JP2020063959A

JP2020063959A - 薬剤感受性測定方法、ストレス測定方法

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Publication number: JP2020063959A
Application number: JP2018195281A
Authority: JP
Inventors: 木下　学; Manabu Kinoshita; 学木下
Original assignee: Acquisition Technology and Logistics Agency ATLA
Current assignee: Acquisition Technology and Logistics Agency ATLA
Priority date: 2018-10-16
Filing date: 2018-10-16
Publication date: 2020-04-23
Anticipated expiration: 2038-10-16
Also published as: JP7066087B2

Abstract

【課題】簡便に、且つ短時間に検体の薬剤感受性を測定すること、また被験体のストレス状態を簡便に且つ短時間に客観評価すること。【解決手段】検体となる細菌を培養液で培養して２分割し、一方の培養液にのみ抗菌薬を投与して２種類の試料を調製する。次に、活性測定デバイス１を用いて培養した各試料を該デバイス１に注入して溶存酸素濃度を測定する。そして、測定した溶存酸素濃度を比較し、抗菌薬を投与した試料の溶存酸素濃度が減少しているときは、検体である細菌の活性が抗菌薬により減弱していることが示唆されるため、検体に抗菌薬が有効であると判断する。【選択図】図１

Description

本発明は、細菌の薬剤耐性能を評価するための薬剤感受性測定方法、主に被験体のメンタルストレスを定量的に客観評価するためのストレス測定方法に関する。

例えば、感染症に罹患した被験体となる患者を対象とした疾病を特定する方法として、感染症の原因となる細菌を同定し、さらに同定した細菌が薬剤耐性能の評価を行う薬剤感受性測定方法が用いられる。

従来から知られている薬剤感受性測定法としては、測定対象となる細菌を培養したコロニーを肉眼で観察する微量液体希釈法（液体希釈法、寒天培地希釈法）やディスク拡散法がある。微量液体希釈法は、抗菌薬を含む培地に一定量の菌を巻き、一定時間培養後にその発育を観察して薬剤に対する感受性を評価する。また、ディスク拡散法は、一定量の菌を寒天培地に撒き、その上に一定量の抗菌薬を含んだディスクを置き、一定時間培養後、形成された発育阻止円の大きさから薬剤に対する感受性を評価する。

さらに、上記微量液体希釈法やディスク拡散法のように寒天培地を使用しない他の測定方法としては、細菌と抗菌剤を一定時間共培養してＰＣＲ反応法を用いて細菌の残存菌量のＤＮＡ量を測定して薬剤に対する感受性を測定する方法や、下記特許文献１に開示されるような耐性菌の検知装置を用いる方法が公知である。

ところで、ストレスなどによって免疫機能が低下した状態にある患者は、弱毒性の病原体によっても感染症（日和見感染症）を発症する場合がある。このため、上記のような起炎菌サイドの対策である細菌同定・薬剤感受性測定方法と平行して、感染細菌の宿主となる患者サイドのストレス状態を評価することも実際の有効な治療施策には必要となる。

ストレスには、精神的なストレスから重度熱傷のような致死的な侵襲に至るまで様々な種類や程度が存在するため、これらを統合的に評価する必要がある。

熱傷や多発外傷、高度侵襲手術などの重度の外科的侵襲（ストレス）にさらされた生体では、免疫能が低下して感染抵抗性が減弱化する、所謂compromised hostの状態となることが知られている。このことは翻って見ると、感染抵抗性がストレス負荷の指標と成り得ることを示唆させるため、侵襲による状態を判断することである程度のストレス評価が可能である。

一方、精神的なストレスの評価には、外科的なストレス指標とは異なった、自覚症のような患者自身の心理的要因を重視した主観的評価が指標とされることが多く、またストレス疲労状態は個人差が大きいため、的確なストレス評価を下すのは非常に困難である。そこで、客観的な指標を目指してストレス評価を定量的に評価する方法として、例えば下記特許文献２に開示される方法が開発されている。

特開平７−３０８１８４号公報特開２０１３−１１０９６９号公報

現在普及している薬剤感受性測定方法では、何れも測定対象となる細菌を培養する時間が必要となるが、寒天培地を用いる微量液体希釈法やディスク拡散法、特許文献１に開示される装置を用いた方法では、培養に１２時間〜２４時間を要するため、判定結果が得られるまでに時間がかかるという問題があった。

また、ＰＣＲ反応法を用いた方法では、ＤＮＡの増幅処理が必要となるが分析完了までに１〜２時間程度と、寒天培地を用いる上記各方法と比べて測定時間が短いという利点がある一方、この方法では細菌のＤＮＡ量を測定して評価しているため、死菌のＤＮＡ量も合せて測定してしまうため、実際に活性している細菌がどの程度存在しているかを測定することができず、正確な薬剤耐性能を評価することができなかった。

また、特許文献２に開示されるストレス評価方法は、ＰＣＲ反応法により遺伝子の発現量を測定してストレスの有無を評価する方法であるため、やはり薬剤感受性測定方法と同様、１〜２時間程度の測定時間を要し、判定結果が得られるまでに時間がかかるという問題があった。

そこで、本発明は上記問題点に鑑みてなされたものであり、簡便に、且つ短時間で正確な測定が行える薬剤感受性測定方法、ストレス測定方法を提供することを目的とする。

上記した目的を達成するため、本発明の第１の態様は、鉛直方向の上から順に、
活性状態に応じて呼吸活性が変動して酸素の消費量が増減する検体を含む試料が流れる試料流路が形成された試料流路層、
前記試料流路を流れる前記試料中の酸素を下層に透過させる酸素透過層、
電解液が流れる電解液流路が形成された電解液流路層、
アノード電極及びカソード電極が形成された電極層を積層してなる活性測定デバイスを用いて前記検体の薬剤感受性能を測定する薬剤感受性測定方法であって、
被験患者から前記検体を採取して培養して２分割し、一方に抗菌薬を投与した第１の試料と、他方に前記抗菌薬を投与しない第２の試料とを調製する処理と、
前記試料流路に前記第１の試料を注入し、前記電解液流路に前記電解液を注入し、酸素電極法を用いて前記第１の試料の溶存酸素濃度を前記電極層で測定する処理と、
前記試料流路に前記第２の試料を注入し、前記電解液流路に前記電解液を注入し、酸素電極法を用いて前記第２の試料の溶存酸素濃度を前記電極層で測定する処理と、
前記第１の試料の溶存酸素濃度と、前記第２の溶存酸素濃度と比較して前記検体の薬剤感受性を評価する処理と、
を含むことを特徴とする、薬剤感受性測定方法である。

本発明の第２の態様は、鉛直方向の上から順に、
活性状態に応じて抗菌活性が変動する検体を含む試料が流れる試料流路が形成された試料流路層、
前記試料流路を流れる前記試料中の酸素を下層に透過させる酸素透過層、
電解液が流れる電解液流路が形成された電解液流路層、
アノード電極及びカソード電極が形成された電極層を積層してなる活性測定デバイスを用いて前記検体の宿主である被験体のストレス状態を測定するストレス測定方法であって、
ストレスを受ける前の被験体から採取した前記検体と、該検体が貪食する異物とを共培養して第１の試料を調製する処理と、
ストレスを受けた後の被験体から採取した前記検体と、該検体が貪食する異物とを共培養して第２の試料を調製する処理と、
前記試料流路に前記第１の試料を注入し、前記電解液流路に前記電解液を注入し、酸素電極法を用いて前記第１の試料の溶存酸素濃度を前記電極層で測定する処理と、
前記試料流路に前記第２の試料を注入し、前記電解液流路に前記電解液を注入し、酸素電極法を用いて前記第２の試料の溶存酸素濃度を前記電極層で測定する処理と、
前記第１の試料の溶存酸素濃度と、前記第２の溶存酸素濃度との差分値に基づいて前記被験体のストレス度合いを評価する処理と、
を含むことを特徴とする、ストレス測定方法である。

本発明の薬剤感受性測定方法によれば、検体の呼吸活性を溶存酸素濃度から定量的に知得することができるため、使用した抗菌薬に対する検体の薬剤感受性に応じて有効な抗菌薬を容易に特定することができる。また、この方法を用いることで、従来の薬剤感受性測定方法と比べて薬剤感受性を判定する時間が格段に短くなり、細菌感染症の迅速診断に大いに貢献することができる。

本発明に係るストレス測定方法によれば、検体の抗菌活性を溶存酸素濃度から定量的に知得することができるため、被験体のストレス・疲労度を溶存酸素濃度から定量的に客観評価することができる。また、この方法を用いることで、従来のストレス評価法と比べてストレス評価を判定する時間が格段に短くなり、被験体のストレス度合いを迅速に客観評価することができる。

さらに、検体の薬剤感受性能や抗菌活性能の測定に用いる活性測定デバイスは、構成が簡素で、且つ持ち運び可能な程度の小型であるため、従来法のようにＰＣＲ反応装置のような検査装置を設置するスペースを確保する必要もなく、測定場所も屋内，屋外を問わない。また、デバイス自体が小型であるため、検体を培養した試料や電解液を使用量が非常に少なくて済み、被験体から検体を採取する際も、被験体への負担を最小限に止めることができる。

（ａ）は本発明で使用する活性測定デバイスの各構成を示す概略分解斜視図であり、（ｂ）は該デバイスを組み立てた状態で試料流路層側から見た概略平面図である。同デバイスの溶存酸素濃度測定部分を示す概略断面図である。本発明に係る薬剤感受性測定方法の処理フローを示す図である。本発明に係るストレス測定方法の処理フローを示す図である。

以下、本発明を実施するための形態について、添付した図面を参照しながら詳細に説明する。
なお、本明細書に添付する図面は、図示と理解のしやすさの便宜上、適宜縮尺、縦横の寸法比、形状などについて、実物から変更し模式的に表現される場合があるが、あくまで一例であって、本発明の解釈を限定するものではない。従って、添付した図面を用いて説明する実施の形態により、本発明が限定されず、この形態に基づいて当業者などにより考え得る実施可能な他の形態、実施例及び運用技術などは全て本発明の範疇に含まれるものとする。

また、本明細書において、添付する各図を参照した以下の説明において、方向乃至位置を示すために上、下、左、右の語を使用した場合、これはユーザが各図を図示の通りに見た場合の上、下、左、右に一致する。

［活性測定デバイス］
まず、本発明に係る薬剤感受性測定方法、ストレス測定方法に用いる活性測定デバイスについて説明する。
活性測定デバイス１は、本発明の薬剤感受性測定方法やストレス測定方法の測定対象となる検体を含む試料から酸素透過膜を透過した酸素が溶解した電解液中の溶存酸素濃度を測定するための装置である。

図１に示すように、活性測定デバイス１は、試料流路層１０と、酸素透過層２０と、電解液流路層３０と、電極層４０とで構成される。活性測定デバイス１は、鉛直方向の上から順に試料流路層１０、酸素透過層２０、電解液流路層３０、電極層４０を積層し、この積層体の表裏面側からアクリル板などの固定部材（図示せず）で挟持して積層状態を保持させる。

活性測定デバイス１の活性測定対象となる検体は、薬剤感受性測定方法とストレス測定方法とで異なる。
薬剤感受性測定方法では、被験体となる患者に感染する好気性菌や通性菌などの酸素呼吸を行って酸素に基づく代謝機構を備えた生物（細菌）を検体とする。
ストレス測定方法では、ヒトや動物などの被験体（宿主）から採取した好中球など、被験体の疲労度によって抗菌活性の強弱が変化する貪食細胞を検体とする。

検体を培養する培養液は、検体となる細菌や細胞の培養に適した溶液を適宜選択して使用することができる。また、電解液は、例えば水や緩衝液（例えばトリス塩酸緩衝液）など、電極層４０による酸化還元反応を阻害しない電気伝導性を有する溶液であれば特に制限はない。

＜試料流路層＞
試料流路層１０は、例えばポリジメチルシロキサン（polydimethylsiloxane：ＰＤＭＳ）、ＦＥＰ（Perfluoro ethylene propylene copolymer）、アクリル樹脂（Polymethyl methacrylat：ＰＭＭＡ）などの樹脂材料で構成され、直方体形状を成している。また、試料流路層１０の層本体１１における底面１１ｂには、測定対象となる検体を培養した培養液からなる試料を流す試料流路１２が形成されている。

試料流路１２の一端は、層本体１１の表面１１ａから底面１１ｂに向かって鉛直方向に形成された試料注入孔１３の注入側開口（始端）と反対側の開口（終端）と連通し、他端は層本体１１の側面（１１ｃ〜１１ｆの何れか）を介して外部と連通する溝である。この溝は、層本体１１の底面１１ｂとその下面に配置される酸素透過層２０の表面とが当接することで試料流路１２として機能する。試料流路１２は、その流路幅や深さはマイクロオーダーとなるため、例えば固体レーザや気体レーザを用いた周知のレーザ加工装置によって刻設される。

図１において、本実施形態の試料流路１２は、層本体１１の一方の短側面１１ｃ側近傍に形成された試料注入孔１３の終端を始点とし、ここから他方の短側面１１ｄに向かって直線状に刻設され、ここから一方の長側面１１ｅ側に向かって略直角に折れ曲がり長側面１１ｅの手前側まで刻設され、ここから短側面１１ｃ側に向かって略直角に折れ曲がり、最終的に短側面１１ｃの壁面まで刻設されている。

なお、試料流路１２の形状はこれに限定されず、電極層４０に形成される電極形状に合せて刻設すればよい。

また、試料流路１２には、酸素透過層２０を介して試料流路層１０と電解液流路層３０とを積層したときに、後述するカソード側測定領域３２ｂ及びカソード電極４２と上下方向（鉛直方向）で対向する位置に試料検出領域１２ａが形成されている。図２に示すように、この試料検出領域１２ａに試料流路１２を流れる試料が一時的に収容されることで、カソード電極４２の還元反応で還元される酸素がカソード側測定領域３２ｂ内に透過される。試料検出領域１２ａの形状は、カソード電極４２の形状に合せて適宜設定される。図２には、ストレス測定方法で使用する試料（検体となる好中球＋異物（大腸菌）を共培養した培養液）と電解液を流した活性測定デバイス１を模式的に示している。

試料は、試料注入孔１３からマイクロシリンダのような注入器を用いて注入されるが、注入した試料の流れが試料流路１２中で滞ると電解液流路層３０側に透過する酸素の透過量が変動して正確な溶存酸素濃度が測定できない虞がある。そのため、測定中は試料流路１２に流す試料の流量が一定となるように注入する必要がある。

また、層本体１１の所定箇所には、表面１１ａから底面１１ｂに貫通する電解液注入孔１４が形成されている。電解液注入孔１４は、酸素透過層２０を介して試料流路層１０と電解液流路層３０とを積層したときに、酸素透過層２０の貫通孔２１と電解液流路層３０の流入部３１ａと上下方向（鉛直方向）で連通する位置に形成されている。後段で詳述するが、電解液流路層３０には、電解液注入孔１４における注入側開口（始端）と反対側の開口（終端）を始点とする電解液流路３２が形成される。

電解液についても、試料と同じように電解液注入孔１４からマイクロシリンダのような注入器を用いて注入される。

＜酸素透過層＞
酸素透過層２０は、シリコーンゴムなどの酸素透過性を有する膜材料で形成され、試料流路層１０を流れる試料中に含まれる酸素を電解液流路層３０に透過させる。酸素透過層２０は、試料流路層１０や電解液流路層３０の外形に合せて成形されている。

また、酸素透過層２０の所定箇所には、酸素透過層２０を介して試料流路層１０と電解液流路層３０とを積層したときに、電解液注入孔１４の終端と電解液流路３２の流入部３２ａと上下方向（鉛直方向）で連通する貫通孔２１が形成されている。

＜電解液流路層＞
電解液流路層３０は、例えばエポキシ樹脂（ＳＵ−８）やＦＥＰ（パーフルオロエチレンプロペンコポリマー）などの樹脂材料からなる板材であり、試料流路層１０や酸素透過層２０の外形に合せて成形されている。また、電解液流路層３０の層本体３１には、電解液が流れる電解液流路３２が形成されている。

電解液流路３２の一端が電解液注入孔１４の終端と連通し、他端は層本体３１の側面を介して外部と連通し、層本体３１の厚み方向に貫通した溝（貫通溝）である。電解液流路３２は、酸素透過層２０と、電極層４０との間に挟持されることで上下方向が塞がれて流路として機能する。電解液流路３２は、その流路幅や深さはマイクロオーダーであるため、試料流路１２と同様、例えば固体レーザや気体レーザを用いた周知のレーザ加工装置によって刻設される。

図１において、本実施形態の電解液流路３２は、層本体３１の一方の短側面３１ｃ側近傍に形成された電解液注入孔１４の終端を始点とし、ここから他方の短側面３１ｄに向かって直線状に刻設され、ここから一方の長側面３１ｅ側に向かって略直角に折れ曲がった後、クランク状に折れ曲がって長側面３１ｅの手前側まで刻設され、ここから短側面３１ｃ側に向かって略直角に折れ曲がり、最終的に短側面１１ｃの壁面まで刻設されている。

なお、電解液流路３２の形状はこれに限定されず、電極層４０に形成される電極形状に合せて刻設すればよい。

また、電解液流路３２には、酸素透過層２０を介して試料流路層１０と電解液流路層３０とを積層したときに、試料検出領域１２ａ及びカソード電極４２と上下方向（鉛直方向）で対向する位置にカソード側測定領域３２ｂが形成されている。カソード側測定領域３２ｂに電解液が一時的に収容されることで、カソード電極４２による還元反応が行われる。カソード側測定領域３２ｂの形状は、カソード電極４２の形状に合せて設定される。

さらに、電解液流路３２には、酸素透過層２０を介して試料流路層１０と電解液流路層３０とを積層したときに、アノード電極４１と上下方向（鉛直方向）で対向する位置にアノード側測定領域３２ｃが形成されている。アノード側測定領域３２ｃに電解液が一時的に収容されることで、アノード電極４１による酸化反応が行われる。アノード側測定領域３２ｃの形状は、アノード電極４１の形状に合せて設定される。

＜電極層＞
電極層４０は、ガラスなどの絶縁性を有する基板４０ａ上に、電極形成で用いられる周知のパターン形成法（真空蒸着法、スパッタリング法、フォトリソグラフィ法など）によりアノード電極４１、カソード電極４２を有する電極パターンが形成されている。

本発明の活性測定デバイス１は、電解液中の溶存酸素濃度を測定するため、アノード電極４１，カソード電極４２間に一定電圧（０．５〜０．８Ｖ）をかけた状態で隔膜（酸素透過層２０）を透過した酸素が作用電極上で還元反応を起こして電解液中の溶存酸素濃度に比例したポーラログラフ的限界電流の電流値から溶存酸素濃度を測定する酸素電極法（クラーク型酸素電極法）の原理に基づく電極パターンとなる。

よって、電極パターンに一定電圧をかけつつ電極間の電流値を測定するため、酸素濃度測定装置として印加電圧を定電位に固定制御しながら電流値が測定可能な定電位測定機能を備えた装置を使用する。

アノード電極４１は、電極材料として銀／塩化銀（Ａｇ／ＡｇＣｌ）を用いて所定の電極パターンに形成され、クラーク型酸素電極における対極として機能する。また、基板４０ａの端部には、図示しない酸素濃度測定装置と接続される端子部４１ａが形成され、配線４１ｂを介してアノード電極４１と端子部４１ａとが導通されている。
ここで、アノード電極４１で起こる酸化反応を下記に示す。
（酸化反応）：Ａｇ＋４Ｃｌ−→４ＡｇＣｌ＋４ｅ^-

カソード電極４２は、電極材料として白金（Ｐｔ）を用いて所定の電極パターンに形成され、クラーク型酸素電極における作用電極として機能する。また、基板４０ａの端部には、酸素濃度測定装置と接続される端子部４２ａが形成されており、配線４２ｂを介してカソード電極４２と端子部４２ａとが導通されている。
ここで、カソード電極４２による還元反応を下記に示す。
（還元反応）：Ｏ₂＋２Ｈ₂Ｏ＋２ｅ^-→４ＯＨ^-

なお、上述した活性測定デバイス１の構成において、具体的な寸法例を例示する。
試料流路層１０、酸素透過層２０、電解液流路層３０の外寸は長辺が約２ｃｍ、短辺が約１．５ｃｍであり、試料流路１２の流路幅は約１．５ｍｍ、深さは約５００μｍである。また、各層の厚さとして、試料流路層１０の厚さは約４ｍｍ、酸素透過層２０の厚さは約３０μｍ、電解液流路ｓ層３０の厚さは約５０μｍ、電極層４０の厚さは５００μｍである。また、試料検出領域１２ａの直径は約１．３ｍｍであり、カソード側測定領域３２ｂの直径は約１ｍｍである。

次に、活性測定デバイス１の組み立て手順を説明する。
まず、電極層４０の上に電解液流路層３０を載置し、裏面に酸素透過層２０を接合した試料流路層１０を電解液流路層３０の上に積層して層構造（積層体）を形成する。重ねる際は、電極層４０の電極パターンを基準に順次重ね合わせる。

そして、層構造となった積層体を、図示しない固定部材（例えばアクリル板材）により上下から挟み込み、この挟持状態のまま固定治具（ネジ）で固定部材を複数箇所（例えば四方）固定して組み立てが完了する。

以上のように、本発明で使用する活性測定デバイス１は、鉛直方向の上から順に、試料流路層１０と、酸素透過層２０と、電解液流路層３０と、電極層４０とを積層させた小型のデバイスであり、試料注入孔１３から検体の試料を注入するとともに電解液注入孔１４から電解液を注入し、電極層４０に酸素濃度測定装置を接続して定電位に制御しながら酸化還元反応を行い、電解液中の溶存酸素濃度を測定する。

活性測定デバイス１は、そのサイズが数センチ四方と小型であるため、設置スペースを確保する必要はなく、また持ち運びも容易に行えるため、測定場所が病院内に限らず屋外でも使用することができる。さらに、デバイス自体が非常に小型であるため、検体を培養した試料や電解液の量が数十μｌ程度と非常に少なくて済み、測定対象となる検体を採取する被験体への負担を最小限に止めることができる。

［薬剤感受性測定方法］
次に、本発明に係る薬剤感受性測定方法について説明する。
薬剤感受性測定方法の測定対象となる検体（通性菌や好気性菌）は、それ自体が活性状態に応じて呼吸活性が変動して酸素の消費量が増減することが知られている。本願発明者は、これに着目して鋭意研究を重ね、上述した活性測定デバイス１を用いて抗菌薬の有無による検体の酸素消費量を測定することで、酸素消費量の低下の度合いに基づき検体の呼吸活性、すなわち検体の薬剤感受性を定量的に評価する方法を開発した。

ここで、薬剤感受性測定方法で行われる各処理内容を、図３に示す処理手順に沿って説明する。
なお、各処理は、前段の処理に引き続き行われるが、例えば「試料調製処理」と「デバイス組み立て処理」の順序など、測定に支障が出ない場合は処理順序を入れ替えることも可能である。また、各処理中に記載された数値は、活性測定デバイス１のサイズなどに応じて規定されるものであり、ここでは代表的な数値例を記載する。

（試料調製処理）
薬剤感受性測定方法は、まず細菌感染した被験体である患者から測定対象となる患者検体（酸素呼吸を行う通性菌又は好気性菌）を培養液中で培養する。
患者検体は、患者の血液や喀痰から採取する。血液検体の場合は、例えば患者から５ｍｌ程度採血し、これを血液培養（好気性菌・通気性菌用）専用の培養液（約５ｍｌ）に入れた後、２〜３時間培養する。また、喀痰検体の場合は、例えば患者の喀痰１ｍｌ程度を専用の培養液に入れ、２〜３時間培養する。

次に、培養液を２つに分ける。２つに分けた試料のうち、一方は抗菌薬を投与した第１の試料（試料１）とし、他方は抗菌薬を投与しない第２の試料（試料２）とする。試料１，２は各々０．０８ｍｌ〜０．２ｍｌの範囲で調製する。

（デバイス組み立て処理）
次に、本発明の活性測定デバイス１を組み立て、端子部４１ａ、４２ａに酸素濃度測定装置を接続する。この処理は、上述したように試料作成処理の前に行うこともできる。

（液体注入処理）
次に、電解液を電解液注入孔１４から注入するとともに、調製した試料１を活性測定デバイス１の試料注入孔１３から注入する。

試料や電解液は、マイクロシリンジなどの注入器を用いて注入する。また、試料や電解液の注入量は、活性測定デバイス１のサイズ（試料流路１２と電解液流路３２の容積）に応じて規定されるが、概ね５０〜６０μｌ程度とする。
なお、試料は、酸素透過層２０からの酸素透過量の変動を抑えるため、測定中は流入量が一定となるように注入する。

（溶存酸素濃度測定処理）
次に、酸素濃度測定装置と活性測定デバイス１を接続し、活性測定デバイス１に一定電圧（０．５〜０．８Ｖ）を印加した状態でデバイス内で発生した酸化還元反応による電流値を検出して電解液中の溶存酸素濃度を測定する。

また、調製した試料２についても同様に、組み立てた活性測定デバイス１を用いて液体注入処理，溶存酸素濃度測定処理の順に処理を行い、溶存酸素濃度を測定する。

（薬剤感受性判定処理）
最後に、溶存酸素濃度測定処理で測定した両者の測定結果（溶存酸素濃度）を比較する。
比較した結果、試料１の溶存酸素濃度よりも試料２の溶存酸素濃度の方が減少している場合、試料１の細菌の呼吸活性が減弱していることを示すため、検体である細菌が抗菌薬によって発育が阻害されていると示唆される。この結果から、使用した抗菌薬は、検体となった細菌に対して有効な薬剤であること判定する。

なお、薬剤感受性判定処理として、例えば複数の抗菌薬と検体との呼吸活性の減弱度合いを段階的に数値化することで、抗菌薬毎における細菌の薬剤感受性の程度を定量的に評価することもできる。

また、活性測定デバイス１を複数用意すれば、平行して２つの試料の溶存酸素濃度を同時に測定することができるため、より測定時間を短縮することが可能となる。

［ストレス測定方法］
次に、本発明に係るストレス測定方法について説明する。
ストレス測定方法の測定対象となる検体（貪食細胞）は、被験体が受けたストレスの度合い（疲労度）応じて貪食能（抗菌活性）の強弱が変化することが知られている。本願発明者はこれに着目して鋭意研究を重ね、検体と、この検体の貪食対象となる大腸菌などの異物とを共培養し、上述した活性測定デバイス１を用いて異物の酸素消費量を測定することで、異物の呼吸活性に応じた酸素消費量の低下の度合いから貪食細胞の異物に対する抗菌活性の強弱、すなわち被験体のストレス（主にメンタルストレス）による疲労度を定量的に客観評価する方法を開発した。

ここで、ストレス測定方法で行われる各処理内容を、図４に示す処理手順に沿って説明する。
なお、各処理は、前段の処理に引き続き行われるが、例えば「試料調製処理」と「デバイス組み立て処理」の順序など、測定に支障が出ない場合は処理順序を入れ替えることも可能である。また、各処理中に記載された数値は、活性測定デバイス１のサイズなどに応じて規定されるものであり、ここでは代表的な数値例を記載する。

（試料調製処理）
試料調製処理では、被験体がストレスを受ける前後の試料（ストレスを受ける前の第１の試料：試料Ａ，ストレスを受けた後の第２の試料：試料Ｂ）をそれぞれ調製する。なお、以下では試料Ａの調製について記載するが、試料Ｂについても同様の処理を行う。

まず、被験体から検体である貪食細胞を採取する。
採取方法としては、被験体であるヒトや動物の血液を０．１ｍｌ程度採血し、分離法（比重沈降法、比重遠心法）によって採取される貪食細胞（好中球など）を使用する。

次に、採取した検体と、検体の貪食対象となる異物（大腸菌）を培養液中で２０〜４０分共培養して試料Ａを調製する。

（デバイス組み立て処理）
次に、本発明の活性測定デバイス１を組み立て、端子部４１ａ、４２ａに酸素濃度測定装置を接続する。この処理は、上述したように試料調製処理の前に行うこともできる。

（液体注入処理）
次に、電解液を電解液注入孔１４から注入するとともに、調製した試料Ａを活性測定デバイス１の試料注入孔１３から注入する。

なお、ストレスによる貪食細胞の抗菌活性の強弱は被験体がストレスを受けることで変位するが、その変位が明確に現れるには被験体に対し数時間にわたりストレス負荷を与え続ける必要がある。そのため、調製した試料Ａ，試料Ｂの測定は、長時間の保存によって貪食細胞の活性が変化しないよう、各試料を調整した直後にそれぞれ測定することになる。

（ストレス評価処理）
最後に、溶存酸素濃度測定処理で測定した両者の測定結果（溶存酸素濃度）の差分値に基づいて被験体のストレス度合いを定量的に評価する。

大腸菌は、酸素が十分にある状態では酸素呼吸をして増殖するため、有酸素環境下で活性が保たれた大腸菌は旺盛な呼吸により酸素消費量が増加する一方、貪食細胞により活性が減弱した大腸菌は呼吸が弱くなり酸素消費量が減少する。
つまり、溶存酸素濃度測定処理で測定した両者の測定結果を比較し、試料Ａの溶存酸素濃度よりも試料Ｂの溶存酸素濃度の方が減少している場合、試料Ｂの貪食細胞の抗菌活性（貪食能）が減弱して大腸菌の呼吸活性が試料Ａより保たれているため、試料Ｂの貪食細胞は、ストレスによる影響でストレスを受ける前の試料Ａよりも抗菌活性が減弱していることが示唆される。このことから、被験体がストレスを受けたときの貪食細胞の抗菌活性の減弱度合いを溶存酸素濃度の差分値に基づいて求めることで、被験体のストレス度合い（疲労度）を定量的に客観評価することができる。

本方法によるストレス評価処理の一例としては、例えばストレス前後の試料における所定時間毎の溶存酸素濃度の差分値を平均化した値（平均差分値）と、予め実験などにより導き出される数値化したストレス評価指標と照らし合わせることで被験体のストレス度合いを数値的に客観評価することができる。

なお、ストレス評価指標は、ストレス度合いを数値化して客観評価するための指標であり、複数の被験体から得られたストレス前後の溶存酸素濃度の平均差分値から統計的に導き出されるものである。例えば各段階に数値範囲を持たせて多段階評価が行えるようにスケール化したストレス評価指標を作成した場合、測定した平均差分値が指標のどの段階に該当するかを照合するだけで被験体のストレス度合いを数値的に得ることができる。

［作用・効果］
以上説明したように、本発明に係る薬剤感受性測定方法は、まず検体となる細菌を培養液で培養して２分割し、一方の培養液にのみ抗菌薬を投与して抗菌薬あり／なしの２種類の試料を調製する。次に、上から順に、試料流路１２が形成された試料流路層１０と、試料流路１２を流れる試料中の酸素を透過させる酸素透過層２０と、電解液流路３２が形成された電解液流路層３０と、アノード電極４１及びカソード電極４２が形成された電極層４０を積層してなる活性測定デバイス１を用い、培養した各試料を該デバイス１に注入して溶存酸素濃度を測定する。そして、測定した溶存酸素濃度を比較し、抗菌薬を投与した試料の溶存酸素濃度が減少しているときは、検体である細菌の活性が抗菌薬により減弱していることが示唆されるため、抗菌薬が有効であると判断する。

このように、薬剤感受性測定方法では、検体の呼吸活性を溶存酸素濃度から定量的に知得することで使用した抗菌薬に対する検体の薬剤感受性の判定が可能となり、検体に対して有効な抗菌薬を容易に特定することができる。また、この方法を用いることで、従来の薬剤感受性測定方法と比べて薬剤感受性を判定する時間が格段に短くなり、薬剤耐性菌を迅速に診断することができる。さらに、遺伝子操作で薬剤耐性となった細菌の薬剤耐性能の程度を評価する際にも有効である。

また、本発明に係るストレス測定方法は、検体となる貪食細胞をストレスを受ける前後の被験体からそれぞれ採取し、これらと貪食対象となる異物を培養液中で共培養して２種類の試料を調製する。次に、各試料を上述した活性測定デバイス１に注入して溶存酸素濃度を測定する。そして、測定した溶存酸素濃度の差分値と予め設定したストレス評価指標とに基づいて被験体のストレス状態を評価する。

このように、ストレス測定方法では、検体の抗菌活性を溶存酸素濃度から定量的に知得することができるため、被験体のストレス・疲労度を定量的に客観評価することができる。また、この方法を用いることで、従来のストレス評価法と比べてストレス評価を判定する時間が格段に短くなり、ストレス診断を迅速に行うことができる。

また、上記２つの方法で用いる活性測定デバイス１は、そのサイズが簡単に持ち運び可能な程度の小型であるため、従来法のようにＰＣＲ反応装置のような検査装置を設置するスペースを確保する必要もなく、測定場所も屋内，屋外を問わない。

さらに、検体を培養した試料や電解液を使用量が５０μｌ程度と非常に少なくて済むため、例えばストレス測定方法において、検体である細胞を採取するために必要な被験体からの採血量も０．１ｍｌと極少量で測定することができ、被験体への負担を最小限に止めることができる。

１…活性測定デバイス
１０…試料流路層
１２…試料流路
２０…酸素透過層
３０…電解液流路層
３２…電解液流路
４０…電極層
４１…アノード電極（４１ａ…端子部）
４２…カソード電極（４２ａ…端子部）

上記した目的を達成するため、本発明の第１の態様は、鉛直方向の上から順に、
活性状態に応じて呼吸活性が変動して酸素の消費量が増減する検体を含む試料が流れる試料流路が形成された試料流路層、
前記試料流路を流れる前記試料中の酸素を下層に透過させる酸素透過層、
電解液が流れる電解液流路が形成された電解液流路層、
アノード電極及びカソード電極が形成された電極層を積層してなる活性測定デバイスを用いて、
細菌感染症の迅速診断のために検体の呼吸活性を溶存酸素濃度から測定して抗菌薬に対する検体の薬剤感受性に応じた有効な抗菌薬を特定する薬剤感受性測定方法であって、
被験体から前記検体を採取して培養して２分割し、一方に抗菌薬を投与した第１の試料と、他方に前記抗菌薬を投与しない第２の試料とを調製する処理と、
前記試料流路に前記第１の試料を前記試料流路と前記電解液流路の容積に応じて規定された注入量である５０〜６０μｌ注入し、前記電解液流路に前記電解液を注入し、酸素電極法を用いて前記第１の試料の溶存酸素濃度を前記電極層で測定する処理と、
前記試料流路に前記第２の試料を前記試料流路と前記電解液流路の容積に応じて規定された注入量である５０〜６０μｌ注入し、前記電解液流路に前記電解液を注入し、酸素電極法を用いて前記第２の試料の溶存酸素濃度を前記電極層で測定する処理と、
前記第１の試料の溶存酸素濃度と、前記第２の溶存酸素濃度と比較して前記検体の薬剤感受性を評価する処理と、
を含むことを特徴とする、薬剤感受性測定方法である。

本発明の第２の態様は、
前記検体が通性菌又は好気性菌である請求項１に記載の薬剤感受性測定方法である。

Claims

鉛直方向の上から順に、
活性状態に応じて呼吸活性が変動して酸素の消費量が増減する検体を含む試料が流れる試料流路が形成された試料流路層、
前記試料流路を流れる前記試料中の酸素を下層に透過させる酸素透過層、
電解液が流れる電解液流路が形成された電解液流路層、
アノード電極及びカソード電極が形成された電極層を積層してなる活性測定デバイスを用いて前記検体の薬剤感受性能を測定する薬剤感受性測定方法であって、
被験体から前記検体を採取して培養して２分割し、一方に抗菌薬を投与した第１の試料と、他方に前記抗菌薬を投与しない第２の試料とを調製する処理と、
前記試料流路に前記第１の試料を注入し、前記電解液流路に前記電解液を注入し、酸素電極法を用いて前記第１の試料の溶存酸素濃度を前記電極層で測定する処理と、
前記試料流路に前記第２の試料を注入し、前記電解液流路に前記電解液を注入し、酸素電極法を用いて前記第２の試料の溶存酸素濃度を前記電極層で測定する処理と、
前記第１の試料の溶存酸素濃度と、前記第２の溶存酸素濃度と比較して前記検体の薬剤感受性を評価する処理と、
を含むことを特徴とする薬剤感受性測定方法。
鉛直方向の上から順に、
活性状態に応じて抗菌活性が変動する検体を含む試料が流れる試料流路が形成された試料流路層、
前記試料流路を流れる前記試料中の酸素を下層に透過させる酸素透過層、
電解液が流れる電解液流路が形成された電解液流路層、
アノード電極及びカソード電極が形成された電極層を積層してなる活性測定デバイスを用いて前記検体の宿主である被験体のストレス状態を測定するストレス測定方法であって、
ストレスを受ける前の被験体から採取した前記検体と、該検体が貪食する異物とを共培養して第１の試料を調製する処理と、
ストレスを受けた後の被験体から採取した前記検体と、該検体が貪食する異物とを共培養して第２の試料を調製する処理と、
前記試料流路に前記第１の試料を注入し、前記電解液流路に前記電解液を注入し、酸素電極法を用いて前記第１の試料の溶存酸素濃度を前記電極層で測定する処理と、
前記試料流路に前記第２の試料を注入し、前記電解液流路に前記電解液を注入し、酸素電極法を用いて前記第２の試料の溶存酸素濃度を前記電極層で測定する処理と、
前記第１の試料の溶存酸素濃度と、前記第２の溶存酸素濃度との差分値に基づいて前記被験体のストレス度合いを評価する処理と、
を含むことを特徴とするストレス測定方法。