CN110117645B - 基于甜菜碱的核酸探针及其应用 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了一种基于甜菜碱的核酸探针及其应用，所述核酸探针包括核酸标记体系及添加于核酸标记体系中的甜菜碱和/或甜菜碱类似物。本发明中通过在核酸标记体系中添加甜菜碱及甜菜碱类似物，可以显著改善核酸的标记效率，特别是高GC含量的核酸探针的标记效率提高尤为显著，并且具有成本较低的优点。
Description
技术领域
本发明涉及核酸标记技术领域，特别是涉及一种基于甜菜碱的核酸探针及其应用。
背景技术
核酸，包括核糖核酸(RNA)、脱氧核糖核酸(DNA)以及核糖核酸和脱氧核糖核酸的嵌合物(单一链中包含核糖核苷和脱氧核糖核苷)或杂合物(双链的两条链分别为RNA和DNA，或至少有一条链为嵌合物)，经常需要使用生物素、地高辛或同位素等进行标记，用于核酸、核酸和蛋白等分子的相互作用的检测。标记的核酸常被称为核酸探针，标记的核酸探针包括单链核酸探针和双链核酸探针。
现有技术中，对于一些核酸标记效率相对较低，特别是对于一些高GC含量的序列标记效率相对较低，对于后续的Northern、Southern、克隆或平板、点杂交或狭缝杂交、原位杂交、电泳迁移率改变检测(EMSA)等涉及到核酸的或核酸与蛋白等其它分子相互作用的检测带来不便。
因此，针对上述技术问题，有必要提供一种基于甜菜碱的核酸探针及其应用。
发明内容
有鉴于此，本发明的目的在于提供一种基于甜菜碱的核酸探针及其应用。
为了实现上述目的，本发明一实施例提供的技术方案如下：
一种基于甜菜碱的核酸探针，所述核酸探针包括核酸标记体系及添加于核酸标记体系中的甜菜碱和/或甜菜碱类似物。
作为本发明的进一步改进，所述甜菜碱类似物包括硫代甜菜碱、丝氨酸甜菜碱、丙氨酸甜菜碱、γ-氨基丁酸甜菜碱、高丝氨酸甜菜碱中的一种或多种。
作为本发明的进一步改进，所述甜菜碱和/或甜菜碱类似物的浓度范围为10mmol/L～5mol/L。
作为本发明的进一步改进，所述甜菜碱和/或甜菜碱类似物的浓度范围为100mmol/L～3mol/L。
作为本发明的进一步改进，所述甜菜碱和/或甜菜碱类似物的浓度范围为200mmol/L～2mol/L。
作为本发明的进一步改进，所述核酸标记体系包括基于核酸模板的酶促合成、直接化学合成、3’末端标记、5’末端标记中的任意一种。
作为本发明的进一步改进，所述基于核酸模板的酶促合成包括聚合酶链式反应、Klenow酶催化的缺口平移中的一种或多种；所述直接化学合成包括使用各种核酸合成仪在核酸合成过程中掺入标记的核苷酸；所述3’末端标记包括基于TdT酶的末端标记；所述5’末端标记体系包括5’末端磷酸化标记。
作为本发明的进一步改进，所述核酸标记体系采用生物素、地高辛、同位素中任意一种或多种进行标记。
本发明一实施例提供的技术方案如下：
一种基于甜菜碱的核酸探针的应用，所述核酸探针用于Northern、Southern、克隆或平板、点杂交或狭缝杂交、原位杂交、电泳迁移率改变检测、ELISA。
本发明的有益效果是：
本发明中通过在核酸标记体系中添加甜菜碱及甜菜碱类似物，可以显著改善核酸的标记效率，特别是高GC含量的核酸探针的标记效率提高尤为显著，并且具有成本较低的优点；
本发明的核酸探针可应用于各种涉及到核酸检测或核酸与蛋白等其它分子相互作用的检测。
附图说明
为了更清楚地说明本发明实施例或现有技术中的技术方案，下面将对实施例或现有技术描述中所需要使用的附图作简单地介绍，显而易见地，下面描述中的附图仅仅是本发明中记载的一些实施例，对于本领域普通技术人员来讲，在不付出创造性劳动的前提下，还可以根据这些附图获得其他的附图。
图1为本发明实施例1中生物素随机引物DNA对照组(未添加甜菜碱)和甜菜碱组(添加有甜菜碱)相对发光强度的对比示意图；
图2为本发明实施例2中高GC含量的小鼠SIRT1部分序列3'末端DNA对照组(未添加甜菜碱)和甜菜碱组(添加有甜菜碱及甘氨酸甜菜碱)相对发光强度的对比示意图。
具体实施方式
为了使本技术领域的人员更好地理解本发明中的技术方案，下面将结合本发明实施例中的附图，对本发明实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述，显然，所描述的实施例仅仅是本发明一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都应当属于本发明保护的范围。
本发明公开了一种基于甜菜碱的核酸探针，该核酸探针包括核酸标记体系及添加于核酸标记体系中的甜菜碱和/或甜菜碱类似物。
其中，甜菜碱类似物包括硫代甜菜碱、丝氨酸甜菜碱、丙氨酸甜菜碱、γ-氨基丁酸甜菜碱、高丝氨酸甜菜碱中的一种或多种。
本发明中甜菜碱及甜菜碱类似物可单独添加，也可以混合添加，甜菜碱及甜菜碱类似物的浓度范围为10mmol/L～5mol/L，优选的浓度范围为100mmol/L～3mol/L，最佳的浓度范围为200mmol/L～2mol/L。
本发明中核酸标记体系包括基于核酸模板的酶促合成、直接化学合成、3’末端标记、5’末端标记等中的任意一种。
其中，基于核酸模板的酶促合成包括但不限于聚合酶链式反应、Klenow酶催化的缺口平移中的一种或多种；直接化学合成包括但不限于使用各种核酸合成仪在核酸合成过程中掺入标记的核苷酸；3’末端标记包括但不限于基于TdT酶的末端标记；5’末端标记体系包括但不限于5’末端磷酸化标记。
另外，本发明中的核酸标记体系采用生物素、地高辛、同位素等中任意一种或多种进行标记。
本发明还公开了一种基于甜菜碱的核酸探针的应用，该核酸探针用于Northern、Southern、克隆或平板、点杂交或狭缝杂交、原位杂交、电泳迁移率改变检测(EMSA)、ELISA。
以下结合具体实施例和对比例对本发明作进一步说明。
实施例1：
1、生物素随机引物DNA标记
在Klenow酶(Klenow fragment,3'-5'exo-)催化下，通过随机引物标记反应(random prime labeling)可以把生物素标记的Biotin-11-dUTP掺入到新合成的DNA探针中，这样就可以产生生物素标记的DNA探针。采用上海碧云天生物技术有限公司生产的生物素随机引物DNA标记试剂盒，在标记反应体系中添加甜菜碱至最终浓度为0.5M，其余完全按照说明书操作。标记的DNA模板采用小鼠p53cDNA序列，该cDNA的双链序列通过PCR扩增获得，同时设置未添加甜菜碱的反应体系作为对照组。
2、标记好的小鼠p53探针采用如下方法进行定量检测
选取可以用ELISA检测的96孔酶标板，参考《分子克隆》中常规的铺被蛋白的方法，在孔底铺被碱性磷酸酯酶标记Streptavidin。铺被完成后，加入100微升不同稀释浓度的小鼠P53探针，浓度依次为10pmol/L、100pmol/L、1nmol/L。室温孵育1小时后，用PBS洗涤3次，随后加入适当稀释的辣根过氧化物酶标记Streptavidin室温孵育1小时，再用PBS洗涤3-5次，随后加入BeyoECL Plus进行发光检测。这样可以通过发光的强弱来确定结合的辣根过氧化物酶标记Streptavidin，从而确定小鼠p53探针上生物素的标记效率。其中，发光检测采用Thermo的多功能酶标仪进行。
参图1所示，添加甜菜碱后，小鼠p53探针的标记效率显著提高，大约提高到了1.5倍以上。
实施例2：
1、生物素3'末端DNA标记
在Terminal Deoxynucleotidyl Transferase(TdT)酶的催化下，可以把生物素或地高辛等标记的dUTP添加到单链DNA的3'末端，这样就可以产生末端标记的单链DNA探针。生物素3'末端DNA标记试剂盒购自上海碧云天生物技术有限公司。在标记反应体系中添加甜菜碱至最终浓度为0.8M，添加甜菜碱类似物甘氨酸甜菜碱至最终浓度为0.1M，其余完全按照说明书操作。待标记的单链DNA模板采用商业化合成的小鼠SIRT1的cDNA的部分序列，具体序列为ATGGCGGACGAGGTGGCGCTCGCCCTTCAGGCCGCCGGCTCCCCT。同时设置未添加甜菜碱和甜菜碱类似物甘氨酸甜菜碱的反应体系作为对照组。前述的小鼠SIRT1cDNA部分序列存在高GC含量的特点。
2、标记好的小鼠SIRT1探针采用如下方法进行定量检测
选取可以用ELISA检测的96孔酶标板，参考《分子克隆》中常规的铺被蛋白的方法，在孔底铺被碱性磷酸酯酶标记Streptavidin。铺被完成后，加入100微升不同稀释浓度的小鼠SIRT1探针，浓度依次为10pmol/L、100pmol/L、1nmol/L。室温孵育1小时后，用PBS洗涤3次，随后加入适当稀释的辣根过氧化物酶标记Streptavidin室温孵育1小时，再用PBS洗涤3-5次，随后加入BeyoECL Plus进行发光检测。这样可以通过发光的强弱来确定结合的辣根过氧化物酶标记Streptavidin，从而确定小鼠SIRT1探针上生物素的标记效率。其中，发光检测采用Thermo的多功能酶标仪进行。
参图2所示，添加甜菜碱和甜菜碱类似物后，高GC含量的小鼠SIRT1探针的标记效率显著提高，大约提高到了2.5倍以上。
由以上技术方案可以看出，本发明具有如下有益效果：
本发明中通过在核酸标记体系中添加甜菜碱及甜菜碱类似物，可以显著改善核酸的标记效率，特别是高GC含量的核酸探针的标记效率提高尤为显著，并且具有成本较低的优点；
本发明的核酸探针可应用于各种涉及到核酸检测或核酸与蛋白等其它分子相互作用的检测。
对于本领域技术人员而言，显然本发明不限于上述示范性实施例的细节，而且在不背离本发明的精神或基本特征的情况下，能够以其他的具体形式实现本发明。因此，无论从哪一点来看，均应将实施例看作是示范性的，而且是非限制性的，本发明的范围由所附权利要求而不是上述说明限定，因此旨在将落在权利要求的等同要件的含义和范围内的所有变化囊括在本发明内。不应将权利要求中的任何附图标记视为限制所涉及的权利要求。
此外，应当理解，虽然本说明书按照实施方式加以描述，但并非每个实施方式仅包含一个独立的技术方案，说明书的这种叙述方式仅仅是为清楚起见，本领域技术人员应当将说明书作为一个整体，各实施例中的技术方案也可以经适当组合，形成本领域技术人员可以理解的其他实施方式。
Claims (1)
1.一种核酸探针的标记方法，其特征在于，所述方法包括 ：
在Terminal Deoxynucleotidyl Transferase酶的催化下，把生物素或地高辛标记的dUTP添加到单链DNA的3'末端，产生末端标记的单链DNA探针；
在标记反应体系中添加甜菜碱至最终浓度为0.8M，添加甜菜碱类似物甘氨酸甜菜碱至最终浓度为0.1M。
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