CN103411955A - 基于拉曼光谱的头孢类抗生素混合溶液的浓度检测方法 - Google Patents

Abstract

本发明公开了一种基于拉曼光谱的头孢类抗生素混合溶液的浓度检测方法，包括：1）测取已知浓度的孢类抗生素混合溶液的拉曼光谱；2）对步骤一中已知浓度的头孢溶液的拉曼光谱进行预处理；3）通过偏最小二乘法对经过步骤二预处理后的头孢类抗生素混合溶液拉曼光谱行处理，获得校正后的预测模型；4）获得待测头孢类抗生素混合溶液的拉曼光谱，并进行预处理；5）将上述步骤四中预处理后的拉曼光谱输入预测模型，从而得到头孢类抗生素混合溶液的浓度。本发明利用拉曼光谱与多变量头孢菌素类抗生素混合溶液浓度进行检测。该方法快速、准确，有效解决了现有技术存在的局限，对快速实现食品安全检测和实时监控具有重要意义。

Description

基于拉曼光谱的头孢类抗生素混合溶液的浓度检测方法

技术领域

本发明涉及拉曼光谱检测领域，尤其涉及一种拉曼光谱对头孢菌素类抗生素溶液浓度的检测方法。

背景技术

拉曼散射，又称拉曼效应，是光通过介质时由于入射光与分子运动相互作用而引起的频率发生变化的散射。拉曼光谱能提供有关化学物质的组成和分子结构的定性和定量方面的信息。物质拉曼光谱的谱带数目、频率位移、谱带强度和形状等都直接与分子的振动及转动相关联，拉曼散射普遍存在于一切分子中，无论是气体、液体或固体，有机物或无机物。这使得拉曼光谱具有定性分析并对相似物质进行区分的功能。拉曼光谱的峰强度与相应分子的浓度成正比，这是拉曼光谱进行定量分析的基础。拉曼光谱定量分析具有独到之处，不用进行前处理，不用进行样品的特别制备，在原始状态下进行快速无损的检测，可对多组分样品进行分析，对固体、气体、液体都能进行分析；抗水的干扰性比红外光谱强，可提供生物活性样品在水相中的可靠信息。

抗生素药物是广泛用于治疗各种微生物感染性疾病的抗菌药物，它在防治细菌等微生物感染性疾病方面起着不可替代的重要作用。近年来，由于经济利益的驱动，不合理地使用和滥用饲料添加剂的情况经常发生，造成抗生素在动物组织中的残留，并通过食物链进入人体，已经对人类的健康构成了严重的威胁。抗生素对人体存在很多副作用，例如：青霉素类抗生素的神经系统毒性反应，头孢菌素类抗生素的肝肾毒性反应，四环素类抗生素的胃肠道不适反应等。抗生素残留会导致人体内产生耐药性菌株，造成人体内的菌群失调，使人的免疫力降低，严重时可危及病人生命。发展能够快速、准确检测抗生素溶液浓度的拉曼光谱检测方法，实现对抗生素残留的检测，以期为食品质量安全检测提供参考。

目前的头孢菌素类抗生素溶液检测方法有微生物测定法，高效液相色谱法，紫外分光光度法，荧光分析，近红外光谱分析等。这些方法操作繁琐，测试费用高，分析时间长，不能用于在线测量。拉曼光谱测量技术快速准确，无需样品制备，且水的拉曼散射非常弱，适用于水溶液的测量，因此在抗生素残留分析中得到广泛应用。现今对头孢菌素类抗生素混合溶液的拉曼光谱检测还鲜见报道。

发明内容

针对上述现有技术，本发明提供一种基于拉曼光谱的头孢类抗生素混合溶液的浓度检测方法，利用拉曼光谱与多元校正方法相结合的方法对头孢菌素类抗生素混合溶液浓度进行检测。该方法快速、准确，有效解决了现有技术存在的局限，对快速实现食品安全检测和实时监控具有重要意义。

为了解决上述技术问题，本发明基于拉曼光谱的头孢类抗生素混合溶液的浓度检测方法，包括如下步骤：

步骤一：测取已知浓度的校正集头孢类抗生素混合溶液的拉曼光谱；

步骤二：运用平滑、求导、多元散射校正、标准正态变量变换中的一种或多种方法对步骤一测取的拉曼光谱进行预处理；

步骤三：通过偏最小二乘法对经过步骤二预处理后的头孢类抗生素混合溶液拉曼光谱与浓度进行处理，获得经过校正的预测模型；

步骤四：获得待测头孢类抗生素混合溶液的拉曼光谱，并运用平滑、求导、多元散射校正、标准正态变量变换中的一种或多种方法对该待测头孢类抗生素混合溶液的拉曼光谱进行预处理；

步骤五：将上述步骤四中预处理后的拉曼光谱输入预测模型，从而得到头孢类抗生素混合溶液的浓度。

与现有技术相比，本发明的有益效果是：

将拉曼光谱和多元校正方法相结合测量溶液中抗生素含量的方法，与传统检测方法相比测量精度高、测量时间短、测量装置灵敏度高、检测范围广、且对样品无损耗。拉曼光谱检测装置输出直接与计算机联用，可以实时在线检测，便于实现抗生素溶液浓度的监控。

附图说明

图1是本发明基于拉曼光谱的头孢菌素类抗生素检测方法流程图；

图2是本发明中测取拉曼光谱所用的装置；

图3a是预处理前的光谱；

图3b是通过SNV方法预处理后的光谱；

图4a是头孢曲松（CRO）模型浓度预测结果示意图；

图4b是噻孢霉素（CTX）模型浓度预测结果示意图；

图4c是头孢唑林钠（COL）模型浓度预测结果示意图。

具体实施方式

下面结合具体实施方式对本发明作进一步详细地描述。

本发明中所述头孢类抗生素包括头孢曲松（CRO）、噻孢霉素（CTX）、头孢唑林钠（COL），具有抗菌作用强、耐青霉素酶、临床疗效高、毒性低等优点，被广泛应用于治疗动物细菌感染。

如图1所示，本发明基于拉曼光谱的头孢类抗生素混合溶液的浓度检测方法，包括以下步骤：

步骤一、测取已知浓度的校正集头孢类抗生素混合溶液的拉曼光谱。运用正交实验设计方法，配制25组三种抗生素混合溶液的样品，作为分析样品。首先准确称量三种抗生素，再按照一定比例加入水混合配制。头孢曲松（CRO）、噻孢霉素（CTX）、头孢唑林钠（COL）的浓度梯度分别为2-8mg/ml，3-10mg/ml，2-8mg/ml。

本实施例中采用如图2所示拉曼光谱装置测取样本的拉曼光谱，该装置包括激光器1、激发光纤2、光纤探头3、样品池4、收集光纤5、光谱仪6和计算机7；所述激光器1通过激发光纤2与所述光纤探头3的入射口相连，所述光纤探头3的出射口通过所述收集光纤5与所述光谱仪6相连，所述光谱仪6与所述计算机7的USB接口相连。所述激光器1选用波长为785nm的半导体激光器，用以激发拉曼散射，其激光功率为350mw。所述样品池4采用光程为1cm的石英比色皿。所述光谱仪为Ocean Optics QE65000光栅光谱仪，其光学分辨率为6cm^-1，在600-1800cm^-1区域内收集拉曼光谱。

对所有样品，连续测量3次，取3次测量光谱数据的平均值作为该样品的拉曼光谱，每次积分时间120s。

步骤二：运用平滑、求导、多元散射校正、标准正态变量变换中的一种或多种方法对测取的拉曼光谱进行预处理；

其中，平滑可以有效消除光谱中的高频成分而保留低频成分，提高分析信号的信噪比，本方法中的平滑滤波是采用Savitzky-Golay卷积平滑滤波。

导数光谱可以消除基线漂移、强化谱带特征、克服谱带重叠，是常用的光谱预处理方法，一阶导数可以去除同波长无关的基线漂移，二阶导数可以取出同波长线性相关的漂移。

多元散射校正（MSC）通过数学方法将光谱中的散射光信号与化学吸收信息进行分离，补偿在反射光谱中遇到的波长依赖的光散射变化，它可以去除光谱中样品的镜面反射及不均匀性造成的噪声，消除基线的不重复性。

标准正态变量变换（SNV）是一种用于消除光谱中斜度误差和固体颗粒大小不均的预处理方法，可用来消除拉曼光谱中激光光源功率变化、光强衰减等引起的噪声。

步骤三：通过偏最小二乘法对经过步骤二预处理后的头孢类抗生素混合溶液拉曼光谱与浓度进行处理，获得经过校正的预测模型；

偏最小二乘法不同与其他多元分析方法，在光谱数据降维的同时考虑了待测属性矩阵的信息。偏最小二乘法中维数的选取十分重要，如使用的主成分过少，会丢失原始光谱有用信息，预测准确度降低，如主成分过多，会将一些代表噪声的主成分包括进去，产生过拟合。

偏最小二乘法首先对光谱矩阵X和浓度矩阵Y进行分解，其模型为：

X=TP'+E  （1）

Y=UQ'+F  （2）

式（1）中，T和U分别为X和Y的得分矩阵；P和Q分别为X和Y的载荷矩阵；E和F分别为偏最小二乘法拟合残差矩阵。

将S和U作线性回归，B为关联系数矩阵：

U=TB  （3）

B=(T^TT)^-1T^TY  （4）

在预测时，首先根据P求出预处理后待测样品的光谱的得分T_pre，由下式得到浓度预测值：

Y_pre=T_preBQ  （5）

并采用交叉检验（cross validation）方法来确定参数。具体做法是：将m个样本中m-1个作为训练样本，剩下的一个作为预测样本，用训练样本建立校正模型来预测留取的样本用来检验预测的效果。经过反复建模及预测，直到每个样品都被且只被预测一次，计算交叉验证均方根误差（RMSECV）来作为指标评价模型的预测能力，选择交叉验证均方根误差最小的那组为最佳预处理方法。交叉验证均方根误差定义为：

$\mathrm{RMSECV}=\sqrt{\frac{1}{N}\underset{i=1}{\overset{N}{\mathrm{\Σ}}}(y_i-{{\hat{y}}_i}^2)}---\left(6\right)$

式（6）中，y_i，

分别是第i个样本的标准值和预测值，N为训练样本数。

在对光谱数据进行偏最小二乘建模时，对500-2000cm^-1光谱区间内所有变量进行基于jack-knifing算法的变量选择。该算法是对回归向量中的每个元素进行t检验，选出对回归量显著变化做贡献的变量。变量选择能够明显提高模型的预测结果精度，减少偏最小二乘主成分数，降低预测误差。光谱变量选择前后的建模结果比较如表1所示：

表1：变量选择前后对模型参数影响的比较

步骤四：获得待测头孢类抗生素混合溶液的拉曼光谱，并运用平滑、求导、多元散射校正、标准正态变量变换中的一种或多种方法对该待测头孢类抗生素混合溶液的拉曼光谱进行预处理；

对于待测头孢类抗生素混合溶液的拉曼光谱的预处理与步骤二类似。不同预处理方法得到的PLS模型（即偏最小二乘模型）参数如表2所示。比较不同光谱预处理方法结果，选择RMSEP最小的方法。确定预处理方法为标准正态变换（SNV）建立头孢曲松（CRO）浓度的PLS定量模型；平滑3点、标准正态变换（SNV）、一阶3点导数三种方法的结合建立噻孢霉素（CTX）浓度的PLS模型；平滑3点和标准正态变换（SNV）建立头孢唑林钠（COL）浓度的PLS模型。

三个模型的最优预处理方法中均含有标准正态变换，说明本发明中的拉曼光谱数据的噪声主要由激光光源功率变化、光强衰减等引起，该方法较好的消除了这些噪声的影响。图3a为所有样本的原始光谱，经过标准正态变换处理后的光谱如图3b，可以明显看出光谱中噪声的降低以及特征峰的增强。

表2不同预处理方法得到的各个组分PLS模型的RMSECV值

表1中：*号代表相对应的预处理方法为最优方法，平滑（3）代表3点平滑滤波，导数（1-3）代表一阶3点导数。

步骤五：将上述步骤四中预处理后的拉曼光谱输入预测模型，从而得到头孢类抗生素混合溶液的浓度。

为了验证模型的精度和稳定性，通常将已知样品分成校正集和验证集用以对模型的有效性进行验证。

模型验证评价参数包括：预测均方根误差（RMSEP），相关系数（R），相对误差（REP）。各指标定义如下：

$\mathrm{RMSEP}=\sqrt{\frac{1}{M}\underset{i=1}{\overset{M}{\mathrm{\Σ}}}{(y_i-{\hat{y}}_i)}^2}---\left(7\right)$

$R=\sqrt{1-\frac{\underset{i=1}{\overset{M}{\mathrm{\Σ}}}{(y_i-{\hat{y}}_i)}^2}{\underset{i=1}{\overset{M}{\mathrm{\Σ}}}{(y_i-\stackrel{\‾}{y})}^2}}---\left(8\right)$

式（7）和式（8）中，y_i，

分别是第i个样本的标准值和预测值，M为训练样本数，

为标准值的均值，M为测试样本数目。

从25个样本中随机抽取7个样本作为验证集，剩余18个样本作为训练样本。对样本集光谱数据进行相应的预处理以及变量选择，分别建立起三种抗生素浓度的PLS模型。

再将验证集光谱数据代入所建模型，得到的模型验证参数如表3所示，头孢曲松（CRO）模型浓度预测结果如图4a所示；噻孢霉素（CTX）模型浓度预测结果如图4b所示，头孢唑林钠（COL）模型浓度预测结果如图4c所示。

表3.三个PLS模型的预测结果

Components	RMSEP	R	REP
				CRO	0.3625	0.9886	7.62%
CTX	0.3497	0.9852	4.96%
				COL	0.4092	0.9840	8.63%

尽管上面结合图对本发明进行了描述，但是本发明并不局限于上述的具体实施方式，上述的具体实施方式仅仅是示意性的，而不是限制性的，本领域的普通技术人员在本发明的启示下，在不脱离本发明宗旨的情况下，还可以作出很多变形，这些均属于本发明的保护之内。

Claims (1)

1.一种基于拉曼光谱的头孢类抗生素混合溶液的浓度检测方法，其特征在于，包括如下步骤：

步骤一：测取已知浓度的校正集头孢类抗生素混合溶液的拉曼光谱；

步骤二：运用平滑、求导、多元散射校正、标准正态变量变换中的一种或多种方法对步骤一测取的拉曼光谱进行预处理；

步骤三：通过偏最小二乘法对经过步骤二预处理后的头孢类抗生素混合溶液拉曼光谱与浓度进行处理，获得经过校正的预测模型；

步骤四：获得待测头孢类抗生素混合溶液的拉曼光谱，并运用平滑、求导、多元散射校正、标准正态变量变换中的一种或多种方法对该待测头孢类抗生素混合溶液的拉曼光谱进行预处理；

步骤五：将上述步骤四中预处理后的拉曼光谱输入预测模型，从而得到头孢类抗生素混合溶液的浓度。

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