JP7195550B2 - 生体分子の3d構造を分析する方法 - Google Patents
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Description
本実施形態は、タンパク質、タンパク質断片およびペプチドなどの生体分子を、それらの天然の立体配座状態で非晶質シリカマトリックスに組み込むことを含む。
APT分析には、標的材料、すなわち実施形態による非晶質シリカマトリックスから作製された超尖鋭針標本を使用する。例えば、針標本の先端部は、100ナノメートル未満の半径を有することが好ましい。図10のステップS2におけるそのような鋭い針標本の作製は、集束イオンビーム走査電子顕微鏡(FIB-SEM)手順を組み合わせて用いて行うことが好ましい。顕微鏡に挿入する前に、イオンおよび電子ビームによる損傷から関心領域を保護し表面伝導率を高めるために、非晶質シリカマトリックス表面上に保護シリカ層をスパッタすることが好ましい。さらに保護するために、約20x2μmの白金(Pt)のストリップまたは長方形を顕微鏡内部の表面に堆積させることが好ましい。次に、ステージを好ましくは22°の角度に傾け、Ptストリップの両側にイオンミリングを行い、下部にくさびを形成する。次に、くさびの一端を切り離し、マイクロマニピュレータの針を導入し、Ptの堆積によってくさびの解放端に取り付ける。取り付け後、くさびの他端を切り離し、針を引き込む。次に、平頂シリコン支柱を備えたクーポンを視野に入れる。くさびを導電性シリコン支柱の上部に接触させ、Pt堆積を使用して取り付ける。くさびの一部をシリコン支柱に固定した後、くさびの残りの部分を削り落とすことが好ましい。くさびの3~10個のピースまたはセグメントが支柱に取り付けられるまでこの手順を繰り返す。次に、各ピースの裏側にPtを堆積させることが好ましい。最後に、半径が少しずつ小さくなる上からの環状ミリングを用いて先端部を製造する。関心領域、すなわち非晶質シリカマトリックス片に頂点が配置されるように、ミリングはますます小さいイオン電流で行う。図2Aおよび図2Bに、プラチナの堆積から最終的なAPT準備完了試料先端部までのプロセス全体の概要を示す。
レーザアシストAPT分析は、緑色(λ=532nm)レーザを使用した場合の酸化物の標準分析条件を使用して行った。電界蒸発は、パルスごとに0.005イオンの公称蒸発速度で、0.5nJのパルスエネルギーを有する200kHzのレーザパルスにより開始した。UVレーザパルスの原子プローブを使用すると、レーザエネルギーを約0.1nJに低減できる。分析中、先端部の基部の温度は50Kに保持され、分析チャンバ内の圧力は約10-9Paであった。機器の検出効率は実験中約37%であり、スペクトル内のすべてのイオン種について無差別であると想定できる。
例1
有機シリカ前駆体を使用した原子プローブ試料の調製
有機シリカ前駆体を使用したタンパク質の埋め込みでは、TEOS 2ml、水972μlおよびHCl 61μl(0.1M)の混合物を超音波浴で60分間超音波処理した後、超純粋水(milliQ water)4mlを追加して即時のゲル化を防止した。次に、加水分解反応中に形成されたエタノールを、ロータリエバポレータを使用して除去し、エタノールによるタンパク質構造の完全性に対する損傷を回避した。このフラスコに、60μlの免疫グロブリンG(IgG)(ゼーレンセンのリン酸緩衝液10mM中10mg/ml)を攪拌しながら加えた。次に、この溶液を標準の顕微鏡用ガラススライド上の液滴(30μl)として、またはバルク材料を生成するためにバイアル中の大容量として、周囲雰囲気中37℃でインキュベートした。次に、上記のようにFIB-SEMを使用して、形成されたタンパク質含有シリカ材料からAPT標本針を調製した。手順の概略図を図3に示し、上記の合成から取得したAPTデータの例を図4に示す。
無機シリカ前駆体を使用した原子プローブ試料の調製
26.5%SiO2を含む市販のケイ酸ナトリウム溶液(Sigma)を無機シリカの供給源として使用した。超純粋水(milliQ water)で約9%に希釈した後、溶液を酸性イオン交換ゲルカラムに通すことによってpHを生理学的値に調整した。10mMのリン酸緩衝生理食塩水(PBS)中に3.8mg/mlの免疫グロブリンG(IgG)を含む50μlの緩衝液を、100μlの希釈シリカ溶液に攪拌しながら加えた。次に、この溶液を標準の顕微鏡用ガラススライド上の液滴(20μl)として、またはバルク材料を生成するためにバイアル中の大容量として、周囲雰囲気中37℃でインキュベートした。手順の概略を図5に示す。次に、上記のようにFIB-SEMを使用して、形成されたタンパク質含有シリカからAPT標本針を調製し、次に原子プローブ断層撮影法を用いて分析した。図6Aに、上記の調製技術を用いて固体シリカマトリックスに埋め込まれた単一のIgG分子のTEM顕微鏡写真を示す。図6Bは、同じプロトコルを用いて調製した固体シリカマトリックスに埋め込まれた単一のIgG分子のAPT分析から取得したデータを使用したIgG分子の再構成を示す。
予め作製された原子プローブ先端部を被覆することによる原子プローブ試料の調製
原子プローブ分析に適した寸法(半径<100nm)のタングステン先端部を、タングステンワイヤ(直径0.1mm)から電解研磨で作製した。10mmのワイヤセグメントを、原子プローブ機器に嵌合するようにアルミニウムホルダに取り付けた。セグメントの端部を、交流5Vを印加した電解質被覆金ループに繰り返し出し入れした。十分に鋭い(半径<100nm)先端部が形成されると、この手順を停止した。タングステン針は、被覆手順の前にアルゴンプラズマチャンバで15分間洗浄した。ケイ酸の溶液は、例1および例2に記載した2つの方法のいずれかによって調製した。10mg/mlのフルオレセインイソチオシアナート(FITC)標識ウサギ抗ヒトIgG(Sigma)を含む緩衝溶液(PBS、10mM)をケイ酸溶液と混合し、予め作製された先端部の頂点をタンパク質含有シリカ溶液に浸漬し、すぐに引き上げ、分析の前に周囲空気で24時間乾燥させた。試料を蛍光顕微鏡で検査してタンパク質被覆の存在を確認し、原子プローブ断層撮影分析の前にSEMで先端部の適切な寸法を確認した。手順を図7に図示する。
生体分子コアシェルシリカ粒子を使用した原子プローブ試料の調製
生体分子コアを持つコアシェル粒子は、上記のいずれかの方法で調製したケイ酸の溶液250μl(10mM)をIgGの緩衝溶液250μl(ゼーレンセンのリン酸緩衝液10mM)にゆっくり(1ml/時間)注入して調製した(IgGの最終濃度は50nmであった)。合成したコアシェル粒子を固体支持体に固定するために、シリコンウェーハを基本的なピラニア溶液(H2O:NH3:H2O2の比率5:1:1)で洗浄し、無水トルエン中の2%アミノプロピルトリエトキシシラン(APTMS)で官能化した。次に、ウェーハを前述の粒子の溶液に60分間浸漬することにより、シリコンウェーハ上に粒子を固定化した。次に、ウェーハをMilliQ水ですすぎ、気体窒素の穏やかな流れの下で乾燥させた。次に、前述のように集束イオンビームSEMを使用して、固定化粒子のAPT標本針のリフトアウトおよび調製を行った。手順を図8に図示する。
シリカ埋め込み表面吸着生体分子からの原子プローブ試料の調製
APT分析は、針状の試料が導電性で、電位を先端部の頂点に伝播させることが可能である場合に成功の可能性が高い。針の中の誘電材料、すなわちシリカの量を最小限にするために、特殊な試料調製手順を考案した。電子ビームで撮像したときに高いコントラストを与える界面近くに生体分子が固定化されたため、この方法には、FIB-SEMの先端部調製ステップ中に標的を提供するという追加の利点があった。この例では、基本的なピラニアで洗浄し、蒸留水で完全に洗浄することにより、シリコンウェーハに薄い酸化シリコン層を設けた。その後、ウェーハをIgGの緩衝溶液(500μg/ml)に1時間浸漬し、表面にタンパク質を吸着させた。次に、結合していないタンパク質を蒸留水で洗い流し、ケイ酸(総濃度1.7%v/v)を溶液に混合し、タンパク質層を囲む非晶質シリカマトリックスを形成した。18時間後、ウェーハを蒸留水ですすぎ、気体窒素で乾燥させた。伝導率を高めるために、ウェーハの上面に10nmのPd被覆層をスパッタし、上記のようにリフトアウトを実行した。電子ビーム画像化を用いてSi-SiO2界面が鮮明なコントラストを与えたため、FIB-SEMで先端部のタンパク質含有領域を標的化することができた。ミリングは針のSiセグメントの約50nm上で停止し、頂点はタンパク質層を取り囲んでいた。表面吸着タンパク質の埋め込みに加えて、上記の手順は、膜関連タンパク質の原子プローブ分析のために固体支持体に吸着された支持タンパク質含有脂質二重層、または脂質単層もしくは二重層小胞の埋め込みにも適用できる。手順の概略図を図9に示す。
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Claims (14)
- 生体分子の三次元(3D)構造を決定する方法であって、前記方法が
前記生体分子を非晶質シリカマトリックスに封入すること(S1)と、
前記生体分子を封入した前記非晶質シリカマトリックスを含む針標本を調製すること(S2)と、
前記生体分子の前記3D構造を決定するために前記針標本の原子プローブ断層撮影分析を行うこと(S3)と
を含む、方法。 - 前記生体分子を封入すること(S1)が、有機シリカ前駆体および/または無機シリカ前駆体からゾルゲルを生成するゾルゲルプロセスで前記生体分子を封入することを含み、前記ゾルゲルが前記生体分子を含む、請求項1に記載の方法。
- 前記生体分子を封入すること(S1)は、前記生体分子を含むコアと、有機シリカ前駆体および/または無機シリカ前駆体からその場で形成された二酸化ケイ素のシェルとを含むコアシェル粒子を調製することを含む、請求項1に記載の方法。
- 前記有機シリカ前駆体が、Si(OR)4の一般式を有するアルコキシドであり、式中、Rはアルキルまたはフェニルである、請求項2または3に記載の方法。
- RがC1-C8アルキルまたはフェニルである、請求項4に記載の方法。
- RがC1-C4アルキルまたはフェニルである、請求項5に記載の方法。
- 前記アルコキシドが、テトラメチルオルトシリカート、テトラエチルオルトシリカート、テトラプロピルオルトシリカート、テトラブチルオルトシリカートおよびそれらの混合物からなる群より選択される、請求項6に記載の方法。
- 前記無機シリカ前駆体が、Na2xSiO2+x、(Na2O)x・SiO2からなる群より選択されるケイ酸ナトリウムであり、式中、xは正の整数である、請求項2~7のいずれか一項に記載の方法。
- xが1、2および3からなる群より選択される、請求項8に記載の方法。
- 前記針標本を調製すること(S2)は、前記非晶質シリカマトリックスを含む針先を形成するために前記非晶質シリカマトリックス上で集束イオンビーム(FIB)ミリングを行うことを含む、請求項1~9のいずれか一項に記載の方法。
- FIBミリングを行うことは、
前記非晶質シリカマトリックスのくさびを形成するために前記非晶質シリカマトリックスのFIBミリングを行うことと、
前記くさびをマイクロマニピュレータの針に取り付けることと、
前記くさびのセグメントを導電性支柱に取り付けることと、
前記針先を形成するために前記セグメントのFIBミリングを行うことと
を含む、請求項10に記載の方法。 - 前記針標本を調製すること(S2)は、前記非晶質シリカマトリックスを含む針先を形成するために、予め作製された針先を前記非晶質シリカマトリックスで被覆することを含む、請求項1~9のいずれか一項に記載の方法。
- 前記針先が、100nm未満の半径を有する、請求項10~12のいずれか一項に記載の方法。
- 前記生体分子が、タンパク質、タンパク質断片およびペプチドからなる群より選択される、請求項1~13のいずれか一項に記載の方法。
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