为主，预后较好。

但少数IM患儿临床表现呈爆发性过程，出现严重并发症，累及全身多个系统并造成多脏器损害，临床称为重症IM(severe infectiousmononucleosis,SIM)或致死性IM(fatal infectious mononucleosis，FIM)，其中约80％FIM可进一步进展为EBV-AHS。然而目前国内对于重症IM并没有统一认识及诊断标准，临床上主要依据患者症状轻重以及并发症来判断其病情轻重程度，以便与普通IM区分。有研究认为IM患者有2个系统以上受损即可诊断为重症IM，曾有学者进行过统计分析发现重症IM如不及时治疗死亡率高达92.3％。所以如何及时并且准确诊断SIM，对于病人的治疗及预后十分关键。

因EBV的分离相对困难，所以临床一般采用血清学方法作辅助诊断。但当机体免疫低下时，则很难用血清学结果分析，所以在EBV感染中应用分子诊断学方法十分必要。目前常见EBV的临床检测项目有外周血涂片进行异型淋巴细胞计数、嗜异性凝集试验、EBV抗体检测(包括EBV-VCA-IgM，EBV-VCA-IgG)、PCR检测EBV-DNA。

外周血涂片异淋计数以及嗜异性凝集试验均为非特异性试验。多数IM患者异淋计数超过10％，但除EBV外的其他病毒如巨细胞病毒(cytomegalovirus)、登革病毒(Denguevirus)等，或某些药物感染也可引起同样反应。嗜异性凝集试验在起病后1-2周可出现阳性，3-4周达到高峰，阳性率据称80％以上，但是少数病例该实验结果始终阴性。另外感染过程的早期常出现嗜异性凝集试验假阴性。

EBV-VCA-IgM是IM急性期重要的诊断指标，出现在EBV感染早期，通常在4-6周消失，所以此项指标与病人入院时间有密切关系，加之实验结果也常受到实验人员操作方式、诊断试剂盒检出率的影响，常常不能准确反应病人情况。EBV-VCA-IgG出现在EBV感染的急性期，发病后2-4周达到高峰，略微下降后持续终生，所以这一指标目前多用于流行病学统计。

临床上常用且较为可靠的指标仅有PCR检测EBV-DNA结果。PCR是20世纪80年代中期发展起来的体外核酸扩增技术，由Mullis首次报道，通过体外扩增可以将目的基因片段百万倍地放大，从而极大地提高核酸分子检测的灵敏度。PCR具有特异性强、灵敏度高、重复性好、简便快速、易自动化以及产率高等优点。但正由于PCR使DNA拷贝数呈指数增长，所以极微量的模板污染就可以造成假阳性出现。其次在标本采集、运输及处理过程中也易发生污染。另假阴性也是其反应过程中易出现的一个不可忽视的问题，这类问题大多数与标本处理、PCR试剂过期或PCR仪器故障有关。

有鉴于此，特提出本发明。

发明内容

本发明的目的在于提供一种用于检测传染性单核细胞增多症患者EB病毒FISH检测探针，以解决上述问题。

为了实现本发明的上述目的，特采用以下技术方案：

一种用于检测传染性单核细胞增多症患者EB病毒FISH检测探针，所述探针为EB病毒BamHI-W片段经过标记得到；

所述BamHI-W片段的核苷酸序列为EBV基因组13232-16189所示。

目前传染性单核细胞增多症患者(以下简称传单患者)EB病毒的临床诊断方法主要有病毒培养、抗体检测及核酸检测等；EBV培养是患者标本接种至新鲜的人B细胞或脐血淋巴细胞中，4周后可通过荧光抗体染色技术检测EBV抗原。但EBV分离鉴定耗时长而且需要特殊的组织培养条件，因而不适宜常规检测所采用。目前EBV培养主要应用于对EBV感染的发病机制、预防、治疗的体外研究。抗体检测是用免疫荧光法、免疫酶法或ELISA法检测EBV抗体有助于EBV感染的诊断。其中ELISA法是目前最常用的检测EBV的方法。此方法操作简单、快速，试验结果应用酶标仪读数，准确性较高，在临床得到广泛应用。急性初次EBV感染的特点是可检测到早期抗原VCA IgM抗体、VCA IgG及VCA IgA。此方法的缺点是特异性较差，抗体产生存在窗口期及操作稳定性欠佳等。核酸检测主要有EBVPCR扩增法，具有较高敏感性和特异性。EBV-PCR有常规PCR、巢式PCR、多重PCR、逆转录PCR和实时PCR等。PCR从DNA水平检测，其敏感度比病毒培养及抗体检测高，但PCR检测成本高且其特异性略差，结果易受各种不确定因素影响，易出现假阳性或假阴性，有时需要多次重复才能得出可靠结果。

以前国内外的报道中从未有相关研究报道过利用FISH技术检测传单患者EBV的方法在临床检测中的应用，因此如果在临床中得以应用及推广无疑会在国内外处于领先水平。

优选的，如上所述的FISH检测探针，所述标记采用Biotin-dUTP标记。

在相关酶(例如Klenow酶)的催化下，通过随机引物标记反应(randomprimelabeling)可以把生物素标记的Biotin-dUTP掺入到新合成的DNA探针中，这样就可以产生生物素标记的DNA探针。在随机引物标记反应过程中，一些标记好的DNA探针可以被酶从模板DNA链上驱赶下来。这样在模板量较少的情况下，通过随机引物标记反应，最后可以产生比模板DNA量更多的生物素标记DNA探针，可多达1-15倍左右。

更优选的，所述标记可采用Biotin-16-dUTP或Biotin-11-dUTP。

一种用于检测传染性单核细胞增多症患者EB病毒FISH检测探针的制备方法，包括：

培养EB病毒并提取EB病毒DNA作为模板，PCR扩增EB病毒BamHI-W片段，对所述BamHI-W片段进行标记得到标记产物；纯化所述标记产物后得到EB病毒FISH检测探针。

优选的，如上所述的制备方法，培养EB病毒所用的宿主细胞为P3hr-1细胞；

更优选的，病毒悬液的制备过程包括：培养P3hr-1细胞，待细胞生长至融合度85～95％，收集培养液，冻于-70～90℃，过夜。次日，水浴融化，再放于-70～90℃冰箱，反复冻融2～4次。0～6℃，2500～3500rpm离心15～25min，将上清用0.4～0.5μm滤器过滤；用Millipore浓缩柱4500～5500rpm，0～6℃离心浓缩至2ml左右。将浓缩液转移到无菌的EP管中，18000～22000g，0～6℃离心70～110min。将上清弃去后用无血清的培养液重悬沉淀，即为病毒悬液。

优选的，如上所述的制备方法，扩增EB病毒BamHI-W片段所用的上游引物核苷酸序列为：

5’-CTTCTCTCTGTCCCCCTGCTCCTCT-3’；

下游引物核苷酸序列为：

5’-CTAGGGTCCCTTCTGGGGGACATCCT-3’。

优选的，如上所述的制备方法，在所述扩增的反应程序中，Tm值为53～57℃，反应循环次数为30～34次。

优选的，如上所述的制备方法，对所述BamHI-W片段进行标记的方法包括：

1)、将BamHI-W片段DNA加入水中98～100℃变性7～13分钟；

2)、按照1g BamHI-W片段DNA：3.5～4.5μL Biotin-High prime的比例加入所述Biotin-High prime，瞬时离心，36～38℃水浴8～16h；

3)、63～67℃加热8～12分钟终止标记得到标记产物。

优选的，如上所述的制备方法，纯化所述标记产物的操作包括：

a)、按体积份数计，将17～23份标记产物、8～12份7.5M的醋酸铵、0.6～1.4份鱼精DNA、70～110份冰冷的无水乙醇混合并于-75～85℃沉淀60～70min；

b)、0～6℃，11000～13000rpm离心15～25min后弃上清；

c)、加入73～77％乙醇洗涤1～2次，0～6℃，11000～13000rpm离心15～25min；

d)、弃上清，风干沉淀，用FISH杂交液重悬。

一种用于检测传染性单核细胞增多症患者EB病毒的试剂盒，其包含如上所述的FISH探针。

如上所述的FISH探针在制备检测传染性单核细胞增多症患者EB病毒的试剂或试剂盒中的应用。

一种检测传单患者EBV的FISH方法，使用如上所述的探针，或如上所述的试剂盒与预处理后的待检样品进行杂交检测；复染后在显微镜下观察荧光信号。

本发明的关键技术点在于对于传单或其它常见的EBV引起的感染性疾病或EBV相关的肿瘤性疾病的诊断过程中，目前临床上常用的检测技术灵敏度和特异性有时达不到临床上的要求导致部分病人的漏诊及误诊，因此寻找更加灵敏、可靠及直观的方法已经势在必行。

本发明首次在国际上利用P3hr-1产EBV的细胞株，提取病毒上清液并通过柱式病毒DNA浓缩纯化EBV的DNA片段，然后以EBV的BamHI-W片段作为模板进行PCR扩增，得到3267bp的特异性PCR产物，通过对产物的纯化后制备EBV的FISH探针，再通过逐步的荧光信号放大过程最终在荧光显微镜下可以清楚的看到细胞内的EBV颗粒。利用此项技术先后在31例普通较为轻型的传单患者及7例重症的传单患者的外周血提取的白细胞检测，发现其灵敏度和特异性较常规的传单检测方法如嗜异性凝集实验、EBV-VCA IgM及PCR检测EBV的病毒拷贝数都要高，而且病毒的细胞内定位准确，也能非常直观的判断病毒载量。这是国内首次运用FISH技术成功检测出传单患者体内的EBV，此方法的建立为今后利用此方法检测EBV相关肿瘤性疾病如鼻咽癌、淋巴瘤及胃癌也将起到很好的示范作用。

附图说明

为了更清楚地说明本发明具体实施方式或现有技术中的技术方案，下面将对具体实施方式或现有技术描述中所需要使用的附图作简单地介绍，显而易见地，下面描述中的附图是本发明的一些实施方式，对于本领域普通技术人员来讲，在不付出创造性劳动的前提下，还可以根据这些附图获得其他的附图。

图1为本发明实施例中的部分实验结果图。

具体实施方式

下面将结合实施例对本发明的实施方案进行详细描述，但是本领域技术人员将会理解，下列实施例仅用于说明本发明，而不应视为限制本发明的范围。实施例中未注明具体条件者，按照常规条件或制造商建议的条件进行。所用试剂或仪器未注明生产厂商者，均为可以通过市售购买获得的常规产品。

实施例

FISH技术是目前临床上检测基因及病毒DNA的常用方法，具有非常直观又有较高的灵敏度及特异性。但是国内外在检测EBV方面没有成品的探针供应，之前的报道常常仅限于基础研究。因此要开发出能够普遍适用于临床的FISH EBV探针尤为必要。我们的前期工作中运用培养产EBV的P3hr-1细胞株病毒上清通过柱式病毒纯化柱浓缩EBV，通过DNA抽提试剂盒提取EBV的DNA。设计EBV的BaMH段特异的DNA引物扩增此段DNA后得到3267bp的DNA片段，送南京金斯瑞公司测序证实。经相关步骤成功研制出FISH探针。为验证此探针的临床运用价值，我们用此探针首先检测了P3HR-1及raji细胞株中EBV的表达水平，结果显示在这两株细胞中都能有效的检测出EB病毒颗粒。具体的探针制作过程如下：

1.EB病毒制备：培养P3hr-1细胞，待细胞生长至90％左右，收集培养基，冻于-80℃，过夜。次日，37℃水浴融化，再放于-80℃冰箱，反复冻融三次。4℃，3000rpm离心20分钟，将上清用0.45μm滤器过滤。然后用Millipore浓缩柱5000rpm，4℃离心浓缩至2ml左右。将浓缩液转移到无菌的1.5mlEP管中，20,000g，4℃离心1小时30分钟。将上清弃去后用无血清的RPM1640培养基重悬沉淀，即为病毒悬液。

2.EB病毒DNA抽提：使用Qiagen公司QIAamp MinElute Virus Spin试剂抽提EBV-DNA。

3.探针模板的PCR扩增：以EB病毒DNA为模板，PCR扩增EB病毒BamHI-W(EBV genome13232-16189)片段作为探针。

4.探针模板的PCR扩增：

以EBV DNA为模板，PCR扩增EBV BamH I-W片段。

引物序列如下：

上游引物5’-CTTCTCTCTGTCCCCCTGCTCCTCT-3’；

下游引物5’-CTAGGGTCCCTTCTGGGGGACATCCT-3’。

以50μL反应体系计，PCR扩增体系为：

PCR反应程序为：

5.PCR产物的胶回收纯化：

(1)用1×TAE配制1％琼脂糖凝胶，DNA与上样缓冲液混合后100V电压下电泳30min；

(2)30min后，用干净的刀片在紫外灯下，小心并迅速的切下含有目的条带的PCR产物置于1.5ml的EP管中，称重，按1g:300μL加入BindingBuffer，56℃溶胶10分钟；

(3)将纯化柱放置于收集管中，将溶解后的胶转移至纯化柱内，8000g离心1分钟；

(4)将700μL溶解混合物转移至离心过滤吸附柱内，并将柱子放在一个干净的2ml收集管中，室温下10000g离心1min，使DNA结合在吸附柱上，弃去滤出液，将剩余混合物同样方法移入吸附柱内；

(5)将纯化柱置于一空的收集管中，13000g离心2分钟；

(6)将吸附柱重新套入收集管内，加入300μl Binding Buffer(XP2)至吸附柱，室温下13000g离心1min，弃去滤液；

(7)将空吸附柱重新套入收集管内，室温下13000g离心2min以甩干柱基质残余的液体；

(8)收集洗脱的DNA片段，即为目标DNA，测定管中DNA浓度后送至南京金斯瑞公司测序，剩余DNA保存于-20℃备用。

6.FISH探针的标记：

采用Roche公司Biotin-High prime随机引物标记试剂盒。

具体步骤如下：

(1)取1μg模板DNA加于1.5mL EP管，再加入无酶水使总体积至16μL；

(2)将上述DNA置于沸水中变性10分钟后，立即置冰上冷却；

(3)轻轻混匀Biotin-High prime，加入4μL Biotin-High prime至上述变性的DNA中，瞬时离心，37℃水浴过夜；

(4)次日将上述混合液转移至200μL PCR管中，65℃加热10分钟终止标记。

7.探针的纯化：

(1)向20μL的探针中加入10μL NH4AC(7.5M)，1μL鱼精DNA，90μL冰冷的无水乙醇，-80℃沉淀1小时；

(2)4℃，12000rpm 20分钟离心后弃上清；

(3)加入75％乙醇洗涤一次，离心4℃，12000rpm 20分钟；

(4)将上清弃去，风干沉淀，并用30μLFISH杂交液重悬探针。

8.细胞预处理：

(1)将悬浮细胞转移至10ml离心管中，1100rpm离心10min，弃上清；

(2)加入0.075mol/LKCL低渗液，37℃水浴中放置20分钟，离心丢弃上清；

(3)加入6ml固定液(甲醇：冰醋酸＝3:1)吹匀，1100rpm离心10min，重复三次；

(4)吸取20μL悬液滴片，20分钟干燥后将玻片依次置于70％、95％及无水乙醇中脱水各3分钟，晾干备用。

9.间接法FISH过程：

(1)将含有探针的杂交液10μL滴于上述处理后的玻片上，加盖玻片，封片胶封严，82℃水浴箱中变性7分钟，再置于湿盒42℃恒温箱中过夜；

(2)42℃50％甲酰胺/2×SSC洗2次各5分钟，0.05％TritonX-100/2×SSC洗5分钟；

(3)加50μL1:100avidin-FITC(2.5％BSA/4×SSC),37℃湿盒中避光孵育30分钟，0.05％Triton X-100/2×SSC洗3次；

(4)加50μL1:100鼠抗FITC(2.5％BSA/4×SSC)，37℃湿盒中避光孵育30分钟，0.05％Triton X-100/2×SSC洗3次；

(5)加50μL1:100兔抗鼠FITC(2.5％BSA/4×SSC)，37℃湿盒中避光孵育30分钟，0.05％Triton X-100/2×SSC洗3次；

(6)依次置于70％、95％及无水乙醇中脱水各3分钟，晾干；

(7)加50μL DAPI液染色5分钟，用防荧光淬灭的盖玻片封片。

10.荧光显微镜检测及结果判断：

待玻片稍干后，置于荧光显微镜下，选择合适的滤光片波长观察。正常人胞浆中无绿色荧光信号，若出现绿色荧光信号则为阳性。

11.阈值的建立：

选取湘雅医院健康体检人群20人，外周血取血标本作为对照样本。每人用技术FISH分析200个细胞并计算平均的荧光颗粒数，我们得出正常阈值为4.02。如果患者检测的荧光颗粒值高于此值判为阳性。

其中图1为本发明的部分实验结果图。图A：FISH方法检测的BJAB细胞株，显示EBV为阴性；图B：FISH方法检测P3hr-1细胞株，为EBV阳性；图C：FISH方法检测raji细胞株，为EBV阳性。

注：BJAB细胞株为不产生EBV的淋巴瘤细胞株，P3hr-1和raji细胞株为产EBV的淋巴瘤细胞株，此图是为了验证我们FISH探针的可靠性。

图D：FISH方法检测的健康对照者，显示EBV为阴性；图E：FISH方法检测轻型传单患者，显示EBV弱阳性；图F：FISH方法检测重型传单患者，显示EBV强阳性。

实验例

发明人运用自行研制的FISH探针，检测38例传单患者，并与常规检测方法比较，具体结果如下。由表可知运用FISH方法检测的传单患者，无论是普通型还是重症传单其阳性率明显高于常规的嗜异性凝集实验，EBV-VCA-IgM，也高于目前临床上认为最为敏感的PCR法，因此在临床上推广此方法具有广阔的实用前景。

注：上表运用FISH技术检测38例传单患者取得了97.4％的阳性率，明显比嗜异性凝集，免疫法测EBV-VCA抗体及PCR阳性率高。而且对于可用于检测轻型及重型传单的EBV载量有一定的鉴别诊断意义。

最后应说明的是：以上各实施例仅用以说明本发明的技术方案，而非对其限制；尽管参照前述各实施例对本发明进行了详细的说明，但本领域的普通技术人员应当理解：其依然可以对前述各实施例所记载的技术方案进行修改，或者对其中部分或者全部技术特征进行等同替换；而这些修改或者替换，并不使相应技术方案的本质脱离本发明各实施例技术方案的范围。

Claims (10)

1.一种用于检测传染性单核细胞增多症患者EB病毒FISH检测探针，其特征在于，所述探针为EB病毒BamHI-W片段经过标记得到；

所述BamHI-W片段的核苷酸序列为EBV基因组13232-16189所示。

2.根据权利要求1所述的FISH检测探针，其特征在于，所述标记采用Biotin-dUTP标记。

3.一种用于检测传染性单核细胞增多症患者EB病毒FISH检测探针的制备方法，其特征在于，包括：

培养EB病毒并提取EB病毒DNA作为模板，PCR扩增EB病毒BamHI-W片段，对所述BamHI-W片段进行标记得到标记产物；纯化所述标记产物后得到EB病毒FISH检测探针。

4.根据权利要求3所述的制备方法，其特征在于，培养EB病毒所用的宿主细胞为P3hr-1细胞。

5.根据权利要求3所述的制备方法，其特征在于，扩增EB病毒BamHI-W片段所用的上游引物核苷酸序列为：

5’-CTTCTCTCTGTCCCCCTGCTCCTCT-3’；

下游引物核苷酸序列为：

5’-CTAGGGTCCCTTCTGGGGGACATCCT-3’。

6.根据权利要求5所述的制备方法，其特征在于，在所述扩增的反应程序中，Tm值为53～57℃，反应循环次数为30～34次。

7.根据权利要求3所述的制备方法，其特征在于，对所述BamHI-W片段进行标记的方法包括：

1)、将BamHI-W片段DNA加入水中98～100℃变性7～13分钟；

2)、按照1g BamHI-W片段DNA：3.5～4.5μL Biotin-High prime的比例加入所述Biotin-High prime，瞬时离心，36～38℃水浴8～16h；

3)、63～67℃加热8～12分钟终止标记得到标记产物。

8.根据权利要求7所述的制备方法，其特征在于，纯化所述标记产物的操作包括：

a)、按体积份数计，将17～23份标记产物、8～12份7.5M的醋酸铵、0.6～1.4份鱼精DNA、70～110份冰冷的无水乙醇混合并于-75～85℃沉淀60～70min；

b)、0～6℃，11000～13000rpm离心15～25min后弃上清；

c)、加入73～77％乙醇洗涤1～2次，0～6℃，11000～13000rpm离心15～25min；

d)、弃上清，风干沉淀，用FISH杂交液重悬。

9.一种用于检测传染性单核细胞增多症患者EB病毒的试剂盒，其包含权利要求1或2所述的FISH探针。

10.权利要求1或2所述的FISH探针在制备检测传染性单核细胞增多症患者EB病毒的试剂或试剂盒中的应用。