JP2011039071A - Dnaのポリメラーゼ連鎖反応をモニタする装置 - Google Patents
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Abstract
【解決手段】複数の離間した反応成分容器と、容器へ励起ビームを差し向けるようにした光源11と、光源と複数の容器との間に、励起ビーム光路に沿って配置された視野レンズ3と、視野レンズから発せられた発光ビームを受けるように配置された検出器10と、を備える機器であって、視野レンズも、複数の容器と検出器との間に、発光ビーム光路に沿って配置されていることを特徴とする。また、視野レンズ3がテレセントリック光学系を提供する。
【選択図】図1
Description
尚、低温伸長相は、全てのDNA鎖がダブルの鎖に再結合される相であり、高温変性相では、DNAは、変性したり、または単一の鎖に分かれる。かかる温度プログラムは、本質的にサイクル毎にDNAを二倍にし、故に、少ない開始量から相当量のDNAを複製する方法を提供する。PCRプロセスは、例えば米国特許第4,683,202号に教示されている。
を有する簡単な構成のビデオカメラとを使用した。かかる装置は、二本鎖DNAが存在する場合に蛍光を発する染料を使用する。これらの技術および機器は、特に、反応を定期的モニタリングするPCR装置には適していない。モニタリングおよび測定の精度をより大きくする需要が存在する。PCRデータのリアル・タイム収集および分析が可能な以前の機器は、必要なダイナミックレンジがない非常に基本的な装置であり、較正手段が組み込まれておらず、サンプルの穴キャップで動作ができず、あまり高価でない。
クを含む反応装置で行われる。成分は、DNAの存在に比例して蛍光を発する蛍光染料を含む。
前記成分はDNAの存在に比例して蛍光を発する蛍光性一次染料を含み、
一次の染料を発光周波数で蛍光発光させる一次の励起周波数を少なくとも有するソースビームを発する光源と、
励起周波数を有する励起ビームに作用するソースビームを受け入れるように配置された第1の手段と、
各懸濁液に励起ビームを焦点に結ばせるように配置されて、一次の染料が発光周波数を有する発光ビームを発する一次のフォーカス手段とを有し、発光ビームは各懸濁液のDNAの濃度を表す強度を有し、フォーカス手段は発光ビームを受け取ると共に通過させ、
発光周波数の発光ビームをより遠くに通過させるようにフォーカス手段からの発光ビームを受け入れるように配置された第2の手段と、
発光ビームを焦点に結ばせるための発光フォーカス手段と、
発光ビームが検出器に焦点に結ぶように、第2の手段および発光フォーカス手段からの発光ビームを受け入れるように配置された検出器を有し、検出器は発光ビームを表す一次のデータ信号を生成し、これによって各小びんのDNAの対応する濃度を生成し、
1次信号データとDNAの対応する濃度とを計算するための一次のデータ信号を受けとる処理手段とを有することを特徴とする光学機器。
(項目2) 第1の手段および第2の手段は、
励起ビーム及び各発光ビームに作用するソースビームを受け入れて、発光周波数の発光ビームを検出器まで通過させるビームスプリッタを有する項目1記載の機器。
(項目3) ビームスプリッタは、励起周波数を有する光を反射し、且つ発光周波数を有する光を通過するように配置される項目2記載の機器。
(項目4) ブロックは、複数の小びんを保持するように構成され、
フォーカス手段は、小びんを覆うように位置するように配置されて、発光ビームは各々が小瓶に対応した個々のビームから成る、対応する複数個の小びんレンズと、個々のビームを受け入れて処理手段が各小びんのDNAの濃度を計算するように対応するデータ信号を生成する光受容体のアレイからなる検出器とを含む項目1記載の機器。
(項目5) 小びんは、透明な小びんキャップを有し、機器は、更に、個々のビーム及び励起ビームの関連部分を通過させるように小びんレンズと一列に並べられる孔を有するプラテンを含み、プラテンは孔に接触しているキャップにはめ込まれる孔に対して配置され、さらに、小びんでのDNA複製を妨げずにキャップの下の凝結を十分に防ぐようにプラテンを加熱する加熱手段を含む項目4記載の機器。
(項目6) フォーカス手段は、小びんレンズと協動するように配置されて各懸濁液に励起ビームの中に焦点を結ばせるように作用するとともに個々のビームを第2の手段に通過させる視野レンズを含む項目4記載の機器。
(項目7) 視野レンズが、補正された非球面フレネルレンズである項目6記載の機器。(項目8) 発光フォーカス手段は、第2の手段および検出器の間に配置された検出レンズを含み、検出レンズは小びんレンズおよび視野レンズと協動して検
出器上に個々のビームの焦点を結ばせる項目6記載の機器。
(項目9) 励起ビームに反応して参照光を発する蛍光性の基準エミッタを更に含み、基準エミッタは検出器に参照ビームとして参照光の少なくとも一部の焦点を結ばせる発光フォーカス手段のために配置され、検出器はさらに参照ビームを受け入れて基準信号を生成し、処理手段は、基準データを計算するために基準信号で受け入れる手段と、DNAの複製反応にて選ばれたポイントに対する基準データで一次のデータを規格化する手段とを含み、故に、モニタリングの間機器ドリフトを補正する項目8記載の機器。
(項目10) 基準部材は、各々が励起ビームに反応して強度が異なる参照ビームを発する複数の基準エミッタと、基準エミッタは検出器に各参照ビームの焦点を結ばせる発光フォーカス手段のために配置され、検出器はさらに各参照ビームを受け入れて基準エミッタ毎に一組の基準信号を生成し、
処理手段は、基準信号を受け入れて相当する基準データの組を計算する手段と、所定の最大値未満の最大の信号データを有する選択された基準データを組から選択する手段とを含み、選択された基準データは一次のデータを規格化するために使用される項目9記載の機器。
(項目11) 第1の手段は更に励起フィルタを含み、第2の手段は更に発光フィルタを含み、第1の手段および第2の手段は、共にビームスプリッタを含み、励起フィルタは光源およびビームスプリッタの間に配置され、発光フィルタはビームスプリッタおよび検出器の間に配置され、励起フィルタは励起周波数を有する光を通過させるとともに発光周波数を有する光を実質的に遮断し、発光フィルタは発光周波数を有する光を通過させるとともに励起周波数を有する光を実質的に遮断し、励起フィルタおよびビームスプリッタは協動してソースビームを受け入れて励起ビームに作用し、発光フィルタおよびビームスプリッタは協動して発光ビームを受け入れて検出器まで発光周波数を有する発光ビームを通過させる項目1記載の機器。
(項目12) 光源、検出器、フォーカス手段、フィルタモジュールを含んでいる筐体を更に含み、ビームスプリッタ、励起フィルタ、発光フィルタはモジュール内に取り付けられて懸濁液に対して選択された一次の染料と関連し、モジュールは、選択された別の一次の染料と関連する別のモジュールと置き換えのために筐体から着脱可能である項目11記載の機器。
(項目13) 光源は、ハロゲンランプと、第1の手段から反対側にランプまでの近傍に配置された楕円反射器とを含み、ランプは楕円反射器から焦点距離に配置されて楕円反射器から反射した光でソースビームに作用し、楕円反射器は実質的に可視光を反射し且つ赤外線光を透過する項目1記載の機器。
(項目14) 励起ビームに応答して参照光を発する蛍光性基準エミッタを更に有し、基準エミッタは検出器への参照ビームとして参照光の少なくとも一部に焦点を結ばせる発光フォーカス手段のために配置され、検出器はさらに参照ビームを受け入れて基準信号を生成し、処理手段は、基準信号を受け入れて基準データを計算する手段と、DNAの反応複製の間に選ばれたポイントに対する基準データで一次のデータを規格化する手段とを有し、故にモニタリングの間機器ドリフトを補正する項目1記載の機器。
(項目15) 基準部材は、各々が励起ビームに応答して強度の異なる参照ビームを発する複数の基準エミッタを含み、基準エミッタは検出器の上へ各参照ビームの焦点を結ばせる発光フォーカス手段のために配置され、検出器はさらに各参照ビームを受け入れて基準エミッタ毎に一組の基準信号を生成し、処理手段は基準信号を受け入れて対応する基準データの組を計算する手段と、所定の最大値未満の最大信号データを有する選択された基準データを組から選択する手段とを有し、選択した基準データは一次のデータを規格化するために使用される項目14記載の機器。
(項目16) 基準部材は、プラスチック蛍光片と、参照ビームと励起ビームの一部とが中性の密度フィルタによって減衰されるように蛍光片に取り付けられた中性の密度フィルタとを含み、中性の密度フィルタは一連の密度を有して各々が参照ビームを発する複数の基準エミッタに作用する項目15記載の機器。
(項目17) 実質的に一定の温度に基準部材を維持する温度手段を更に含む項目16記載の機器。
(項目18) 温度手段は、蛍光片の下に取り付けられる加熱片と、加熱片を制御自在に加熱する手段を含む項目17記載の機器。
(項目19) 各々が励起ビームに応答して強度の異なる参照ビームを発する複数の蛍光性の基準エミッタを更に有し、基準エミッタは検出器の上へ各参照ビームの焦点を結ばせる発光フォーカス手段のために配置され、検出器はさらに各参照ビームを受け入れて基準エミッタ毎の一組の基準信号を生成し、処理手段は、基準信号を受け入れて基準データの対応する組を計算する手段と、所定の最大値未満の最大信号データを有する選択された基準データを組から選択する手段と、DNAの反応複製の間に選ばれたポイントに対して対応する選択基準データで一次のデータを規格化する手段とを有し、故に、モニタリングの間機器ドリフトを補正する項目1記載の機器。
(項目20) データ信号の組は複製シーケンスにて順次生成され、処理手段または検出器、またはその組合せは、各組のデータ信号に対して飽和制限を有し、検出器は、検出器用の処理手段に動作時に接続されて一組の信号の各々を生成するために予め選択された露光時間に亘って入力される発光ビームを積分し、処理手段は、飽和制限未満に対応するデータ信号を維持するために所定の動作範囲内に一次のデータを維持するように露光時間の調整を自動的に行う調節手段と、露光時間の調整に比例して一次のデータを補正する手段とを有する項目1記載の機器。
(項目21) 検出器は、関連する露光時間にて対応するデータ信号を生成するために発光ビームを受け入れる光受容体のアレイを有し、所定の動作範囲が光受容体毎に存在し、処理手段は、更に光受容体毎にデータ信号から光受容体データを計算する手段を有し、調節手段は、最大光受容体データを確認する手段と、最大光受容体データと所定の動作範囲との大小またはその範囲内にあるかどうかを判別する手段と、かかる判別に基づいて所定の動作範囲内に次の光受容体データを維持するために次の露光時間に作用するように露光時間をそれぞれ増減、又は維持する手段と、を有する項目20記載の機器。
(項目22) 各々が励起ビームに応答して強度の異なる参照ビームを発する複数の蛍光性の基準エミッタを更に有し、基準エミッタは検出器の上へ各参照ビームの焦点を結ばせる発光フォーカス手段のために配置され、検出器は各参照ビームを受け入れて基準エミッタ毎に一組の基準信号を生成し、処理手段は、基準信号を受け入れて基準データの対応する組を計算する手段と、所定の最大値未満の最大信号データを有する選択された基準データを組から選択する手段と、DNAの反応複製にて選ばれたポイントに対して対応する選択基準データで一次のデータを規格化する手段と、故にモニタリングの間機器ドリフトを補正する項目1記載の機器。
(項目23) 小びんの成分は、更にDNAからの影響を受けずに実質的に蛍光を発する蛍光性受動染料の標準濃度を含み、ソースビームは、第2の発光周波数で受動染料を蛍光発光させ、このことにより、第2の手段によって通過させて検出器の上へ焦点を結ばせ第2の発光ビームを発光させて対応する第2のデータ信号を生成する第2の励起周波数を含み、処理手段は、更に第2のデータ信号を受け入れて第2のデータを計算する手段と、一次のデータを規格化する染料のための手段とを有し、DNAの計算された濃度は、受動染料の標準濃度に規格化される項目20記載の機器。
(項目24) 第2の励起周波数は、一次の励起周波数と同一であり、受動染料は、第2のビームが発光周波数に実質的にあるように蛍光を発し、DNAが再び結合され且つ対応して一次の染料の発光が最大になるときに熱サイクルブロックのサイクリングの伸長相の間に一次のデータ信号が生成され、DNAが変性され且つ対応して一次の染料の発光が最小になるときに熱サイクルブロックのサイクリングの変性相の間に第2データ信号は生成され、故に、伸長相のためのデータ信号は実質的にDNA濃度を表わし、変性相のデータ信号は実質的に受動染料の標準濃度を表わす項目23記載の機器。
(項目25) 小びんの成分は、更にDNAからの影響を受けずに実質的に蛍光を発する蛍光性受動染料の標準濃度を含み、ソースビームは、第2の発光周波数で受動染料を蛍光発光させ、このことにより、第2の手段によって通過されて検出器の上へ焦点を結ばせた第2の発光ビームを発光させて対応する第2のデータ信号を生成する第2の励起周波数を含み、処理手段は、更に第2のデータ信号を受け入れて第2のデータを計算する手段と、一次のデータを規格化する染料のための手段とを有し、DNAの計算された濃度は、受動染料の標準濃度に規格化される項目1記載の機器。
(項目26) 第2の励起周波数は、一次の励起周波数と同一であり、受動染料は、第2のビームが発光周波数に実質的にあるように蛍光を発し、DNAが再結合され且つ対応して一次の染料の発光が最大になるときに熱サイクルブロックのサイクリングの伸長相の間に一次のデータ信号が生成され、DNAが変性され且つ対応して一次の染料の発光が最小になるときに熱サイクルブロックのサイクリングの変性相の間に第2データ信号は生成され、故に、伸長相のためのデータ信号は実質的にDNA濃度を表わし、変性相のデータ信号は実質的に受動染料の標準濃度を表わす項目25記載の機器。
(項目27) DNAを複製し且つそれをモニタリングするシステムであって、DNAのポリメラーゼ連鎖反応複製用の反応装置と、かかる複製の間のDNAの存在を監視する光学器械とから成り、装置は、反応用の成分の懸濁液を含む少なくとも一つの小びんを保持する熱サイクルブロックを有し、成分はDNAの存在に比例して蛍光を発する蛍光染料を含み、さらにポリメラーゼ連鎖反応を行うための熱サイクリングブロックおよび懸濁液用に手段を有し、機器は、
染料を発光周波数で蛍光発光させる励起周波数を少なくとも有するソースビームを発する光源と、
ソースビームを受け入れて励起周波数を有する励起ビームに作用し且つ励起ビームをフォーカス手段に通過させるように配置された第1の手段とを有し、フォーカス手段は、染料が発光周波数を有する発光ビームを発するように懸濁液毎に励起ビームの焦点を結ばせるとともに、発光ビームを第2の手段に通過させ、第2の手段は発光ビームを検出器に更に通過させるものであり、検出器は、発光ビームを表わすデータ信号さらにはDNAの濃度を生成するために第2の手段からの発光ビームを受け入れるように配置され、
データ信号を受け入れてDNAの濃度を計算し表示する処理手段を有することを特徴とするシステム。
(項目28) 第1の手段および第2の手段は、ともに、ソースビームを受け入れて励起ビームに作用し、且つ発光ビームを受け入れて発光ビームを検出器に通過させるビームスプリッタを有する項目27記載のシステム。
(項目29) 反応用の成分の懸濁液を含んでいる少なくとも一つの小びんを保持する熱サイクルブロックを含む反応装置のDNAのポリメラーゼ連鎖反応複製をモニタするための光学機器用のフィルタモジュールであって、成分はDNAの存在に比例して蛍光を発する蛍光性一次染料を含み、機器は、染料を発光周波数で蛍光発光させる励起周波数を少なくとも有するソースビームを発するように筐体に配置される光源と、染料が発光周波数を有する発光ビームを発するように
各懸濁液に励起周波数を有する励起ビームの焦点を結ばせるように筐体に配置されるフォーカス手段と、発光ビームを受け入れるように筐体に配置されて発光ビームを表すデータ信号とこれに基づきDNAの濃度とを生成する検出器と、データ信号を受け入れてDNAの濃度を計算して表示する処理手段と、を有し、
モジュールは、
サポートフレームを有し、機器は機器へとサポートフレームを受け入れ、
サポートフレームに取り付けられるビームスプリッタフレームを有し、モジュールが差し込まれた状態で、ビームスプリッタはソースビームを受け入れて励起ビームに作用し、発光ビームを受け入れて発光ビームを検出器に通過させ、
光励起周波数を有する光を通過させ且つ実質的に発光周波数を有する光を遮断する励起フィルタを有し、励起フィルタはサポートフレームの内部に取り付けられ、モジュールは挿入された状態で、励起フィルタは、光源およびビームスプリッタの間に配置され、
発光周波数を有する光を通過し且つ実質的に励起周波数を有する光を遮断する発光フィルタを有し、発光フィルタはサポートフレーム内に取り付けられ、モジュールが差し込まれた状態で、発光フィルタは、検出器およびビームスプリッタの間に配置され、
ビームスプリッタ、励起フィルタ、発光フィルタ、従ってモジュールは、懸濁液用に選択された染料と関連し、モジュールは選択された別の染料と関連する別のモジュールに置き換えるために筐体から着脱可能であることを特徴とするフィルタモジュール。
(項目30) ビームスプリッタは、励起周波数を有する光を反射し、発光周波数を有する光を透過させる項目29記載のモジュール。
第1のフォーカス手段は、一次の染料が発光周波数と各懸濁液のDNAの濃度を表す強度とを有する発光ビームを発するように、各懸濁液の中に励起ビームの焦点を結ばせるように配置されている。フォーカス手段は、発光ビームを受け入れて通過させる。第2の手段は、検出器の上へ発光ビームの焦点を結ばせる別のフォーカス手段に対して発光周波数の発光ビームを通過させるために、フォーカス手段から発光ビームを受け入れるように配置される。検出器は、発光ビームを表す一次のデータ信号と、これによる各小びんのDNAの対応する濃度とを生成する。プロセッサは、一次のデータ信号を受け入れてDNAの濃度を計算して表示する。
検出器は、検出器のために動作時に処理手段に接続され、データ信号の各組を生成するために予め選択された露出時間に亘って入力される発光ビームを積分する。そして、処理手段または検出器、またはそれの組合せは、データ信号に対して飽和制限を有する。本発明の更なる態様において、処理手段は、飽和制限未満に対応するデータ信号を維持するために所定の動作範囲内に一次のデータを維持する露出時間を自動で調整する調節手段と、露出時間の調整に比例して一次のデータを補正する手段とからなる。好ましくは、プロセッサは、光レセプタ毎にデータ信号から光レセプタデータを計算する。そして、調節手段は、最大光レセプタデータを確認し、最大光レセプタデータの所定の動作範囲に対する大小、または動作範囲にあるかどうかを判別し、かかる判別に基づいて、次の光レセプタデータを所定の動作範囲内に維持するために次の露出時間に作用するように、露出時間を増減させたり保持する。
機器の底部にて、プラテン2が小びんのキャップに対して載置され、または、キャップが無い場合には、直接小びんに対して載置される。プラテンは、アルミニウム製が都合良く、小びんと直線的に配列される孔2aのアレイを有する。尚、各孔は、直径は小びん上部の直径とほぼ同じである。キャップがある場合、プラテンは、小びんでのDNA複製を妨げずにキャップの下での凝結をほぼ完全に防ぐために、フィルムヒータや、プラテンを加熱する他の手段により維持される温度を有すべきである。これによって、例えば、プラテンは、熱サイクルが達するサンプルの最高温度よりも若干高い温度に保持される。
器は、二色性でなければならず、すなわち、他の光部品から、そして、機器の過熱から赤外線を制限するために、実質的に可視光を反射するとともに赤外線を透過する。これは、光路の熱反射ミラー13によって更に促進される。機械的または電子シャッタ12によって、暗データ(darkdata)を得るために光源を封鎖できる。このタイプの光源は、重要で
なく、投影ランプやレーザなどの他のタイプの光源を適切な光元素とともに使用しても良い。
、口径食が最小でなければならない。
の信号を処理する。したがって、プログラミングは、例えば本譲受人の1998年7月14日出願の係属中の仮特許出願第60/092,785号に開示されるように、対象の画素領域(ROI)を定義するマスキングを含むことが望ましい。光学系の機械的アラインメントは、対象のプログラム領域へのビームの集束を支援するのに必要となることがある。アナログデータ信号は、アナログ/デジタル(A/D)装置15を介してプロセッサに供給される。尚、アナログ/デジタル(A/D)装置15は、本発明においては、プロセッサの一部であると考えられる。飽和レベルは、検出器またはA/Dにより差し止められ、または、好ましくは、CCDダイナミックレンジは、A/Dダイナミックレンジに対応している。適切な範囲は、8ビットの精度(256レベル)であり、CCD増幅器のオフセットは、CCDの暗信号出力(シャッタ12は閉鎖)がA/D範囲内にくるように設定される。プロセッサは、露光時間を選択して、出力がダイナミックレンジ内に維持されるように、検出器に指示する。
75で次の調光(dimmer)セグメントも選択され、選択された基準データ74は、そのセグメントからデータを含む。暗データ51は、78で基準データ74から減算され、暗補正データ80は、84で露光時間54に対して調整されて、調整された基準データを82で生ずる。
この基準染料は、例えば、ローダミンおよびフルオレセイン染料誘導体を含む核酸シーケンスから形成される。適切な基準は、パーキン・エルマ・アプライド・バイオシステムのロックス(Rox)染料である。これらの受動染料分子は、PCR反応に参加しない。故に、その蛍光は実質的にDNAからの影響の無いものであって、反応の間一定に維持される。この蛍光は、好ましくは、少なくとも一つの小びん、好ましくは小びん毎の成分に含まれる受動染料の標準濃度を有するDNA結合染料からの蛍光を規格化するために使用することができる。
2のデータ信号を生成する。プロセッサは、基準濃度を表す第2のデータを計算するために第2のデータ信号を受け入れる。これらのデータは、第1のデータを規格化するために使用され、故に、DNAの濃度が、ドリフト用の規格化とともに、露光時間の調整に比例してDNAの濃度の計算を補正した後に受動染料の基準濃度に規格化される。本実施例において、第2の励起周波数は、第1の励起周波数と同一であり、受動染料は、発光第2のビームが実質的に発光周波数になるように、蛍光を発する。第1のデータ信号は、DNAが再び結合され、且つ、対応して第1の染料発光が最大になるときに、熱サイクルブロックのサイクリングの各伸長相の間生成される。第2のデータ信号は、DNAが変性し、且つ、対応して第1の染料発光が最小になるときに、熱サイクルブロックのサイクリングの各変性相の間に生成される。このように、第1のデータ信号は、DNAの濃度を実質的に表し、第2の相のデータ信号は、受動染料の基準濃度を実質的に表す。
暗データは、55’にて次のものから減じられて、補正された暗データ112を生ずる。これは、さらに基準時間114および実際の露光時間106で69’にて補正され、補正された第2のデータ116を生ずる。
または、第2のデータは、ドリフト規格化の前後で補正された第1データ71に適用することができる。ベースラインサンプルは、122にて選択でき、124にて平均されて、ベースラインデータ126を生ずる。次に、更なる規格化データ120は、ベースラインデータによって128にて除算され、ベースライン補正データ130を生ずる。これらのベースラインサンプルは、PCRの成長が図7の曲線のうちのほぼ水平なベースライン部分を越える前に選択される。選択されたベースラインサイクルは、例えば、6〜15サイクルである。118での更なる規格化の後、更なる規格化データ118が、98でのDNA濃度96の計算に使用される。
簡単なプロシージャは、平らから立ち上がる遷移部で変曲点に対して推論されることになっている。より精巧なプロシージャは、前述の米国特許第5,766,889号に記載されている。
2b レンズ
6 ビームスプリッタ
9 検出レンズ
11 光源
14 プロセッサ
Claims (3)
- 複数の離間した反応成分容器と、
前記複数の容器へ励起ビームを差し向けるようにした光源と、
前記光源と前記複数の容器との間に、励起ビーム光路に沿って配置された視野レンズと、
発光ビーム光路に沿って配置され、前記視野レンズから発せられた発光ビームを受けるように配置された検出器と、を備える機器であって、
前記視野レンズも、前記複数の容器と前記検出器との間に、発光ビーム光路に沿って配置されていることを特徴とする機器。 - 前記視野レンズがテレセントリック光学系を提供する、請求項1に記載の機器。
- 明細書の記載によりさらに特徴付けられる、請求項1または2に記載の機器。
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