JP7066087B2 - 薬剤感受性測定方法 - Google Patents
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Description
活性状態に応じて呼吸活性が変動して酸素の消費量が増減する検体を含む試料が流れる試料流路が形成された試料流路層、
前記試料流路を流れる前記試料中の酸素を下層に透過させる酸素透過層、
電解液が流れる電解液流路が形成された電解液流路層、
アノード電極及びカソード電極が形成された電極層を積層してなる活性測定デバイスを用いて、
患者が罹患した細菌感染症の迅速診断のために前記検体の呼吸活性を溶存酸素濃度から測定して抗菌薬に対する前記検体の薬剤感受性に応じた有効な抗菌薬を特定する薬剤感受性測定方法であって、
細菌感染した患者から測定対象となる前記検体を含む血液又は喀痰を採取して2~3時間培養して2分割し、一方に抗菌薬を投与した第1の試料と、他方に前記抗菌薬を投与しない第2の試料とを調製する処理と、
第1の前記活性測定デバイスを用い、前記試料流路に前記第1の試料を前記試料流路と前記電解液流路の容積に応じて規定された注入量である50~60μl注入し、前記電解液流路に前記電解液を注入し、酸素電極法を用いて前記第1の試料の溶存酸素濃度を前記電極層で測定する処理と、
第2の前記活性測定デバイスを用い、前記試料流路に前記第2の試料を前記試料流路と前記電解液流路の容積に応じて規定された注入量である50~60μl注入し、前記電解液流路に前記電解液を注入し、酸素電極法を用いて前記第2の試料の溶存酸素濃度を前記電極層で測定する処理と、
前記第1の試料の溶存酸素濃度と、前記第2の試料の溶存酸素濃度を比較して前記検体の薬剤感受性を評価することにより、患者に感染した前記検体に対して有効な抗菌薬を判定する処理であって、複数の抗菌薬と検体との呼吸活性の減弱度合いを段階的に数値化することで、抗菌薬毎における細菌の薬剤感受性の程度を定量的に評価する判定処理と、
を含むことを特徴とする、薬剤感受性測定方法である。
前記検体は、患者に感染した通性菌又は好気性菌である請求項1に記載の薬剤感受性測定方法である。
なお、本明細書に添付する図面は、図示と理解のしやすさの便宜上、適宜縮尺、縦横の寸法比、形状などについて、実物から変更し模式的に表現される場合があるが、あくまで一例であって、本発明の解釈を限定するものではない。従って、添付した図面を用いて説明する実施の形態により、本発明が限定されず、この形態に基づいて当業者などにより考え得る実施可能な他の形態、実施例及び運用技術などは全て本発明の範疇に含まれるものとする。
まず、本発明に係る薬剤感受性測定方法、ストレス測定方法に用いる活性測定デバイスについて説明する。
活性測定デバイス1は、本発明の薬剤感受性測定方法やストレス測定方法の測定対象となる検体を含む試料から酸素透過膜を透過した酸素が溶解した電解液中の溶存酸素濃度を測定するための装置である。
薬剤感受性測定方法では、被験体となる患者に感染する好気性菌や通性菌などの酸素呼吸を行って酸素に基づく代謝機構を備えた生物(細菌)を検体とする。
ストレス測定方法では、ヒトや動物などの被験体(宿主)から採取した好中球など、被験体の疲労度によって抗菌活性の強弱が変化する貪食細胞を検体とする。
試料流路層10は、例えばポリジメチルシロキサン(polydimethylsiloxane:PDMS)、FEP(Perfluoro ethylene propylene copolymer)、アクリル樹脂(Polymethyl methacrylat:PMMA)などの樹脂材料で構成され、直方体形状を成している。また、試料流路層10の層本体11における底面11bには、測定対象となる検体を培養した培養液からなる試料を流す試料流路12が形成されている。
酸素透過層20は、シリコーンゴムなどの酸素透過性を有する膜材料で形成され、試料流路層10を流れる試料中に含まれる酸素を電解液流路層30に透過させる。酸素透過層20は、試料流路層10や電解液流路層30の外形に合せて成形されている。
電解液流路層30は、例えばエポキシ樹脂(SU-8)やFEP(パーフルオロエチレンプロペンコポリマー)などの樹脂材料からなる板材であり、試料流路層10や酸素透過層20の外形に合せて成形されている。また、電解液流路層30の層本体31には、電解液が流れる電解液流路32が形成されている。
電極層40は、ガラスなどの絶縁性を有する基板40a上に、電極形成で用いられる周知のパターン形成法(真空蒸着法、スパッタリング法、フォトリソグラフィ法など)によりアノード電極41、カソード電極42を有する電極パターンが形成されている。
ここで、アノード電極41で起こる酸化反応を下記に示す。
(酸化反応):Ag+4Cl-→4AgCl+4e-
ここで、カソード電極42による還元反応を下記に示す。
(還元反応):O2 +2H2 O+2e- →4OH-
試料流路層10、酸素透過層20、電解液流路層30の外寸は長辺が約2cm、短辺が約1.5cmであり、試料流路12の流路幅は約1.5mm、深さは約500μmである。また、各層の厚さとして、試料流路層10の厚さは約4mm、酸素透過層20の厚さは約30μm、電解液流路s層30の厚さは約50μm、電極層40の厚さは500μmである。また、試料検出領域12aの直径は約1.3mmであり、カソード側測定領域32bの直径は約1mmである。
まず、電極層40の上に電解液流路層30を載置し、裏面に酸素透過層20を接合した試料流路層10を電解液流路層30の上に積層して層構造(積層体)を形成する。重ねる際は、電極層40の電極パターンを基準に順次重ね合わせる。
次に、本発明に係る薬剤感受性測定方法について説明する。
薬剤感受性測定方法の測定対象となる検体(通性菌や好気性菌)は、それ自体が活性状態に応じて呼吸活性が変動して酸素の消費量が増減することが知られている。本願発明者は、これに着目して鋭意研究を重ね、上述した活性測定デバイス1を用いて抗菌薬の有無による検体の酸素消費量を測定することで、酸素消費量の低下の度合いに基づき検体の呼吸活性、すなわち検体の薬剤感受性を定量的に評価する方法を開発した。
なお、各処理は、前段の処理に引き続き行われるが、例えば「試料調製処理」と「デバイス組み立て処理」の順序など、測定に支障が出ない場合は処理順序を入れ替えることも可能である。また、各処理中に記載された数値は、活性測定デバイス1のサイズなどに応じて規定されるものであり、ここでは代表的な数値例を記載する。
薬剤感受性測定方法は、まず細菌感染した被験体である患者から測定対象となる患者検体(酸素呼吸を行う通性菌又は好気性菌)を培養液中で培養する。
患者検体は、患者の血液や喀痰から採取する。血液検体の場合は、例えば患者から5ml程度採血し、これを血液培養(好気性菌・通気性菌用)専用の培養液(約5ml)に入れた後、2~3時間培養する。また、喀痰検体の場合は、例えば患者の喀痰1ml程度を専用の培養液に入れ、2~3時間培養する。
次に、本発明の活性測定デバイス1を組み立て、端子部41a、42aに酸素濃度測定装置を接続する。この処理は、上述したように試料作成処理の前に行うこともできる。
次に、電解液を電解液注入孔14から注入するとともに、調製した試料1を活性測定デバイス1の試料注入孔13から注入する。
なお、試料は、酸素透過層20からの酸素透過量の変動を抑えるため、測定中は流入量が一定となるように注入する。
次に、酸素濃度測定装置と活性測定デバイス1を接続し、活性測定デバイス1に一定電圧(0.5~0.8V)を印加した状態でデバイス内で発生した酸化還元反応による電流値を検出して電解液中の溶存酸素濃度を測定する。
最後に、溶存酸素濃度測定処理で測定した両者の測定結果(溶存酸素濃度)を比較する。
比較した結果、試料1の溶存酸素濃度よりも試料2の溶存酸素濃度の方が減少している場合、試料1の細菌の呼吸活性が減弱していることを示すため、検体である細菌が抗菌薬によって発育が阻害されていると示唆される。この結果から、使用した抗菌薬は、検体となった細菌に対して有効な薬剤であること判定する。
次に、本発明に係るストレス測定方法について説明する。
ストレス測定方法の測定対象となる検体(貪食細胞)は、被験体が受けたストレスの度合い(疲労度)応じて貪食能(抗菌活性)の強弱が変化することが知られている。本願発明者はこれに着目して鋭意研究を重ね、検体と、この検体の貪食対象となる大腸菌などの異物とを共培養し、上述した活性測定デバイス1を用いて異物の酸素消費量を測定することで、異物の呼吸活性に応じた酸素消費量の低下の度合いから貪食細胞の異物に対する抗菌活性の強弱、すなわち被験体のストレス(主にメンタルストレス)による疲労度を定量的に客観評価する方法を開発した。
なお、各処理は、前段の処理に引き続き行われるが、例えば「試料調製処理」と「デバイス組み立て処理」の順序など、測定に支障が出ない場合は処理順序を入れ替えることも可能である。また、各処理中に記載された数値は、活性測定デバイス1のサイズなどに応じて規定されるものであり、ここでは代表的な数値例を記載する。
試料調製処理では、被験体がストレスを受ける前後の試料(ストレスを受ける前の第1の試料:試料A,ストレスを受けた後の第2の試料:試料B)をそれぞれ調製する。なお、以下では試料Aの調製について記載するが、試料Bについても同様の処理を行う。
採取方法としては、被験体であるヒトや動物の血液を0.1ml程度採血し、分離法(比重沈降法、比重遠心法)によって採取される貪食細胞(好中球など)を使用する。
次に、本発明の活性測定デバイス1を組み立て、端子部41a、42aに酸素濃度測定装置を接続する。この処理は、上述したように試料調製処理の前に行うこともできる。
次に、電解液を電解液注入孔14から注入するとともに、調製した試料Aを活性測定デバイス1の試料注入孔13から注入する。
なお、試料は、酸素透過層20からの酸素透過量の変動を抑えるため、測定中は流入量が一定となるように注入する。
次に、酸素濃度測定装置と活性測定デバイス1を接続し、活性測定デバイス1に一定電圧(0.5~0.8V)を印加した状態でデバイス内で発生した酸化還元反応による電流値を検出して電解液中の溶存酸素濃度を測定する。
最後に、溶存酸素濃度測定処理で測定した両者の測定結果(溶存酸素濃度)の差分値に基づいて被験体のストレス度合いを定量的に評価する。
つまり、溶存酸素濃度測定処理で測定した両者の測定結果を比較し、試料Aの溶存酸素濃度よりも試料Bの溶存酸素濃度の方が減少している場合、試料Bの貪食細胞の抗菌活性(貪食能)が減弱して大腸菌の呼吸活性が試料Aより保たれているため、試料Bの貪食細胞は、ストレスによる影響でストレスを受ける前の試料Aよりも抗菌活性が減弱していることが示唆される。このことから、被験体がストレスを受けたときの貪食細胞の抗菌活性の減弱度合いを溶存酸素濃度の差分値に基づいて求めることで、被験体のストレス度合い(疲労度)を定量的に客観評価することができる。
以上説明したように、本発明に係る薬剤感受性測定方法は、まず検体となる細菌を培養液で培養して2分割し、一方の培養液にのみ抗菌薬を投与して抗菌薬あり/なしの2種類の試料を調製する。次に、上から順に、試料流路12が形成された試料流路層10と、試料流路12を流れる試料中の酸素を透過させる酸素透過層20と、電解液流路32が形成された電解液流路層30と、アノード電極41及びカソード電極42が形成された電極層40を積層してなる活性測定デバイス1を用い、培養した各試料を該デバイス1に注入して溶存酸素濃度を測定する。そして、測定した溶存酸素濃度を比較し、抗菌薬を投与した試料の溶存酸素濃度が減少しているときは、検体である細菌の活性が抗菌薬により減弱していることが示唆されるため、抗菌薬が有効であると判断する。
10…試料流路層
12…試料流路
20…酸素透過層
30…電解液流路層
32…電解液流路
40…電極層
41…アノード電極(41a…端子部)
42…カソード電極(42a…端子部)
Claims (2)
- 鉛直方向の上から順に、
活性状態に応じて呼吸活性が変動して酸素の消費量が増減する検体を含む試料が流れる試料流路が形成された試料流路層、
前記試料流路を流れる前記試料中の酸素を下層に透過させる酸素透過層、
電解液が流れる電解液流路が形成された電解液流路層、
アノード電極及びカソード電極が形成された電極層を積層してなる活性測定デバイスを用いて、
患者が罹患した細菌感染症の迅速診断のために前記検体の呼吸活性を溶存酸素濃度から測定して抗菌薬に対する前記検体の薬剤感受性に応じた有効な抗菌薬を特定する薬剤感受性測定方法であって、
細菌感染した患者から測定対象となる前記検体を含む血液又は喀痰を採取して2~3時間培養して2分割し、一方に抗菌薬を投与した第1の試料と、他方に前記抗菌薬を投与しない第2の試料とを調製する処理と、
第1の前記活性測定デバイスを用い、前記試料流路に前記第1の試料を前記試料流路と前記電解液流路の容積に応じて規定された注入量である50~60μl注入し、前記電解液流路に前記電解液を注入し、酸素電極法を用いて前記第1の試料の溶存酸素濃度を前記電極層で測定する処理と、
第2の前記活性測定デバイスを用い、前記試料流路に前記第2の試料を前記試料流路と前記電解液流路の容積に応じて規定された注入量である50~60μl注入し、前記電解液流路に前記電解液を注入し、酸素電極法を用いて前記第2の試料の溶存酸素濃度を前記電極層で測定する処理と、
前記第1の試料の溶存酸素濃度と、前記第2の試料の溶存酸素濃度を比較して前記検体の薬剤感受性を評価することにより、患者に感染した前記検体に対して有効な抗菌薬を判定する処理であって、複数の抗菌薬と検体との呼吸活性の減弱度合いを段階的に数値化することで、抗菌薬毎における細菌の薬剤感受性の程度を定量的に評価する判定処理と、
を含むことを特徴とする薬剤感受性測定方法。 - 前記検体は、患者に感染した通性菌又は好気性菌である請求項1に記載の薬剤感受性測定方法。
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