ITBO20060531A1 - Metodo colorimetrico e relativo dispositivo per la rilevazione della carica batterica - Google Patents
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Description
D E SCR I Z ION E
del brevetto per invenzione industriale di
UNIVERSITÀ' DEGLI STUDI DI ROMA TRE
di nazionalità italiana, B02006A 0 00 53 1 con sede a VIA OSTIENSE, 159
Inventori: ANTONINI Giovanni; 11 LUG. 2006
MARI Alberto,-MASSUCCI Maria Teresa.
★★* ****★ ***
La presente invenzione riguarda un metodo colorimetrico ed il relativo dispositivo per la rilevazione della carica batterica.
Nel settore alimentare diventa sempre più pressante l'esigenza di garantire una maggiore sicurezza igienico-sanitaria degli alimenti e delle
acque.
Sia i paesi ad alta tecnologia sia i paesi in via di sviluppo, anche se con diverse motivazioni, hanno l'esigenza di un controllo microbiologico di alimenti ed acque che sia semplice, rapido e poco costoso. Fino ad ora non vi sono sul mercato metodiche di analisi microbiologica con caratteristiche tali da unire semplicità di uso, rapidità di analisi e basso costo.
I microrganismi che più spesso sono ricercati nella analisi di alimenti ed acque sono i cosiddetti
con buona sicurezza la assenza anche di microrganismi
patogeni. Tra gli "indicatori", la maggiore importanza
è rivestita dalla ricerca quantitativa di microrganismi
totali, coliformi/E.coli e stafilococchi coagulasi
positivi (St. aureus). La rilevazione di tali
microrganismi copre circa il 40-50 % delle analisi
microbiologiche nel settore delle acque e degli
alimenti .
Il metodo tradizionale per la rilevazione di
microrganismi presenti in un liquido (es. acqua) od in
un solido (prodotti alimentari) si basa sulla
rilevazione della moltiplicazione microbica. Infatti, i
microrganismi, normalmente invisibili ad occhio nudo,
possono essere rilevati quando, in seguito alla
moltiplicazione per divisioni successive da una singola
cellula (cloni), si formano aggregati di miliardi di
cellule (colonie) visibili ad occhio nudo. I metodi
tradizionali basati sulla moltiplicazione batterica
sono perciò anche detti di conta delle Unità Formanti
Colonie (CFU). La specificità della rilevazione di un
particolare tipo di microrganismo è data dall'uso di
terreni nutritivi selettivi. La moltiplicazione dei
microrganismi si può facilmente osservare ad occhio
nudo in terreni selettivi sia solidi (metodo della
conta su piastra per l'esame microbiologico di liquidi)
sia liquidi (metodo del "most probable number" per l'esame microbiologico di solidi). Nel metodo della conta su piastra i terreni selettivi solidi in genere sono contenuti in apposite capsule trasparenti. Una goccia del campione liquido da esaminare (eventualmente concentrato su filtri) viene deposta sul terreno nutritivo selettivo e la moltiplicazione dei microrganismi diviene visibile sotto forma di "colonie", ognuna formata da miliardi di cellule, tutte derivanti da almeno 20-22 successive divisioni di una singola cellula (cloni). Tali colonie appaiono come piccoli rilievi delle dimensioni da 0.5 a 1 o più mm. Dal numero di colonie presenti in una singola capsula si può, quindi, risalire al numero di microrganismi inizialmente presenti nella goccia di campione liquido deposta sul terreno nutritivo.
Nel metodo del "most probable number" i terreni selettivi liquidi sono invece contenuti in provette trasparenti. Tali provette vengono addizionate di una piccola quantità di omogeneizzato del campione solido da esaminare. La moltiplicazione dei microrganismi risulta evidente dalla comparsa di una torbidità diffusa del terreno nutritivo contenuto nella provetta. Attraverso apposite tabelle elaborate su base statistica, dalla presenza o assenza della torbidità
nelle differenti provette a differenti diluizioni del campione da esaminare, si potrà risalire al "più probabile numero" di microrganismi inizialmente presente nel campione solido.
E' evidente da quanto sopra esposto, che tali metodi richiedono sia una lavorazione impegnativa, sia la presenza di un laboratorio attrezzato per poter sterilizzare preventivamente il materiale da utilizzare e mantenerne le condizioni di sterilità. L'assenza di sterilità porterebbe infatti ad inquinamenti microbici estranei al campione da esaminare con conseguente perdita di significato dell'analisi effettuata.
Sono attualmente impiegate metodiche alternative, Ili O
quali quella basata sull'utilizzo di terreni cromogeni. 2 Pur essendo anch'esso un metodo colturale, l'utilizzo di terreni cromogeni per l'analisi microbiologica può
essere spesso considerato un metodo "rapido", perché permette di ottimizzare la ricerca di microrganismi specifici senza bisogno di eseguire sottocolture e talvolta nemmeno esami di conferma.
Tra i metodi rapidi, quello che ha avuto un impatto maggiore in campo alimentare è relativo all'utilizzo di anticorpi. La specificità degli anticorpi monoclonali, la semplicità e la versatilità della reazione antigene-anticorpo ha permesso lo sviluppo di numerosi metodi immunologie! di analisi. Tali metodi soffrono, tuttavia, degli inconvenienti relativi alla necessità di personale ed attrezzature specialistici, ed all'elevato limite di sensibilità uguale ad almeno IO<4>cellule/ml.
Infine, più recentemente sono stati utilizzati metodi genetici di analisi molecolare. Tali metodi comprendono ibridazione DNA/DNA, analisi delle sequenze di rRNA (RNA ribosomale), impiego di sonde oligonucleotidiche complementari all'rRNA o ad altri geni bersaglio, di ribotipizzazione e PCR-Polymerase Chain Reaction. Questi metodi, nonostante presentino il vantaggio relativo ad un basso limite di sensibilità (<10<2>cellule/ml), tuttavia non risolvono il problema relativo alla necessità di personale altamente
specializzato per l'utilizzo di apparecchiature complesse, e di ambienti controllati per evitare contaminazioni del campione ed, inoltre, spesso non riescono a distinguere tra microrganismi vivi o morti.
Scopo della presente invenzione è quello di realizzare un procedimento per la rilevazione di carica batterica, le cui caratteristiche tecniche siano tali da renderlo efficiente, economico ed, al tempo stesso, di semplice utilizzo senza necessitare, quindi, dell'intervento di personale specializzato.
Oggetto della presente invenzione è un metodo per la rilevazione di carica batterica comprendente le fasi di addizionare un campione da analizzare ad un reattivo di analisi in un opportuno contenitore di reazione opportunamente sterilizzato, di termostatare il detto contenitore di reazione ad una temperatura compresa tra 25 e 45°C, e di verificare il cambio di colorazione del detto reattivo di analisi; il detto metodo essendo caratterizzato dal fatto che il detto reattivo di analisi è una soluzione acquosa comprendente da 1 a 100 g/1 di una fonte di aminoacidi scelta nel gruppo composto da peptoni di carne, peptoni vegetali, LU o idrolizzati di caseina, triptosio, triptoni e estratto
co di lievito; da 0 a 50 g/1 di una fonte di glucidi scelta tra i glucidi monometrici o oligomerici metabolizzabili dai microrganismi; da 0 a 200 g/1 di un sistema tampone atto a tenere il pH compreso tra 5,5 e 8,5; da 0,03 a 3 g/1 di un indicatore redox con potenziale conpreso tra -250 e 250 mV e/o di un indicatore di pH con intervallo di viraggio conpreso tra pH 4.0 e pH 9.0; ed un conposto liquido organico non miscibile con l'acqua e con minore densità dell'acqua stessa ed atto a separare la fase acquosa da una fase gassosa preesistente all'analisi o formatasi durante la reazione.
Preferibilmente, la fase di verifica del cambio di
colorazione comprende una operazione di illuminazione
del campione ad almeno due differenti lunghezze d'onda
conprese nell'intervallo tra 500 e 700 nm ed una
operazione di ricezione della radiazione riflessa e/o
trasmessa.
Preferibilmente, la fase di verifica del cambio di
colorazione comprende il calcolo del tempo necessario
perché si verifichi il cambio di colorazione del detto
reattivo di analisi.
Preferibilmente, il reattivo di analisi conprende
da 0 a 200 g/1 di un agente selettivo per la
LUl_ rilevazione di una specifica classe di batteri.
Preferibilmente, il metodo della presente
invenzione comprende una fase di sterilizzazione finale
in cui ad analisi completata una sostanza sterilizzante
viene aggiunta nel contenitore di reazione.
Preferibilmente, il detto contenitore di reazione
è una fiala monouso comprendente una porzione di
contenimento realizzata in materiale trasparente ed un
tappo atto ad accoppiarsi con la porzione di
contenimento mediante rispettive filettature, e
conprendente un serbatoio di alloggiamento della
sostanza sterilizzante ed atto ad essere svuotato
all'interno della porzione di contenimento mediante una azione di tranciatura a pressione.
Un ulteriore oggetto della presente invenzione è un dispositivo di analisi per la realizzazione del metodo secondo una delle rivendicazioni precedenti, comprendente almeno una unità di analisi ed una centralina di comando/controllo connessa alla detta unità di analisi per comandarne l'esercizio e riceverne informazioni in base alle quali calcolare la concentrazione batterica per confronto con parametri precedentemente impostati; la detta unità di analisi comprendendo una cavità di analisi rivestita di uno strato di materiale riflettente ed atta ad alloggiare un contenitore di analisi in cui viene depositato il LU _ campione da analizzare, un termostato atto a mantenere la detta cavità di analisi ad una temperatura compresa tra 25 e 45°C, mezzi emettitori di radiazione all'interno della detta cavità di analisi, ed un elemento recettore di radiazione nella detta cavità di analisi; il detto dispositivo essendo caratterizzato dal fatto che i detti mezzi emettitori emettono nella detta cavità di analisi ad almeno due differenti lunghezze d'onda comprese nell'intervallo 500 - 700 nm.
Preferibilmente, i mezzi emettitori e l'elemento recettore si affacciano nella cavità di analisi alla medesima altezza, ed in posizione tale da essere tra
loro angolarmente spaziati di un angolo inferiore o uguale a 90°.
Preferibilmente, i mezzi emettitori emettono ad almeno tre differenti lunghezze d'onda comprese nell'intervallo 500 - 700 nm.
Preferibilmente, il dispositivo della presente invenzione comprende una pluralità di unità di analisi.
Preferibilmente, il dispositivo della presente invenzione comprende mezzi di visualizzazione dei risultati ottenuti dalla centralina di comando/controllo .
LU
Gli esempi che seguono servono a scopo
o illustrativo e non limitativo, per una migliore comprensione dell'invenzione con l'ausilio delle figure 7= £ del disegno annesso, in cui:
la figura 1 illustra schematicamente il dispositivo oggetto della presente invenzione;
la figura 2 è una vista schematica laterale dell'unità di analisi del dispositivo secondo una preferita forma di realizzazione;
la figura 3 è una vista schematica in pianta dell'unità di analisi di figura 1;
la figura 4 è un diagramma di flusso che illustra le operazioni svolte dalla centralina di comando/controllo del dispositivo della presente invenzione; e
la figura 5 è una sezione di una fiala secondo la presente invenzione.
In figura 1, è indicato nel suo complesso con 1 il dispositivo di analisi secondo la presente invenzione.
Il dispositivo 1 comprende una pluralità di unità di analisi 2, una centralina di comando/controllo 3 e mezzi di visualizzazione 4 dei risultati ottenuti.
Come illustrato schematicamente nelle figure 2 e 3 ognuna delle unità di analisi 2 comprende una parete cilindrica 5 internamente rivestita da uno strato di materiale riflettente 6, e definente una cavità di LU Zo analisi 7 in cui è alloggiata una fiala in cui il
co campione da analizzare viene fatto reagire con il reagente della presente invenzione. L'unità di analisi 2 comprende, inoltre, un termostato illustrato schematicamente con 8, atto a mantenere la cavità di analisi 7 ad una temperatura compresa tra 25 e 45°C, quattro LED emettitori 9, dei quali due emettono a 560nm e due emettono a 660nm, un fotodiodo recettore 10 con alta resa nel visibile, e un circuito elettrico per l'alimentazione e l'amplificazione del segnale indicato schematicamente con 11. L'utilizzo di almeno due lunghezze d'onda permette la valutazione del cambio di colore anche quando la soluzione del reattivo più il campione sia torbida. infatti, in questo modo è possibile la lettura alternata ad almeno due lunghezze d'onda e la sottrazione dell'assorbimento aspecifico dovuto alla torbidità del campione per determinare il cambiamento di colore.
La posizione relativa del fotodiodo recettore 10 e dei LED emettitori 9 consente la rilevazione della radiazione sia secondo il fenomeno della riflettanza sia secondo il fenomeno della trasmittanza, con la conseguenza di garantire una maggiore efficienza di rilevamento.
In figura 4 viene rappresentato il diagramma a blocchi relativo alle impostazioni da comunicare alla
co centralina 3 e alle operazioni che la stessa deve svolgere.
In particolare, la centralina di comando/controllo 3 costituisce l'interfaccia del dispositivo con l'operatore ed è connessa al termostato 8, ai LED emettitori 9 ed al fotodiodo recettore 10.
Con riferimento allo schema a blocchi di figura 4, alla centralina 3 va impostato l'alloggiamento delle fiale indicato con II, la scelta del tipo di analisi indicato con 12 e l'avvio dell'analisi indicato con 13.
Successivamente, 1'operazioni che la centralina 3 svolge sono: il comando all'unità 2 dell'illuminazione del campione mediante i LED 9 indicata con 01, la lettura dell'intensità luminosa mediante il fotodiodo recettore 10 indicata con 02, il calcolo dell'assorbimento specifico indicata con 03, confronto con l'assorbimento al tempo zero indicata con 04. Qualora l'operazione 04 porti come risultato l'assenza di cambiamento di colore, la centralina comunica l'assenza di carica batterica (operazione indicata con 05) mediante i mezzi di visualizzazione 4, mentre qualora l'operazione 04 porti come risultato il cambiamento di colore, la centralina 3 opera il calcolo della concentrazione della carica batterica (operazione indicata con 06) e comunica il risultato (operazione indicata con 07) mediante i mezzi di visualizzazione 4.
L'operazione 06 si basa sulla dimostrata
correlazione tra il numero di batteri presenti nel campione ed il tempo necessario al cambiamento di colore del reattivo. Sulla base di tale correlazione sono state realizzate delle rette di calibrazione specifiche per i diversi ceppi batterici, e che mettono in relazione il logaritmo della concentrazione dei batteri presenti nel campione con il tempo necessario al cambio di colore del reattivo. I dati di tali rette vengono inpostati nella centralina 3 ed utilizzati mediante confronto nell'operazione 06 con quanto rilevato nella operazione 04.
In figura 5 viene indicata nel suo complesso con
12 la fiala utilizzata nel metodo della presente
invenzione. La fiala 12 comprende una porzione di
contenimento 13 realizzata in materiale trasparente, ed
un tappo 14 atto a chiudere o ad aprire la porzione di
contenimento 13. Sia la porzione di contenimento 13 sia
il tappo 14 sono provvisti di filettatura, indicata
rispettivamente con 15 e 16, in maniera tale da
accoppiarsi o disaccoppiarsi mediante rispettivamente
una azione di avvitamento o sviamento.
Il tappo 14 conprende una parete laterale 18 di m
O
forma cilindrica nella quale è ricavata la filettatura
16, un tappo perforabile 19 fissato alla parete
(!Uo laterale 18, ed un tappo serbatoio 20 contenente la
sostanza sterilizzante ed atto a scorrere all'interno
della parete laterale 18 per consentire la tranciatura
di una membrana di fondo 21 del tappo perforabile 19 ed
il conseguente scarico della sostanza sterilizzante
all'interno della porzione di contenimento 13.
Il tappo perforabile 19 conprende corpo a tazza
19a fissato alla parete laterale 18 mediante l'azione
di un dente anulare di incastro 22 estendentesi dalla
parete laterale 18 stessa.
Il tappo serbatoio 20 conprende una testa di azionamento 23 sulla quale agisce l'operatore, ed una parete cilindrica 24 nella quale è contenuta la sostanza sterilizzante ed avente una estremità tranciante 25 atta a tranciare la membrana di fondo 21 del corpo a tazza 19a stesso.
In altre parole, una volta che si vuole depositare nella porzione di contenimento 13 la sostanza sterilizzante, l'operatore deve esercitare una pressione sulla testa di azionamento 23 provocando la tranciatura della membrana di fondo 21 da parte dell'estremità tranciante 25 e di conseguenza la fuoriuscita della sostanza sterilizzante. A tale
LL1_ Z
riguardo va specificato che la sostanza sterilizzante preferita è il dicloroisocianuro.
La presenza delle filettature 15 e 16 garantisce
2 una pratica azione di apertura e di chiusura della porzione di contenimento 13 da parte del tappo 14, ed al tempo stesso evita che si verifichi una apertura accidentale quando il tappo 14 è avvitato.
La fiala presenta un volume utile di circa 13 mi, e contiene il reattivo in quantità variabile tra 1 e 2 g, che sarà addizionato al momento dell'analisi a 10 mi di campione liquido oppure a 0,1-1 g di campione solido addizionato di 9-10 mi di acqua deionizzata sterile.
Le fiale come sopra descritte possono essere commercializzate pronte per l'uso e, quindi, già sterilizzate e contenenti il reattivo per l'analisi
Di seguito saranno riportati quattro esempi di reattivo della presente invenzione. In particolare, il reattivo 1 è aspecifico è può essere applicato per rilevare tutti i batteri ad eccezione di quelli anaerobi obbligati, il reattivo 2 è specifico per la specie Staphylococcus, il reattivo 3 è specifico per le enterobatteriacee, ed il reattivo 4 è specifico per i coliformi.
LU O CO
O .2
REATTIVO 3 (1.7 g per ogni fiala da 13 mi)
REATTIVO 4 (1.7 g per ogni fiala da 13 mi)
*HEPES: acido 4-(2-idrossietil)-1-piperazin etan
sulfonico
** TMPD: Ν,Ν,Ν',Ν' tetrametri-p-fenilen diammina
idrocloruro (Ν,Ν,Ν',Ν'-tetrametil benzene-1,4-diamina idrocloruro)
Come può risultare ovvio ad un tecnico del ramo, LU le composizioni dei reattivi 1-4 costituiscono le
migliori forme di realizzazione relativamente alle
tipologie dei batteri menzionati. Tuttavia, la presente
invenzione è relativa alle composizioni dei reattivi
come rivendicate.
Claims (16)
- R IV EN D ICA Z ION I 1. Metodo per la rilevazione di carica batterica comprendente le fasi di addizionare un campione da analizzare ad un reattivo di analisi in un opportuno contenitore di reazione (12) opportunamente sterilizzato, di termostatare il detto contenitore di reazione ad una temperatura compresa tra 25 e 45°C, e di verificare il cambio di colorazione del detto reattivo di analisi; il detto metodo essendo caratterizzato dal fatto che il detto reattivo di analisi è una soluzione acquosa comprendente da 1 a 100 g/1 di una fonte di aminoacidi scelta nel gruppo conposto da peptoni di carne, peptoni vegetali, idrolizzati di caseina, triptosio, triptoni e estratto di lievito; da 0 a 50 g/1 di una fonte di glucidi scelta tra i glucidi monometrici o oligomericimetabolizzabili dai microrganismi; da 0 a 200 g/1 di un sistema tampone atto a tenere il pH compreso tra 5,5 e 8,5; da 0,03 a 3 g/1 di un indicatore redox con potenziale compreso tra -250 e 250 mV e/o di un indicatore di pH con intervallo di viraggio compreso tra pH 4.0 e pH 9.0; ed un composto liquido organico non miscibile con l'acqua e con minore densità dell'acqua stessa ed atto a separare la fase acquosa da una fase gassosa preesistente all'analisi o formatasi durante la reazione.
- 2. Metodo secondo la rivendicazione 1, caratterizzato dal fatto che la detta fase di verifica del cambio di colorazione comprende una operazione di illuminazione del campione ad almeno due differenti lunghezze d'onda conprese nell'intervallo tra 500 e 700 nm ed una operazione di ricezione della radiazione riflessa e/o trasmessa.
- 3. Metodo secondo la rivendicazione 1 o 2, caratterizzato dal fatto che la detta fase di verifica del cambio di colorazione comprende il calcolo del tempo necessario perché si verifichi il cambio di colorazione del detto reattivo di analisi.
- 4. Metodo secondo una qualsiasi delle rivendicazioni precedenti, caratterizzato dal fatto che il reattivo di analisi conprende da 0 a 200 g/1 di unagente selettivo per la rilevazione di una specifica classe di batteri.
- 5. Metodo secondo una qualsiasi delle rivendicazioni precedenti, caratterizzato dal fatto di conprendere una fase di sterilizzazione in cui, ad analisi completata, una sostanza sterilizzante viene aggiunta nel contenitore di reazione senza apertura dello stesso.
- 6. Metodo secondo una qualsiasi delle rivendicazioni precedenti, caratterizzato dal fatto che il detto reattivo è specifico per tutti i batteri esclusi gli anaerobi obbligati e presenta la seguente composizione in g/1: da 1 a 100 di infuso di cuorecervello ed estratto di lievito o altre fonti di aminoacidi quali peptoni di carne, peptoni vegetali, idrolizzati di caseina, triptosio o triptoni; da 0 a 100 di HEPES o altri sistemi tampone atto a tenere il pH compreso tra 5,5 e 8,5; da 0.03 a 3 di TMPD o altri indicatori redox con potenziale conpreso tra -250 e 250 mV; e da 1 a 1000 di olio di vasellina o altro liquido organico non miscibile con l'acqua e con minore o densità dell'acqua stessa. _ «
- 7. Metodo secondo una qualsiasi delle rivendicazioni da 1 a 5, caratterizzato dal fatto che il detto reattivo è specifico per lo Staphylococcus e presenta la seguente composizione in g/1: da 1 a 100 di infuso di cuore-cervello o altre fonti di aminoacidi quali peptoni di carne, peptoni vegetali, idrolizzati di caseina, triptosio, triptoni e estratto di lievito; da 1 a 100 di Mannitolo o altri glucidi; da 0.01 a 10 di Polimixina B o altri antibiotici cui lo Staphylococcus sia noto essere resistente, da 10 a 200 di NaCl o altri sali inorganici cui lo Staphylococcus sia noto essere resistente; da 0.5 a 100 di K2HP04o altri sistemi tampone atti a tenere il pH compreso tra 5,5 e 8,5; da 0.03 a 3 di TMPD o altri indicatori redox con potenziale compreso tra -250 e 250 mV; da 0.1 a 3 di Rosso fenolo o altri indicatori di pH con intervallo di viraggio compreso tra pH 4.0 e pH 9.0; e da 1 a 1000 di olio di vasellina o altro liquido organico non miscibile con l'acqua e con minore densità dell'acqua stessa.
- 8. Metodo secondo una qualsiasi delle rivendicazioni da 1 a 5, caratterizzato dal fatto che il detto reattivo è specifico per le enterobatteriacee e presenta la seguente composizione in g/1: da 1 a 100 di infuso di cuore-cervello o altre fonti di aminoacidi quali peptoni di carne, peptoni vegetali, idrolizzati di caseina, triptosio, triptoni e estratto di lievito,· da 1 a 100 di glucosio o altri glucidi; da 1 a 100 di Colato di sodio o altri detergenti cui le enterobatteriacee siano note essere resistenti; da 1 a 10 di K2C03e/o di HEPES o altri sistemi tampone atti a tenere il pH compreso tra 5,5 e 8,5; da 0.03 a 3 di TMPD o altri indicatori redox con potenziale compreso tra -250 e 250 mV; e da 1 a 1000 di olio di vasellina o altro liquido organico non miscibile con l'acqua e con minore densità dell'acqua stessa.
- 9. Metodo secondo una qualsiasi delle rivendicazioni da 1 a 5, caratterizzato dal fatto che il detto reattivo è specifico per i coliformi e presenta la seguente composizione in g/1: da 1 a 100 di infuso di cuore-cervello o altre fonti di aminoacidi quali peptoni di carne, peptoni vegetali, idrolizzati di caseina, triptosio, triptoni e estratto di lievito; da 1 a 100 di lattosio o altri glucidi; da 1 a 100 di Colato di sodio o altri detergenti cui i coliformi siano noti essere resistenti; da 1 a 10 di K2C03e/o di HEPES o altri sistemi tampone atti a tenere il pH compreso tra 5,5 e 8,5; da 0.03 a 3 di TMPD o altri indicatori redox con potenziale compreso tra -250 e 250 mV,- da 0.03 a 3 di Rosso fenolo o altri indicatori di pH con intervallo di viraggio compreso tra pH 4.0 e pH 9.0; e da 1 a 1000 di olio di vasellina o altroliquido organico non miscibile con l'acqua e con minore densità dell'acqua stessa.
- 10 . Metodo secondo una qualsiasi delle rivendicazioni precedenti, caratterizzato dal fatto che il detto contenitore di reazione è una fiala monouso (12) contenente un reattivo secondo una delle rivendicazioni precedenti e comprendente una porzione di contenimento (13) realizzata in materiale trasparente ed un tappo (14) tra loro accoppiabili mediante rispettive filettature (15, 16); il detto tappo (14) comprendendo un serbatoio di alloggiamento della sostanza sterilizzante (20) atto ad essere svuotato all'interno della porzione di contenimento (13) mediante una azione di tranciatura a pressione.
- 11. Metodo secondo la rivendicazione 10, caratterizzato dal fatto che il detto tappo (14) comprende una parete laterale (18) di forma cilindrica nella quale è ricavata la detta filettatura (16), un tappo perforabile (19) fissato alla parete laterale (18), ed un tappo serbatoio (20) contenente la sostanza sterilizzante ed atto a scorrere all'interno della parete laterale (18) per consentire la tranciatura di LU_ una membrana di fondo (21) del tappo perforabile (19) £o s ed il conseguente scarico della sostanza sterilizzante all'interno della porzione di contenimento (13).
- 12. Dispositivo (1) di analisi per la realizzazione del metodo secondo una delle rivendicazioni precedenti, comprendente almeno una unità di analisi (2) ed una centralina di comando/controllo (3) connessa alla detta unità di analisi (2) per comandarne l'esercizio e riceverne informazioni in base alle quali calcolare la concentrazione batterica per confronto con parametri precedentemente impostati; la detta unità di analisi (2) comprendendo una cavità di analisi (7) rivestita di uno strato (6) di materiale riflettente ed atta ad alloggiare un contenitore di analisi in cui viene depositato il campione da analizzare, un termostato (8) atto a mantenere la detta cavità di analisi (7) ad una temperatura compresa tra 25 e 45°C, mezzi emettitori di radiazione (9) all'interno della detta cavità di analisi (7), ed un elemento recettore (10) di radiazione nella detta cavità di analisi (7); il detto dispositivo essendo caratterizzato dal fatto che i detti mezzi emettitori (9) emettono nella detta cavità di analisi (7) ad almeno due differenti lunghezze d'onda comprese nell'intervallo 500 - 700 nm.
- 13. Dispositivo secondo la rivendicazione 12, caratterizzato dal fatto che i detti mezzi emettitori (9) ed il detto elemento recettore (10) si affacciano nella detta cavità di analisi (7) alla medesima altezza, ed in posizione tale da essere tra loro angolarmente spaziati di un angolo inferiore o uguale a 90°.
- 14. Dispositivo secondo la rivendicazione 12 o 13, caratterizzato dal fatto che i detti mezzi emettitori (9) emettono ad almeno tre differenti lunghezze d'onda comprese nell'intervallo 500 - 700 nm.
- 15. Dispositivo secondo una qualsiasi delle rivendicazioni da 12 a 14, caratterizzato dal fatto di comprendere una pluralità di unità di analisi (2).
- 16. Dispositivo secondo una qualsiasi delle rivendicazioni da 12 a 15, caratterizzato dal fatto di comprendere mezzi di visualizzazione (4) dei risultati ottenuti dalla centralina di comando/controllo. p.i.: UNIVERSITÀ' DEGLI STUDI ROMA TRE<
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