CN110945340B - 分析生物分子3d结构的方法 - Google Patents

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Abstract

本发明涉及测定生物分子例如蛋白质、蛋白质片段和肽三维结构的方法。将生物分子包封在无定形硅石基质中，由此制备针状样品。然后，将原子探针断层成像用于分析针状样品，并将数据用于重构生物分子的三维结构。本发明非常便于生物分子的三维结构的测定。

Description

分析生物分子3D结构的方法
技术领域
本发明实施方案广泛涉及分析生物分子的三维(3D)结构，并特别涉及利用原子探针断层成像技术，测定生物分子的3D结构。
背景
蛋白质的性质和生物功能与其3D结构密切相关。蛋白质3D结构的知识巨大增加药物设计的成功，并且在药物研发领域，对于寻求新治疗剂，评价蛋白质的3D结构无疑是最重要的信息。因此，大量的努力付诸于这些分子3D结构的测定，以发现或合成具有所需药理作用的药物。
对于蛋白质结构测定，两项最常见的试验技术是X-射线衍射和核磁共振(NMR)。在X-射线衍射中，将蛋白质纯化和结晶，并进行通常来自同步加速器源的强束X-射线照射。衍射的X-射线将产生特征的点状图，其被翻译为3D-结构。在最佳情况下，除了蛋白质中的氢和晶体中可能存在的配体，该技术提供具有所有原子的原子解析的详细结构信息。然而，因为不是所有蛋白质容易形成晶体和实现所需信号需要相对大的样品体积(大约2-10mm3)，存在巨大限制。尤其是，已显示跨膜蛋白质难于结晶。当研究柔韧的蛋白质和侧链时，也存在限制，其通常是看不见的。此外，通过结晶蛋白质，蛋白质的拓扑学可能被扭曲，以及不正确地评价生物活性的3D结构。
X-射线衍射的限制一定程度上由NMR补充，其中当在高磁场影响下，用无线电波探测，分析原子的局部环境。NMR的优点是可在液体中直接分析蛋白质，并且蛋白质的柔性是无关的。然而，NMR是耗时的，并需要大量计算机计算。并且，由于NMR谱中的峰重叠，仅可测定小的或中等大小的蛋白质。
除了这些技术，在过去十年中，电子显微镜(EM)技术已得到迅速发展，以适合生物样品的分析。特别是，已利用低温-电子显微镜/断层扫描技术。对于低温透射电子显微镜(cryo-TEM)成像，通常通过在液体乙烷中速冻而使含水样品变成玻璃状物质，以防止水结晶，由此保持蛋白质的完整性。然后，从多个角度获取样品超薄切片的TEM图像，并随后平均化，并利用图像分析组合，以构建蛋白质的3D渲染。利用所述方法，已用分辨率解析蛋白质的3D结构，尽管目前高分辨率图像限于比～300kDa大的蛋白质。对于蛋白质的高分辨率成像和分析，EM的一个限制是不可恢复样品的化学信息。在清晰的对比下，仅得到样品中原子的空间分布。
因此，存在对测定生物分子3D结构的有效技术的需求。
概述
一般目的是提供测定生物分子三维结构的方法。
所述和其他目的通过文中公开的实施方案实现。
实施方案的一方面涉及测定生物分子三维(3D)结构的方法。该方法包含将生物分子包封在无定形硅石(silica)基质中，并制备含有无定形硅石基质的针状样品。该方法还包含进行针状样品(specimen)的原子探针断层成像分析，以测定生物分子的3D结构。
本发明和所附权利要求的方法解决至少一些上述与生物分子例如蛋白质、其片段或肽的3D结构测定相关的问题。这通过将生物分子包埋于无定形硅石基质，用于利用原子探针断层成像(APT)进一步分析而实现。
通过将生物样品包埋于无定形硅石基质中，本发明能制造具有足够机械完整性的针状样品尖端，以允许具有原子分辨率的生物分子的APT分析。
本发明还解决从生物样品减去背景信号的问题。利用无定形硅石基质，可容易地从分析样品体积的背景中，识别碳种类。所述与其中样品尖端由(有机)多聚体构建的先前的方法相比。
附图简述
通过参考下文所述，以及附图，可以最好地理解实施方案，及其其他目标和优点，其中：
图1是描述本发明不同实施方案的流程图，其显示从生物分子包埋至用原子探针断层成像分析的过程。
图2A是扫描电镜(SEM)显微照片，其解释说明聚焦离子束-扫描电镜(FIB-SEM)移出(lift-out)步骤(1-3)，并随后连接至硅石杆(4)，用于由无定形硅石基质制备超尖样品针。
图2B是SEM显微照片，其显示环形研磨步骤，其中产生适合于APT分析的尖端。
图3显示根据实施例1中所述，利用有机硅石前体生产APT样品的合成和构造的概述。
图4描述来自IgG分子聚集物APT重构的原子密度热图，所述聚集物包埋于源自有机硅石前体的无定形硅石基质中。
图5显示根据实施例2中所述，利用无机硅石前体生产APT样品的合成和构造的概述。
图6A描述根据实施例2中所述包埋于源自无机硅石源的无定形硅石基质中的个体IgG分子的TEM显微照片。
图6B是来自根据实施例2中所述包埋于无定形硅石基质中的单一IgG分子的APT重构的3D原子密度热图。
图7描述根据实施例3中所述，经导电单丝电抛光和浸涂制备的硅石包衣的APT样品尖端的制备概述。
图8是根据实施例4中所述，核-壳纳米颗粒的合成概述，其中核由生物分子构成，且壳由无定形硅石基质构成。
图9描述实施例5中所述的方法，其中将生物分子固定在固体载体上，随后包埋于无定形硅石基质中，从中完成FIB-SEM移出，然后环状离子研磨，以生产针状样品，用于APT分析。
图10是解释说明测定生物分子3D结构的方法的流程图。
实施方案详述
本发明实施方案广泛涉及分析生物分子的三维(3D)结构，并且特别是利用原子探针断层成像，测定生物分子的3D结构。
原子探针断层成像(APT)是材料科学中的强有力的方法，能化学分析亚纳米级的3D。该方法是通过施用大的正电场，基于尖针形样品表面的原子和分子的射出。电场引起原子和分子的离子化，由此通过电场加速它们向时间飞行检测器的移动。因为用质谱记录和收集飞行时间，所以可评价到达检测器的各离子的化学身份。位置敏感检测器上的碰撞点保证尖端各离子的侧位置的测定，并且使得样品中的组成原子能3D重构。
现有技术的APT分析的限制因素是针状样品上产生的机械应力，其由高电场引起。这个问题已限制相对硬的固体材料例如金属、半导体和矿物质的分析技术。迄今，还没有利用APT直接获得关于有机材料结构的有意义的信息。其主要原因是有机物机械强度和导电性的缺乏，妨碍表面原子的受控蒸发。
通过制造具有足够机械完整性的针状样品尖端，以保证具有原子分辨率的生物分子APT分析，本发明解决上述APT的缺点。通过将生物分子封闭于无定形硅石基质例如无定形无机硅石或硅酸盐基质或结构中，所述是可能的。
因此，实施方案的一方面涉及测定生物分子3D结构的方法。参见图10，所述方法包含在步骤S1中将生物分子包封于无定形硅石基质中。所述方法还包含在步骤S2中，制备包含无定形硅石基质的针状样品。步骤S3中完成针状样品的原子探针断层成像(APT)分析，以测定生物分子的3D结构。
因此，根据本实施方案，将生物分子包埋于无定形硅石基质中。所述无定形硅石基质有效提供足够的机械强度和完整性，以保证可用于APT分析的针状样品的制造。
无定形硅石基质不但能制造针状样品，而且另外使分析期间从背景中识别含碳生物分子简单化。原因是无定形硅石基质通常不含任何碳，所述碳可干扰生物分子的APT分析。然而，当利用有机聚合物包埋和包封要分析的样品时，从背景中区别相关样品的问题是存在于本领域中。
步骤S2中制备或制造的针状样品具有通常的针形，即细的尖端，其适合于APT分析。针状样品可以是包封生物分子的无定形硅石基质的均一针形样品。然而，还可能的是具有无定形硅石基质放置于其上的核心结构，以形成针形样品，所述将进一步在文中描述。
下文提供本发明实施方案的实例。然而，除了且不限于文中所述的方法或实施方案，本发明可用几种方法实施。
蛋白质的硅石包埋
本实施方案涉及将生物分子例如蛋白质、蛋白质片段和肽以其天然构象状态引入无定形硅石基质中。
已将两种不同类型的硅石前体可交换地用于合成本发明的硅石。第一个实施方案涉及有机途径，其中将醇化物(alkoxide)例如原硅酸四甲基酯、原硅酸四乙基酯、原硅酸四丙基酯或原硅酸四丁基酯或者具有通式Si(OR)4的任何其他醇化物用作硅石前体，其中R是烷基链，优选C1-C8烷基链或者苯基。第二个实施方案涉及无机途径，其中将硅酸钠(水玻璃)用作硅石前体。还可以使用无机和有机硅石前体的混合物。先前工作已确证利用有机和无机硅石前体，包埋于固体硅石后，保存蛋白质，保持结构和功能[1，2]。
当引入水中时，醇化物自发水解，并且缩合，形成硅和氧的无机无定形网状物。该反应取决于有机侧链的性质、pH、H2O/醇化物比率和温度。通过变化所述参数，可控制形成的固体的胶凝时间和物理外观[3]。醇化物的疏水性对于某些制备可以是有利的，其中醇化物穿透至例如较大分子或生物学结构的脂双层或疏水核可有利于二氧化硅沉积，并由此有利于包埋生物分子。
图3中显示生物分子包埋于通过本发明中醇化物途径衍生得到的无定形硅石基质中的方法概述。醇化物水解期间，作为副产物形成醇。为了避免生物分子的解折叠或变性，优选例如通过旋转蒸发除去醇，仅剩下硅酸的水溶液。为了保证生物分子的稳定性，优选将硅酸溶液的固有低pH调节至所关注生物分子的个体生理学范围，然后将生物分子引入到硅石溶液中。
一旦从溶液中蒸发水，由具有通式Na2xSiO2+x或(Na2O)x·SiO2的硅酸钠例如偏硅酸钠(Na2SiO3)、原硅酸钠(Na4SiO4)和焦硅酸钠(Na6Si2O7)制备的硅酸钠水溶液自发形成固态玻璃状硅酸钠凝胶。可通过改变胶凝时间、温度、SiO2:Na2O比率和溶液中加入的离子种类，而控制凝胶的物理性质[4]。图5解释说明本发明所用的生物分子包埋方法的示例。与上文所述的醇化物途径相比，硅酸钠水溶液是碱性的，并由此不适合于在不损害其3D结构的情况下，溶解蛋白质。然而，通过将硅酸钠溶液过离子交换柱，硅酸钠溶液中的Na+离子与酸性离子交换凝胶中的H+离子交换，由此降低pH。然后，通过加入碱/酸或缓冲溶液，将最终pH调节至所需水平。
相对于有机前体，硅酸钠水溶液的应用可能是有利的，因为其在胶凝过程中不形成醇类副产物。如果要分析敏感生物分子，这会是有利的，因为已知醇类损害几种蛋白质的结构完整性。并且，因为醇类是有机分子，当用原子探针分析时，留在形成的硅石中的其任何残留可干扰目标生物分子来源的碳。
尽管硅酸钠是优选的无机硅石前体，然而本发明不限于其。并且，可使用其他无机硅酸盐，代替硅酸钠，或者与硅酸钠组合使用。所述其他无机硅酸盐包含但不限于硅酸钾、硅酸铵和硅酸镁。
利用上述途径，可用各种实施方案，将生物分子包埋于散装硅石基质(a bulkmatrix of silica)中；作为个体分子分散于无定形硅石基质中，预吸附在底物上，引入或原位于支持的脂质双分子层或者引入于脂质单-或双层囊泡中。
因此，在一实施方案中，图10的步骤S1包含在溶胶-凝胶方法中将生物分子包封，所述方法由有机硅石前体和/或无机硅石前体产生溶胶-凝胶。该溶胶-凝胶包含生物分子。
在一实施方案中，有机硅石前体是具有通式Si(OR)4的醇化物。在一优选实施方案中，R是烷基或苯基。在一更优选的实施方案中，R是C1-C8烷基或苯基，并更优选C1-C4烷基或苯基。
在一具体实施方案中，醇化物选自原硅酸四甲基酯、原硅酸四乙基酯、原硅酸四丙基酯、原硅酸四丁基酯及其混合物。
在一实施方案中，无机硅石前体是硅酸钠，优选Na2xSiO2+x、(Na2O)x·SiO2，及其混合物。在所述实施方案中，x是正整数，优选自1、2和3。
除了上述，可将生物分子用原位形成的二氧化硅的包装材料包被，以形成核-壳纳米颗粒，其中核理想地由一个单一的生物分子构成，并且壳由硅石构成[5]。当通过缓慢注射进生物分子溶液中而引入硅石前体时，生物分子表面作为硅石网状物聚合的缩合核，并且围绕生物分子形成固体硅石的“壳”。对于壳的形成，可使用衍生自无机前体、有机前体或者无机和有机前体混合物的硅酸。利用所述方法，规避APT分析的定位个体生物分子的问题，因为个体核壳颗粒比个体分子更容易检测，以及在原子探针样品制备中更容易处理。图8显示含有生物分子的核壳纳米颗粒的合成示意图。
因此，在一实施方案中，图10的步骤S1包括制备核-壳颗粒，其包含含有生物分子的核和由有机硅石前体和/或无机硅石前体原位形成的二氧化硅的壳。
用于本实施方案的有机和/或无机硅石前体可选自上文提供的醇化物和硅酸钠示例。
步骤S1中的包封或包埋优选在至少部分基于待分析的各个体类型生物分子的物理-化学性质的信息完成。例如，根据生物分子的电荷、生物分子的亲水性、生物分子的等电点、生物分子的大小和/或生物分子的浓度，可调整硅石溶液的pH和离子强度中的至少一种。所述基于生物分子性质的硅石溶液的调节防止或至少显著降低生物分子聚集或变性的风险。此外，保证生物分子在无定形硅石基质中的有效分散。无定形硅石基质中生物分子的最佳浓度取决于所关注分子的分子量和化学性质，并可经试验测定。
用于APT分析的样品制备
APT分析利用目标材料(即根据实施方案的无定形硅石基质)制造的超尖针状样品。例如，针状样品的尖端优选具有比100纳米更小的半径。优选利用组合聚焦离子束-扫描电镜(FIB-SEM)方法，完成图10步骤S2中所述尖针状样品的制造。插入显微镜之前，优选将保护性金属层喷至无定形硅石基质表面，以保护所关注区域免于离子束和电子束的损害，并提高表面的导电性。对于另外的保护，优选将大约20x2μm大小的铂(Pt)条或矩形放在显微镜内的表面上。然后，将台子倾斜至优选22°的角度，并在Pt条的两侧完成离子研磨，以便在下面形成楔形。然后，将楔形的一端自由切割，并引入显微操作器的针，并利用Pt沉积将其连接至楔形的游离端。一旦连接，楔形的另一端自由切割，并将针收缩。然后，将具有平顶硅石柱的试样带入视野。让楔形与传导性硅石柱的顶端接触，并利用Pt沉淀连接。一旦一片楔形固定至硅石柱，优选将其从楔形的剩余部分切下。重复该步骤，直到已将3-10片或段楔形装在柱上。然后，优选将Pt沉积在每片的背面。最后，利用具有递减地更小的半径的来自上面的环状磨，产生尖端。用越来越小的离子流，完成磨细，以便将顶点置于所关注的区域，即在无定形硅石基质块中。图2A和2B中显示从铂沉积至最终APT可用的样品尖端的全过程的概述。
在一实施方案中，图10的步骤S2包含在无定形硅石基质上完成聚集离子束(FIB)研磨，以形成含有无定形硅石基质的针状尖端。
在一具体实施方案中，针状尖端优选具有比100nm更小的半径。
在一实施方案中，完成FIB磨制包含FIB磨制无定形硅石基质，以形成无定形硅石基质的楔形物。将楔形物连接到显微操作器的针上。所述实施方案还包含将楔形物段或片安装在导电性硅石柱上，以及FIB磨制段或片，以形成针状尖端。
在另一实施方案中，通过用无定形硅石基质包被预制造的针状尖端或者将无定形硅石基质沉积在预制造的针状尖端，以形成针状尖端，得到具有针状尖端的针状样品。图7中图示本实施方案。因此，在所述实施方案中，图10的步骤S2包含用无定形硅石基质包被预制造的针状尖端，以形成含无定形硅石基质的针状尖端。
在具体实施方案中，针状尖端优选具有比100nm更小的半径。
调节无定形硅石基质合成中的参数，以符合目标生物分子的物理化学性质，这也将对用于原子探针分析的最终样品尖端的机械强度和适应性产生影响。例如，由于衍生自无机物的硅石中低的孔形成，与衍生自有机硅石源例如原硅酸四乙酯(TEOS)的硅石基质相比，当用无机硅石源制备时，具有中性pH的无定形硅石基质在基线强度方面是优良的。
因此，在一实施方案中，图10中的步骤S1包含在由无机硅石前体产生溶胶-凝胶的溶胶-凝胶方法中，将生物分子包封。溶胶-凝胶包含生物分子，并具有中性pH，即大约7的pH，例如6.6～7.3的pH。
原子探针断层成像分析和重构
当使用绿色(λ＝532nm)激光时，利用氧化物的标准分析条件，完成激光-辅助的APT分析。以0.005离子/脉冲的标称蒸发速率，利用具有0.5nJ的脉冲能力的200kHz激光脉冲，启动场蒸发。如果使用UV激光-脉冲的原子探针，可将激光能量降低至大约0.1nJ。分析期间，将尖端底部的温度保持于50K，并且分析室的压力是大约10-9Pa。试验期间，设备的检测效率是大约37％，并可将其假定为在光谱中所有的离子种类中是无差别的。
利用APT的标准方案，完成重构，其中假定尖端恒定的柄角(shank angle)。Geiser等人已详细地描述该方法[6]。通过分析前，检测尖端的高分辨扫描电子显微镜成像，可评价柄角，具有良好的准确度。或者，可使用基于电压的重构，以产生原子断层照片，虽然具有某种受损的精确度[7]。通过将分析的体积分成体素(voxels)，评价生物分子原子成分的空间分布。然后，可用热图的形式，将原子密度分布推导出和可视化。
图1是概述从生物分子包埋至APT分析的本发明不同实施方案的流程图。
本发明解决用于X-射线衍射(XRD)的广泛蛋白样品制备问题，以及蛋白质纯化或结晶引起的蛋白结构完整性的丧失风险。
本发明解决用于NMR或TEM分析的生物样品大小局限性的问题。
本发明实施方案可用于测定可包封于无定形硅石基质中的任何生物分子的3D结构。所述生物分子的非限制的而是解释性的示例包括蛋白质、蛋白质片段和肽，包括酶和抗体。所述实施方案可用于膜蛋白例如整合膜蛋白和跨膜蛋白，以及非膜或溶解蛋白。生物分子还可以是多种蛋白、蛋白片段和/或肽的复合物或者蛋白质、蛋白片段、肽和其他生物分子(例如核苷酸分子、碳水化合物、脂质等)的复合物形式的。
生物分子的其他示例包括脂质和核酸分子例如DNA和/或RNA分子。
实施例
实施例1
利用有机硅石前体制备原子探针样品
对于利用有机硅石前体的蛋白质包埋，将2ml TEOS、972μl水和61μl HCl(0.1M)的混合物在超声浴中超声60分钟，随后再加入4ml milliQ水，以防止立刻胶凝。然后，利用旋转蒸发仪除去水解反应期间形成的乙醇，以避免乙醇对蛋白质结构完整性的损害。在搅拌下，向所述烧瓶中，加入60μl免疫球蛋白G(IgG)(10mg/ml的10mM Sorensen磷酸缓冲液)。然后，将所述溶液在环境气氛中于37℃在标准显微镜载玻片上作为微滴(30μl)或者在小瓶中作为较大体积温孵，以产生散装物质。然后，根据上述，利用FIB-SEM，由形成的含蛋白质的硅石物质制备APT样品针状物。图3显示方法的简图，并且图4显示上述合成所需的APT数据的示例。
实施例2
利用无机硅石前体制备原子探针样品
将含26.5％SiO2的市售硅酸钠溶液(Sigma)用作无机硅石源。在milliQ-水中稀释至～9％后，通过将溶液通过酸性离子交换凝胶柱，将pH调至生理值。在搅拌下，将50μl在10mM磷酸盐缓冲盐水(PBS)中的含3.8mg/ml免疫球蛋白G(IgG)的缓冲液加至100μl稀释的硅石溶液中。然后，将溶液在环境气氛下于37℃，在标准显微镜载玻片上作为微滴(20μl)或者在小瓶中作为较大体积温孵，以产生散装物质。在图5中将本方法进行图示。然后，根据上述，利用FIB-SEM，由含蛋白质的硅石制备APT样品针状物，然后利用原子探针断层成像进行分析。图6A中，显示利用上述制备技术包埋于固体硅石基质中的单个IgG分子的TEM显微照片。图6B显示利用利用相同方案制备的包埋于固体硅石基质中的单个IgG分子的APT分析得到的数据，重构IgG分子。
实施例3
通过包被预制造的原子探针尖端制备原子探针样品
通过电解抛光，由钨丝(直径0.1mm)制造用于原子探针分析的具有适当大小的钨尖端(半径<100nm)。将10mm金属丝段安装于铝座上，以适配于原子探针仪器。将该段的末端重复移进和移出电解液覆盖的金环，向其施用5V AC。当形成足够尖(半径<100nm)的尖端时，停止该步骤。包衣步骤之前，将钨针在氩气等离子室中清洁15min。通过实施例1和实施例2中所述的两种方法中的任何一种，制备硅酸溶液。将含有10mg/ml异硫氰酸荧光素(FITC)标记的兔抗-人IgG(Sigma)的缓冲溶液(PBS，10mM)与硅酸溶液混合，并将预制造的尖端的顶点浸于含蛋白质的硅石溶液中，并立即缩回，并在分析前于环境大气中干燥24h。用荧光显微镜检测样品，以确证蛋白质包衣的存在，并用SEM检测样品，以保证原子探针断层成像分析之前，尖端的适当大小。图7中提供本方法的解释说明。
实施例4
利用生物分子-核-壳硅石颗粒的原子探针样品的制备
通过将上述方法中任何一种制备的250μl硅酸溶液(10mM)缓慢注射(1ml/h)到250μl IgG(IgG的最终浓度是50nm)的缓冲溶液(Sorensen磷酸盐缓冲液10mM)中，制备载有生物分子核的核壳颗粒。为了将合成的核壳颗粒固定在固体支架上，将硅晶片用碱性食人鱼溶液(5:1:1比率的H2O:NH3:H2O2)清洁，并在无水甲苯中用2％氨丙基三乙氧基硅烷(APTMS)功能化。然后，通过将晶片浸于上述颗粒的溶液中60min，将颗粒固定在硅晶片上。然后，将晶片用MilliQ水冲洗，并在气态氮的温和气流下干燥。然后，利用前面所述的聚焦离子束-SEM，完成固定颗粒的APT样品针状物的移出和制备。图8中提供本方法的解释说明。
实施例5
从吸附生物分子的硅石包埋的表面制备原子探针样品
如果针状样品是传导性的，允许电势传导到尖端的顶点，那么APT分析具有更大的成功可能性。为了使针状物中介电材料例如硅石的量最小，设计了特殊的样品制备方法。所述方法具有增加的益处，即在FIB-SEM尖端制备步骤中提供目标，因为将生物分子固定在界面附近，当用电子束成像时，其提供高对比度。在本实施例中，通过在碱性食人鱼溶液中清洗并用蒸馏水彻底冲洗，将硅晶片提供薄的氧化硅层。随后，将晶片在IgG的缓冲溶液(500μg/ml)中浸没1h，以保证蛋白质吸附在表面。然后用蒸馏水洗掉未键合的蛋白质，并将硅酸(总浓度1.7％v/v)混合至溶液中，形成环绕蛋白层的无定形硅石基质。18h后，将晶片用蒸馏水冲洗，并用气态氮干燥。将晶片的顶面用10nm Pd包衣层喷射，以提高导电性，并根据上文所述，完成移出。尖端的含蛋白质的区域可用FIB-SEM靶向，因为利用电子束成像时，Si-SiO2界面给出强烈对比。在针的Si片段上面大约50nm停止研磨，顶点包含蛋白质层。除了吸附蛋白质的包埋表面，还可将上述步骤用于包埋的支持的含蛋白质的脂质双层或者吸附在固体支架上的脂质单-或双层囊泡，用于膜相关的蛋白质的原子探针分析。图9中显示该方法的简图。
应该将上述实施方案理解为本发明的一些解释性实施例。本领域技术人员应该理解在不背离本发明范围的情况下，可进行各种修饰、组合和变化。具体地讲，当技术上可能时，可将不同实施方案的不同部分的方案组合于其他配置中。然而，本发明的范围将通过所附的权利要求书定义。
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Claims (14)

1.测定生物分子三维结构的方法，所述方法包含：
步骤S1，在由有机硅石前体和/或无机硅石前体产生溶胶-凝胶的溶胶-凝胶方法中将所述生物分子包封于无定形硅石基质中，所述溶胶-凝胶包含所述生物分子；
步骤S2，制备含所述无定形硅石基质的针状样品；和
步骤S3，进行所述针状样品的原子探针断层成像分析，以测定所述生物分子的三维结构。
2.根据权利要求1所述的方法，其中包封所述生物分子的步骤S1包括制备核-壳颗粒，该核-壳颗粒包含含有所述生物分子的核和由有机硅石前体和/或无机硅石前体原位形成的二氧化硅的壳。
3.根据权利要求1或2所述的方法，其中所述有机硅石前体是具有通式Si(OR)4的醇化物，其中R是烷基或苯基。
4.根据权利要求3所述的方法，其中R是C1-C8烷基或苯基。
5.根据权利要求4所述的方法，其中R是C1-C4烷基或苯基。
6.根据权利要求5所述的方法，其中所述醇化物选自原硅酸四甲基酯、原硅酸四乙基酯、原硅酸四丙基酯、原硅酸四丁基酯及其混合物。
7.根据权利要求1所述的方法，其中所述无机硅石前体是选自Na2xSiO2+x、(Na2O)x·SiO2的硅酸钠，其中x是正整数。
8.根据权利要求7所述的方法，其中x选自1、2和3。
9.根据权利要求1所述的方法，其中所述无机硅石前体是选自以下的硅酸钠：偏硅酸钠、原硅酸钠和焦硅酸钠。
10.根据权利要求1所述的方法，其中制备所述针状样品的步骤S2包括在所述无定形硅石基质上进行聚焦离子束研磨，以形成含所述无定形硅石基质的针状尖端。
11.根据权利要求10所述的方法，其中进行聚焦离子束研磨包括：
聚焦离子束研磨所述无定形硅石基质，以形成所述无定形硅石基质的楔形物；
将所述楔形物连接至显微操作器的针上；
将所述楔形物的段固定在传导柱上；和
聚焦离子束研磨所述段，以形成所述针状尖端。
12.根据权利要求1所述的方法，其中制备所述针状样品的步骤S2包括用所述无定形硅石基质包被预制备的针状尖端，以形成含所述无定形硅石基质的针状尖端。
13.根据权利要求10所述的方法，其中所述针状尖端具有比100nm更小的半径。
14.根据权利要求1所述的方法，其中所述生物分子选自蛋白质、蛋白质片段和肽。
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