ITRM20120218A1 - Dispositivo e metodo per l'analisi ed il monitoraggio della tossicità nelle acque. - Google Patents
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Description
"DISPOSITIVO E METODO PER L’ANALISI ED IL MONITORAGGIO DELLA
TOSSICITA’ NELLE ACQUE"
DESCRIZIONE
La presente invenzione si riferisce a un dispositivo per l’analisi ed il monitoraggio della tossicità nelle acque. L’apparato della presente invenzione à ̈ specificamente ideato per determinare la tossicità nelle acque in più campioni simultaneamente e in tempi rapidi con un elevato grado di accuratezza e precisione. Il dispositivo della presente invenzione ha applicazione nel campo del controllo e monitoraggio delle risorse idriche e nel settore delle analisi ecotossicologiche.
STATO DELLA TECNICA ANTERIORE
Il monitoraggio della qualità delle acque rappresenta una questione fondamentale per la tutela della sicurezza e della salute a livello mondiale. Una delle tecnologie, molto diffusa a livello mondiale per l’analisi tossicologica dell’acqua, à ̈ un prodotto da laboratorio venduto con il nome commerciale di MicroTOX®, commercializzato da Strategic Diagnostics Inc. Questo sistema à ̈ costituito da un luminometro utilizzato per misurare variazioni di bioluminescenza di batteri reidratati da lotti liofilizzati prima dei test analitici. I test analitici sono eseguiti in modalità completamente manuale da operatori specializzati.
Per quanto concerne il monitoraggio della tossicità delle acque tramite sistemi automatizzati, sono commercialmente disponibili solo analizzatori basati su tecnologie a flusso. Alcuni degli analizzatori di tossicità tramite organismi batterici basati su tecnologie a flusso sono TOXcontrol® On-line Biomonitor System, prodotto da microLAN B.V. e CCB-TOX® Continuous Contamination Biomonitor, prodotto da CheckLight Ltd. Brevemente, il campione ed i batteri luminescenti sono convogliati separatamente ed introdotti congiuntamente in una camera di misura di luminescenza per la determinazione dell’effetto di tossicità del campione. Immediatamente prima o dopo, i batteri luminescenti sono convogliati separatamente e introdotti congiuntamente al tampone di riferimento in una camera di misura di luminescenza per la determinazione del bianco, parallela alla camera di misura del campione. Il confronto tra il bianco ed il campione delinea la misura di tossicità .
Anche per quanto concerne il monitoraggio della tossicità delle acque con microalghe tramite sistemi automatizzati, sono commercialmente disponibili solo analizzatori basati su tecnologie a flusso. Molto diffuso à ̈ l’analizzatore Algae Toximeter®, prodotto da bbe-Moldaenke GmbH, in cui le microalghe sono coltivate in continuo in un fermentatore. Come per sistemi a flusso basati su substrati batterici, la procedura analitica à ̈ basata sul convogliamento idraulico del biosubstrato in camera di misura alternativamente con bianchi e campioni ed il risultato à ̈ ricavato dal confronto delle misure di bianco e campione. Il fenomeno monitorato à ̈ il ritardo algale nell’emissione della luce, meglio noto come delayed fluorescence, causato da interferenti fitotossici.
Un analizzatore on-line di recente produzione à ̈ VibrioTox® di AppliTek, derivazione commerciale del brevetto EP1883808 (A2) di Gibson and Jones. Questa tecnologia proprietaria à ̈ basata sul monitoraggio della tossicità nelle acque tramite l’utilizzo di batteri bioluminescenti che sono allevati in continuo da un bio-reattore che lavora in condizioni di stato stazionario. I batteri sono successivamente prelevati dal bio-reattore per consentire l’esecuzione dell’analisi in modalità a flusso continuo.
Principali svantaggi della tecnica antecedente
Uno dei principali limiti degli analizzatori dello stato della tecnica à ̈ l’impossibilità di analizzare più campioni simultaneamente e di ottenere più misurazioni dello stesso campione con un elevato grado di precisione e accuratezza. Inoltre gli analizzatori disponibili nello stato della tecnica hanno tempi di svolgimento dell’analisi non compatibili con la necessità di un pronto intervento come nel caso di episodi di contaminazione imprevista di acquedotti.
Gli analizzatori automatici presenti nello stato della tecnica sono basati sulla movimentazione idraulica dei microrganismi (alghe e batteri) e quindi soggetti a crosscontaminazione e a fouling.
SCOPO DELL’INVENZIONE
La presente invenzione à ̈ relativa ad un dispositivo, basato su tecnologia random access a lettura diretta, per monitorare autonomamente in modo continuo la qualità delle acque ed analizzare in maniera automatizzata campioni, percolati ed estratti acquosi, incluse le parti componenti dello stesso, associato a metodi analitici che permettono di determinare la contaminazione nelle acque e individuare la presenza di contaminanti in campioni, percolati ed estratti acquosi.
Il dispositivo della presente invenzione ha applicazione nel campo del controllo e monitoraggio delle risorse idriche, inclusi gli acquedotti e le acque di falda, delle acque ad uso industriale in ingresso ed in uscita dagli impianti, dei reflui civili e industriali pre- e post- trattamento, delle acque sotterranee e delle acque superficiali, inclusi torrenti, sorgenti, ruscelli, canali, bacini idrici, fiumi, laghi e comprendenti anche le acque marine. L’invenzione à ̈ analogamente utilizzabile nel settore delle analisi ecotossicologiche su campioni, percolati ed estratti acquosi di qualsiasi origine e/o derivazione, inclusi rifiuti, suoli, sedimenti e materiali.
Lo scopo della presente invenzione à ̈ quello di risolvere i numerosi problemi lasciati ancora aperti dalla tecnica nota e ciò à ̈ ottenuto attraverso un dispositivo come definito nella rivendicazione n.1.
Ulteriori caratteristiche della presente invenzione sono definite nelle corrispondenti rivendicazioni dipendenti.
Vantaggi dell’Invenzione
La presente invenzione, superando i citati problemi della tecnica nota, comporta numerosi ed evidenti vantaggi:
1. Possibilità di monitoraggio in continuo.
2. Possibilità di campionare e processare decine di campioni simultaneamente. 3. Tempi di campionamento, preparazione e misura ridottissimi.
4. Completa autonomia analitica con salvaguardia di costi e forza lavoro.
5. Maggiore accuratezza e precisione sperimentale.
6. Segnalazione in tempo quasi reale, anche in remoto, di eventi inattesi di contaminazione, e conseguente possibilità di messa in sicurezza tempestiva della risorsa idrica, corpo idrico, refluo, effluente o acquedotto monitorato.
7. Possibilità di valutare simultaneamente gli effetti di tossicità su batteri ed alghe, ovvero organismi procarioti e eucarioti, con tempo di utilizzabilità , stabilità e durata dei substrati microbici quantificabile in un intervallo compreso tra 25 e 35 giorni.
Mentre i dispositivi (analizzatori) con tecnologie a flusso della tecnica nota permettono di analizzare solo un campione o comunque un numero molto limitato di campioni alla volta, il dispositivo della presente invenzione permette l’analisi simultanea di un numero elevato di campioni, pari alle posizioni disponibili nel piatto di reazione. Vi à ̈ quindi anche la possibilità di eseguire repliche simultanee dello stesso campione, di analizzare contemporaneamente lo stesso campione a diverse diluizioni ed effettuare nello stesso tempo misure di bianco e di calibrazione con composti puri e/o matrici reali a tossicità nota.
Il dispositivo della presente invenzione permette di analizzare un campione ogni 10–30 secondi, contro i 15–30 minuti per campione delle tecnologie a flusso.
Il continuo passaggio di sospensioni batteriche o algali lungo tutto il percorso degli analizzatori a flusso aumenta i rischi di fouling e bio-fouling, specialmente in tubi e condutture. Sono perciò necessarie una o più accurate operazioni di lavaggio e sterilizzazione di tutto il sistema tra un campione e l’altro per evitare il già citato fouling o qualsiasi tipo di interferenza con l’analisi successiva. Al contrario, nel dispositivo qui descritto, solo l’ago di prelievo e le cuvette di reazione sono esposte a potenziale contaminazione e quindi soggette a lavaggio. Ciò permette di garantire un altissimo livello di pulizia e affidabilità del sistema.
Gli analizzatori a flusso possono eseguire misure in cinetica simultanea di bianchi, calibranti e campioni solo se provvisti di detector multipli, in un numero pari ai bianchi, calibranti e campioni da misurare contemporaneamente. Tuttavia, l’esecuzione della misura di bianchi, calibranti e campioni in tempi diversi à ̈ causa di errori che possono diventare significativi, dato che l’effetto di tossicità à ̈ calcolato dalla diminuzione o variazione di segnale, osservate rispetto ad un test eseguito in assenza di contaminazione. Di conseguenza, il risultato ottenuto à ̈ strettamente legato all’attività metabolica ideale della popolazione attiva esprimibile in quell’esatto intervallo di tempo. Data la innata transitorietà del loro status metabolico, sia i batteri che le microalghe possono essere soggetti a variazioni di segnale e sensibilità anche molto significative con il trascorrere del tempo. Al contrario, il dispositivo della presente invenzione può simultaneamente eseguire misure in cinetica di bianchi, calibranti e campioni, anche a intervalli molto ridotti, come ogni 10-30 secondi, per tutto il tempo desiderato, utilizzando un solo detector di bioluminescenza ed un solo detector di fluorescenza, poiché à ̈ il piatto di reazione a ruotare e collocarsi nella posizione corrispondente al detector richiesto. Ciò risulta essere un valore aggiunto imprescindibile, che permette di eseguire, in parallelo alle analisi di campioni reali, cicli di bianchi e calibrazioni con soluzioni note di diverse tipologie di analiti tossici e/o matrici reali a tossicità nota.
Rispetto all’analizzatore VibrioTox® di AppliTek, il dispositivo oggetto della presente invenzione, presenta i seguenti ulteriori vantaggi:
1. Il reattivo biologico contenuto in fialette usa e getta à ̈ monitorato tramite l’esecuzione di bianchi e contaminanti. In caso di perdita di efficienza, il reattivo può essere semplicemente sostituito. Al contrario nel dispositivo VibrioTox®, il chemostato à ̈ un fermentatore di gestione molto critica e facilmente soggetto a contaminazione esterna e richiedente, per essere mantenuto in funzione in maniera efficace, di complessi controlli di innumerevoli parametri, quali la densità di microorganismi, il volume totale, l’aggiunta e rimozione di reagenti, l’aerazione e la torbidità . In caso di contaminazione o di semplice guasto o inconveniente, la ri-messa in moto del ciclo di fermentazione à ̈ una procedura lunga e complicata o perlomeno non così immediata come la sostituzione di una fialetta.
2. Essendo soggetto alla formazione di bollicine d’aria di difficile rimozione che possono influenzare sensibilmente la misura analitica, il sistema idraulico degli analizzatori a flusso necessita di air traps o di sistemi analoghi per la rimozione di tali bolle.
3. La misura in luminescenza o fluorescenza in un analizzatore a flusso continuo ha tempistiche necessariamente molto accelerate poiché gli analiti biologici sono sospesi in un fluido in movimento. Inoltre, il numero di fotoni misurati à ̈ variabile in funzione della velocità di flusso. Dato che nel dispositivo qui descritto la lettura avviene in condizioni statiche, essa risulta più robusta e ripetibile.
4. In un analizzatore a flusso continuo, la sensibilità analitica à ̈ più bassa a causa dei volumi ridotti che possono essere letti dal detector. Questo problema à ̈ fisiologico alla tipologia di analizzatore dato che, per aumentare i volumi, sarebbe essenziale ridurre la velocità di flusso, con conseguenti squilibri inaccettabili nel flusso stesso e fluttuazioni nel numero di fotoni misurati.
Breve descrizione dei disegni
Figura 1. La figura 1 Ã ̈ una rappresentazione schematica di una forma di realizzazione del dispositivo secondo la presente invenzione.
Figura 2. La figura 2 Ã ̈ un particolare del modulo di misura luminometrica 8 della forma di realizzazione mostrata in figura 1.
Figura 3. La figura 3 Ã ̈ un particolare del modulo di misura fluorimetrica 9 della forma di realizzazione mostrata in figura 1.
Figura 4. La figura 4 Ã ̈ una rappresentazione schematica di una forma di realizzazione del modulo di reidratazione di microrganismi.
Figura 5. La figura 5 Ã ̈ una rappresentazione schematica di una forma di realizzazione del reattore termostatato ed illuminato per il mantenimento di soluzioni algali.
Figura 6. La figura 6 mostra le cinetiche di inibizione del fenolo ottenute per via sperimentale, come descritto nell’esempio 1.
Figura 7. La figura 7 mostra il calcolo della IC 50 ottenuto con i dati di figura 6. Figura 8. La figura 8 mostra le cinetiche di inibizione dello zinco ottenute per via sperimentale, come descritto nell’esempio 2.
Figura 9. La figura 9 mostra il calcolo della IC 50 ottenuto con i dati di figura 8.
DESCRIZIONE DETTAGLIATA DELL’INVENZIONE
La presente invenzione ha per oggetto un dispositivo 1 per l’analisi ed il monitoraggio della tossicità nelle acque basato sulla tecnologia conosciuta come random access descritta in Journal of Automatic Chemistry, Vol. 10, No. 4 (October-December 1988), pp.167-170, e qui incorporata mediante referenza comprendente: a) un modulo di stoccaggio di campioni acquosi 2;
b) un modulo di stoccaggio di tamponi acquosi 3;
c) un modulo di dispensazione 4;
d) un piatto di reazione 5 atto ad ospitare cuvette di reazione 6;
e) un modulo di lavaggio 7 di dette cuvette di reazione 6;
f) uno o più moduli di misura luminometrica 8 e/o fluorimetrica 9 disposti in corrispondenza di posizioni predefinite di detto piatto di reazione 5.
Il modulo di dispensazione 4 à ̈ essenzialmente un modulo di prelievo, trasferimento e aggiunta di reagenti e campioni e potrà comprendere un braccio meccanico preferibilmente dotato di 3 gradi di libertà , sensore di livello capacitivo, preriscaldamento reagenti a temperatura programmabile, ago con lavaggio automatico interno ed esterno, prediluizione automatica di reagenti e campioni con intervallo di campionamento preferibilmente compreso tra 3 e 330 microlitri e passo compreso tra 0,25 e 1,00 microlitri.
Il piatto di reazione 5 à ̈ un piatto dotato di alloggiamento per le cuvette di reazione 6 contenenti il campione da analizzare. Il piatto potrà essere predisposto per l’alloggiamento di un numero elevato di cuvette, come ad esempio 50, 60, 70, 80, 100 di diverso volume, ad esempio 500 microlitri. In una forma di realizzazione preferita, il piatto à ̈ fornito della possibilità di regolazione della temperatura di reazione, ad esempio in un intervallo compreso tra 10 e 50 °C, t ramite circolazione di liquido in apposito canale realizzato nel corpo del piatto.
Il modulo di lavaggio delle cuvette di reazione 7 sarà preferibilmente collegato a dei contenitori contenenti soluzioni di lavaggio e programmabile per eseguire autonomamente il numero di cicli di lavaggio e sterilizzazione richiesti dall’operatore. Il modulo di lavaggio sarà ad esempio posizionato sulla circonferenza del piatto di reazione e accederà alle cuvette del piatto attraverso una traslazione verticale. Il modulo di lavaggio preferibilmente sarà anche un modulo di sterilizzazione; in questo caso saranno usate idonee soluzioni di sterilizzazione. Il modulo di lavaggio 7 preferibilmente comprenderà un’apposita linea di scarico per smaltire i lavaggi.
Il modulo di stoccaggio di campioni acquosi 2 à ̈ un modulo contenente i campioni, percolati o estratti acquosi da analizzare. In una forma di realizzazione, il modulo à ̈ strutturato in maniera tale da poter alloggiare preferibilmente almeno 4 cestelli movimentati da 15 posizioni da 3 ml ciascuno e 8 contenitori fissi da 3 ml ciascuno.
Il modulo di stoccaggio di tamponi acquosi 3 à ̈ un comparto per lo stoccaggio dei tamponi di diluizione e soluzioni di reidratazione idonee a reidratare o diluire i microrganismi usati per l’analisi tossicologica. In una forma di realizzazione, il modulo contiene preferibilmente almeno due cestelli motorizzati da 16 posizioni per fiale da 20 mL e preferibilmente almeno 4 contenitori cilindrici fissi da 50 mL. Il modulo di stoccaggio potrà contenere un termostato per regolare la sua temperatura.
Il dispositivo 1 potrà comprendere uno o più moduli di misura luminometrica 8 e/o fluorimetrica 9.
In una forma di realizzazione, il modulo di misura luminometrica 8 comprende un fotomoltiplicatore 18 e un bundle di fibre ottiche 19 disposti in corrispondenza di una posizione predefinita di detto piatto di reazione 5. Il bundle di fibre ottiche 19 ha una sezione rettangolare e una superficie sostanzialmente corrispondente alla superficie di dette cuvette di reazione 6 dal lato di detto piatto di reazione 5 e una sezione circolare dal lato di detto fotomoltiplicatore 18; questa forma di realizzazione permette di ottenere migliori risultati analitici, in particolare quando le fibre ottiche hanno dimensioni comprese tra 100 e 150 mm<2>e preferibilmente di circa 130 mm<2>.
In una forma di realizzazione, il modulo di misura fluorimetrica 9 comprende almeno 3 sorgenti di luce 20 di eccitazione a diverse lunghezze d'onda ed i rispettivi detector 21 sono posti a circa 90° rispetto a dette sorgenti di luce.
In una forma di realizzazione, il dispositivo 1 comprende un modulo di reidratazione di microrganismi. Facendo riferimento alla figura 4, il modulo di reidratazione in un forma di realizzazione preferita à ̈ basato su un cestello 11 per l’alloggiamento delle fiale contenenti i microrganismi liofilizzati; le fiale potranno avere ad esempio un volume di circa 20-25 ml per consentire l'immissione del tampone di reidratazione. Il cestello 11 à ̈ contenuto all'interno di un mantello refrigerato 12 a temperatura controllata, ad esempio 4 °C, ed à ̈ cale ttato su un alberino motorizzato che può consentire la rotazione delle fiale sia a scopo di miscelazione della sospensione di microrganismi, che di posizionamento delle stesse al di sotto del dispositivo di estrazione 13 del tappo di chiusura in gomma e permettere quindi la reidratazione automatica dei microrganismi. Il dispositivo di estrazione 13 potrà avere la forma di un arpione per la penetrazione nel tappo in gomma con una traslazione verso il basso e la rimozione dello stesso con una traslazione verso l'alto. Una volta rimosso il tappo, il cestello porta-fiale 11 viene opportunamente ruotato per posizionare la fiala al di sotto del modulo di dispensazione 4. Il modulo di dispensazione 4 potrà quindi essere provvisto di una cannula di adduzione collegata ad una mini pompa 17 adatta al trasferimento del tampone di reidratazione dall'apposito contenitore alla fiala da reidratare.
In una forma di realizzazione, il dispositivo comprende un reattore termostatato ed illuminato per il mantenimento di soluzioni algali. Facendo riferimento alla figura 5, il reattore termostatato ed illuminato per il mantenimento di soluzioni algali in una forma di realizzazione preferita comprende una provetta 14 di grandi dimensioni, ad esempio in vetro con un volume di circa 100 ml, in cui viene ricostituita la sospensione algale per essere ivi conservata per un periodo di circa 30 giorni. La provetta in vetro à ̈ inserita all'interno di un mantello termostatato ad una temperatura di circa 25 °C. Sulla parete del mantello sono praticati una serie di fori per alloggiare altrettanti diodi LED per illuminare costantemente la soluzione. Nella estremità superiore della provetta à ̈ posizionato un tappo su cui à ̈ fissato un motorino per la rotazione di un alberino su cui à ̈ calettato un miscelatore ad elica necessario al mantenimento in sospensione delle micro alghe. Dallo stesso tappo di chiusura à ̈ possibile accedere all'interno della provetta con l'ago di aspirazione/dispensazione presente sul modulo di dispensazione, sia per il prelievo della sospensione algale necessaria per l'analisi, che per l'introduzione periodica di una soluzione di nutrimento, che viene conservata nel comparto reagenti.
La presenza del reattore termostatato ed illuminato permette l’uso delle soluzioni algali per la misura di sostanze tossiche, quali erbicidi, metalli pesanti, etc. Le soluzioni algali devono essere mantenute in vita a temperatura controllata illuminandole con specifiche lunghezze d'onda e fornendo quotidianamente sostanze nutritive.
In una forma di realizzazione, il dispositivo 1 comprenderà anche uno o più moduli di misura colorimetrici 10, disposti in corrispondenza di posizioni predefinite di detto piatto di reazione 5. Il modulo di misura colorimetrico 10 potrà comprendere, ad esempio, un colorimetro, uno spettrofotometro, uno spettrofotometro con monocromatore.
In una forma di realizzazione, il dispositivo 1 comprenderà anche dei mezzi per il controllo delle operazioni dei diversi moduli come, ad esempio, una piattaforma elettronica che consente il controllo di tutti i dispositivi operativi, il dialogo con il software interfaccia utente e la segnalazione tempestiva in remoto via web o cellulare dei dati ottenuti e di qualsiasi anomalia analitica o strumentale registrata. Detti mezzi per il controllo delle operazioni potranno comprendere software ed hardware per la programmazione ed esecuzione in forma completamente automatizzata dei cicli analitici definiti dall’operatore come, ad esempio, per l’esecuzione di analisi end-point, cinetiche, fixed time, multistandard e differenziali con bianco campione, in luminescenza e fluorescenza, con l’opzione di potere associare ad esse anche la misurazione spettrofotometrica di colorimetria. I vari moduli costituenti il dispositivo potranno essere controllati da un sistema a microprocessore centrale che governa le varie fasi delle sequenze analitiche. In particolare i vari rilevatori (Spettrofotometro, Colorimetro, Luminometro, Fluorimetro) saranno disposti lungo la circonferenza del piatto di reazione 5, che potrà essere dotato di un sistema di movimentazione a stepper motor, che consente un posizionamento accurato di ciascuna cuvetta di fronte a ciascun rivelatore.
In un’ulteriore forma di realizzazione, il dispositivo 1 potrà comprendere un modulo di campionamento con mezzi per la filtrazione, digestione UV, digestione acida, distillazione, dialisi, diluizione e/o concentrazione dei campioni acquosi da analizzare. Al fine di monitorare o analizzare acque di approvvigionamento o di scarico o provenienti da un corpo idrico ambientale superficiale o sotterraneo, percolati di discarica o estratti acquosi di suoli, sedimenti e materiali in continuo, à ̈ necessario un modulo di campionamento. Alcune di queste matrici, tra cui le acque di rete e i reflui effluenti, non sono sempre analizzabili direttamente dato che sono sottoposte a trattamenti disinfettanti, quali la clorazione, la cloramminazione, l’ozonizzazione e la perossidazione. Ad esempio, il livello residuo di cloro libero disciolto, generalmente compreso tra 0,5 e 1,0 mg/L, che à ̈ mantenuto al fine di proteggere l’acqua potabile da contaminazione batterica durante i trasferimenti, deve essere preliminarmente abbattuto con un opportuno agente rimuovente.
Un’opzione utilizzabile nel pre-trattamento del campione e prevista, in forma preferibile ma non necessaria, prevede la prefiltrazione dei campioni da analizzare. Essa à ̈ utile al fine della rimozione di solidi sospesi e, genericamente, di sostanze atte ad interferire con le misure analitiche. In aggiunta, potranno essere compresi dei mezzi per l’integrazione di un modulo per la pre-concentrazione del campione, ove fosse necessario aumentare la sensibilità analitica e quindi abbassare la soglia di tossicità misurabile. In una versione “da laboratorio†del dispositivo, à ̈ previsto, di serie, un comparto in cui l'operatore può alloggiare un grande numero di campioni, provenienti da diversi punti di campionamento, e che possono essere stati pre-trattati (filtrati, distillati, etc.) preventivamente dall'operatore. Nella versione “on-line†, à ̈ necessario portare il campione all'analizzatore o in continuo o in occasione dell'esecuzione di un nuovo ciclo di analisi. Poiché le caratteristiche fisiche del campione (torbidità , presenza di sostanza organica, etc.) potrebbero essere non adatte ad un suo trasferimento diretto nel reattore analitico, si rende necessario interporre tra il campione e l'analizzatore uno o più moduli di campionamento e pretrattamento, che possano consentire la preparazione del campione per la successiva analisi. Il campione pretrattato con una o più delle modalità descritte, viene fatto fluire in altrettanti pozzetti con troppo pieno a volume costante, per essere prelevato dal dispositivo al momento opportuno.
In un ulteriore forma di realizzazione, il dispositivo 1 comprenderà mezzi per la regolazione della temperatura del modulo di stoccaggio di tamponi acquosi 3 e/o del piatto di reazione 5. Il raffreddamento potrà essere ottenuto attraverso passaggio continuo di acqua refrigerata alla temperatura richiesta, all'interno di uno specifico canale realizzato nel corpo del piatto di reazione; l'acqua refrigerata sarà ad esempio pompata da un chiller esterno. Il riscaldamento potrà essere ottenuto interrompendo la circolazione di acqua refrigerata ed alimentando una fascia scaldante di adeguata potenza termica posizionata sulla base del corpo metallico del piatto di reazione.
È anche oggetto della presente invenzione l’uso del dispositivo in tutte le possibili forme di realizzazione sopra descritte in un procedimento per l’analisi ed il monitoraggio della tossicità di un campione acquoso che utilizza batteri bioluminescenti e/o microalghe e detti procedimenti.
Preferibilmente, il procedimento per l’analisi di tossicità acuta secondo l’invenzione prevede l’utilizzo di batteri bioluminescenti appartenenti al ceppo di riferimento Vibrio fischeri NRRL B-11177. I batteri sono allevati, stabilizzati e liofilizzati in modo tale da garantirne un utilizzo continuativo dopo la reidratazione in apposito tampone salino. In questo modo, essi mantengono per 25–30 giorni un segnale di bioluminescenza misurabile e un’inalterata sensibilità alle diverse tipologie di composti tossici, racchiudibili in due grandi macro-categorie: inquinanti organici, tra cui i pesticidi e gli idrocarburi, e inorganici, tra cui i metalli pesanti ed anioni come il cianuro.
Preferibilmente, il procedimento per la determinazione rapida di tossicità algale secondo l’invenzione prevede l’utilizzo di microalghe che, preferibilmente ma non necessariamente, appartengono alla specie Chlamydomonas reinhardtii. Le microalghe sono allevate, stabilizzate e immobilizzate in maniera originale tale da garantirne un utilizzo continuativo dopo la risospensione in apposito tampone salino. In questo modo, esse mantengono per 30–35 giorni un segnale di fluorescenza relativa variabile eccitabile e misurabile e un’inalterata sensibilità alle diverse tipologie di composti tossici, racchiudibili in due grandi macro-categorie: inquinanti organici, tra cui gli erbicidi, e inorganici, tra cui i metalli pesanti.
La misurazione continua di bianchi e campioni a concentrazioni crescenti e intervalli di tempo predefiniti, tendenzialmente di 30 secondi, risulta nella generazione di cinetiche di inibizione, che permettono di acquisire informazioni preliminari sulla natura e la concentrazione del contaminante che influenza il segnale di bioluminescenza batterica e/o di fluorescenza relativa variabile algale.
Usando il dispositivo dell’invenzione à ̈ anche possibile eseguire immediatamente repliche, a concentrazioni uguali o maggiori di campione, per confermare una tossicità identificata o chiarire, in senso positivo o negativo, una tossicità dubbia.
Come accennato precedentemente, il parametro comunemente utilizzato per definire una misura di tossicità acuta à ̈ la percentuale di inibizione. Essa rappresenta la variazione di luce emessa dai microorganismi in punti percentuale causata dalla presenza del campione. L’emissione luminosa del bianco eseguito utilizzando acqua o matrice a tossicità nulla al posto del campione à ̈ utilizzata come valore di riferimento.
Per i batteri bioluminescenti la percentuale di inibizione (ICb(t)(%)) potrà essere determinata come riportato di seguito:
ICb(t)(%) = [1 – (RLUS(t)/ RLUB(t))] x 100, dove ICb(t)(%) à ̈ la percentuale di inibizione di bioluminescenza al tempo t indotta dal campione S, RLUS(t)à ̈ la misura di luminescenza del campione S al tempo t espressa in unità relative di luminescenza RLU e RLUB(t)à ̈ la misura di luminescenza del bianco B al tempo t espressa in unità relative di luminescenza RLU.
Per le microalghe:
ICf(t)(%) = [1 – (RVFS(t)/ RVFB(t))] x 100, dove ICf(t)(%) à ̈ la percentuale di inibizione al tempo t, RVFS(t)à ̈ la misura adimensionale di fluorescenza relativa variabile calcolata per il campione S al tempo t e RVFB(t)à ̈ la misura adimensionale di fluorescenza relativa variabile calcolata per il bianco B al tempo t.
I campioni acquosi sono opportunamente miscelati con detti microorganismi in modalità completamente automatica tramite tecnologia discreta e dette stazioni di misura sono capaci di misurare i fotoni emessi da detti microorganismi in bioluminescenza e/o in fluorescenza, perciò quando, dopo il contatto con detti campioni acquosi, dette stazioni di misura registrano una variazione significativa del numero di fotoni emessi, l’analizzatore segnala tempestivamente che detti campioni acquosi sono contaminati.
Le sostanze aggiunte (tamponi di reazione) nei procedimenti qui descritti vanno ad alterare la forza ionica di detti campioni acquosi, in modo da renderli isotonici per detti microrganismi. Inoltre, detti tamponi di reazione possono essere utilizzati per alterare la concentrazione ionica di almeno uno ione selezionato e, più preferibilmente, per rimuovere composti tossici generati in seguito a clorazione, cloramminazione, ozonizzazione o perossidazione di detta rete idrica di approvvigionamento o di scarico o di detti campioni, percolati o estratti acquosi.
Detti microorganismi sono una popolazione di batteri bioluminescenti e una popolazione di microalghe stoccati in comparti separati. Detti batteri bioluminescenti e dette microalghe possono essere di volta in volta utilizzati in serie o in parallelo, sia per monitorare le acque, che per analizzare detti campioni, percolati o estratti acquosi. Più tipicamente, detti microorganismi sono selezionati in modo che la loro sensibilità ai contaminanti si esprima tramite una variazione significativa delle loro capacità fotoemittenti. Nel caso dei batteri, questo à ̈ specificatamente dovuto alla diminuzione o alla morte di parte o di tutta la popolazione considerata, mentre nel caso delle microalghe questo à ̈ specificatamente dovuto a un’interferenza al normale processo di fotosintesi clorofilliana.
In una realizzazione alternativa dell’invenzione, à ̈ possibile che si utilizzino batteri che dimostrino un’aumentata emissione luminosa, in risposta alla presenza di particolari contaminanti. In questo caso, la popolazione batterica à ̈ in grado di individuare la presenza di bionutrienti.
In una forma di realizzazione, in ogni posizione del piatto di reazione 5, detti microorganismi, alternativamente batteri bioluminescenti o microalghe, sono combinati con uno o più detti tamponi acquosi e con uno o più detti campioni, percolati o estratti acquosi, al fine di determinare la presenza di eventuali contaminanti nei detti campioni, percolati o estratti acquosi e tutte le operazioni di aggiunta e miscelazione di detti microorganismi, di detti tamponi acquosi e di detti campioni, percolati o estratti acquosi sono eseguite automaticamente dal modulo di dispensazione basato su tecnologia robotica. A posizioni fisse all’esterno del piatto di reazione sono associati un luminometro ed un fluorimetro; il piatto di reazione 5 ruota automaticamente al fine di posizionare alternativamente ogni cuvetta di reazione contenente detti microorganismi, detti tamponi acquosi e detti campioni, percolati o estratti acquosi all’altezza del luminometro o del fluorimetro, al fine di misurare automaticamente la luce emessa dalla sospensione di reazione. Dopo l’esecuzione delle misure ad intervalli di tempo prestabiliti e per la durata prestabilita, tutte le sospensioni contenute in dette cuvette di reazione sono rimosse e smaltite tramite apposita linea di scarico. Le posizioni utilizzate sono lavate e sterilizzate automaticamente da detto modulo di lavaggio.
Il procedimento secondo una forma di realizzazione comprende i seguenti passaggi che definiscono un procedimento per l’analisi ed il monitoraggio in continuo di campioni acquosi:
i. trasferire campioni acquosi da una rete di approvvigionamento o scarico idrico o da un corpo idrico naturale o artificiale all’interno di un dispositivo di tipo random access;
ii. reidratare una o più fiale di microrganismi;
iii. dosare aliquote di acqua all’interno di una o più cuvette posizionate su un piatto di reazione;
iv. dosare aliquote di detti campioni acquosi, in quantità analoghe a dette aliquote di acqua aggiunte in dette cuvette bianco, o in volumi minori, seguite da aggiunte di volumi complementari di acqua, all’interno di una o più cuvette campione posizionate su detto piatto di reazione;
v. dosare aliquote di uno o più tamponi acquosi all’interno di dette cuvette di bianco e di dette cuvette campione;
vi. dosare aliquote di detti microorganismi all’interno di dette cuvette di bianco e di dette cuvette campione;
vii. misurare a tempi prestabiliti per un determinato intervallo di tempo in bioluminescenza e/o fluorescenza, i fotoni emessi da dette cuvette bianco e da dette cuvette campione;
viii. individuare, ove à ̈ stata registrata una variazione significativa nell’emissione luminosa, come risultato del contatto di dette aliquote di detti microorganismi con dette aliquote di detti campioni acquosi, la presenza di contaminanti in detti campioni acquosi;
ix. rimuovere e scaricare dette aliquote di detti microrganismi, dette aliquote di detti tamponi acquosi, dette aliquote di acqua e dette aliquote di detti campioni acquosi da dette cuvette bianco e da dette cuvette campione;
in cui detto procedimento à ̈ caratterizzato dal fatto che la movimentazione di dette aliquote di detti microrganismi, dette aliquote di detti tamponi acquosi, dette aliquote di acqua e dette aliquote di detti campioni acquosi à ̈ autonomamente ed automaticamente gestita da un braccio meccanico dotato di 3 gradi di libertà preferibilmente provvisto di ago di prelievo con sensore di livello capacitivo.
Il procedimento secondo un ulteriore forma di realizzazione dell’invenzione comprende i seguenti passaggi che definiscono un metodo analitico in batch per rilevare la presenza di contaminanti in campioni, percolati ed estratti acquosi:
i. introdurre uno o più campioni, percolati o estratti acquosi all’interno di un dispositivo di tipo random access;
ii. reidratare una o più fiale di microrganismi;
iii. dosare aliquote di acqua all’interno di una o più cuvette di bianco posizionate su un piatto di reazione;
iv. dosare aliquote di detti campioni, percolati o estratti acquosi, in quantità analoghe a dette aliquote di acqua aggiunte in dette cuvette di bianco, o in volumi minori, seguite da aggiunte di volumi complementari di acqua, all’interno di una o più cuvette campione posizionate su un piatto di reazione;
v. dosare aliquote di uno o più tamponi acquosi all’interno di dette cuvette bianco e di dette cuvette campione;
vi. dosare aliquote di detti microorganismi all’interno di dette cuvette bianco e di dette cuvette campione;
vii. misurare a tempi prestabiliti per un determinato intervallo di tempo in bioluminescenza e/o fluorescenza, i fotoni emessi da dette cuvette bianco e da dette cuvette campione;
viii. individuare, ove à ̈ stata registrata una variazione significativa nell’emissione luminosa, come risultato del contatto di dette aliquote di detti microorganismi con dette aliquote di detti campioni, percolati o estratti acquosi, la presenza di contaminanti in detti campioni, percolati o estratti acquosi;
ix. rimuovere e scaricare dette aliquote di detti microrganismi, dette aliquote di detti tamponi acquosi, dette aliquote di acqua e dette aliquote di detti campioni, percolati o estratti acquosi da dette cuvette bianco e da dette cuvette campione e ripetere dall’inizio il processo sopradescritto;
caratterizzato dal fatto che:
la movimentazione di dette aliquote di detti microrganismi, dette aliquote di detti tamponi acquosi, dette aliquote di acqua e dette aliquote di detti campioni, percolati o estratti acquosi à ̈ autonomamente ed automaticamente gestita da un braccio meccanico dotato di 3 gradi di libertà e provvisto di ago di prelievo con sensore di livello capacitivo.
Preferibilmente ma non necessariamente, in entrambe le forme di realizzazione dei procedimenti sopra descritti, a ogni misura di detto campione, percolato o estratto acquoso corrisponde una misura del relativo bianco, eseguito aggiungendo una quantità uguale e analoga di acqua invece del campione, percolato o estratto stesso. Ciò à ̈ reso possibile dalle potenzialità intrinseche del dispositivo basato su tecnologia RA, che riesce a preparare e misurare bianchi e campioni in successione nello spazio di pochi secondi. Inoltre, à ̈ possibile associare alla medesima misura di bianco una serie di misure di campione a differenti diluizioni al fine di determinare, con la massima accuratezza, il livello di tossicità indotta dal campione sui microrganismi selezionati, ovvero la quantità di campione necessaria per ridurre significativamente la luminescenza dei batteri e/o condizionare significativamente l’emissione di fluorescenza dopo debita eccitazione da parte delle microalghe, in un determinato intervallo di tempo. Inoltre, anche l’intervallo previsto tra una misurazione e l’altra del medesimo bianco e campione può essere accuratamente programmato al fine di eseguire misure di tipo cinetico e calcolare il tempo necessario ai contaminanti per causare una riduzione significativa della luminescenza batterica e/o una variazione significativa dell’emissione di fluorescenza algale, ovvero procurare un effetto di tossicità misurabile. L’utilizzo della tecnologia discreta consente, quindi, all’utilizzatore, di accumulare simultaneamente e in tempo quasi reale, informazioni che correlano tempi di azione, concentrazioni ed effetti di tossicità dei contaminanti sia su organismi procarioti che eucarioti, permettendo sia un monitoraggio on-line in continuo di una stessa matrice che uno screening in batch ad alto rendimento di campioni, percolati o estratti differenti.
Tipicamente nel test batterico, si osserva una riduzione di bioluminescenza quando contaminanti ad effetto tossico sono contenuti nel campione acquoso, e questa riduzione à ̈ definita inibizione percentuale. Il risultato analitico à ̈ espresso come IC 50 ad un determinato tempo di incubazione, ovvero la concentrazione di campione, percolato o estratto acquoso o contaminante necessaria a causare una riduzione di bioluminescenza pari al 50 percento della bioluminescenza emessa dal bianco dopo quel medesimo tempo di incubazione.
Tipicamente nel test algale, si osserva una riduzione della fluorescenza relativa variabile, quando contaminanti ad effetto tossico sono contenuti nel campione acquoso, e questa riduzione à ̈ definita inibizione percentuale. Il risultato analitico à ̈ espresso come IC 50 ad un determinato tempo di incubazione, ovvero la concentrazione di campione, percolato o estratto acquoso o contaminante necessaria a causare una riduzione di fluorescenza relativa variabile pari al 50 percento della fluorescenza relativa variabile emessa dal bianco dopo quel medesimo tempo di incubazione.
Secondo una realizzazione preferita dell’invenzione, i batteri bioluminescenti sono forniti in forma liofilizzata, sono reidratati automaticamente e sono conservati in una soluzione di mantenimento a loro conveniente nel detto modulo di reidratazione e stoccaggio di microrganismi.
Secondo una realizzazione preferita dell’invenzione, le microalghe sono fornite in forma immobilizzata e sono risospese automaticamente in appropriato tampone acquoso e conservate in una soluzione di mantenimento a loro conveniente nel detto modulo di reidratazione e stoccaggio di microrganismi.
Secondo una realizzazione ulteriormente preferita dell’invenzione, i batteri bioluminescenti sono conservati in condizioni di crescita estremamente rallentata al fine di mantenere al massimo livello la riproducibilità delle performances analitiche. Ciò à ̈ ottenuto refrigerando a 4 °C un comparto dedicato del detto modulo di reidratazione e stoccaggio di microorganismi tramite circuito di refrigerazione.
Secondo una realizzazione ulteriormente preferita dell’invenzione, le microalghe sono conservate in condizioni di crescita ottimale al fine di mantenere al massimo livello la riproducibilità delle performances analitiche. Ciò à ̈ ottenuto condizionando a 24 °C un comparto dedicato del detto modulo di reid ratazione e stoccaggio di microorganismi tramite circuito di condizionamento.
Esempi
Mediante il dispositivo oggetto della presente invenzione, sono state effettuate le prove descritte negli esempi, secondo uno i procedimenti sopra descritti. I seguenti esempi sono solo illustrativi e non limitano l’invenzione.
Esempio 1 – Misura di tossicità del fenolo come composto organico di riferimento.
Un liofilizzato batterico di Vibrio fischeri NRRL B-11177 à ̈ stato risospeso in 5 ml di tampone salino sterile ed utilizzato per testare la tossicità di 11 campioni standard di fenolo a concentrazioni crescenti da 1 a 25 ppm, rispetto ad un bianco di riferimento. La luminescenza in ogni campione à ̈ stata misurata ogni 30 secondi per la durata di 16 minuti. Alla fine dell’analisi le cuvette sono state automaticamente lavate e sterilizzate.
L’intero ciclo analitico, incluso il lavaggio, à ̈ stato eseguito in 30 minuti. IC 50 calcolato dall’analizzatore à ̈ risultato essere di 18,5 ppm, in perfetto accordo con quanto riportato in letteratura, ovvero compreso tra 13,0 e 26,0 ppm. In figura 6, sono mostrate le letture luminometriche in cinetica a sinistra e le cinetiche di inibizione all’aumentare della concentrazione di fenolo a destra. In figura 7, à ̈ mostrato il calcolo dell’IC 50.
Esempio 2 – Misura di tossicità dello zinco come metallo pesante di riferimento. Un liofilizzato batterico di Vibrio fischeri NRRL B-11177, preparato secondo procedura originale a cura dell’inventore, à ̈ stato risospeso in 5 ml di tampone salino sterile ed utilizzato per testare la tossicità di 11 campioni di zinco solfato a concentrazioni crescenti da 1 a 12.5 ppm, rispetto ad un bianco di riferimento. La luminescenza in ogni campione à ̈ stata misurata ogni 30 secondi per la durata di 16 minuti. Alla fine dell’analisi le cuvette sono state automaticamente lavate e sterilizzate. L’intero ciclo analitico, incluso il lavaggio, à ̈ stato eseguito in 30 minuti. IC 50 calcolato dall’analizzatore à ̈ risultato essere di 7,5 ppm, in perfetto accordo con quanto riportato in letteratura, ovvero compreso tra 3 e 10 ppm. In figura 8, sono mostrate le letture luminometriche in cinetica a sinistra e le cinetiche di inibizione all’aumentare della concentrazione di zinco solfato a destra. In figura 9, à ̈ mostrato il calcolo dell’IC 50.
Claims (13)
- RIVENDICAZIONI 1. Dispositivo (1) di tipo random access per l’analisi ed il monitoraggio della tossicità nelle acque comprendente: a) un modulo di stoccaggio di campioni acquosi (2); b) un modulo di stoccaggio di tamponi acquosi (3); c) un modulo di dispensazione (4); d) un piatto di reazione (5) atto ad ospitare cuvette di reazione (6); e) un modulo di lavaggio (7) di dette cuvette di reazione (6); f) uno o più moduli di misura luminometrica (8) e/o fluorimetrica (9) disposti in corrispondenza di posizioni predefinite di detto piatto di reazione (5).
- 2. Dispositivo (1) secondo la rivendicazione 1 in cui detta stazione di misura luminometrica (8) comprende un fotomoltiplicatore (18) e un bundle di fibre ottiche (19) disposti in corrispondenza di una posizione predefinita di detto piatto di reazione (5), in cui detto bundle di fibre ottiche (19) ha una sezione rettangolare e una superficie sostanzialmente corrispondente alla superficie di dette cuvette di reazione (6) dal lato di detto piatto di reazione (5) e una sezione circolare dal lato di detto fotomoltiplicatore (18).
- 3. Dispositivo (1) secondo la rivendicazione 1 o 2 in cui detto modulo di misura fluorimetrica (9) comprende almeno 3 sorgenti di luce (20) di eccitazione a diverse lunghezze d'onda ed i rispettivi rilevatori (21) sono posti a circa 90° rispetto a dette sorgenti di luce.
- 4. Dispositivo (1) secondo una qualsiasi delle rivendicazioni da 1 a 3 ulteriormente comprendente un modulo di reidratazione di microrganismi (11, 12, 13).
- 5. Dispositivo (1) secondo una qualsiasi delle rivendicazioni da 1 a 4 ulteriormente comprendente un reattore termostatato ed illuminato per il mantenimento di soluzioni algali (14, 15, 16).
- 6. Dispositivo (1) secondo una qualsiasi delle rivendicazioni da 1 a 5 ulteriormente comprendente un modulo di campionamento.
- 7. Dispositivo (1) secondo la rivendicazione 6 in cui detto modulo di campionamento comprende mezzi per la filtrazione, digestione UV, digestione acida, distillazione, dialisi, diluizione e/o concentrazione di campioni acquosi.
- 8. Dispositivo (1) secondo una qualsiasi delle rivendicazioni da 1 a 7 ulteriormente comprendente un modulo di misura colorimetrico (10) disposto in corrispondenza di posizioni predefinite di detto piatto di reazione (5).
- 9. Dispositivo (1) secondo una qualsiasi delle rivendicazioni da 1 a 8 ulteriormente comprendente mezzi per la regolazione della temperatura di detto modulo di stoccaggio di tamponi acquosi (3) e/o di detto piatto di reazione (5).
- 10. Dispositivo (1) secondo una qualsiasi delle rivendicazioni da 4 a 9 in cui detti microrganismi sono batteri appartenenti al genere Photobacterium, Vibrio, Photorhabdus e/o microalghe appartenenti alla specie Chlamydomonas reinhardtii.
- 11. Dispositivo (1) secondo una qualsiasi delle rivendicazioni da 1 a 10 ulteriormente comprendente mezzi per il controllo delle operazioni dei moduli del dispositivo.
- 12. Uso di un dispositivo secondo una qualsiasi delle rivendicazioni da 1 a 11 in un procedimento per l’analisi ed il monitoraggio della tossicità di un campione acquoso che utilizza batteri bioluminescenti e/o microalghe.
- 13. Procedimento per l’analisi ed il monitoraggio in continuo di campioni acquosi comprendente i seguenti passaggi: i. trasferire campioni acquosi da una rete di approvvigionamento o scarico idrico o da un corpo idrico naturale o artificiale in un dispositivo di tipo random access; ii. reidratare una o più fiale di microrganismi; iii. dosare aliquote di acqua all’interno di una o più cuvette posizionate su un piatto di reazione; iv. dosare aliquote di detti campioni acquosi, in quantità analoghe a dette aliquote di acqua aggiunte in dette cuvette bianco, o in volumi minori, seguite da aggiunte di volumi complementari di acqua, all’interno di una o più cuvette campione posizionate su detto piatto di reazione; v. dosare aliquote di uno o più tamponi acquosi all’interno di dette cuvette di bianco e di dette cuvette campione; vi. dosare aliquote di detti microorganismi all’interno di dette cuvette di bianco e di dette cuvette campione; vii. misurare a tempi prestabiliti per un determinato intervallo di tempo in bioluminescenza e/o fluorescenza, i fotoni emessi da dette cuvette di bianco e da dette cuvette campione; viii. individuare, ove à ̈ stata registrata una variazione significativa nell’emissione luminosa, come risultato del contatto di dette aliquote di detti microorganismi con dette aliquote di detti campioni acquosi, la presenza di contaminanti in detti campioni acquosi; ix. rimuovere e scaricare dette aliquote di detti microrganismi, dette aliquote di detti tamponi acquosi, dette aliquote di acqua e dette aliquote di detti campioni acquosi da dette cuvette bianco e da dette cuvette campione; in cui detto procedimento à ̈ caratterizzato dal fatto che la movimentazione di dette aliquote à ̈ autonomamente ed automaticamente gestita da un braccio meccanico dotato di 3 gradi di libertà .
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