CN117448164A - 基于高通量生物芯片的细菌分离方法 - Google Patents
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Abstract
本公开提供一种基于高通量生物芯片的细菌分离方法。具体地,该方法包括:对采集的样本进行预处理,得到菌液样本;其中,菌液样本包括荧光染料;将菌液样本分注至生物芯片的多个微孔;其中,微孔分注的细菌平均数量根据微孔注入至多一个细胞的目标概率和泊松分布确定;按照预设培养条件对经过第一荧光检测的生物芯片进行细菌培养,并通过第二荧光检测监测生物芯片的荧光强度,直至荧光增强的微孔数量的增量满足第一荧光条件;比较分析第一荧光检测的结果和最后一次第二荧光检测的结果,确定荧光增强满足第二荧光条件的孔位;吸取孔位内的菌液样本进行扩大培养,并进行菌种鉴定。这样的方案能够实现细菌的快速、大批量分离。
Description
技术领域
本公开涉及生物技术领域,尤其涉及一种基于高通量生物芯片的细菌分离方法。
背景技术
在土壤、水体、空气及动植物体中,不同种类的微生物绝大多数都是混杂生活在一起的。在临床上,细菌感染引起的疾病,常须从患者体内分离出病原菌才能确诊。对分离出的病原菌作药物敏感试验,能帮助临床选择有效的药物进行治疗。人工分离培养所得的纯种细菌及其代谢产物,可制成疫苗、类毒素、诊断用标准菌液,或经类毒素、纯种细菌免疫动物后制备抗毒素及诊断血清,用于传染性疾病的诊断、预防与治疗。人工分离纯化培养细菌后,再用免疫学和其他方法检测细菌的毒力因子,并可以配合动物实验来鉴定细菌的侵袭力和进行毒力分析。因此,从环境中分离单细胞水平的细菌或者单一菌株对于开发和利用这些微生物,服务于生态环境保护和人类可持续发展是非常有意义的。
目前常用的平板划线法以及稀释涂布法,二者的原理相似,都是在对菌液进行稀释之后,通过连续划线或是平板涂布的方法,使单菌细胞分开,最后在平板上形成单个菌落。但以上常规方法能够获得单菌的数量和种类非常有限,其实验操作费时费力,实验成本较高。
发明内容
有鉴于此,本公开的目的在于提出一种基于高通量生物芯片的细菌分离方法。
基于上述目的,本公开提供了一种基于高通量生物芯片的细菌分离方法,包括:
对采集的样本进行预处理,得到菌液样本;其中,所述菌液样本包括荧光染料;
将所述菌液样本分注至生物芯片的多个微孔;其中,所述微孔分注的细菌平均数量根据所述微孔注入至多一个细胞的目标概率和泊松分布确定;这里,目标概率可以预先设定,例如96%、99%等。
按照预设培养条件对经过第一荧光检测的所述生物芯片进行细菌培养,并通过第二荧光检测监测所述生物芯片的荧光强度,直至荧光增强的微孔数量的增量满足第一荧光条件;
比较分析所述第一荧光检测的结果和最后一次所述第二荧光检测的结果,确定荧光增强满足第二荧光条件的孔位;
吸取所述孔位内的菌液样本进行扩大培养,并进行菌种鉴定。
在一些实施例中,所述对采集的样本进行预处理,得到菌液样本的步骤,具体包括:
将所述样本和缓冲液混匀,静置后取上清进行细胞计数;
利用培养基稀释所述上清,得到预设细胞浓度的菌液样本。
在一些实施例中,所述荧光染料选自刃天青、DMAO染料;和/或
所述刃天青在菌液样本中的浓度是80~120μM。
在一些实施例中,还包括:
在进行第一荧光检测之前,对分注后的芯片封膜并离心。
在一些实施例中,所述封膜的操作条件依据目标细菌的氧气依赖性确定。
在一些实施例中,所述离心的参数包括:离心力1800~2200xg,时间1.5~2.5min。
在一些实施例中,利用纳升级点样仪对所述菌液样本进行分注。
在一些实施例中,所述菌液样本的浓度是0.3个/100nL;所述菌液样本分注的体积是100nL。
在一些实施例中,所相邻两次第二荧光检测的间隔时间为10~14小时。
在一些实施例中,所述样本选自土壤、水体、空气或动植物组织。
从上面所述可以看出,本公开提供的一种基于高通量生物芯片的细菌分离方法,根据泊松分布原理将低浓度的菌液样本分样注入芯片微孔中,以使得细菌被分散至不同的微孔中实现细菌的物理分离,通过荧光显色判断细菌的生长繁殖状况,从而有针对性的吸取细菌进行扩大培养,能够单细胞水平细菌的分离培养,达到单个微生物菌株分离的目的,具有快速、高效的优势,并可以借助实验仪器自动化操作,减少人工,节约成本。芯片微孔培养细菌在实现细菌分离的同时,相比于培养皿还降低了耗材的成本;荧光显色判断仅需细菌生长即可,相比传统方法将细菌培养至肉眼可见节约了细菌培养时间。此外,本方法还能有效地消除种间竞争,在分离通常被常规方法忽略的微生物物种方面提供了显著技术优势。
附图说明
为了更清楚地说明本公开或相关技术中的技术方案,下面将对实施例或相关技术描述中所需要使用的附图作简单地介绍,显而易见地,下面描述中的附图仅仅是本公开的实施例,对于本领域普通技术人员来讲,在不付出创造性劳动的前提下,还可以根据这些附图获得其他的附图。
图1为本公开实施例提供的一种基于高通量生物芯片的细菌分离的技术流程示意图;
图2为本公开实施例提供的SmartChip芯片的第一荧光检测的结果图;
图3为本公开实施例提供的SmartChip芯片经过预设培养条件培养12小时候的第二荧光检测的结果图。
具体实施方式
为使本公开的目的、技术方案和优点更加清楚明白,以下结合具体实施例,并参照附图,对本公开进一步详细说明。
需要说明的是,除非另外定义,本公开实施例使用的技术术语或者科学术语应当为本公开所属领域内具有一般技能的人士所理解的通常意义。本公开实施例中使用的“第一”、“第二”以及类似的词语并不表示任何顺序、数量或者重要性,而只是用来区分不同的条件或操作步骤。“包括”或者“包含”等类似的词语意指出现该词前面的元件或者物件涵盖出现在该词后面列举的元件或者物件及其等同,而不排除其他元件或者物件。“连接”或者“相连”等类似的词语并非限定于物理的或者机械的连接,而是可以包括电性的连接,不管是直接的还是间接的。“上”、“下”、“左”、“右”等仅用于表示相对位置关系,当被描述对象的绝对位置改变后,则该相对位置关系也可能相应地改变。除非特殊说明,本文中的“μM”指的是“μmol/L”,“mM”指的是“mmol/L”。
为了便于理解本公开的技术方案,下面对本公开涉及的一些技术术语进行介绍。
泊松(Poisson)分布是一种统计与概率学里常见到的离散概率分布,适合于描述单位时间(或空间)内随机事件发生的次数。
芯片微孔随机加载一小部分菌液(小于单个芯片微孔的体积)。假设它们彼此独立,细菌将按照泊松分布理论分散在整个阵列的微孔中,这是对在固定时间或空间内发生的随机事件数量的描述。对于单个孔,该孔中存在一定数量细菌的概率由下式描述:
其中,λ是每孔的平均细菌数,e是欧拉常数,n是最终进入孔的实际细菌数。
假设λ是0.3个细菌/微孔,有4%的机会在一个孔中得到多个细菌,也就是说,大多数芯片微孔将会得到零个细菌或一个细菌。需要说明的是,将细菌样本稀释至足够的低浓度,基于该低浓度和每个微孔中加载的样本体积就能够实现对λ的精准控制。
如果严格控制微孔中存在多个细菌的情况,可以通过降低λ值,即加入更低的细菌密度来实现。通过降低细菌样本的浓度或降低加载样本的体积均能够达到降低细菌密度的效果。示例性的,假设λ是0.1个细菌/微孔,那么只有10%的微孔被占用,每个微孔超过一个细菌的概率仅为0.5%。
基于泊松分布,本公开实施例提供一种基于高通量生物芯片的细菌分离方法,能够实现单细胞水平细菌的分离培养,达到单个微生物菌株分离的目的。相比常规的分离方法,本公开提供的细菌分离方法,在实现细菌分离的同时能够有效地避免种间竞争,从而分离得到常规方法因种间竞争无法分离而被忽略的微生物物种,为确保微生物分离的准确性、全面性提供技术保障,具有显著技术优势。
图1为本公开实施例提供的一种基于高通量生物芯片的细菌分离的技术流程示意图。如图1所示,本公开实施例提供的分离细菌的方法,具体包括:
获取样本。这里的样本可以是土壤、水体、空气或动植物组织。
接着利用缓冲液提取样本中的细菌,使得样本中的细菌转移至缓冲液中并计数。需要说明的是,根据不同的样本,可以选择不同的缓冲液。示例性的,样本是土壤,对应的缓冲液可以是磷酸缓冲盐溶液(phosphate buffered saline,简称PBS)。在一些实施例中,可以将获取的样本和缓冲液混匀,静置后取上清进行细胞计数。这里,混匀的步骤包括但不限于涡旋、搅拌、振动等。可选地,细胞计数可以采用细胞计数板来计数。
然后,利用培养基梯度稀释上清,得到预设细胞浓度的菌液样本。需要说明的是,预设细胞浓度可以根据在后续一个芯片微孔中得到多个细菌的概率以及每一微孔的分注体积来确定。示例性的,一个孔内多个细菌的概率是4%,分注体积是100nL,则预设细胞浓度可以是0.3个/100nL。
为了便于观察细菌的生长状态,培养基中包括荧光染料。可选地,荧光染料选自刃天青、DMAO染料。需要说明的是,刃天青随着细菌生长繁殖时产生NADH、NADPH、FMNH2,细胞色素能使刃天青还原,并产生绿色荧光,从而可以借助荧光检测仪进行检测。DMAO染料是一种膜渗透性的绿色核酸荧光染料,与细菌内的染色体DNA结合,能够染色不同活性状态的细菌,这种染料很适合用来染色活细菌,对革兰氏阳性菌和革兰氏阴性菌都可进行染色。
可选地,所述刃天青在菌液样本中的浓度是80~120μM,例如80μM、86μM、90μM、100μM、110μM、120μM。
接着,可以将菌液样本分装至多孔板(384孔板)中,再由多孔板分注至高通量生物芯片的多个微孔中。示例性的,每个微孔的分注体积可以是100nL。采用这样的方式,有利于将菌液样本借助仪器实现自动化分注,操作简便,节省了人工操作时间,降低了因手动操作失误造成实验失败的风险。这里的仪器可以是液体分注平台,例如纳升级点样仪。
可选地,所述高通量生物芯片包含5184个微孔,微孔直径为450μm,高度为0.9mm,容积是150nL。
可选地,利用纳升级点样仪对所述菌液样本进行分注。
然后,对分注完成的芯片封膜并离心。可选地,所述封膜的操作条件依据目标细菌的氧气依赖性确定。示例性的,分离的目标细菌是好氧菌,则封膜可以在普通的超净工作台或生物安全柜内进行;分离的目标细菌是厌氧菌,则点样仪对上述菌液样本进行分注和封膜需要在厌氧操作台内进行。封膜可以避免污染,确保后续分离得到的细菌均来自样本菌液。可选地,封膜的材料可以是不透气的透明膜。
在一些实施例中,所述离心的参数包括:离心力1800~2200xg,例如1800xg、1950xg、2000xg、2100xg或2200xg;离心时间1.5~2.5min,例如1.5min、1.9min、2.0min、2.3min或2.5min。
接着,对芯片进行第一荧光检测,检测结果可以拍照记录。这里,第一荧光检测的检测条件可以根据样本菌液中的荧光试剂确定。例如,刃天青采用荧光定量PCR仪的VIC(绿色荧光)通道进行检测,曝光时间可以是10s。
然后,按照预设培养条件对经过第一荧光检测的所述生物芯片进行细菌培养,并通过第二荧光检测监测所述生物芯片的荧光强度,直至荧光增强的微孔数量的增量满足第一荧光条件。这里,预设培养条件可以包括但不限于温度、氧气含量、湿度等。示例性的,湿度可以是>80%。荧光增强是指每一次第二荧光检测与第一荧光检测相比荧光强度增大,增量是指相邻两次第二荧光检测的荧光增强的微孔数量的差值,第一荧光条件可以包括荧光强度增大量以及差值条件,具体可以预先设定。示例性的,荧光强度增大量例如≥5000,≥10000等,差值条件可以是≥5,≥10等。
需要说明的是,芯片包括多个微孔,在上述预设细胞浓度和分注体积的基础上,大部分微孔中存在零个或一个细菌,极少部分微孔中存在多个细菌。对于存在一个或多个细菌的微孔,随着培养时间的延长,细菌生长会导致荧光增强,而不存在细菌的微孔则荧光强度保持不变。由于细菌生长的速度可能存在差异,荧光增强的速度也存在差异,导致每次第二荧光检测可以出现新的荧光增强的微孔。当荧光增强的微孔数量的增量满足第一荧光条件,则表明芯片上微孔内的各细菌已经生长起来能够被检测到,而无荧光增强或荧光增强较弱的微孔是分注时无细菌的微孔,从而可以根据每个微孔的荧光强度对微孔内是否存在细菌进行判断。
在一些实施例中,相邻两次第二荧光检测的间隔时间为10~14小时,例如10小时、12小时、14小时。
接着,比较分析所述第一荧光检测的结果和最后一次所述第二荧光检测的结果,确定荧光增强满足第二荧光条件的孔位。这里,第二荧光条件可以依据活细胞的荧光强度确定,可以有效避免因检测误差带来荧光增强对分析结果的影响。示例性的,第二荧光条件可以是≥5000、≥10000等。可选地,依据荧光增强的孔位,可以生成孔位荧光信号信息表。
然后,吸取所述孔位内的菌液样本进行扩大培养,并进行菌种鉴定。需要说明的是,基于孔位荧光信号信息表,借助仪器吸取对应孔位的菌液样本进行扩大培养。
可选地,利用多孔板(96孔板)进行扩大培养。这里,多孔板内装有培养基。
在一些实施例中,菌种鉴定包括基因测序。需要说明的是,基因测序可以再次验证菌株的单一性,以确保获得的是单一菌株。若测序发现菌液中包含一种以上的菌株,则可以通过划线法进行二次分离,从而获得单一菌株。
最后,保存经过菌种鉴定的细菌。
需要说明的是,本公开实施例提供的基于高通量生物芯片的细菌分离方法可以用于分离球菌、杆菌和螺旋菌。
为了使得本公开的技术方案更加清楚、易于理解,下面结合附图和具体实施例,对本公开示例性实施例提供的基于高通量生物芯片的细菌分离方法进行详细说明。
下述实施例中所使用的实验方法如无特殊说明,均为常规方法,按照本领域内的文献所描述的技术或条件或者按照产品说明书进行。
下述实施例中所用的材料、试剂等,如无特殊说明,均可从商业途径得到。本公开实施例所用的缩写具有它们的在化学和生物领域内的常规含义。根据化学领域中已知的标准化合价规则构建本文阐述的化学结构和化学式。
下述实施例中使用Takara品牌的高通量、纳升级荧光定量PCR系统(Real-Time PCR System),该系统包括一个液体分注平台(MSND)和一个荧光定量PCR仪(Cycler)。需要说明的是,本公开的实施例也可以借助其他具有类似功能的仪器来实现,本公开对此不做限定。
实施例1
本实施例的目的在于验证泊松分布所预测的比例与实际结果,并对比不同浓度的刃天青对实验的影响。具体步骤如下:
S1.准备试剂,配制LB培养基并灭菌,配制400mM刃天青溶液;
S2.样本采用大肠杆菌,用细胞计数器对该菌液进行浓度计量,两次计数取平均值为109;
S3.将上述大肠杆菌稀释至0.01cell/100nl、0.03cell/100nl、0.1cell/100nl、0.5cell/100nl,各2ml,然后各稀释菌液再等分为4份,分别加不同体积的400mM刃天青溶液,使刃天青浓度分别为50μM、100μM、200μM和400μM;
S4.在384孔板中,按下表1所示,添加上述不同菌液,CK代表未添加菌液的培养基;
表1步骤S4的384孔板中部分孔位与菌液种类的对应关系表
A | B | C | D | |
1 | 100μM+ck | 50μM+0.03 | 50μM+0.5 | 100μM+0.01 |
2 | 100μM+ck | 50μM+0.03 | 50μM+0.5 | 100μM+0.01 |
3 | 100μM+ck | 100μM+0.03 | 100μM+0.5 | 100μM+0.01 |
4 | 100μM+ck | 100μM+0.03 | 100μM+0.5 | 100μM+0.01 |
5 | 100μM+0.01 | 200μM+0.03 | 200μM+0.5 | 100μM+0.01 |
6 | 100μM+0.01 | 200μM+0.03 | 200μM+0.5 | 100μM+0.01 |
7 | 100μM+0.01 | 400μM+0.03 | 400μM+0.5 | 100μM+ck |
8 | 100μM+0.01 | 400μM+0.03 | 400μM+0.5 | 100μM+ck |
9 | 50μM+0.01 | 50μM+0.1 | ||
10 | 50μM+0.01 | 50μM+0.1 | ||
11 | 100μM+0.01 | 100μM+0.1 | ||
12 | 100μM+0.01 | 100μM+0.1 | ||
13 | 200μM+0.01 | 200μM+0.1 | ||
14 | 200μM+0.01 | 200μM+0.1 | ||
15 | 400μM+0.01 | 400μM+0.1 | ||
16 | 400μM+0.01 | 400μM+0.1 |
注:表1中A、B、C、D列对应384孔板的前四列;表1中1~16行对应384孔板的前16行。
S5.在MSND上设置参数,选择100nL的喷液模式,将设有5184个微孔的SmartChip芯片和上一步配置的384孔板放置在合适位置,然后执行分液程序,将384孔板内的样品喷入SmartChip芯片中;
S6.封膜,2000xg离心2分钟;
S7.在Cycler上进行拍照,选用VIC通道,荧光照片保存为0小时;
S8.将SmartChip芯片放在37℃培养;
S9.培养12小时后,拍摄荧光照片保持为12小时;
S10.对找芯片孔位信息表,将荧光强度较大的孔位标记为1,荧光强度较小的标记为0,从而生成一个细菌生长统计表;
S11.将SmartChip芯片放在离心机中2000xg离心2分钟,然后撕下膜,放在取样仪中,将装有LB培养基的96孔板也放在取样仪的右侧;
S12.将细菌生长统计表导入取样仪软件中,取样仪即可将芯片中生长的菌液一对一地转移至96孔板中进行培养。
荧光分析结果与测序鉴定结果相结合,可以确定采用上述方法分离的大肠杆菌在SmartChip芯片的分布满足泊松分布。采用100μM的刃天青可以有效指示细菌的生长。
实施例2
本实施例以土壤为例,对上述基于高通量生物芯片的细菌分离方法进行详细说明,具体步骤如下:
S1.样本处理,将1g土壤悬浮在50mL锥形管内的9mL 1X PBS中,并以3000rpm的速度涡旋30秒;将管上下倒置3次并使直立放置10分钟,以较大的土壤颗粒沉降到管底后,收集上清液;
S2.采用细胞计数板进行计数;
S3.用加有100μM的刃天青溶液的10%胰蛋白胨大豆肉汤培养基(TSB)将上述样本进行梯度稀释至每100nL含有0.3个细菌;然后分装至灭菌的384孔板的48个孔位;
S4.将MSND仪器设置为单一样本喷液模式,分注量每孔100nL,放置384孔板和芯片,点击开始运行;
S5.运行结束后,封上膜,2000xg,离心2分钟;
S6.通过Cycler进行拍照,记为0小时;拍照结果如图2所示;
S7.将芯片放在室温中培养,每12小时进行一次拍照,观察荧光的变化;拍照结果可以参考图3所示;
S8.培养三天后,没有新的孔有明显的荧光增加,取出样品并停止培养;
S9.对0小时的荧光照片和最后一次荧光照片进行分析,确定有明显荧光值增加的孔位,生成孔位信息表;
S10.通过单通道的取样仪吸取相应孔内的菌液,加注在装有培养基的96孔板中进行扩大培养;
S11.对每个获得的菌进行测序鉴定和菌种保存。
结果表明,芯片内的细菌分布满足泊松分布,实现了对土壤中细菌快速、大通量分离。
所属领域的普通技术人员应当理解:以上任何实施例的讨论仅为示例性的,并非旨在暗示本公开的范围(包括权利要求)被限于这些例子;在本公开的思路下,以上实施例或者不同实施例中的技术特征之间也可以进行组合,步骤可以以任意顺序实现,并存在如上所述的本公开实施例的不同方面的许多其它变化,为了简明它们没有在细节中提供。
本公开实施例旨在涵盖落入所附权利要求的宽泛范围之内的所有这样的替换、修改和变型。因此,凡在本公开实施例的精神和原则之内,所做的任何省略、修改、等同替换、改进等,均应包含在本公开的保护范围之内。
Claims (10)
1.基于高通量生物芯片的细菌分离方法,其特征在于,包括:
对采集的样本进行预处理,得到菌液样本;其中,所述菌液样本包括荧光染料;
将所述菌液样本分注至生物芯片的多个微孔;其中,所述微孔分注的细菌平均数量根据所述微孔注入至多一个细胞的目标概率和泊松分布确定;
按照预设培养条件对经过第一荧光检测的所述生物芯片进行细菌培养,并通过第二荧光检测监测所述生物芯片的荧光强度,直至荧光增强的微孔数量的增量满足第一荧光条件;
比较分析所述第一荧光检测的结果和最后一次所述第二荧光检测的结果,确定荧光增强满足第二荧光条件的孔位;
吸取所述孔位内的菌液样本进行扩大培养,并进行菌种鉴定。
2.根据权利要求1所述的方法,其特征在于,所述对采集的样本进行预处理,得到菌液样本的步骤,具体包括:
将所述样本和缓冲液混匀,静置后取上清进行细胞计数;
利用培养基稀释所述上清,得到预设细胞浓度的菌液样本。
3.根据权利要求1所述的方法,其特征在于,所述荧光染料选自刃天青、DMAO染料;和/或
所述刃天青在菌液样本中的浓度是80~120μM。
4.根据权利要求1所述的方法,其特征在于,还包括:
在进行第一荧光检测之前,对分注后的芯片封膜并离心。
5.根据权利要求4所述的方法,其特征在于,所述封膜的操作条件依据目标细菌的氧气依赖性确定。
6.根据权利要求4所述的方法,其特征在于,所述离心的参数包括:离心力1800~2200xg,时间1.5~2.5min。
7.根据权利要求1所述的方法,其特征在于,利用纳升级点样仪对所述菌液样本进行分注。
8.根据权利要求1所述的方法,其特征在于,所述菌液样本的浓度是0.3个/100nL;所述菌液样本分注的体积是100nL。
9.根据权利要求1所述的方法,其特征在于,所相邻两次第二荧光检测的间隔时间为10~14小时。
10.根据权利要求1所述的方法,其特征在于,所述样本选自土壤、水体、空气或动植物组织。
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