CN110646610B - 一种基于TdT信号放大技术的试纸条及其制备方法 - Google Patents

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Abstract

本发明属于食品安全检测领域，具体涉及一种基于TdT信号放大技术的试纸条及其制备方法，试纸条的结合释放垫上包覆树枝状纳米金复合物，树枝状纳米金复合物包括纳米金‑夹心适配体1‑PolyN1复合物和纳米金‑PolyN2复合物；反应膜包被夹心适配体2的检测限，包被与PolyN2互补的序列探针的质控线。制备包括：结合释放垫浸泡吸收含有树枝状纳米金复合物的缓冲液，干燥；含有标记链霉亲和素‑生物素的夹心适配体2的溶液与含有标记链霉亲合素‑生物素的与PolyN2互补的序列探针的溶液经划膜仪分别包被于反应膜上；沿层析方向将样品垫、结合释放垫、反应膜和吸收垫依次固定于背衬上。该试纸条放大检测信号，提高检测灵敏度。

Description

一种基于TdT信号放大技术的试纸条及其制备方法
技术领域
本发明属于食品安全检测领域，具体涉及一种基于TdT信号放大技术的试纸条及其制备方法。
背景技术
目前对于恩诺沙星的检测手法主要有微生物法、四平板法、光生物感受器测定法、高效液相色谱法、薄屋层析法、液相色谱质谱联用法、超临界流体萃取法、高效毛细管电泳法、表面等离子谐振、免疫分析法等。但这些方法的缺点是仪器昂贵、操作复杂、样品的前期处理比较麻烦同时不具备即时性。其中高效液相色谱法是国标的方法，其检测限可以达到μg/kg级。但此方法前处理较麻烦、需要专业的人员进行操作、成本较高且所需测定时间较长，不适合现场检测。
目前试纸条比较适合现场的即时检测。层析技术具有速度快、抗基质干扰能力强、操作简单等优点，是即时检测的首选方法，同时在食品安全、医药卫生、环境保护等相关领域创新研究的热点。试纸条不需要专业技能和昂贵复杂仪器设备即可实现分析检测。广泛用于激素、病原微生物(病毒、细菌、寄生虫等)、肿瘤标记物、违禁药物、兽药、农药、生物毒素、毒品等靶标的快速检测。免疫层析试纸条快速检测技术是一种非常适合实时和现场检测的成熟技术，具有通用的检测模式、设备和工艺完备，研发时间短，产品上市快，易于大规模批量生产。
尽管目前试纸条的应用前景很是广泛，且可以检测出国标的最高检测限，但检测信号不是很明显，同时市面上的试纸条大多是抗体免疫层析试纸条，费用昂贵易污染，假阳性偏高。
胶体金层析试纸条正好可以规避这些弊端，不需要专业仪器，只需要插入对比即可，具有快速低沉本操作简单，能满足绝大部分食品样品的检测，适用于大量样品的筛选。
常规的胶体金试纸条灵敏度较低，难以实现目标物的快速分析，同时随着监管体系的完善和对检测力度的加强，食品中目标检测物的含量会越来越少，所以对试纸条的灵敏度提出了更高的要求。
发明内容
针对现有技术的不足，本发明提供一种基于TdT信号放大技术的试纸条，放大检测信号，显著提高检测灵敏度，操作简便，易于控制，实现快速检测分析。
本发明还提供一种基于TdT信号放大技术的试纸条的制备方法，简便易操作，不需要专业仪器，成本低。
本发明的技术方案为，一种基于TdT信号放大技术的试纸条，背衬底板上沿层析方向依次固定样品垫、结合释放垫、反应膜和吸收垫，且依次相邻的两者间部分重叠；结合释放垫上包覆树枝状纳米金复合物，树枝状纳米金复合物包括纳米金-夹心适配体1-PolyN1复合物和纳米金-PolyN2复合物，纳米金-夹心适配体1-PolyN1复合物中修饰有PolyN1扩增序列的夹心适配体1以纳米金颗粒为中心呈辐射状分布，纳米金-PolyN2复合物中PolyN2序列以纳米金颗粒为中心呈辐射状分布，纳米金-夹心适配体1-PolyN1复合物与纳米金-PolyN2复合物通过互补杂交固定；PolyN1与PolyN2为互补序列，N1为A或T；反应膜上沿层析方向依次设有检测线和质控线，检测线包被夹心适配体2，质控线包被与PolyN2互补的序列探针；夹心适配体1和夹心适配体2为能够捕获目标检测物的DNA序列。
样品垫与结合释放垫间重叠部位长度为1～2mm，样品垫置于结合释放垫上方；结合释放垫与反应膜间重叠部位长度为1～2mm，结合释放垫置于反应膜上方；反应膜与吸收垫间重叠部位长度为1～3mm，吸收垫置于反应膜上方。
纳米金颗粒的粒径为10～20nm，优选为15nm；PolyN1的长度为100～300个碱基，PolyN2和与PolyN2互补的序列探针的长度为8～15个碱基。
基于链霉亲和素-生物素的亲和作用，夹心适配体2包被于反应膜上形成检测线，夹心适配体2的3’端修饰的生物素结合链霉亲合素，链霉亲合素连接反应膜；与PolyN2互补的序列探针包被于反应膜上形成质控线，与PolyN2互补的序列探针的3’端修饰的生物素结合链霉亲合素，链霉亲和素连接反应膜。
检测恩诺沙星时，夹心适配体1的基因序列为：5’-AAAAAAACCCATCAGGGGGGTAGGCTAACACGGTTCGGC-3’，5’端修饰巯基(SH)，3’端修饰PolyT扩增序列；
夹心适配体2的基因序列为：5’-TCTCTGAGCCCGGGTTATTTCAGGGGGA-3’，3’端修饰生物素(Biotin)。
检测钾离子时，夹心适配体1的基因序列为：5’-AAAAAAAAAAGGTTGGT-3’，5’端修饰巯基(SH)，3’端修饰PolyT扩增序列；夹心适配体2的基因序列为：5’-GTGGTTGG-biotin-3’，3’端修饰生物素(Biotin)。
检测卡那霉素时，夹心适配体1的基因序列为：5'-AAAAAAAAAATGGGGGTTGAG-3’，5’端修饰巯基(SH)，3’端修饰PolyT扩增序列；夹心适配体2的基因序列为5'-GCTAAGCCGA-3'，3’端修饰生物素(Biotin)。
N1为T碱基时，PolyN2序列为：5’-AAAAAAAAAA-3’，5’端修饰巯基(SH)；与PolyN2互补的序列探针为：5’-TTTTTTTTTT-3’，3’端修饰生物素(Biotin)。
N1为A碱基时，PolyN2序列为：5’-TTTTTTTTTT-3’，5’端修饰巯基(SH)；与PolyN2互补的序列探针为：5’-AAAAAAAAAA-3’，3’端修饰生物素(Biotin)。
上述基于TDT信号放大技术的试纸条的制备方法，步骤包括：
a.释放垫浸泡吸收含有树枝状纳米金复合物的缓冲液，干燥，即得包覆树枝状纳米金复合物的结合释放垫；
b.含有标记链霉亲和素-生物素的夹心适配体2的溶液与含有标记链霉亲合素-生物素的与PolyN2互补的序列探针的溶液经划膜仪分别包被于反应膜上形成沿层析方向依次间隔分布的检测线和质控线，即得标记检测线和质控线的反应膜；
c.沿层析方向将样品垫、包覆树枝状纳米金复合物的结合释放垫、标记检测线和质控线的反应膜和吸收垫依次固定于背衬上，前后依次相邻的两者间部分重叠。
步骤a，树枝状纳米金复合物的制备步骤包括：纳米金-夹心适配体1-PolyN1复合物与纳米金-PolyN2复合物于杂交体系中，90℃杂交2min，即得树枝状纳米金复合物。杂交体系中，纳米金-夹心适配体1-PolyN1复合物的浓度为1～3nM，优选为2nM；纳米金-夹心适配体1-PolyN1复合物与纳米金-PolyN2复合物的摩尔浓度比为1：2～4，优选为1：2.5。杂交体系包括去离子水、dN1TP、反应缓冲液和TdT。N1为A或T。
纳米金-夹心适配体1-PolyN1复合物的扩增PolyN1序列与纳米金-PolyN2复合物的PolyN2序列互补杂交结合，纳米金-PolyN2复合物固定结合于纳米金-夹心适配体1-PolyN1复合物上。
纳米金-夹心适配体1-PolyN1复合物的制备步骤包括：TdT酶介导下，纳米金-夹心适配体1复合物与dN1TP于反应缓冲液中，37℃扩增2h，即得纳米金-夹心适配体1-PolyN1复合物。N1为A或T，扩增N1碱基数为100～300个碱基，优选为200～260bp。
扩增保温方式为金属浴或水浴。
反应缓冲液中，纳米金-夹心适配体1复合物的浓度为3～6nM，优选为4nM。
纳米金-夹心适配体1复合物的制备步骤包括：夹心适配体1与胶体金混匀，20℃～28℃反应12～16h；加入PB缓冲液，室温震荡0.5～1h；再分批加入pH7.4、含氯化钠的PB缓冲液，20℃～28℃反应12～16h；去离子水离心洗涤3～4次，即得纳米金-夹心适配体1复合物。
检测恩诺沙星时，夹心适配体1的基因序列为：5’-AAAAAAACCCATCAGGGGGGTAGGCTAACACGGTTCGGC-3’，5’端修饰巯基(SH)；
检测钾离子时，夹心适配体1的基因序列为：5’-AAAAAAAAAAGGTTGGT-3’，5’端修饰巯基(SH)；
检测卡那霉素时，夹心适配体1的基因序列为：5'-AAAAAAAAAATGGGGGTTGAG-3’，5’端修饰巯基(SH)。
夹心适配体1与胶体金的混匀体系中，夹心适配体1的浓度为90～100mM。胶体金中金纳米颗粒的粒径为10～20nm，优选为15nm。
优选25℃反应12h。保温方式为金属浴或水浴。
加入PB缓冲液并震荡均匀的体系中PB浓度与后续加入的pH7.4、含氯化钠的PB缓冲液中PB浓度相同，均为0.01M。加入的PB缓冲液起到缓冲作用，增加胶体金的耐盐度。
加入pH7.4、含氯化钠的PB缓冲液形成的体系中，氯化钠的浓度为0.14～0.16M，优选为0.15M；PB浓度为9～11mM，优选为9.5～10.5mM。pH7.4、含氯化钠的PB缓冲液为老化液，使金纳米颗粒上吸附的DNA站立起来(老化液作用：减少DNA与纳米金之间的静电斥力，让纳米金上的DNA立起来，提高纳米金上DNA的孵育数量，同时站立起来后，便于后续扩增与杂交的顺利进行)，便于后续扩增与杂交的顺利进行。分批缓慢加入pH7.4、含氯化钠的PB缓冲液使得被加入溶液内的离子浓度缓慢增加，避免胶体金发生团聚。
每次去离子水离心洗涤的条件为：4℃、12000rpm离心20min，避免胶体金团聚。
步骤b，含有标记链霉亲和素-生物素的夹心适配体2的溶液的制备步骤包括：夹心适配体2原液与链霉亲和素混匀后，4℃孵育12～16h。夹心适配体2的浓度为65～75μM，优选为66～67μM；夹心适配体2与链霉亲合素的摩尔比为5～7：1，优选为6～6.5：1。
检测恩诺沙星时，夹心适配体2的基因序列为：5’-TCTCTGAGCCCGGGTTATTTCAGGGGGA-3’，3’端修饰生物素(Biotin)；
检测钾离子时，夹心适配体2的基因序列为：5’-GTGGTTGG-biotin-3’，3’端修饰生物素(Biotin)；
检测卡那霉素时，夹心适配体2的基因序列为5'-GCTAAGCCGA-3'，3’端修饰生物素(Biotin)。
步骤b，含有标记链霉亲合素-生物素的与PolyN2互补的序列探针的溶液的制备步骤包括：与PolyN2互补的序列探针原液与链霉亲和素混匀后，4℃孵育12～16h。与PolyN2互补的序列探针的浓度为65～75μM，优选为66～67μM；与PolyN2互补的序列探针与链霉亲合素的摩尔比为5～7：1，优选为6～6.5：1。
N1为T碱基时，与PolyN2互补的序列探针为：5’-TTTTTTTTTT-3’，3’端修饰生物素(Biotin)。
N1为A碱基时，与PolyN2互补的序列探针为：5’-AAAAAAAAAA-3’，3’端修饰生物素(Biotin)。
纳米金-PolyN2复合物的制备步骤包括：PolyN2与胶体金混匀，20℃～28℃反应12～16h；加入PB缓冲液，室温震荡0.5～1h；再分批加入pH7.4、含氯化钠的PB缓冲液，20℃～28℃反应12～16h；去离子水离心洗涤3～4次，即得纳米金-夹心适配体1复合物。
N1为T碱基时，PolyN2序列为：5’-AAAAAAAAAA-3’，5’端修饰巯基(SH)。
N1为A碱基时，PolyN2序列为：5’-TTTTTTTTTT-3’，5’端修饰巯基(SH)。
PolyN2与胶体金的混匀体系中，PolyN2的浓度为90～100mM。胶体金中金纳米颗粒的粒径为10～20nm，优选为15nm。
优选25℃反应12h。保温方式为金属浴或水浴。
上述胶体金的制备步骤包括：向加热至沸腾的氯金酸溶液中加入柠檬酸钠进行反应，反应结束后停止加热，搅拌过夜，即得胶体金。具体地，向加热至沸腾的氯金酸溶液中加入柠檬酸钠溶液。制得的胶体金于4℃冷藏。优选地，先剧烈搅拌再搅拌过夜。
反应体系中，氯金酸的浓度为0.09～0.15g/L，优选为0.095～0.1g/L，更优选为0.096～0.097g/L；氯金酸与柠檬酸钠的质量比为1：2.5～5，优选为1：3.5。反应时间为15～30min，优选为20min。
加热方式为油浴、水浴或金属浴。
纳米金颗粒的粒径为10～20nm，优选为15nm。
步骤c，样品垫与结合释放垫间重叠部位长度为1～2mm，样品垫置于结合释放垫上方；结合释放垫与反应膜间重叠部位长度为1～2mm，结合释放垫置于反应膜上方；反应膜与吸收垫间重叠部位长度为1～3mm，吸收垫置于反应膜上方。
将本发明制备的基于TdT信号放大技术的试纸条的样品垫置于待测样品的原液或提取液等待测样品液中，或者向本发明制备的基于TdT信号放大技术的试纸条的样品垫上滴加待测样品的原液或提取液，进行待测样品的基于核酸适配体的层析检测，操作简便，抗干扰能力强，专属性好，灵敏度高，实时、快速、准确的完成定性和/或定量测定；不需要专业仪器，制备及检测成本低；满足绝大部分食品、医药、环境等领域样品的检测，适用范围广。
基于TdT信号放大技术的检测方法，利用本发明制备的基于TdT信号放大技术的试纸条检测待测样品液。具体地，将本发明制备的基于TdT信号放大技术的试纸条的样品垫置于待测样品的原液或提取液等待测样品液中，或者向本发明制备的基于TdT信号放大技术的试纸条的样品垫上滴加待测样品的原液或提取液。
相对于现有技术，本发明的优点在于：本发明针对现有金标试纸条的信号难以满足市场检测要求，提供一种基于TdT信号放大技术的试纸条及其制备方法，通过可以特异性识别待检样品的适配体1和适配体2，采用夹心法原理，将适配体1通过金硫键与纳米金孵育后，通过TdT酶扩增后所得产物再与Au-polyN互补杂交制得树枝状纳米金复合物，作为信号放大的探针代替常规的Au-aptamer1探针，放大检测信号，显著提高试纸条的检测灵敏度，实现高灵敏检测，同时具有简单、快速、结果容易判读等特点。
本发明基于TdT信号放大技术的试纸条，通过末端转移酶(terminaldeoxynucleotidyl transferase,TdT)的作用原理，37℃即可进行扩增，不需要其他大型仪器进行扩增，将aptamer末端扩增后的适配体与连接纳米金的polyA杂交，进而在试纸条上实现信号放大。相对现有技术，检测信号更加明显。
附图说明
图1为本发明树枝状纳米金复合物的结构示意图。
图2为本发明基于TdT信号放大技术的试纸条结构示意图。
图3为本发明基于TdT信号放大技术的试纸条检测结构判定图，分别为对照例的无效、阴性、阳性检测结果，及本发明试纸条的阳性、无效检测结果。
图4为实施例1基于TdT信号放大技术的试纸条检测恩诺沙星标准溶液的标准曲线图。X轴为恩诺沙星标准溶液浓度的对数，Y轴为T线视觉强度。
图5为采用未扩增纳米金复合物(Au-aptamer1)的试纸条检测恩诺沙星标准溶液的标准曲线图。X轴为恩诺沙星标准溶液浓度的对数，Y轴为T线视觉强度。
具体实施方式
为了使本发明实现的技术手段、创作特征、达成目的与功效易于明白了解，下面结合具体实施例，进一步阐述本发明。
实施例1恩诺沙星检测用胶体金试纸条的制备及检测
(1)制备胶体金
99g水和1mL10g/L氯金酸溶液在磁力搅拌并油浴加热至沸腾后，加入3.5mL10g/L柠檬酸钠溶液反应20min后停止加热，先剧烈搅拌后搅拌过夜，制得胶体金，胶体金中纳米金的粒径为15nm，于4℃储存备用。
(2)组装纳米金与恩诺沙星适配体1(aptamer1)
将20μL修饰巯基的恩诺沙星适配体1(aptamer1，100μmol)与1mL胶体金(2.3nM)混合，25℃过夜后，加入113μL 0.1M PB(PB终浓度为0.01M)，室温震荡30min；再分6次加入总体积为91.89μL、pH＝7.4含氯化钠(2M)的PB溶液(PB浓度为0.01M)，每次加入15.3μL，加完后置于25℃金属浴过夜；然后用去离子水离心洗涤3～4次(每次：12000rpm/20min/4℃)，最后一次离心洗涤后，去除上清液(包含游离的aptamer1)并加入200μL去离子水，4℃储存备用，恩诺沙星适配体1(aptamer1)5’端修饰的巯基连接于纳米金上形成Au-aptamer1，Au-aptamer1的浓度为10nM。
恩诺沙星适配体1(aptamer1)的DNA序列为：5’-SH-TCTCTGAGCCCGGGTTATTTCAGGGGGA-3’。
(3)扩增Au-aptamer1
TdT(Terminal Deoxynucleotidyl Transferase)，末端脱氧核糖核酸转移酶，是一种非模板依赖的DNA聚合酶，可以催化在寡核苷酸、单链或双链DNA的3'羟基端加上dNTP。可以催化的寡核苷酸的最短长度为3个核苷酸，在37℃即可进行扩增反应，不需要其它扩增用大型仪器。
TdT酶对Au-aptamer1进行T碱基扩增，扩增体系为：4μL Au-aptamer1(10nM)，2μL去离子水，1μLdTTP(10mM)，2μLReaction Buffer(5X)，1μL TdT(5U/μl)。将该扩增体系置于37℃金属浴2h得到扩增产物(Au-aptamer1-polyT)，扩增T碱基数大约为200～260bp，扩增产物4℃离心清洗去除上清后重新用扩增体系复溶。
(4)制备树枝状的纳米金复合物溶液
将体积比为1：1的扩增体系复溶的Au-aptamer1-polyT(4nM)与Au-polyA10(10nM)溶液置于PCR中，90℃杂交2min后取出，放至室温，制得树枝状的纳米金复合物溶液(如图1所示)，置于4℃储存备用。
polyA10的5’端修饰SH。
Au-polyA10的制备步骤：将20μL polyA10(100μmol)与1mL粒径15nm胶体金(2.3nM)混合，25℃过夜后，加入113μL 0.1M PB(PB终浓度为0.01M)，室温震荡30min；再分6次加入总体积为91.89μL、pH＝7.4含氯化钠(2M)的PB溶液(PB浓度为0.01M)，每次加入15.3μL，加完后置于25℃金属浴过夜；然后用去离子水离心洗涤3～4次(每次：12000rpm/20min/4℃)，最后一次离心洗涤后，去除上清液(包含游离的aptamer1)并加入200μL去离子水，4℃储存备用，polyA10(aptamer1)5’端修饰的巯基连接于纳米金上形成Au-polyA10，Au-polyA10的浓度为10nM。
(5)制备结合物释放垫
步骤(4)制备的树枝状的纳米金复合物溶液用缓冲液(running buffer：0.5％PEG、1％蔗糖、1％TWEEN20、0.02％MgSO4、0.05％(NH4)2SO4)4℃离心清洗后复溶，结合释放垫置于树枝状的纳米金复合物的复溶液中，采用浸泡法，使得树枝状的纳米金复合物及未与Au-aptamer1杂交的Au-polyA10标记于结合物释放垫上，然后将浸泡后的结合垫置于37℃烘箱内干燥4h，结合物释放垫呈蓬松状态，密封保存。
(6)制备标记链霉亲和素-生物素的恩诺沙星适配体2(aptamer2)的孵育液、标记链霉亲合素-生物素的polyT10的孵育液
取15.6μM链霉亲和素溶液与100μM恩诺沙星适配体2(aptamer2)原液(3’端标记生物素(biotin))，链霉亲和素溶液与aptamer2 DNA原液的体积比为1：2，4℃过夜孵育，储存备用。
恩诺沙星适配体2(aptamer2)的DNA序列为：5’-TCTCTGAGCCCGGGTTATTTCAGGGGGA-Biotin-3’。
取15.6μM链霉亲和素溶液与100μM polyT10原液(3’端标记生物素(biotin))，链霉亲和素溶液与polyT10 DNA原液的体积比为1：2，4℃过夜孵育，储存备用。
polyT10的3’端修饰生物素(Biotion)。
链霉亲和素是一种糖蛋白，分子量60KD，每个分子由4个亚基组成，可以和4个生物素分子亲密结合。链霉亲合素与生物素的结合，特异性强，亲和力大，两者一经结合就极为稳定。由于1个链霉亲合素分子可结合4个生物素分子，形成一种类似晶格的复合体，且链霉亲合素可与硝酸纤维素膜连接，使得标记链霉亲和素-生物素的aptamer2附着在硝酸纤维素膜上形成检测线(T线)，标记链霉亲和素-生物素的polyT10附着在硝酸纤维素膜上形成质控线(C线)。
(7)制备硝酸纤维素反应膜
将步骤(6)制备的标记链霉亲合素-生物素的恩诺沙星适配体2(aptamer2)的孵育液打入划膜仪中，在硝酸纤维素反应膜上划线，形成检测线(T线)。
将步骤(6)制备的标记链霉亲合素-生物素的polyT10的孵育液打入划膜仪中，在硝酸纤维素反应膜上划线，形成质控线(C线)。
硝酸纤维素反应膜上沿层析方向依次排列T线和C线。
(8)组装恩诺沙星检测用试纸条
如图2所示，将样品垫、结合释放垫、硝酸纤维素反应膜和吸水纸(吸收垫)依次黏贴到PVC底板上，样品垫与结合释放垫间重叠部位长度为1～2mm，样品垫置于结合释放垫上方；结合释放垫与硝酸纤维素反应膜间重叠部位长度为1～2mm，结合释放垫置于硝酸纤维素反应膜上方；硝酸纤维素反应膜与吸水纸间重叠部位长度为1～3mm，吸水纸置于硝酸纤维素反应膜上方。用切割机切成5mm宽的试纸条，得到基于TdT信号放大技术的用于恩诺沙星检测的试纸条。
(9)恩诺沙星检测
配制梯度浓度的恩诺沙星标准溶液(0.1g/L、0.01g/L、0.001g/L、0.0001g/L、0.00001g/L、0.000001g/L、0.0000001g/L)，采用本实施例组装的恩诺沙星检测用试纸条进行检测，恩诺沙星标准溶液(0.1g/L、0.01g/L、0.001g/L、0.0001g/L、0.00001g/L、0.000001g/L、0.0000001g/L)对应的试纸条T线视觉强度依次为82、62、55、47、34、19、6，恩诺沙星标准溶液与试纸条T线视觉强度间的线性函数为Y＝11.96x+91.42，R2＝0.985，如图4所示(X轴为恩诺沙星标准溶液浓度的对数，Y轴为T线视觉强度)。
在试纸条的样品垫上滴加待测样品脱脂奶粉，通过吸水纸的层析作用，将结合释放垫上的树枝状纳米金复合物带到硝酸纤维素反应膜上，恩若沙星的检测限达到1μg/L。
取步骤(2)制备的未经扩增Au-aptamer1标记于结合物释放垫上，其中Au含量与本实施例试纸条相同，作为对照。胶体金试纸条检测结果判定图如图3所示，检测同等浓度的待测样品时，本发明TdT酶扩增产物与Au-polyA杂交后得到的树枝状纳米金复合物的颜色比Au-aptamer1显色更深，实现比常规试纸条信号放大的作用。
采用结合物释放垫负载步骤(2)制备的未扩增纳米金复合物(Au-aptamer1)的试纸条进行恩诺沙星标准溶液检测，恩诺沙星标准溶液(0.1g/L、0.01g/L、0.001g/L、0.0001g/L、0.00001g/L)对应的试纸条T线视觉强度依次为51、43、38、19、9，恩诺沙星标准溶液与试纸条T线视觉强度间的线性函数为Y＝10.8x+64.4，R2＝0.959，如图5所示(X轴为恩诺沙星标准溶液浓度的对数，Y轴为T线视觉强度)。
相较于采用未扩增纳米金复合物(Au-aptamer1)的试纸条，本实施例试纸条的灵敏度扩增100倍。
实施例2钾离子检测用胶体金试纸条的制备及检测
(1)制备金溶胶：制备工艺同实施例1。
(2)组装纳米金与钾离子适配体1：制备工艺同实施例1，不同之处在于：钾离子适配体1(aptamer1)的DNA序列为：5’-SH-AAAAAAAAAAGGTTGGT-Biotin-3’，5’端修饰的巯基。
(3)扩增Au-aptamer1：制备工艺同实施例1。
(4)制备树枝状的纳米金复合物溶液：制备工艺同实施例1。
(5)制备结合释放垫：制备工艺同实施例1。
(6)链霉亲和素-生物素标记钾离子适配体2(aptamer2)的孵育液的制备工艺同实施例1，不同之处在于：钾离子适配体2(aptamer2)的DNA序列为：5’-GTGGTTGG-Biotin-3’。
链霉亲合素-生物素标记polyT10的孵育液的制备工艺同实施例1。
(7)制备硝酸纤维素反应膜：制备工艺同实施例1，不同之处在于：链霉亲和素-生物素标记钾离子适配体2(aptamer2)的孵育液在硝酸纤维素反应膜上划线，形成检测线(T线)；链霉亲合素-生物素标记polyT10的孵育液在硝酸纤维素反应膜上划线，形成质控线(C线)。
(8)组装钾离子检测用试纸条：制备工艺同实施例1。
(9)钾离子检测：本实施例胶体金试纸条检测结果判定图同实施例1。
实施例3卡那霉素检测用胶体金试纸条的制备及检测
(1)制备金溶胶：制备工艺同实施例1。
(2)组装纳米金与钾离子适配体1：制备工艺同实施例1，不同之处在于：卡那霉素适配体1(aptamer1)的DNA序列为：5'-SH-AAAAAAAAAATGGGGGTTGAG-3’。
(3)扩增Au-aptamer1：制备工艺同实施例1。
(4)制备树枝状的纳米金复合物溶液：制备工艺同实施例1。
(5)制备结合释放垫：制备工艺同实施例1。
(6)链霉亲和素-生物素标记卡那霉素适配体2(aptamer2)的孵育液的制备工艺同实施例1，不同之处在于：卡那霉素适配体2(aptamer2)的DNA序列为：5'-GCTAAGCCGA-biotin-3'。
链霉亲合素-生物素标记polyT10的孵育液的制备工艺同实施例1。
(7)制备硝酸纤维素反应膜：制备工艺同实施例1，不同之处在于：链霉亲和素-生物素标记卡那霉素适配体2(aptamer2)的孵育液在硝酸纤维素反应膜上划线，形成检测线(T线)；链霉亲合素-生物素标记polyT10的孵育液在硝酸纤维素反应膜上划线，形成质控线(C线)。
(8)组装卡那霉素检测用试纸条：制备工艺同实施例1。
(9)卡那霉素检测：本实施例胶体金试纸条检测结果判定图同实施例1。
上述描述仅为便于本领域的普通技术人员理解和使用本发明，并不以此限制本发明，凡根据本发明原理、构思及范畴所作的等效变化或修饰，均涵盖在本发明的保护范围之内。
Figure IDA0002285721130000011
Figure IDA0002285721130000021

Claims (6)

1.一种基于TdT信号放大技术的试纸条，其特征在于，背衬底板上沿层析方向依次固定样品垫、结合释放垫、反应膜和吸收垫，且依次相邻的两者间部分重叠；
结合释放垫上包覆树枝状纳米金复合物，树枝状纳米金复合物包括纳米金-夹心适配体1-PolyN1复合物和纳米金-PolyN2复合物，纳米金-夹心适配体1-PolyN1复合物中修饰有PolyN1扩增序列的夹心适配体1以纳米金颗粒为中心呈辐射状分布，纳米金-PolyN2复合物中PolyN2序列以纳米金颗粒为中心呈辐射状分布，纳米金-夹心适配体1-PolyN1复合物与纳米金-PolyN2复合物通过互补杂交固定；
PolyN1与PolyN2为互补序列，N1为A或T；
反应膜上沿层析方向依次设有检测线和质控线，检测线包被夹心适配体2，质控线包被与PolyN2互补的序列探针；
夹心适配体1和夹心适配体2为能够捕获目标检测物的DNA序列；
纳米金颗粒的粒径为10～20nm，PolyN1的长度为100～300个碱基，PolyN2和与PolyN2互补的序列探针的长度为8～15个碱基；
所述树枝状纳米金复合物的制备步骤包括：纳米金-夹心适配体1-PolyN1复合物与纳米金-PolyN2复合物于杂交体系中，90℃杂交2min，即得树枝状纳米金复合物；
所述纳米金-夹心适配体1-PolyN1复合物的制备步骤包括：TdT酶介导下，纳米金-夹心适配体1复合物与dN1TP于反应缓冲液中，37℃扩增2h，即得纳米金-夹心适配体1-PolyN1复合物；
夹心适配体2包被于反应膜上形成检测线，夹心适配体2的3’端修饰的生物素结合链霉亲合素，链霉亲合素连接反应膜；与PolyN2互补的序列探针包被于反应膜上形成质控线，与PolyN2互补的序列探针的3’端修饰的生物素结合链霉亲合素，链霉亲和素连接反应膜。
2.权利要求1所述基于TdT信号放大技术的试纸条的制备方法，其特征在于，步骤包括：
a. 释放垫浸泡吸收含有树枝状纳米金复合物的缓冲液，干燥，即得包覆树枝状纳米金复合物的释放垫；
所述树枝状纳米金复合物的制备步骤包括：纳米金-夹心适配体1-PolyN1复合物与纳米金-PolyN2复合物于杂交体系中，90℃杂交2min，即得树枝状纳米金复合物；
所述纳米金-夹心适配体1-PolyN1复合物的制备步骤包括：TdT酶介导下，纳米金-夹心适配体1复合物与dN1TP于反应缓冲液中，37℃扩增2h，即得纳米金-夹心适配体1-PolyN1复合物；
纳米金-夹心适配体1复合物的制备步骤包括：夹心适配体1与胶体金混匀，20℃～28℃反应12～16h；加入PB缓冲液，室温震荡0.5～1 h；再分批加入pH7.4、含氯化钠的PB缓冲液，20℃～28℃反应12～16h；去离子水离心洗涤3～4次，即得纳米金-夹心适配体1复合物；
b. 含有标记链霉亲和素-生物素的夹心适配体2的溶液与含有标记链霉亲合素-生物素的与PolyN2互补的序列探针的溶液经划膜仪分别包被于反应膜上形成沿层析方向依次间隔分布的检测线和质控线，即得标记检测线和质控线的反应膜；
c. 沿层析方向将样品垫、包覆树枝状纳米金复合物的结合垫、标记检测线和质控线的反应膜和吸收垫依次固定于背衬上，前后依次相邻的两者间部分重叠。
3.根据权利要求2所述的制备方法，其特征在于，胶体金的制备步骤包括：向加热至沸腾的氯金酸溶液中加入柠檬酸钠进行反应，反应结束后停止加热，搅拌过夜，即得胶体金。
4.根据权利要求2所述的制备方法，其特征在于，步骤b，含有标记链霉亲和素-生物素的夹心适配体2的溶液的制备步骤包括：夹心适配体2原液与链霉亲和素混匀后，4℃孵育12～16h。
5.根据权利要求2所述的制备方法，其特征在于，步骤b，含有标记链霉亲合素-生物素的与PolyN2互补的序列探针的溶液的制备步骤包括：与polyN2互补的序列探针原液与链霉亲和素混匀后，4℃孵育12～16h。
6.基于TdT信号放大技术的检测方法，其特征在于，利用权利要求1所述的试纸条检测待测样品液。
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