CN107548462B - 用于生物分析的系统和方法 - Google Patents

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Abstract

本发明提供了一种生物分析系统。所述系统包括一个样本块组件。所述样本块组件包含一个构造成能够容纳一个样本固持器的样本块，所述样本固持器被如此构造以接纳多个样本。所述系统还包括一个控制系统，该控制系统被如此构造以使所述多个样本在一系列温度之间循环。所述系统还包括一个自动托盘，该托盘包括一个滑动组件，并且所述托盘被如此构造成以使所述样本块组件可逆地从闭合位置滑动至打开位置，以允许用户接触所述多个样本固持器。

Description

用于生物分析的系统和方法
技术领域
本发明整体涉及用于观察、测试和/或分析一个或多个生物样本的系统、装置和方法，并且更具体地涉及用于观察、测试和/或分析生物样本的阵列的系统、装置和方法。
背景技术
一般来说，需要日益提高生物分析系统的自动化程度以提高效率。例如，自动生物样本处理仪器的进步允许更快速并且更高效地分析样本。
也越来越多的需要提供针对用户需求进行设计的生物分析系统，所述用户需求诸如易于安装、易于使用、最小化必需的实验室空间。
发明内容
在本发明的一个实施例中，提供了一种生物分析系统。该系统包括样本块组件，该样本块组件包含一个构造为容纳样本固持器的样本块，样本固持器构造为接纳多个样本。该系统还可包括一个控制系统，该系统构造为使所述多个样本在一系列温度之间循环；以及一个托盘，该托盘构造为用于使样本块组件可逆地从闭合位置滑动至打开位置，以允许用户触及所述多个样本固持器。
在另一个实施例中，提供了一种生物分析系统。该系统包括块组件，该块组件包括具有多个块孔的样本块，该样本块构造为容纳样本固持器，样本固持器构造为接纳多个样本。该系统还可包括一个控制系统，构造为使所述多个样本在一系列温度之间循环；一个光学系统，构造为将激发光传输至所述多个样本并且检测所述多个样本中每个样本所发出的荧光水平。该系统还可包括一个加热的盖子，该盖子包括一块下部板、一个加热器和一块具有多个上部板孔的上部板。下部板可具有一个用于配合所述样本固持器一个上表面的配对表面，该配对表面具有多个下部板孔，每个下部板孔与所述多个块孔中相关联的一个对准以允许激发光传送到块孔。
在其他实施例中，提供了一种生物分析系统。该系统包括多个系统模块，所述多个系统模块包括一个检测器模块、一个发射模块、一个激发模块和一个基座模块。所述多个系统模块可被构造为可逆地连接以形成第一生物分析装置类型。
在另一个实施例中，提供了一种生物分析系统。该系统包括一台仪器和一个用于校准仪器的校准系统。所述仪器可包括一个块组件，其中包括一个构造为容纳一个具有多个反应位点的样本固持器的样本块；以及一个光学系统，能够对多个反应位点发射的荧光成像。所述校准系统可包括一个感兴趣区域(ROI)校准器，该感兴趣区域校准器构造为确定图像中的反应位点位置。校准系统还可包括纯染料校准器，该纯染料校准器构造为通过比较荧光染料的原始谱图与荧光染料的纯谱图校准数据来确定各个反应位点处所用的荧光染料的贡献。该校准系统还可包括一个仪器归一化校准器，该仪器归一化校准器构造为测定滤光器归一化因子。该校准系统甚至还可包括RNase P验证器，该RNase P验证器构造为验证仪器能否区分两种不同数量的样本。该校准系统还可包括显示引擎，该显示引擎构造为显示校准结果。
下文说明和权利要求示出本发明的另外的方面、特征和优点，特别是结合附图予以考虑时，附图中类似的参考标号表示类似的部件。
附图说明
图1为示出示例性仪器系统的框图，根据该示例性仪器系统可实现本教导内容的实施例。
图2为示出计算机系统的框图，根据该计算机系统可实现本教导内容的实施例。
图3示出根据本文所述的各种实施例的一个示例性分布式网络系统。
图4示出根据本文所述的各种实施例的一个具有外壳的热循环仪系统。
图5示出根据本文所述的各种实施例的图4的热循环仪系统，其中可移动的托盘处于打开位置。
图6示出根据本文所述的各种实施例的一个模块化仪器系统。
图7为根据本发明的一个实施例的一个系统的示意图。
图8为各种光源的归一化光谱图，其中包括根据本发明的一个实施例的一个光源。
图9为图8所示的光源光谱在各种波长范围内的光谱积分图。
图10为根据本发明的一个实施例的光学和样本处理系统的实体模型图示。
图11为图7所示的光学系统的放大实体模型图示。
图12为图10所示的光学系统的一部分的剖视图。
图13为根据本发明的一个实施例的成像单元的顶部透视图。
图14为图13所示的成像单元的剖面图。
图15和图16为图13所示的成像单元的底部透视图。
图17-19为图13所示的成像单元的部分放大图。
图20为图11所示的系统的剖视图。
图21示出根据本文所述的各种实施例的生物仪器的校准工作流程。
图22示出qPCR仪器校准中使用的一系列步骤。
图23示出96孔样本容器的感兴趣区域。
图24为校准板的图像，其中FAM染料占据96孔校准板中的每个孔。
图25和图26示出根据本公开的一个实施例的实例工作流程。
图27A示出根据本公开的一个实施例具有棋盘构形的校准板。
图27B为一块包含FAM、VIC、ROX和SYBR染料的四染料棋盘96孔校准板之图像，该校准板与图27A所示的板3100具有相同的构形。
图28A示出本教导内容的各种实施例中使用的染料混合物。
图28B示出用于本教导内容的各种实施例的纯染料和主通道滤光器组合。
图29示出根据本教导内容的各种实施例在归一化之前染料混合物的百分比偏差。
图30示出根据本教导内容的各种实施例在归一化之后染料混合物的百分比偏差。
图31示出根据本教导内容的各种实施例在归一化之后染料混合物的百分比偏差的近距离视图。
图32为示出根据本教导内容的各种实施例的归一化处理的流程图。
图33示出根据本文所述的各种实施例，用于验证一台仪器的一种示例性方法。
图34示出根据本文所述的各种实施例，用于验证一台仪器的另一种示例性方法。
图35示出根据本文所述的各种实施例由扩增数据确定多个荧光阈值。
图36示出根据本文所述的各种实施例用于验证仪器的系统。
图37示出根据本文所述的各种实施例用于校准仪器的系统。
图38示出根据本文所述的各种实施例的可滑动组件。
图39示出根据本文所述的各种实施例，图38中移除了样本块组件的可滑动组件。
图40为根据本文所述的各种实施例，图38的实施例的侧视图。
图41A、图41B和41C提供了根据本文所述的各种实施例的可滑动组件的光学传感器的不同视图。
图42A和42B提供了根据本文所述的各种实施例的可滑动组件的光学传感器的不同视图。
图43示出根据本文所述的各种实施例的样本块组件的一个实施例。
图44A示出根据本文所述的各种实施例的加热的盖子。
图44B和44C提供了根据本文所述的各种实施例的压板的顶视图。
图45示出根据本文所述的各种实施例的加热的盖子的滑轮系统。
具体实施方式
下文说明提供了本发明的实施例，其整体涉及用于制备、观察、测试和/或分析生物样本的阵列的系统、装置和方法。此类说明并非旨在限制本发明的范围，仅仅是为了提供实施例的说明。
系统概述
为制备、观察、测试和/或分析生物样本的阵列，根据各个实施例可以利用的仪器的一个实例为一个热循环仪装置，诸如终点聚合酶链反应(PCR)仪器或定量或实时PCR仪器。图1为示出热循环仪系统100的框图，根据该热循环仪系统可实现本教导内容的实施例。热循环仪系统100可包括加热的盖子110，如下文所详述，该加热的盖子110置于样本块114上，具有多个反应区域或样本块孔，构造为将多个样本112装载到样本固持器(未示出)上，同样如下文所详述。
在各种实施例中，样本固持器可具有多个样本区域或孔，所述多个样本区域或孔被配置为用于接纳多个样本，其中孔可通过盖、顶盖、密封膜或孔与加热的盖子110之间的任何其他密封机构密封在样本固持器内。样本固持器的一些实例可包括但不限于任何尺寸的多孔板、卡或阵列，包括但不限于24孔微量滴定板、48孔微量滴定板、96孔微量滴定板、384孔微量滴定板、微卡、通孔阵列或诸如玻璃或塑料滑片等本质上平面的固持器。在样本固持器的各种实施例中，孔可包括凹陷、凹痕、脊以及它们的组合，在样本固持器基板的表面上形成规则或不规则阵列。样本或反应体积也可位于基板中形成的孔或凹痕内，溶液斑点分布于基板或其他类型的反应室或形式的表面上，诸如样本或溶液位于测试位点或微流体系统的体积内，或位于小珠或小球内部或上部。
在另一个实施例中，初始样本或溶液可以分为数百、数千、数万、数十万或甚至数百万个反应位点，每个反应位点具有例如几纳升、约1纳升或小于1纳升(例如，数十或数百皮升或更少)的体积。
热循环仪系统100还可包括一个样本块114、一个用于加热和冷却的元件116、一个热交换器118、一个控制系统120和一个用户界面122，其中组件114、组件116和组件118可包括在热块组件内。下文更详细地讨论了热块组件。
在一个实施例中，用于加热和冷却的元件116可为热电装置，例如Peltier装置。热块组件内使用的热电装置的数量可取决于多种因素，包括但不限于成本、所需的独立区域的数量以及样本固持器的尺寸。例如，用于固定48孔微量滴定板的样本块的尺寸可以设定成容纳单个热电装置，而为具有多个孔的板配置的样本块则可以容纳多于一个热电装置，例如四个热电装置。此外，如果需要控制样本块上的多个区域，则热电装置的数量可以从单个热电装置改变为诸如样本块上的每个样本区域(例如，孔、通孔、反应位点等)对应一个热电装置。例如，对于这样的样本块，其中该样本块可划分为例如16孔形式的6个子块，这些子块一起形成可容纳96孔微量滴定板的96孔阵列。如果需要对每个子块进行独立的区域控制，则采用6个热电装置，其中每个热电装置对应于相关联的子块。
在另选的实施例中，热循环仪系统100可具有双面热组件，其中用于加热和冷却的元件116和热交换器118可设置在样本块114的上方(上侧)和下方(下侧)在此类实施例中，设置在样本块114的上方的双面热组件的上侧可替代加热器盖子110。此类配置可从样本的上方和下方提供更均匀的加热。对于实时热循环仪，上侧可具有透光结构的部分，允许激发光源和发射的荧光穿过。此类部分可由任何透光材料制成，包括诸如塑料和玻璃等材料。
热循环仪系统100还可具有光学系统124。在图1中，光学系统124可具有一个发射电磁能量的照明源(未示出)、一个用于接收来自样本固持器的样本112的电磁能量的光学传感器、检测器或成像器件(未示出)、用于将电磁能量从每个DNA样本引导至成像器件的光学器件。该光学系统将在下文中更详细地讨论。
控制系统120可用于控制光学系统124、加热的盖子110和热块组件的功能，其中热块组件包括样本块114、加热和冷却元件116和热交换器118。控制系统120可由最终用户通过图1的热循环仪系统100的用户界面122进行访问。控制系统120可用于控制热循环仪系统100的校准，如下文所详述。
计算机实现的系统
按照本文所述的实施例的方法可在计算机系统中实现。
本领域的技术人员将认识到，可以适当地使用硬件、软件、固件或它们的组合来实现各种实施例的操作。例如，一些过程可由使用处理器或软件、固件或硬连线逻辑部件控制下的其它数字电路执行。(术语“逻辑部件”在本文中是指如本领域的技术人员所认识到的能够执行上述功能的固定硬件、可编程逻辑部件和/或它们的适当组合。)软件和固件可存储在非暂态计算机可读介质上。一些其他过程可使用模拟电路来实现，正如本领域的普通技术人员所熟知。另外，存储器或其它存储设备以及通信部件也可以用于本发明的实施例中。
图2为示出根据各种实施例可用于执行处理功能的计算机系统200的框图。执行实验的仪器可以连接至示例性计算系统200。根据各种实施例，可以利用的仪器包括例如图1的热循环仪系统100。计算系统200可包括一个或多个处理器，诸如处理器204。例如，处理器204可使用通用或专用处理引擎，诸如微处理器、控制器或其它控制逻辑部件来实现。处理器204可连接至总线202或其它通信媒介。
参见图2，计算机系统200可提供对图1中的热循环仪系统100以及用户界面功能的控制。另外，图2的计算机系统200可提供数据处理、显示和报告准备功能。所有此类仪器控制功能可局部专用于PCR仪器。于是，计算机系统200可用作图1所示的控制系统120。图2的计算机系统200还可提供对控制、分析和报告功能中的一部分或全部的远程控制，如随后所详述。
图2的计算系统200还可实现为多种形式中的任一种，诸如机架式计算机、大型机、超级计算机、服务器、客户端、台式计算机、笔记本电脑、平板计算机、手持式计算设备(例如，PDA、蜂窝电话、智能电话、掌上电脑等)、集群网格、上网本、嵌入式系统或给定应用或环境可能期望的或适当的任何其他类型的专用或通用计算设备。另外，计算系统200可包括传统网络系统或与LIS/LIMS基础设施的集成，其中传统网络系统包括客户端/服务器环境和一个或多个数据库服务器。多种传统网络系统在本领域中是已知的，其中包括局域网(LAN)或广域网(WAN)，并且包括无线和/或有线部件。另外，客户端/服务器环境、数据库服务器和网络在本领域中已有充分记载。根据本文所述的各种实施例，计算系统200可能被配置为连接至分布式网络中的一个或多个服务器。计算系统200可接收来自分布式网络的信息或更新。计算系统200还可以传输待存储于分布式网络内的信息，该信息可以由连接至分布式网络的其他客户端来访问。
图2的计算系统200还包括存储器206，该存储器206可为随机存取存储器(RAM)或其它动态存储器，其耦合到用于存储将由处理器204执行的指令的总线202。存储器206还可用于在执行将由处理器204执行的指令的过程中存储临时变量或其它中间信息。
计算系统200还包括耦合到总线202用于存储处理器204的静态信息和指令的只读存储器(ROM)208或其它静态存储设备。
计算系统200还可包括存储设备210，例如提供并且耦合到总线202以存储信息和指令的磁盘、光盘或固态驱动器(SSD)。存储设备210可包括介质驱动器和可移动存储接口。介质驱动器可包括支持固定或可移动存储介质的驱动器或其他机构，如硬盘驱动器、软盘驱动器、磁带驱动器、光盘驱动器、CD或DVD驱动器(R或RW)、闪盘驱动器或其他移动或固定介质驱动器。如这些实例所示，存储介质可包括计算机可读存储介质，该计算机可读存储介质中具有特定的计算机软件、指令或数据。
在另选的实施例中，存储设备210可包括其它类似的工具以允许计算机程序或其他指令或数据加载到计算系统200中。此类工具可包括诸如可移动存储单元和接口，例如程序盒式存储器和盒式存储器接口、移动存储器(例如，闪速存储器或其他可移动存储模块)和存储器插槽，以及用于允许将软件和数据从存储设备210传送至计算系统100的其他移动存储单元和接口。
图2的计算系统200还可包括通信接口218。通信接口218可用于允许软件和数据在计算系统200和外部设备之间传输。通信接口218的实例可包括调制解调器、网络接口(例如以太网或其他NIC卡)、通信端口(例如USB端口、RS-232C串行端口)、PCMCIA插槽和PCMCIA卡、蓝牙等。通过通信接口218传送的软件和数据可以是能够由通信接口218接收的电子、电磁、光学及其他信号的形式。这些信号可以由通信接口218通过诸如无线介质、线材或线缆、光纤或其他通信介质的信道来发送和接收。信道的一些实例包括电话线、蜂窝电话链路、RF链路、网络接口、局域网或广域网及其他通信信道。
计算系统200可通过总线202耦合到显示器212，例如阴极射线管(CRT)或液晶显示器(LCD)，该显示器212用于向计算机用户显示信息。例如，包括字母数字键及其他键的输入设备214耦合到总线202，该设备用于将信息和命令选择传输至处理器204。输入设备还可以是具有触摸屏输入功能的显示器，例如LCD显示器。另一种类型的用户输入设备为光标控制装置216，例如用于将方向信息和命令选择传递至处理器204并且用于控制光标在显示器212上移动的鼠标、轨迹球或光标方向键。该输入设备通常具有两个轴上的两种自由度以使设备指定在平面上的位置，所述两个轴为第一轴(例如，x轴)和第二轴(例如，y轴)。计算系统200提供数据处理并且提供此类数据的置信水平。与本教导内容的实施例的某些具体实施相一致的是，数据处理和置信度值由计算系统200提供，以响应处理器204执行包含在存储器206中的一个或多个指令的一个或多个序列。此类指令可以由另一个如存储设备210的计算机可读介质读入存储器206中。执行包含在存储器206中的指令序列引起处理器204执行本文所述的过程。或者，硬连线电路可用于代替软件指令或与软件指令结合以实施本教导的实施例。因此，本教导内容的实施例的具体实施不限于硬件电路和软件的任何特定组合。
本文中使用的术语“计算机可读介质”和“计算机程序产品”通常是指涉及向处理器204提供用于执行的一个或多个序列或一个或多个指令的任何介质。在执行时，通常被称为“计算机程序代码”的此类指令(其可以以计算机程序的形式或其它分组的形式分组)使计算系统200能够执行本发明的实施例的特征或功能。这些及其他形式的非暂态计算机可读介质可采取多种形式，包括但不限于非易失性介质、易失性介质和传输介质。非易失性介质包括诸如固态盘、光盘或磁盘，例如存储设备210。易失性介质包括动态存储器，例如存储器206。传输介质包括同轴线缆、铜线和光纤，该光纤包括线材，该线材包括总线202。
计算机可读介质的常见形式包括例如软盘(floppy disk)、软磁盘(flexibledisk)、硬盘、磁带、或任何其他磁介质、CD-ROM、任何其他光学介质、穿孔卡、纸带、任何其他具有孔图案的物理介质、RAM、PROM以及EPROM、FLASH-EPROM、任何其他存储器芯片或盒式存储器、如下文所述的载波、或计算机可读取的任何其他介质。
各种形式的计算机可读介质可涉及将一个或多个指令的一个或多个序列携带至用于执行的处理器204。例如，指令最初可携带在远程计算机的磁盘上。远程计算机可将指令加载到其动态存储器中并且使用调制解调器通过电话线路发送指令。计算系统200的本地调制解调器可接收电话线的数据并且使用红外发射器将数据转换为红外信号。耦合到总线202的红外检测器可接收红外信号中携带的数据并且将该数据置于总线202上。总线202将该数据携带至存储器206，处理器204从存储器206中检索并且执行指令。由存储器206接收的指令可可选地在处理器204执行之前或执行之后存储于存储设备210上。
应当理解，为清楚起见，上述说明参考不同的功能单元和处理器描述本发明的实施例。然而，显而易见的是，在不脱离本发明的情况下可使用不同的功能单元、处理器或域之间任何合适的功能分布。例如，示出的由独立的处理器或控制器执行的功能可以由相同的处理器或控制器来执行。因此，对特定功能单元的引用仅应视为对提供所述功能的合适装置的引用，而非指示严格的逻辑或物理结构或组织。
分布式系统
典型的互联网网络配置2500的一些元素如图5所示，其中可能处于远程本地办公室中的多个客户端机器2502被示出为连接至网关/集线器/隧道服务器等2510，网关/集线器/隧道服务器等2510本身通过一些互联网服务提供商(ISP)连接2510连接到互联网2508。还示出了类似地通过ISP连接2514连接到互联网2508的其他可能的客户端2512，其中这些单元与可能的中心实验室或办公室进行通信，例如，通过ISP连接2516连接到网关/隧道服务器2518，网关/隧道服务器2518已连接2520至各种企业应用服务器2522，企业应用服务器2522可通过另一个集线器/路由器2526连接到各种本地客户端2530。这些服务器2522中的任一种可用作分析本发明中所述的潜在内容管理和传输设计解决方案的开发服务器，下文提供了更为全面的描述。
模块化系统
图4示出热循环仪系统100的一个实施例，其中外壳140包封前文所述的系统的100的许多元件。在该实施例中，用户界面122设置在系统100的前侧，其中托盘面150设置在界面122下方。外壳140可基于优选要求由单一件或多件制成。
图5示出图4的实施例，其中可移动托盘160处于打开的暴露位置。可移动托盘160可包括如图所示的样本块114。在打开位置处，样本块114可用于装载样本。除样本块114之外，可移动托盘160可包括其他部件，这些部件在可移动托盘160处于打开位置时被顶出。例如，可移动托盘160可包括与样本块114相关联的加热和冷却元件。另外，可移动托盘160可包括相关联的热交换器或散热器。可移动托盘160能够以手动或机械的方式移动。例如，如果托盘160能够以手动方式移动，则可设置手柄或握把。如果能够以机械方式移动，则系统100内可设置电机系统，如下文所详述。
图6示出热循环仪系统100的一个实施例，其中系统100由模块化组件构成。通过使用模块化构造，模块可被构造以使其适用于多种仪器系统。例如，光学器件模块可被构造为用于不同类型的仪器。此外，模块化结构通过提供已经构造的仪器部分而无需从零开始的完整仪器结构，从而降低构造难度。另外，模块化结构可提高适用性。仅需连接几个模块即可形成一个完整的仪器，因此只需反转该过程即可获得待维修的特定模块。
在图6中，系统100包括检测器模块405(相关联的传感器板/检测器板、检测器和PSB)、发射模块410(发射滤光轮、相机)、激发模块415(激发源和激发滤光轮)、基座模块420(分束器、折叠式反射镜)和面板425。
检测器模块405可包括例如与光学系统124相关联的所述发射传感器、发射检测器、传感器印刷电路板和检测器印刷电路板。发射模块410可包括例如与光学系统124相关联的所述相机和发射滤光轮。激发模块415可包括例如与光学系统124相关联的所述激发源、源冷却部件和激发滤光轮。基座模块420可包括例如与光学系统124相关联的所述分束器和折叠式反射镜，以及例如所述样本块、块加热/冷却元件、热交换器/散热器、控制系统和加热器盖子。最后，面板425可用于例如覆盖基座模块420的所述镜部件，辅助连接基座模块420至发射模块410，和/或提供一个平面以容纳用户界面122。将在下文中对上述部件进行更详细的讨论。而且，上述特定模块所包括的部件仅用于示例性目的且可以根据需要互换。此外，可根据需要增加或减少模块的数量。例如，检测器模块405和发射模块410可结合到单个模块中。另一方面，基座模块420可分成多个较小的模块。
模块405、410、415和420中的一个或多个还可用作不同仪器类型的模块。这种灵活性使制造更有效，因为可采用常见模块构造多种类型的仪器。例如，上述模块可被连接以形成一个具有一个96孔形式的qPCR仪器。这些模块的一者或多者还可用以形成例如具有一种384孔形式、一种通孔形式、一种平块形式等的一个qPCR仪器。这些模块的一者或多者还可用以形成例如一个端点PCR仪器。这些模块的一者或多者还可用以形成例如具有不同光学系统的qPCR仪器，所述不同光学系统包括例如4色或6色光学系统。这些模块的一者或多者还可用以形成例如一个毛细管电泳仪器。这些模块的一者或多者还可用以形成例如一个数字PCR仪器。这些模块的一者或多者还可用以形成例如一个光读出器。
光学系统
如上文所概述并且如图1所示，热循环仪系统100可包括光学系统124。
如本文所用，术语“辐射”或“电磁辐射”意指由某些电磁过程释放的辐射能，其可能包括一种或多种可见光(例如，辐射能的特征在于介于400纳米和700纳米之间或介于380纳米和800纳米之间的一个或多个波长)或不可见的电磁辐射(例如，红外线、近红外线、紫外线(UV)、X射线或γ射线辐射)。
如本文所用的“激发源”意指电磁辐射的来源，其可能朝向至少一个包含一种或多种化合物的样本，使得电磁辐射与所述至少一个样本相互作用，以产生指示所述至少一个样本之状况的发射电磁辐射。激发源可能包括光源。如本文所用，术语“光源”是指包含一段具有一个峰值或最大输出(例如，功率、能量或强度)之电磁波谱的电磁辐射的来源，该峰值或最大输出在所述电磁波谱(例如范围在400纳米至700纳米或380纳米和800纳米之波长范围内的电磁辐射)的可见光波段范围内。除此之外或另选地，所述激发源可包含处于电磁波谱的红外(近红外、中红外和/或远红外)或紫外线(近紫外和/或极紫外)部分的至少一部分内的电磁辐射。除此之外或另选地，所述激发源可能包含电磁波谱其他波段中的电磁辐射，例如在电磁波谱的X射线和/或无线电波部分中。所述激发源可能包含一个单一光源，例如一个白炽灯、一个气体放电灯(例如，卤素灯、氙灯、氩灯、氪灯等)、一个发光二极管(LED)、一个有机LED(OLED)、一束激光，诸如此类。所述激发源可能包含多个单个光源(例如，多个LED或激光器)。所述激发源还可能包括一个或多个激发滤光器，诸如一个高通滤光器、一个低通滤光器或一个带通滤光器。例如，该激发滤光器可能包括一个滤色器和/或一个二向色滤光器。所述激发源包含在空间上和/或时间上分离的单一束流或多个束流。
如本文所用，一次“发射”意指由于来自一个激发源的辐射，与包含或被认为包含一种或多种化学和/或生物分子或者目标化合物之一个或多个样本的相互作用而产生的一次电磁辐射。所述发射可能起因于样本对来自所述激发源的辐射所产生的一种反射、折射、偏振、吸收和/或其他光学效应。例如，该发射可能包含通过一个或多个样本所吸收的所述激发电磁辐射而诱发的发光或荧光。如本文所用，“发射光”是指包含一段具有一个峰值或最大输出(例如，功率、能量或强度)之电磁波谱的一次发射，该峰值或最大输出在所述电磁波谱(例如范围在420纳米至700纳米之波长范围内的电磁辐射)的可见光波段范围内。
如本文所用，一个透镜意指被构造成能够引导或聚焦入射电磁辐射以便会聚或发散此类辐射的一个光学元件，例如在一段有限距离或在光学无限远处提供真实或虚拟的图像。该透镜可能包含具有由所述入射电磁辐射的折射、反射和/或衍射所提供之一个光功率的一个单一光学元件。或者，该透镜可能包含一个由多个光学元件组成的复合系统，例如，包括但不限于一个消色差透镜、双透镜、三合透镜或相机透镜。该透镜可能至少部分地容纳在一个透镜罩或一个透镜支架中，或至少部分地被一个透镜罩或一个透镜支架包围。
如本文所用，术语“光功率”意指一个透镜或光学器件置于空气中时会聚或发散光以提供一个焦点(实际或虚拟)的能力。如本文所用，术语“焦距”意指所述光功率的倒数。如本文所用，术语“衍射功率”或“衍射光功率”意指一个透镜或光学器件或其一部分的功率，归因于入射光进入一个或多个衍射级的衍射。除非另外注明，否则一个透镜、光学器件或光学元件的所述光功率来源于与透镜或光学器件相关联的参考平面(例如，一个光学器件的主平面)。
如本文所用，术语“生物样本”意指包含本文所描述或暗示的本发明各种实施例之用户、制造商或经销商的任何类型的目标生物化学品或组分和/或任何靶分子的一种样本或溶液，以及包含用于执行生物测定、实验或测试目的的相关化学品或化合物的任何样本或溶液。这些生物化学品、组分或靶分子可能包括但不限于DNA序列(包括无细胞DNA)、RNA序列、基因、寡核苷酸、分子、蛋白质、生物标志物、细胞(例如，循环肿瘤细胞)或任何其他合适的靶生物分子。一个生物样本可能包含至少一种靶核酸序列、至少一种引物、至少一种缓冲液、至少一种核苷酸、至少一种酶、至少一种洗涤剂、至少一种封闭剂，或至少一种适用于检测靶标或参比核酸序列的染料、标志物和/或探针中的至少一者或多者。在各个实施例中，此类生物组分可能与一种或多种PCR方法和系统结合使用，诸如胎儿诊断、多重dPCR、病毒检测，以及量化标准物、基因分型、测序分析、实验，或方案、测序验证、突变检测、转基因生物检测、罕见等位基因检测，和/或拷贝数变异。
根据本发明的实施例，包含至少一种目标生物靶标的一种或多种样本或溶液可以包含于、分散介于或分配介于多个较小的样本体积或反应区域(例如，小于或等于10纳升、小于或等于1纳升，或者小于或等于100皮升的体积或区域)中。本文所公开的反应区域通常示出为包含在位于基板材料中的孔中；然而，根据本发明的实施例之其他形式的反应区域可能包括位于形成于基板中通孔或凹痕内的反应区域、分布于基板表面上的溶液斑点、位于毛细管或微流体系统的测试位点或体积内，或位于多个微珠或微球上的样本或溶液。
虽然根据本发明实施例所述的装置、仪器、系统和方法通常涉及dPCR和qPCR，但本发明的实施例可适用于任何PCR过程、实验、测定或方案，其中对大量反应区进行处理、观察和/或测量。在根据本发明实施例所述的dPCR测定或实验中，将包含至少一种靶标多核苷酸或核苷酸序列的一份稀释溶液细分为多个反应区，使得这些反应区中的至少一部分包含靶标核苷酸序列的一个分子或不含靶标核苷酸序列。当反应区随后在PCR方案、程序、测定、过程或实验中进行热循环时，包含所述靶标核苷酸序列的一个或多个分子的反应区被大量扩增并且产生正的可检出的检测信号，而那些不含任何所述靶标核苷酸序列的反应区将不被扩增并且不产生检测信号，或产生低于预定阈值或噪声水平的信号。使用泊松统计，可将分布在反应区之间的原溶液中靶标核苷酸序列的数量与产生正检测信号的反应区的数量关联起来。在一些实施例中，所述检测到的信号可用于测定原溶液中包含的靶分子的数量或数量范围。例如，一个检测系统可以被配置为区分包含一个靶分子的反应区与包含两个或至少两个靶分子的反应区。除此之外或另选地，所述检测系统可能被配置为区分包含多个等于或低于预定量的靶分子之反应区与包含超过预定量的靶分子之反应区。在某些实施例中，qPCR和dPCR两者的过程、测定或方案使用单一相同的装置、仪器或系统和方法加以实施。
参见图7，系统100可包括一个计算机系统、电子处理器，或控制器200、一个被构造为接纳和/或处理一个生物或生化样本的样本块114，和/或光学系统124中的一种或多种。不局限于本发明的范围，系统100可能包括一个测序仪器、一个聚合酶链反应(PCR)仪器(例如，一个实时PCR(qPCR)仪器和/或数字PCR(dPCR)仪器)、毛细管电泳仪、一个用于提供基因分型信息的仪器，诸如此类。
计算机系统200被配置为控制、监测和/或接收来自光学系统124和/或样本块114的数据。计算机系统200可能被物理集成到光学系统124和/或样本块114中。除此之外或另选地，计算机系统200可能与光学系统124和样本块114分开，例如，一台外部台式计算机、便携式计算机、笔记本计算机、平板计算机，诸如此类。计算机系统200与光学系统124和/或样本块114之间的通信可能直接通过诸如USB电缆等物理连接，和/或间接通过无线或网络连接(例如，通过Wi-Fi连接、一个局域网、互联网连接、云连接等)来实现。计算机系统200可能包括包含有指令、例程、算法、测试和/或配置参数、测试和/或实验数据等的电子存储器。计算机系统200可能被配置为例如操作光学系统124的各个部件或者获取和/或处理由样本块114所提供的数据。例如，计算机系统200可能被用以获取和/或处理由光学系统124的一个或多个光电检测器所提供的光学数据。
在某些实施例中，计算机系统200可能集成到光学系统124和/或样本块114中。计算机系统200可能例如使用一个硬线连接、一个局域网、一个互联网连接、云计算系统等与外部计算机通信和/或发送数据到外部计算机以供进一步处理。该外部计算机可能是位于系统100中或系统100附近的物理计算机，例如一台台式计算机、膝上型计算机、笔记本计算机、平板计算机，诸如此类。除此之外或另选地，所述外部计算机和计算机系统200中的任一者或两者可能包含一个虚拟装置或系统，诸如一个云计算或存储系统。数据可能经由一个无线连接、一个云存储或计算系统等在两者之间进行传输。除此之外或另选地，来自计算机系统200(例如，来自光学系统124和/或样本块114)的数据可能被传输至一个外部存储器设备，例如一个外部硬盘驱动器、一个USB存储器模块、一个云存储系统，诸如此类。
在某些实施例中，样本块114被构造为接纳所述样本固持器305。样本固持器305可能包含多个或一系列空间上独立的反应区、位点或位置308，用于容纳对应的多个或一系列生物或生化样本114。反应区308可能包含任何多个体积或位置，其隔离或被构造为隔离所述多个生物或生化样本114。例如，反应区308可能包含一块基板或一个组件中的多个通孔或孔(例如，一块标准微量滴定板中的样本孔)、一个通道或腔室中的多个样本珠、微珠或微球、一个流动池中的多个不同位置、一个基板表面上的多个样本斑点，或被构造为接纳一个样本固持器的多个孔或开口(例如，被构造为接纳一块微量滴定板之一个样本块组件中的所述腔体)。
样本块114可能包括样本固持器305。至少一部分的反应区308可能包括所述一个或多个生物样本114。生物或生化样本114可能包括至少一种靶核酸序列、至少一种引物、至少一种缓冲液、至少一种核苷酸、至少一种酶、至少一种洗涤剂、至少一种封闭剂，或至少一种适用于检测一个靶标或参比核酸序列的染料、标志物和/或探针中的一者或多者。样本固持器305可能被构造为执行一项PCR测定、一项测序分析，或一项毛细管电泳测定、一项印迹测定中的至少一者。在某些实施例中，样本固持器305可能包括一块微量滴定板、包含多个孔或通孔的基板、包含一个或多个通道的基板，或包括含一种或多种生物样本的多个小珠或小球的腔室中的一者或多者。反应区308可能包含多个孔中的一者或多者、基板中的多个通孔、一块基板上或通道内的多个不同位置、一个反应体积内的多个微珠或微球，诸如此类。样本固持器305可能包含一块微量滴定板，例如其中反应区308可能包含至少96个孔、至少384个孔，或至少1536个孔。
在某些实施例中，样本固持器305可能包含一块基板，该基板包括一个第一表面、一个对向第二表面以及设置在所述表面之间的多个通孔，所述多个通孔被构造为容纳一个或多个生物样本，例如专利申请公开号US 2014-0242596和WO 2013/138706中所述，这些专利申请以引用方式并入本文，其如同被完整陈述。在此类实施例中，所述基板可能包含至少3096个通孔或至少20,000个通孔。在某些实施例中，样本固持器305可能包含一个毛细管阵列，该阵列被构造为能够通过一种或多种靶分子或分子序列。
在某些实施例中，系统100可能包括所述加热的盖子110，后者可能被设置在样本固持器305和/或样本块114上。加热的盖子110可能被用以例如防止在样本固持器305中所含样本上发生凝聚，其有助于保持光进入生物样本114。
在某些实施例中，光学系统124包含一个激发源、照明源、辐射源或光源1402，其产生特征在于一个第一波长的至少一个第一激发光束1405a以及特征在于不同于所述第一波长之一个第二波长的一第二激发光束1405b。光学系统124还包含一个光学传感器或光学检测器1408，该光学传感器或光学检测器1408被构造为接收来自一个或多个生物样本响应于激发源1410和/或激发光束1405a、1405b中的一者或多者的发射或辐射。光学系统124另外还包含一个激发光学系统1410，该激发光学系统1410沿一个激发光路1412设置在激发源1402和受照的一个或多个生物样本之间。光学系统124进一步包含一个发射光学系统1415，该发射光学系统1415沿一个发射光路1417设置在所述受照的一个或多个样本和光学传感器1408之间。在某些实施例中，光学系统124可能包含一个分束器1420。光学系统124可能任选地包括一个光束收集器或辐射挡板1422，该光束收集器或辐射挡板1422被构造为减少或防止投射到分束器1420上的辐射从激发源1402反射到发射光路1417中。
在图7示出的例示性实施例以及本文所公开的发明之其他实施例中，激发源1402包含一个辐射源1425。辐射源1425可能包含至少一个白炽灯、至少一个气体放电灯、至少一个发光二极管、至少一个有机发光二极管和/或至少一个激光器中的一者或多者。例如，辐射源1425可能包含至少一个卤素灯、氙灯、氩灯、氪灯、二极管激光器、氩激光器、氙激光器、准分子激光器、固态激光器、氦氖激光器、染料激光器，或它们的组合。辐射源1425可包括特征在于所述电磁波谱的可见光波段中最大波长或中心波长的一个光源。除此之外或另选地，辐射源1425可能包含一个紫外、红外或近红外光源，其对应的最大波长或中心波长处于所述电磁波谱的那些波段中的一者内。辐射源1425可能为一个宽带源，例如，具有至少100纳米、至少200纳米，或至少300纳米的光谱带宽，其中该带宽被定义为强度、能量或功率输出大于预定量的一个范围(例如，其中所述预定量等于或约等于所述辐射源之一个最大波长或中心波长的1％、5％或10％)。激发源1402还可能包含一个源透镜1428，后者被构造为调整来自辐射源1425的发射，例如，用于增加样本固持器305和/或生物样本114中接收的激发辐射的量。源透镜1428可能包含一个单透镜或者可能为一个包括两个或更多个元件的复合透镜。
在某些实施例中，激发源1402还包含可移入和移出激发光路1412的两个或更多个激发滤光器1430，例如，与一个宽带激发源1402结合使用。在此类实施例中，可能使用不同的激发滤光器1430以选择适于诱导生物样本114内一份相应的染料或标志物产生荧光的不同波长范围或激发通道。激发滤光器1430中的一者或多个可能具有一个至少+10纳米或至少+15纳米的波长带宽。激发滤光器1430可能包含多个滤光器，后者共同提供适于使一份
Figure GDA0002541354320000201
染料或探针、一份FAMTM染料或探针、一份
Figure GDA0002541354320000202
染料或探针、一份ROXTM染料或探针，或一份TAMRATM染料或探针中的一者或多者发荧光的多个带通。激发滤光器1430可能布置在一个可旋转的滤光轮(未示出)中或其他使用激发源1402提供不同激发通道的合适装置或设备上。在某些实施例中，激发滤光器1430包含至少5个滤光器或至少6个滤光器。
在某些实施例中，激发源1402可能包含多个单个激发源，后者可能使用又一个分束器或光束组合器加以组合，使得来自每个单个激发源的辐射沿着一个共光路传输，例如沿着图7所示的激发光路1412传输。或者，所述单个激发源中的至少一部分可能被布置成提供沿不同非重叠光路传播的激发光束，例如，以照亮所述多个反应区308的不同反应区。每个单个激发源可能被寻址、激活或选择以照亮反应区308，例如，单独地或成组地或全部同时进行。在某些实施例中，所述单个激发源可能被布置为一个一维或二维阵列，其中这些单个激发源中的一者或多者的特征在于一个最大波长或中心波长不同于所述阵列中其他单个激发源中之至少一者的最大波长或中心波长。
在某些实施例中，第一激发光束1405a包含一个第一波长范围，第一激发光束1405a的强度、功率或能量在该第一波长范围内高于一个第一预定值，并且第二激发光束1405b包含一个第二波长范围，第二激发光束1405b的强度、功率或能量在该第二波长范围内高于一个第二预定值。所述激发光束1405a、1405b的特征波长可能为所述对应波长范围的一个中心波长，或所述对应波长范围内最大电磁强度、功率或能量的一个波长。该激发光束1405中的至少一者的中心波长可能为对应波长范围内的一个平均波长。对于每条激发光束1405(例如，激发光束1405a、1405b)，所述预定值可能小于所述对应最大强度、功率或能量的20％；小于对应最大强度、功率或能量的10％；小于对应最大强度、功率或能量的5％；或小于对应最大强度、功率或能量的1％。所述预定值对于所有激发光束1405(例如，对于激发光束1405a、1405b两者)可能相同，或者该预定值可能彼此不同。在某些实施例中，所述第一和第二激发光束1405a、1405b的波长范围不重叠，而在其他实施例中，所述波长范围中的至少一者至少部分地与其他波长范围重叠。在某些实施例中，所述第一和第二中心波长相隔至少20纳米。在某些实施例中，所述第一和第二波长范围中的至少一者具有一个至少20纳米或至少30纳米的值。
激发光学系统1410被构造为将激发光束1405a、1405b引导至所述一个或多个生物样本。在适用情况下，本文引用的激发光束1405a、1405b可能被应用于包括多于两条激发光束1405的实施例。例如，激发源1402可能被构造为引导至少五条或六条激发光束1405。激发光束1405a、1405b可能被同时产生或提供，可在时间上分离，和/或可在空间上分离(例如，其中激发光束1405a被引导至一个反应区308，并且激发光束1405b被引导至一个不同的反应区308)。所述激发光束1405可能被顺序产生，例如，通过顺序打开和关闭以不同波长为特征的不同颜色的单个辐射源1425，或者通过在一个单一辐射源1425的前面顺序放置不同颜色的滤光器来实现。或者，激发光束1405a、1405b可能被同时产生，例如通过使用一个多波段滤光器、分束器或反射镜，或者通过将不同的单个辐射源1425诸如两个不同颜色的发光二极管(LED)耦合在一起来实现。在一些实施例中，激发源1402产生多于两条激发光束1405，其中激发光学系统1410将所述激发光束的每条引导至一个或多个生物样本114。
参见图8-9，辐射源1425的所述光谱分布可能被以不明显的方式选择，以使不同颜色或激发通道的至少五条激发光束1405能够与一个公共分束器1420配合使用，同时保持所有激发通道在例如qPCR测定的每个循环过程中具有可接受或预定的数据通量。如本文所用，术语“激发通道”意指由一个被构造为照亮一个或多个生物样本的激发源(例如，激发源1402)所提供的若干不同电磁波段中的每个波段。如本文所用，术语“发射通道”意指允许电磁辐射传递到一个光学传感器或检测器(例如，光学传感器1408)上的若干不同发射波段中的每个波段。
图8示出三种不同辐射源之波长谱的相对能量。虚线图为一个卤素灯(在本文中称为“光源1”)的光谱，其特征在于在可见光谱的蓝色波长范围内具有相对较低的能量水平，并且能量随波长增加而提高，在约670纳米处达到一个峰值。点划线光谱图为可商购获得的LED光源(在本文中称为“光源2”)的光谱，其在约450纳米处具有峰值能量，并且在约530纳米至约580纳米处具有一个较低的峰值，然后逐渐降低能量至该可见光谱的红色波长范围。实线图为根据本发明一个实施例的另一种LED光源(在本文中称为“光源3”)的光谱(例如，激发源402的一个示例性光谱)。图9示出图8所示三种光源中每一种光源的各个光谱范围内的积分能量，其中这些光谱为qPCR领域中使用的典型激发滤光器的光谱。所述波长范围和激发滤光器名称在下表1中示出。
激发滤光器通道 波长范围(纳米)
X1 455-485
X2 510-530
X3 540-560
X4 570.5-589.5
X5 630.5-649.5
X6 650-674
表1.图9中所用激发滤光器的光谱带宽。
在qPCR领域中，一个重要的性能参数是获得包含多种目标染料的样本之发射数据的总时间。例如，在一些情况下，宜获得5个或6个染料或滤光器通道(例如，X1-X5/M1-M5或X1-X6/M1-M6，其中“M”代表对应的X(激发)通道编号的发射通道编号)的发射数据。发明人发现，在具有用于六个EX/EM滤光器通道(例如，激发通道X1-X6及对应的发射通道M1-M6)的单一宽带分束器的系统中使用光源2时，获取通道5和/或通道6之数据的时间量对于某些应用场合而言可能过长而无法接受。为了应对这种情况，对于激发通道1和/或2可以使用一个或多个窄带二向色分束器以增加样本接收的激发光的量和传感器接收的发射光的量(使得在这种情况下通过使用二向色分束器来提高总体光学效率)。然而，这排除了如图7所示的单分束器布置，以及一个单分束器配置所对应的优势(例如，缩减尺寸、成本、复杂性)。发现一种更佳解决方案是其中将光源诸如光源3与一个单分束器(例如一个宽带分束器，诸如一个50/50分束器等)结合使用。已发现，激发通道X1、X5和/或X6中的相对能量可用以鉴定适合与单分束器实施例配合使用的一个激发源402。使用光源2和光源3作为实例，由图8和图9所示的数据可以导出下表2所示的下列数据。
比率 光源2 光源3
X1/X2 2.02 3.00
X2/X2 1.00 1.00
X3/X2 1.20 0.98
X4/X2 1.09 0.89
X5/X2 0.49 0.90
X6/X2 0.38 0.90
表2.每个滤光器通道归一化到通道2所得的归一化LED强度。
基于此类数据，发明人发现，在某些实施例中，当X1/X2大于2.5(例如大于或等于3)时，可以获得改善的性能(例如，就较短的通道1积分时间而言)。除此之外或另选地，在其他实施例中，当X5/X2大于0.7(例如，大于或等于0.9)和/或当X6/X2大于0.7(例如，大于或等于0.9)时，可以获得改善的性能(例如，就较短的通道1积分时间而言)。
再次参见图7，激发光束1405在操作过程中被沿激发光路1412导向样本处理样本块114，例如在存在样本固持器305时导向反应区308。当存在时，光源透镜1428被构造为调整激发光束1405，例如以捕获并且引导激发源1402所的大部分发射辐射。在某些实施例中，一个或多个反射镜1432(例如，折叠式反射镜)可能被沿激发光路1412结合，例如以使光学系统124更紧凑和/或提供预定的包装尺寸。图7示出一个反射镜1432；然而，可能使用另外的反射镜，例如以满足包装设计约束。如下文更详细地讨论，另外的透镜可能被设置在样本固持器305附近，例如，以便进一步调整来自包含于一个或多个反应区中的生物样本的所述激发光束1405和/或对应的发射。
发射光学系统1415被构造为能够将来自所述一个或多个生物样本的发射引导至光学传感器1408。这些发射中的至少一部分可能包含来自所述生物样本中至少一部分以响应激发光束1405中至少一者的荧光发射。除此之外或另选地，所述发射中至少一部分包含来自激发光束1405中至少一者的辐射，该辐射被所述生物样本中的至少一部分反射、折射、衍射、散射或偏振。在某些实施例中，发射光学系统1415包含一个或多个发射滤光器1435，所述一个或多个发射滤光器1435被构造为例如阻止激发辐射反射或散射到发射光路1417中。在某些实施例中，每个激发滤光器1430均存在一个对应的发射滤光器1435。
在某些实施例中，发射光学系统1415包含一个传感器透镜1438，该传感器透镜1438被构造为将来自至少一部分所述生物样本中的射线引导至光学传感器1408上。光学传感器1408可能包含一个单一传感器元件，例如一个光电二极管检测器或一个光电倍增管等。除此之外或另选地，光学传感器1408可能包含一个阵列传感器，该阵列传感器包括一个传感器或像素阵列。阵列传感器1408可能包含一个互补金属氧化物半导体传感器(CMOS)、一个电荷耦合装置(CCD)传感器、多个光电二极管检测器、多个光电倍增管等中的一者或多者。传感器透镜1438可能被构造为由来自所述多个生物样本114中一者或多者的发射形成一个图像。在某些实施例中，光学传感器1408包含两个或更多个阵列传感器1408，例如其中由来自所述多个生物样本114中一者或多者的发射形成两个或更多个图像。在此类实施例中，来自所述多个生物样本114中一者或多者的发射可以被划分以提供该多个生物样本114中一者或多者的两个信号。在某些实施例中，所述光学传感器包含至少两个阵列传感器。
分束器1420被沿激发和发射光路1412、1417布置并且被构造为在操作过程中接纳第一和第二激发光束1405a、1405b两者。在图7所示的例示性实施例中，分束器1420被构造为传输所述激发光束1405并且反射来自所述生物样本114的发射。或者，分束器1420可能被构造为反射所述激发光束并且传输来自所述生物样本114的发射。在某些实施例中，分束器1420包含一个宽带分束器，后者对于由激发源1402提供并且被引导至反应区308的所述激发光束1405(例如，所述例示性实施例中的激发光束1405a、1405b)的全部或大部分具有相同或近似相同的反射比。例如，分束器1420可能为一个宽带分束器，后者特征在于在至少200纳米的波段、在至少200纳米的波段，或在所述电磁波谱的可见波段、在所述电磁波谱的可见光和近红外波段，或450纳米至680纳米的波段具有恒定或大约恒定的反射比。在某些实施例中，分束器1420为一个中性密度滤光器，例如，一个在所述电磁波谱的可见波段具有约20％、50％或80％的反射比的滤光器。在某些实施例中，分束器1420为一个二向色分束器，后者在一个或多个选定的波长范围内透射或反射，例如，在中心位于激发光束1405的一个峰值波长处或附近的多于一个波段透射和/或反射的一个多波段分束器。
在某些实施例中，分束器1420为一个单分束器，其配置为单独地或与一个单光束收集器1422结合地接收所述多条激发光束1405(例如，激发光束1405a、1405b)中的一部分或全部。每条激发光束可能被称为一个激发通道，其可能单独或结合使用以激发所述生物样本114中一者或多者中的不同荧光染料或探针分子。相比之下，许多现有技术的系统和仪器，例如，在qPCR领域中，通过针对所述系统或仪器的每个激发通道和/或每个发射通道使用一个单独的分束器和/或光束收集器来提供多条激发光束。在此类现有技术的系统和仪器中，通常在激发通道的至少一部分中使用色度选择性二向色滤光器，以增加样本处接收的辐射量。针对每个通道使用不同分束器和/或光束收集器的系统和仪器之缺点包括尺寸、成本、复杂性和响应时间的增加(例如，由于在激发和/或发射通道之间改变时必须移动或旋转的质量增加)。发明人发现，可以用单分束器1420和/或单光束收集器1422代替这些多分束器和/或光束收集器，同时仍然提供可接受或预定的系统或仪器性能，例如通过适当选择激发源1402的光谱分布和/或通过配置所述系统或仪器以减少由光学传感器408接收的杂散或多余辐射的量(如本文所作进一步讨论)。因此，与现有技术的系统和仪器相比，本发明的实施例可能用以提供具有缩减的尺寸、成本、复杂性及响应时间的系统和仪器。
参见图10-11，在某些实施例中，光学系统124还可能包含一个透镜1440和/或一个透镜阵列1442，其可能包含对应于样本固持器305的每个所述反应区308的多个透镜。透镜1440可能包含一个场透镜，其可能被构造成能够为样本固持器305、反应区308、透镜阵列1442或光学传感器1408中的至少一者提供一个远心光学系统。如图10中的例示性实施例所示，透镜1440可能包含一个菲涅尔透镜。
另外参见图12-16，在某些实施例中，光学系统124包括一个成像单元1445，该成像单元1445包含一块光学传感器电路板1448、传感器透镜1438(其可以是一个复合透镜，如图12所示)、一个内透镜安装架1449、一个外透镜安装架1450、一个螺纹外壳1452和一个聚焦齿轮1455。光学传感器电路板1448、螺纹外壳1452和传感器透镜1438可能一起形成一个包围或包含光学传感器1408的腔体1458，并且可能被构造为能够阻挡任何来自投射光学传感器1408的未进入传感器透镜1438的外部光。外透镜安装架1450包括一个外表面，该外表面包含齿轮齿1460，齿轮齿1460可能经由一个弹性元件(未示出)例如一个弹簧以能够移动或能够滑动的方式接合聚焦齿轮1455的齿。在某些实施例中，聚焦齿轮1455沿一块板1465的一个狭槽1462滑动，如图16所示。内透镜安装架1449包含一个螺纹部分1468，该螺纹部分1468接合或配合螺纹外壳1452的一个螺纹部分。
内透镜安装架1449可能被固定安装于外透镜安装架1450，同时螺纹外壳1452被相对于光学传感器电路板1448固定安装。内透镜安装架1449被以能够移动或旋转的方式安装于螺纹外壳1452。因此，聚焦齿轮1455和外透镜安装架1450可能得以接合，使得聚焦齿轮1455的一次旋转也旋转外透镜安装架1450。这继而使得内透镜安装架1449和传感器透镜1438经由内透镜安装架1449和螺纹外壳1452中的螺纹沿传感器透镜1438的一个光轴移动。通过这种方式，可调整传感器透镜1438的焦点，而无需直接接合传感器透镜1438或其相关联的安装架1449、1450，其内埋于非常紧凑的光学系统124内。与聚焦齿轮1455的接合可能手动或自动实现，例如使用一个电机(未示出)，该电机诸如一个步进电机或直流电机。
参见图13和15-19，在某些实施例中，成像单元1445还包含一个锁定装置或机构1470。锁定装置1470包含一个边缘或齿1472，其可能被可滑动地接合在聚焦齿轮1455的两个齿之间(参见图17-19)。如图17和图18所示，锁定装置1470可能具有一个第一位置(图17)和一个第二位置(图18)，其中在第一位置处，聚焦齿轮1455自由旋转并且调整传感器透镜1438的焦点，而在第二位置处，聚焦齿轮1455被锁定到位并且阻止或防止旋转。通过这种方式，传感器透镜1438的焦点可以被锁定，同时有利地避免直接接触内透镜安装架1449的螺纹1468，直接接触可能损坏所述螺纹并妨碍传感器透镜1438在锁定到位后的后续重新聚焦。锁定装置1470的操作可采用手动或自动方式。在某些实施例中，锁定机构1470还包含一个弹性元件(未示出)，其中聚焦齿轮1455的旋转可能通过克服由所述弹性元件产生的一个阈值力来实现。
参见图20，光学系统124还可包括光学器件外壳1477。在某些实施例中，光学系统124包括辐射屏蔽件1475，该辐射屏蔽件1475包括沿发射光路1417设置的传感器孔1478以及设置为与传感器孔1478结合的至少一种阻挡结构1480，使得仅来自激发光束1405并且被受照区域1482反射以穿过传感器孔1478的辐射为同样被光学器件外壳1477的至少一个其他表面或光学器件外壳1477内至少一个其他表面反射的辐射。换句话说，辐射屏蔽件1475被配置为使得来自激发光束1405反射受照区域1482的辐射被阻挡而不直接穿过孔1478，并且由此阻挡其传入传感器透镜1438并且到达光学检测器1408。在某些实施例中，受照区域1482包括由对应于所述多个反应区域308的加热的盖子110的所有孔1483限定的区域。
在图20的例示性实施例中，阻挡结构1480包括架子1480。虚线或射线1484a和1484b可用于示出阻挡结构1480防止由受照区域1482直接反射的光通过传感器孔1478并且到达透镜1438和/或光学传感器1408的效果。射线1484a来自受照区域1482的边缘并且恰好通过架子1480，但不通过传感器孔1478。射线1484b是来自被架子1480阻挡的受照区域1482的相同边缘的另一条射线。从图中可以看到，当不存在架子1480时，这条射线将进入传感器孔1478。
继续参见图20，在某些实施例中，光学系统124还可以包括能量或功率检测单元，该能量或功率检测单元包括光耦到光管1492的一个端部的功率或能量传感器1490。光管1492的另一端1493被构造为被激发光束1405照亮。光管端部1493可直接由激发光束1405中包含的辐射照亮或间接地由例如漫反射面散射的辐射照亮。在某些实施例中，传感器1490位于激发源1402的激发光路1412之外。除此之外或另选地，传感器1490位于光学器件外壳1477之外和/或位于仪器外壳105之外的远程位置。在图20所示的例示性实施例中，光管端部1493设置在反射镜1432附近或邻近，并且可以被定向成使得光管的表面垂直或几乎垂直于反射激发光束1405的反射镜1432的表面。发明人发现，在以这种方式取向时，由光管1492拦截的能量或功率的量很少，其足以实现监测激发光束1405的能量或功率的目的。有利地，通过将传感器1490定位于激发光束的光路之外，可以提供更紧凑的光学系统124。
在某些实施例中，光管1492包括单纤维或纤维束。除此之外或另选地，光管1492可以包括由透明或透射材料制成的杆，所述材料包括诸如玻璃、树脂玻璃、如丙烯酸的聚合物类材料等。
光学系统124另外的方面还可如下所述：
在另选的实施例1中，提供了一种用于生物分析的仪器，该仪器包括：基座，该基座构造为接纳样本固持器，样本固持器包括用于处理一个或多个生物样本多个空间上分离的反应区，该基座包括构造为对单独的生物样本进行聚合酶链反应测定的热循环仪；激发源，该激发源构造为产生特征为第一波长的第一激发光束以及特征为不同于第一波长的第二波长的第二激发光束；光学传感器，该光学传感器构造为接收来自生物样本响应于激发源的发射；沿激发光路设置在激发源和样本固持器之间的激发光学系统，该激发光学系统包括设置用于将激发光束导向样本固持器的样本透镜；沿激发光路设置在样本固持器和光学传感器之间的发射光学系统，该发射光学系统构造为将发射从生物样本引导至光学传感器；沿激发光路并且沿发射光路设置的分束器，该分束器配置用于接收第一激发光束和接收第二激发光束，样本透镜沿激发光路设置在分束器和基座之间；光束收集器构造为接收来自分束器的激发光束辐射并且将少于10％的激发光束辐射反射回分束器；成像单元，其包括：底部表面和相对的顶部表面，该顶部表面包括光学传感器电路板；至少部分地被透镜罩容纳的传感器透镜，该底部表面包括传感器透镜的表面；以及包括接合透镜罩的齿轮的聚焦机构，该聚焦机构可从包封件外部触及以调整传感器透镜的焦点；沿激发光路设置在分束器和基座之间的受照表面，该受照表面构造为在使用过程中产生反射的辐射，该反射的辐射包括来自激发源并且由受照表面反射的辐射；辐射屏蔽件，其包括：沿发射光路设置在分束器和传感器透镜之间的传感器孔；以及阻挡结构，该阻挡结构被设置为在使用过程中与传感器孔结合，使得无反射的辐射被光学传感器接收，并且该辐射同样不反射出仪器的另一个表面；能量或功率检测单元，其包括：位于光路之外的能量或功率传感器；和邻近分束器设置并且构造为将来自分束器的辐射传输至功率传感器的光管；构造为发出辐射的位置源以及对应的构造为接收来自位置源的辐射的位置传感器，位置源和位置传感器构造为产生位置信号，该位置信号指示光学元件沿至少一条光路设置的位置；辐射屏蔽件，该辐射屏蔽件构造为阻挡来自位置源的至少一部分辐射；包封光路的光学包封件，该包封件包括分割线索环，该分割线索环构造为使线材或线缆穿过包封件外部的位置和包封件内部的位置之间，同时阻挡包封件之外的光进入包封件；透镜孔盖，该透镜孔盖构造为允许对传感器透镜进行三维调整，同时阻挡包封件之外的光进入包封件；其中光学传感器为互补金属氧化物半导体传感器。
在另选的实施例2中，提供了用于生物分析的仪器，其中阻挡结构被设置为在使用过程中与传感器孔结合，使得无反射的辐射投射到传感器透镜上，并且同样不反射出仪器的另一个表面。
在另选的实施例3中，提供了一种用于生物分析的仪器，该仪器包括：基座，该基座构造为接纳样本固持器，样本固持器包括用于处理一个或多个生物样本多个空间上分离的反应区；激发源，该激发源构造为产生特征为第一波长的第一激发光束以及特征为不同于第一波长的第二波长的第二激发光束；光学传感器，该光学传感器构造为接收来自生物样本响应于激发源的发射；沿激发光路设置在激发源和样本固持器之间的激发光学系统；沿发射光路设置在样本固持器和光学传感器之间的发射光学系统，该发射光学系统构造为将发射从生物样本引导至光学传感器；成像单元，该成像单元包括：底部表面和相对的顶部表面，该顶部表面包括光学传感器电路板；至少部分地被透镜罩容纳的传感器透镜，该底部表面包括传感器透镜的表面；以及包括接合透镜罩的齿轮的聚焦机构，该聚焦机构可从包封件外部触及以调整传感器透镜的焦点。
在另选的实施例4中，提供了一种用于生物分析的仪器，该仪器包括：基座，该基座构造为接纳样本固持器，样本固持器包括用于处理一个或多个生物样本多个空间上分离的反应区；热控制器，该热控制器构造为控制基座、样本固持器或单独的生物样本中至少一者的温度；激发源，该激发源构造为产生特征为第一波长的第一激发光束以及特征为不同于第一波长的第二波长的第二激发光束；光学传感器，该光学传感器构造为接收来自生物样本响应于激发源的发射；沿激发光路设置在激发源和样本固持器之间的激发光学系统；沿发射光路设置在样本固持器和光学传感器之间的发射光学系统，该发射光学系统构造为将发射从生物样本引导至光学传感器；传感器透镜，该传感器透镜构造为将发射从生物样本的至少一部分引导至光学传感器上；沿激发光路设置在分束器和基座之间的受照表面，该受照表面构造为在使用过程中产生反射的辐射，该反射的辐射包括来自激发源由受照表面反射的辐射；辐射屏蔽件，其包括：沿发射光路设置在分束器和传感器透镜之间的传感器孔；以及阻挡结构，该阻挡结构被设置为在使用过程中与传感器孔结合，使得无反射的辐射被光学传感器接收，并且同样不反射出仪器的另一个表面。
在另选的实施例5中，提供了一种用于生物分析的仪器，该仪器包括：基座，该基座构造为接纳样本固持器，样本固持器包括用于处理一个或多个生物样本多个空间上分离的反应区；激发源，该激发源构造为产生特征为第一波长的第一激发光束以及特征为不同于第一波长的第二波长的第二激发光束；光学传感器，该光学传感器构造为接收来自生物样本响应于激发源的发射；沿激发光路设置在激发源和样本固持器之间的激发光学系统；沿发射光路设置在样本固持器和光学传感器之间的发射光学系统，该发射光学系统构造为将发射从生物样本引导至光学传感器；能量或功率检测单元，其包括：位于光路之外的能量或功率传感器；和邻近分束器设置并且构造为将来自分束器的辐射传输至功率传感器的光管。
在另选的实施例6中，提供了一种用于生物分析的仪器，该仪器包括：基座，该基座构造为接纳样本固持器，样本固持器包括用于处理一个或多个生物样本多个空间上分离的反应区；激发源，该激发源构造为产生特征为第一波长的第一激发光束以及特征为不同于第一波长的第二波长的第二激发光束；光学传感器，该光学传感器构造为接收来自生物样本响应于激发源的发射；沿激发光路设置在激发源和样本固持器之间的激发光学系统；沿发射光路设置在样本固持器和光学传感器之间的发射光学系统，该发射光学系统构造为将发射从生物样本引导至光学传感器；构造为发出辐射的位置源以及对应的构造为接收来自位置源的辐射的位置传感器，位置源和位置传感器构造为产生位置信号，该位置信号指示光学元件沿至少一条光路设置的位置；辐射屏蔽件，该辐射屏蔽件构造为阻挡来自位置源的至少一部分辐射。
在另选的实施例7中，提供了一种用于生物分析的仪器，该仪器包括：基座，该基座构造为接纳样本固持器，样本固持器包括用于处理一个或多个生物样本多个空间上分离的反应区；激发源，该激发源构造为产生特征为第一波长的第一激发光束以及特征为不同于第一波长的第二波长的第二激发光束；光学传感器，该光学传感器构造为接收来自生物样本响应于激发源的发射；沿激发光路设置在激发源和样本固持器之间的激发光学系统；沿发射光路设置在样本固持器和光学传感器之间的发射光学系统，该发射光学系统构造为将发射从生物样本引导至光学传感器；沿激发光路并且沿发射光路设置的分束器，该分束器设置用于接收第一激发光束和接收第二激发光束，包封光路的光学包封件，该包封件包括分割线索环，该分割线索环构造为使线材或线缆穿过包封件外部的位置和包封件内部的位置之间，同时阻挡包封件之外的光进入包封件；透镜孔盖，该透镜孔盖构造为允许对传感器透镜进行三维调整，同时阻挡包封件之外的光进入包封件。
在另选的实施例8中，提供了一种用于生物分析的仪器，该仪器包括：基座，该基座构造为接纳样本固持器，样本固持器包括用于处理一个或多个生物样本多个空间上分离的反应区；激发源，该激发源构造为产生特征为第一波长的第一激发光束以及特征为不同于第一波长的第二波长的第二激发光束；光学传感器，该光学传感器构造为接收来自生物样本响应于激发源的发射；沿激发光路设置在激发源和样本固持器之间的激发光学系统；沿发射光路设置在样本固持器和光学传感器之间的发射光学系统，该发射光学系统构造为将发射从生物样本引导至光学传感器；沿激发光路并且沿发射光路设置的分束器，该分束器设置用于接收第一激发光束和接收第二激发光束，其中光学传感器为互补金属氧化物半导体传感器。
在另选的实施例9中，提供了根据实施例1、[00125]、[00127]、[00127]、[00128]、[00129]或[00130]中任一项所述的仪器，还包括沿发射光路设置的一个或多个发射滤光器。
在另选的实施例10中，提供了根据实施例1、[00125]、[00127]、[00127]、[00128]、[00129]或[00130]中任一项所述的仪器，其中至少部分发射包括生物样本中至少一部分响应于激发光束中至少一者而产生的荧光发射。
在另选的实施例11中，提供了根据实施例1、[00125]、[00127]、[00127]、[00128]、[00129]或[00130]中任一项所述的仪器，其中至少部分发射包括生物样本中至少一部分响应于激发光束中至少一者而产生的荧光发射。
在另选的实施例12中，提供了根据实施例1、[00125]、[00127]、[00127]、[00128]、[00129]或[00130]中任一项所述的仪器，其中至少一些发射包括来自激发光束中至少一者的辐射，该辐射被生物样本中至少一部分反射、折射、衍射、散射或偏振。
在另选的实施例13中，提供了根据实施例1、[00125]、[00127]、[00127]、[00128]、[00129]或[00130]中任一项所述的仪器，还包括沿激发光路设置在基座和分束器之间的温控盖子。
在另选的实施例14中，提供了根据实施例[00135]所述的仪器，还包括沿激发光路设置在基座和分束器之间的反射镜。
在另选的实施例15中，提供了根据实施例1、[00125]、[00127]、[00127]、[00128]、[00129]或[00130]中任一项所述的仪器，还包括沿激发光路设置在基座和分束器之间的反射镜。
在另选的实施例16中，提供了根据实施例1、[00125]、[00127]、[00127]、[00128]、[00129]或[00130]中任一项所述的仪器，其中所述基座包括样本块组件，该样本块组件构造为控制样本固持器或生物样本的温度。
在另选的实施例17中，提供了根据实施例[00138]所述的仪器，其中样本块组件包括样本块、Peltier装置或散热器中的一者或多者。
在另选的实施例18中，提供了根据实施例[00125]、[00127]、[00127]、[00128]、[00129]或[00130]中任一项所述的仪器，其中基座包括构造为执行PCR检测的热循环仪。
在另选的实施例19中，提供了根据实施例1、[00125]、[00127]、[00127]、[00128]、[00129]或[00130]中任一项所述的仪器，其中仪器包括样本固持器。
在另选的实施例20中，提供了根据实施例[00141]所述的仪器，其中所述样本固持器包括一块微量滴定板、包括多个孔或通孔的基板、包括一个或多个通道的基板，或包括含一种或多种生物样本的多个小珠或小球的腔室中的一者或多者。
在另选的实施例21中，提供了根据实施例[00141]所述的仪器，其中所述空间上分离的反应区包括多个孔、一块基板中的多个通孔、一块基板上或一个通道内多个不同的位置，或一个反应体积内多个小珠或小球中的一者或多者。
在另选的实施例22中，提供了根据实施例[00141]所述的仪器，其中所述空间上分离的反应区中的至少一部分包括所述一个或多个生物样本。
在另选的实施例23中，提供了根据实施例[00144]所述的仪器，其中所述一个或多个生物样本包括至少一种靶核酸序列、至少一种引物、至少一种缓冲液、至少一种核苷酸、至少一种酶、至少一种洗涤剂、至少一种封闭剂，或至少一种适用于检测靶标或参比核酸序列的染料、标志物和/或探针中的一者或多者。
在另选的实施例24中，提供了根据实施例[00141]所述的仪器，其中所述样本固持器包括一块微量滴定板并且反应区包括至少96个孔、至少384个孔，或至少1536个孔。
在另选的实施例25中，提供了根据实施例[00141]所述的仪器，其中所述样本固持器包括一块基板，该基板包括一个第一表面、一个对向第二表面以及设置在所述表面之间的多个通孔，所述多个通孔构造为容纳一个或多个生物样本。
在另选的实施例26中，提供了根据实施例[00147]所述的仪器，其中所述基板包括至少3096个通孔或至少20,000个通孔。
在另选的实施例27中，提供了根据实施例[00141]所述的仪器，其中所述样本固持器包括一系列毛细管，这些毛细管构造为通过一种或多种靶分子或分子序列。
在另选的实施例28中，提供了根据实施例[00141]所述的仪器，其中所述样本固持器构造为执行聚合酶链反应、测序分析，或毛细管电泳测定、印迹测定中的至少一种。
在另选的实施例29中，提供了根据实施例[00125]、[00127]、[00127]、[00128]、[00129]或[00130]中任一项所述的仪器，其中所述激发光学系统包括一个样本透镜，该样本透镜构造为将激发光束导向基座。
在另选的实施例30中，提供了根据实施例1或实施例[00151]中任一项所述的仪器，其中所述样本透镜包括一个场透镜，该场透镜在使用过程中在所述多个空间上分离的区域上方延伸。
在另选的实施例31中，提供了根据实施例1或实施例[00151]中任一项所述的仪器，其中所述样本透镜包括至少一个在使用过程中在所述多个空间上分离的区域上方延伸的场透镜，或者包括多个透镜，所述多个透镜中的每个在使用过程中设置在所述多个反应区域中相应的一者之上。
在另选的实施例32中，提供了根据实施例1或实施例[00151]中任一项所述的仪器，其中样本透镜包括复合透镜、曲面镜、衍射光学元件或全息光学元件中的至少一者。
在另选的实施例33中，提供了根据实施例1所述的仪器，其中在使用过程中，所述样本透镜为样本固持器、空间上分离的反应区或光学传感器中的至少一者提供远心光学系统。
在另选的实施例34中，提供了根据实施例[00151]所述的仪器，其中在使用过程中，所述样本透镜为一个样本固持器、空间上分离的反应区或光学传感器中的至少一者提供远心光学系统。
在另选的实施例35中，提供了根据实施例1或实施例[00151]中任一项所述的仪器，其中所述样本透镜包括菲涅尔透镜。
在另选的实施例36中，提供了根据实施例1或实施例[00151]中任一项所述的仪器，其中所述样本透镜包括多个透镜，所述多个透镜对应于所述多个反应区域。
在另选的实施例37中，提供了根据实施例1、[00125]、[00127]、[00127]、[00128]、[00129]或[00130]中任一项所述的仪器，其中所述分束器被配置为在使用过程中传输激发光束或被配置为在使用过程中反射激发光束。
在另选的实施例38中，提供了根据实施例1、[00125]、[00127]、[00127]、[00128]、[00129]或[00130]中任一项所述的仪器，其中所述分束器包括一个宽带分束器，该宽带分束器的特征在于反射率在至少100纳米的波段保持恒定。
在另选的实施例39中，提供了根据实施例1、[00125]、[00127]、[00127]、[00128]、[00129]或[00130]中任一项所述的仪器，其中所述分束器的特征在于反射率在450纳米至680纳米的波段保持恒定。
在另选的实施例40中，提供了根据实施例1、[00125]、[00127]、[00127]、[00128]、[00129]或[00130]中任一项所述的仪器，其中所述分束器的特征在于反射率在电磁波谱的可见光波段保持恒定。
在另选的实施例41中，提供了根据实施例1、[00125]、[00127]、[00127]、[00128]、[00129]或[00130]中任一项所述的仪器，其中所述分束器包括一个中性密度滤光器。
在另选的实施例42中，提供了根据实施例1、[00125]、[00127]、[00127]、[00128]、[00129]或[00130]中任一项所述的仪器，其中所述分束器包括一个50/50分束器。
在另选的实施例43中，提供了根据实施例1、[00125]、[00127]、[00127]、[00128]、[00129]或[00130]中任一项所述的仪器，其中所述分束器包括一个二向色分束器。
在另选的实施例44中，提供了根据实施例1、[00125]、[00127]、[00127]、[00128]、[00129]或[00130]中任一项所述的仪器，其中所述分束器包括一个多波段分束器。
在另选的实施例45中，提供了根据实施例1、[00125]、[00127]、[00127]、[00128]、[00129]或[00130]中任一项所述的仪器，其中所述第一激发光束和第二激发光束在时间上分离和/或在空间上分离。
在另选的实施例46中，提供了根据实施例1、[00125]、[00127]、[00127]、[00128]、[00129]或[00130]中任一项所述的仪器，其中所述第一激发光束和第二激发光束同时产生。
在另选的实施例47中，提供了根据实施例1、[00125]、[00127]、[00127]、[00128]、[00129]或[00130]中任一项所述的仪器，其中所述激发光源包括至少一个白炽灯、至少一个气体放电灯、至少一个发光二极管、至少一个有机发光二极管和/或至少一个激光器中的一者或多者。
在另选的实施例48中，提供了根据实施例[00169]所述的仪器，其中所述至少一个气体放电灯包括一个卤素灯、一个氙灯、一个氩灯、或一个氪灯中的一者或多者。
在另选的实施例49中，提供了根据实施例[00169]所述的仪器，其中所述至少一个激光器包括一个二极管激光器、一个氩激光器、一个氙激光器、一个准分子激光器、一个固态激光器、一个氦氖激光器、或一个染料激光器中的一者或多者。
在另选的实施例50中，提供了根据实施例1、[00125]、[00127]、[00127]、[00128]、[00129]或[00130]中任一项所述的仪器，其中所述第一激发光束包括第一波长范围，在该第一波长范围内，第一激发光束的强度、功率或能量高于第一预定值，所述第二激发光束包括第二波长范围，在该第二波长范围内，第二激发光束的强度、功率或能量高于第二预定值，第一波长为(1)第一波长范围内的中心波长或(2)第一波长范围内最大电磁强度、功率或能量的波长中的至少一者，并且第二波长为(1)第二波长范围内的中心波长或(2)第二波长范围内最大电磁强度、功率或能量的波长中的至少一者。
在另选的实施例51中，提供了根据实施例[00172]所述的仪器，其中所述中心波长中的至少一者为对应的波长范围内的平均波长。
在另选的实施例52中，提供了根据实施例[00172]所述的仪器，其中所述预定值中的至少一者小于对应的波长范围内对应的最大强度、功率或能量的20％。
在另选的实施例53中，提供了根据实施例[00172]所述的仪器，其中第二预定值等于第一预定值。
在另选的实施例54中，提供了根据实施例[00172]所述的仪器，其中第一波长范围与第二波长范围不重叠或第一波长范围与第二波长范围仅部分重叠。
在另选的实施例55中，提供了根据实施例[00172]所述的仪器，其中第二波长与第一波长相差至少20纳米。
在另选的实施例56中，提供了根据实施例[00172]所述的仪器，其中第一波长范围和第二波长范围中的至少一者具有至少20纳米的值。
在另选的实施例57中，提供了根据实施例1、[00125]、[00127]、[00127]、[00128]、[00129]或[00130]中任一项所述的仪器，其中第二波长与第一波长相差至少20纳米。
在另选的实施例58中，提供了根据实施例1、[00125]、[00127]、[00127]、[00128]、[00129]或[00130]中任一项所述的仪器，其中所述激发源包括一个光源，并且第一波长和第二波长处于电磁波谱的可见光波段。
在另选的实施例59中，提供了根据实施例1、[00125]、[00127]、[00127]、[00128]、[00129]或[00130]中任一项所述的仪器，其中所述激发源包括具有至少100纳米带宽的光源。
在另选的实施例60中，提供了根据实施例1、[00125]、[00127]、[00127]、[00128]、[00129]或[00130]中任一项所述的仪器，其中所述激发源包括多个移入和移出激发光路的激发滤光器。
在另选的实施例61中，提供了根据实施例[00182]所述的仪器，其中所述激发滤光器中的至少一者具有至少±10纳米的波段。
在另选的实施例62中，提供了根据实施例[00182]所述的仪器，其中所述激发滤光器包括至少5个激发滤光器。
在另选的实施例63中，提供了根据实施例[00182]所述的仪器，其中所述激发滤光器包括多个滤光器，后者共同提供适于使一份
Figure GDA0002541354320000381
染料或探针、一份FAMTM染料或探针、一份
Figure GDA0002541354320000382
染料或探针、一份ROXTM染料或探针，或一份TAMRATM染料或探针中的一者或多者发荧光的多个带通。
在另选的实施例64中，提供了根据实施例[00182]所述的仪器，其中所述激发滤光器安装于可旋转的滤光轮上，该滤光轮配置为使每个滤光器移入和移出激发光路。
在另选的实施例65中，提供了根据实施例1、[00125]、[00127]、[00127]、[00128]、[00129]或[00130]中任一项所述的仪器，其中所述激发源包括多个单独的激发源。
在另选的实施例66中，提供了根据实施例[00187]所述的仪器，其中所述多个单独的激发源形成单独激发源的二维阵列。
在另选的实施例67中，提供了根据实施例1、[00125]、[00127]、[00127]、[00128]、[00129]或[00130]中任一项所述的仪器，其中所述光学传感器包括一个阵列传感器。
在另选的实施例68中，提供了根据实施例[00189]所述的仪器，其中所述阵列传感器包括一个互补金属氧化物半导体传感器或一个电荷耦合器件传感器中的至少一者。
在另选的实施例69中，提供了根据实施例1、[00125]、[00127]、[00127]、[00128]、[00129]或[00130]中任一项所述的仪器，其中所述光学传感器包括至少两个阵列传感器。
在另选的实施例70中，提供了根据实施例[00127]、[00127]、[00128]或[00130]中任一项所述的仪器，还包括一个传感器透镜，该传感器透镜构造为将来自生物样本的至少一部分的发射引导至光学传感器。
在另选的实施例71中，提供了根据实施例[00125]、[00127]、[00127]、[00128]、[00129]或[00130]中任一项所述的仪器，其中所述光学传感器为一个互补金属氧化物半导体传感器。
在另选的实施例72中，提供了根据实施例[00127]所述的仪器，其中所述阻挡结构被设置为在使用过程中与传感器孔结合，使得无反射的辐射投射到传感器透镜上，并且同样不反射出仪器的另一个表面。
校准工作流程
生物分析仪器校准的进步有利于减少操作人员错误、减少操作人员输入、减少校准生物分析仪器及其各种部件所需的时间，实现正确高效的安装。
因此，根据本教导内容的各种实施例，可以将专业知识结合到自动校准和验证系统中，在识别出故障时提供通过/失败状态和故障排除反馈。如果仪器未能通过校准过程，则致电服务工程师。本教导内容可最大程度减少所述安装和校准程序所需的成本和时间。
总体校准工作流程
通常依靠生物仪器产生准确可靠的实验数据。生物仪器的定期校准和维护确保仪器处于正常和最佳运行状态，可最大程度提高用户工作效率，通过在潜在问题出现前将其解决而最大程度减少昂贵的维修，并且提高结果质量。
根据本教导内容的各种实施例，本文所述的校准方法可单独进行，也可任意组合进行。此外，本文所述的校准方法可在制造后的初始校准过程中或在初始安装和使用后的任意时间进行。本文所述的校准方法可以例如每周、每月、每半年、每年或根据需要进行。
根据本教导内容中所述的各种实施例，使用诸如感兴趣区域(ROI)校准、背景校准、均匀性校准、纯染料校准、仪器归一化等校准方法来确定每次读数中荧光信号的位置和强度、与每个荧光信号相关联的染料以及信号的意义。另外，根据各种实施例，可执行自动染料校正、自动背景校准和板检测，以进一步完善检测和染料读数并确定误差。使用RNaseP验证的系统也可以自动执行合适性能的仪器验证。
图21示出可以在根据本文所述的各种实施例的仪器上执行的示例性校准工作流程2100。应当认识到，校准工作流程2100是一个实例，并且本文所述的校准方法可以单独地或作为子集以任何组合和顺序来执行。
在步骤2102中，执行ROI校准。一般来说，ROI校准将在检测器的视场中产生限定孔的位置的信息。本教导内容可通过最大程度减少或消除用户干预而自动完成ROI校准。各种实施例可通过提供使用直方图分析和二进制搜索模式确定每个滤光器的最佳曝光时间的方法和系统来实现该过程的自动化。根据本文所述的各种实施例的ROI校准，相比于之前的方法能够更准确地识别图像中的孔并且减少错误。根据各种实施例所述的ROI校准方法和系统如下文所详述。
在步骤2104中，执行背景校准。通常，即使不存在发出可检测信号的样本，检测器也将读取一定量的信号。导致背景信号可以非常重要的原因是可以从样本信号读数中扣除背景信号以便获得更准确的样本信号测量结果。可使用一个水板测定每个滤光器/孔组合的背景信号，进行背景校准。该步骤可自动完成以最大程度减少或消除用户干预。可提供将测试是否采用了正确的校准板进行背景校准的自动化操作。例如，步骤2104可以查看信号电平并消除使用错误测试板的可能性，诸如在ROI校准中使用发射强信号的测试板。如果信号电平远超出背景的预期电平，将警示用户插入正确的测试板。这一阶段还可通过检查信号电平的宽趋异度来测试测试板中一个或多个孔的污染，如果发现污染，将触发一个警告，指示可能存在脏的或受污染的孔。受污染的孔可导致从所述样本信号电平中扣除不正确的背景信号电平。
在步骤2106中，执行均匀性校准。在一些情况下，尽管每个孔中存在等量的荧光染料，但是板几何形状(翘曲、厚度)的变化可导致板上强度读数变化。均匀性校准可校准使用多染色板的仪器，因而可以校正板变化引起的强度变化。步骤2106可自动完成并且减少或消除用户干预。该自动化操作的一部分可包括检测错误校准板的使用以及检测和调整校准板中空的或受污染的孔。
在步骤2108中，执行纯染料校准。校准qPCR仪器中所用的荧光染料使该仪器软件能够使用由染料标样采集的校准数据来表征和区分每种染料在仪器所采集的总荧光中各自的贡献。根据本教导内容的各种实施例，在一样本运行完成后，该仪器软件呈每个读数的一原始光谱信号形式的数据。该软件通过将每种染料贡献的原始光谱与纯光谱校准数据进行比较来确定每个反应位点中所用每种荧光染料的贡献。当一用户在分析后保存一项实验时，该仪器软件将所述纯光谱与采集的实验用荧光数据以及每个孔中每种荧光染料的贡献一起存储。该方法如下文所详述。根据本教导内容的各种实施例，使用纯染料校准，可使用较少的纯校准板，节省用户成本，并且消除校准过程中的误差来源。
在步骤2110中，执行仪器归一化校准。研究人员通常面临的一个难题是无法轻松比较在多台仪器上运行所得的实验结果。诸如光源、光学元件和荧光检测器等部件的参数之物理变化例如可导致分析结果的变化，这种分析可能基于相同的生物样本。因此，始终需要有助于最大程度减少所述部件之变化的方法和装置。
在qPCR中，通过将一种报告基因染料的信号归一化到相同溶液中的一种被动参比染料来测定扩增曲线。此归一化可以被报告为带标记的归一化荧光值或“Rn”。即使所述总体信号电平受液体体积或总体照明强度的影响，被动参比归一化也能实现一致的Rn值。如果所述报告基因染料与参比染料之间的信号比率不同，诸如所述照明光谱中的仪器之间差异，则被动参比归一化无法正常工作。根据本文所述的各种实施例，仪器归一化校准包括从所述染料混合物中读取荧光以得到“归一化因子”到调整Rn值需要另外的费用。
在步骤2112中，执行RNase P验证。执行验证测试检查以确定一台仪器是否正常工作。例如，RNase P验证确定一台仪器能否准确区分两个不同数量的样本。过去使用标准曲线手动执行RNase P验证，由用户进行统计计算以验证所述仪器。根据本教导内容所述的各种实施例，可以由系统自动执行RNase P验证，且无需使用标准曲线。RNase P验证的各种实施例如下文所详述。
图37示出根据本文所述的各种实施例用于校准仪器的系统4100。系统4100包括ROI校准器4102、纯染料校准器4104、仪器归一化校准器4108、RNase P验证器4110和显示引擎/GUI 4106。ROI校准器4102构造为测定图像中的反应位点位置。纯染料校准器4104构造为通过对比荧光染料的原始谱图与荧光染料的纯谱图校准数据来确定各个反应位点处所使用荧光染料的贡献。仪器归一化校准器4108构造为测定滤光器归一化因子。RNase P验证器4110构造为验证仪器能否区分两个不同数量的样本。显示引擎4106构造为显示器校准结果。
本教导内容参考实时聚合酶链反应(RT-PCR)仪器进行描述。具体地，本教导内容的一个实施例由采用孔板光学成像的RT-PCR仪器实现。此类仪器能够同时测量来自多个样本或斑点的信号以作分析目的，并且通常需要校准，包括但不限于下列过程：在多组分分析中识别ROI(感兴趣区域)、测定背景信号、均匀性和纯染料光谱校准。校准还可涉及使用具有预期结果的已知样本板的RT-PCR验证反应。本领域的技术人员将理解，虽然本教导内容已经结合有关RT-PCR仪器的实例来描述，但是它们的原理广泛适用于可能需要校准和验证的其他形式的实验室仪器，以确保准确性和/或结果最优化。
感兴趣区域(ROI)校准
如上文所述，本教导内容参考实时聚合酶链反应(RT-PCR)仪器进行描述。具体地，本教导内容的一个实施例由采用孔板光学成像的RT-PCR仪器实现。此类仪器能够同时测量来自多个样本或斑点的信号以作分析目的，并且通常需要校准。可能需要校准的过程的一个实例是识别ROI或感兴趣区域。
一般来说，ROI校准可以使用在对应于所有滤光器的每个室中具有强发射的一块板来执行。该过程可以是有用的，因为每个滤光器的ROI可能不同。滤光器之间的ROI差异可以由滤光器和其他滤光器光谱特性中的微小角度差引起。因此，各种实施例执行全滤光器/全孔(PFPR)-ROI校准。这些PFPR-ROI校准用于测定每个滤光器的96孔板中孔的位置。ROI校准可使用诸如美国专利号6,518,068 Bl中所述的自适应掩模制备技术等方法来执行。
本教导内容可通过最大程度减少或消除用户干预而自动完成ROI校准。各种实施例可通过提供使用直方图分析和二进制搜索模式测定每个滤光器的最佳曝光时间的软件来自动完成该过程。曝光时间为捕捉板的一个图像所需的时间量。同样，该值可根据一个滤光器的光谱特征而变化。一般来说，ROI校准将在检测器的视场中产生限定孔的位置的信息。在2304中，该信息可存储为掩模文件，其具有对应于不同滤光器的全局掩模或多个掩模。
诸如上文所述的校准过程通常使用行和列投影以及强度分布。这可导致ROI测定结果易受孔内的伪影和饱和度、网格旋转、放大系数的变化和光学径向畸变的影响。因此，有利的是具有更稳定的ROI测定结果，以最大程度减小此类敏感性并且消除检测到的发射数据中的畸变及其他不需要的背景噪音。
背景噪音可指固有的系统噪音及其他不需要的噪音。例如，数据中的一些背景噪音可能是归因于基板的物理来源，诸如灰尘颗粒或划痕。可提供背景噪音的物理来源的另一个实例是固定或包封样本的固持器或壳体。数据中的其他背景噪音可能归因于仪器表面的自然辐射，诸如反射和自然荧光。其他背景噪音也可是例如来自检测发射数据或光源的光学系统所致。
生物仪器可检测数百至数千个样本，所有这些样本的体积可能非常小，比如小于1纳升。因此，其他背景噪音去除方法可以单独使用或结合本文所述的校准方法根据各种实施例来使用，以便能够由样本体积测定和分析发射数据。在一些实施例中，可更准确地测定基板内样本体积的位置以执行更准确的分析。例如，在数字PCR分析中，能够更准确地区分样本体积中的反应与非反应，可得到更准确的结果。根据本文所述的各种实施例，甚至还可区分空孔或通孔与不反应的孔或通孔中的样本体积，其还可与反应的孔或通孔中的样本体积区分开来。
根据本文所述的各种实施例，背景噪音去除可包括图像数据分析和处理。该方法可包括分析图像数据的强度值以内推可从所述基板的图像中去除的背景噪音。通过这种方式，还可确定图像内感兴趣区域的位置。背景噪音去除还可包括从已知包括感兴趣区域的图像区域内推数据。确定图像上的背景噪音后，可从图像数据中扣除背景噪音。
图22示出根据本发明的一个实施例所述的一种示例性计算机模拟方法2600。计算机模拟方法2600包括计算机可读格式的多组工作流子程序，其可以包括用于生物技术过程的子程序。图22仅为示例性方法，并且本领域的技术人员鉴于本公开将认识到，实际数目的子程序可以从至少约2个子程序变为许多个子程序(例如2-10、2-20、2-30、2-n(其中n可以是3-100、3-1000等任何数量的子程序)。每组子程序310-370可包括单个步骤或任务，或者任选地可包括多于1个步骤或任务，其同样为计算机可读格式，并且每个步骤还可包括另外可选的可定制步骤或任务。每个可选/可定制的步骤或任务可具有一个或多个可由用户查看、审核、设置或定制的可选参数(选项)。在一些实施例中，本发明的计算机模拟方法包括由用户使用图形用户界面(GUI)选择生物技术过程的每个可选/可定制步骤的至少一个参数，以选择用于每个可选/可定制步骤的至少一个参数。在某些实施例中，工作流程的子程序的每个步骤和每个参数都可供用户查看并且可选地编辑。生物信息学程序通常对用户隐藏这些参数和/或步骤中的一部分，导致用户失望和效率低下，当计算机模拟设计实验的结果并非用户预期的结果时尤其如此。
如图22一般性示出的本公开的一种计算机模拟方法可通过下列步骤来进行(执行)：在计算机系统(如图2所示)上生成至少一个方法文件，该方法文件包括用于可定制步骤(A、B、C)的多个子程序(10、20、30或更多)的计算机可读指令，每个可定制步骤可具有可被查看、选择、更改或输入的一个或多个参数；以及利用计算机系统通过计算机模拟执行生物技术过程以获得至少一种生物技术产品，该执行过程包括执行至少一个包括计算机可读指令的方法文件。
在一些实施例中，从默认参数中选择至少一个可定制/可选参数，其中默认参数存储于计算机系统的组件(诸如存储器、数据库等)中。
再次参见图22，计算ROI位置的第一步是由步骤2610中的荧光阈值估计初始ROI中心。提供构造为容纳多个生物样本的样本板，并且将其插入能够在PCR过程中分析生物样本的分析仪器中。每个生物样本都包含在一个样本孔中，并且可被一个光源激发，并且可响应于可在预定波长发出荧光的激发，该荧光可由荧光检测器检测。如上文相对于图7所述，光源1402可为激光、LED或其他类型的激发源，其能够发射与待由计算机系统200检测的光谱物质相互作用的光谱。另外，生物样本可包括光谱可分辨染料，诸如FAM、SYBR Green、VIC、JOE、TAMRA、NED、CY-3、德克萨斯红、CY-5、ROX(被动参比)或发出能够被检测的信号的任何其他荧光染料中的一种或多种。
在激发生物样本之前，设置输入参数和算法参数以提供ROI测定的起始点。输入参数可包括孔尺寸、孔中心至中心距离、每毫米的光学像素和板布局。所述板布局可包括孔的总数和样本孔的配置。经常使用的配置可为包括多个行和多个列的矩形阵列。然而，本领域的技术人员将理解，该配置可以为适合所使用的仪器的任何几何形状。另外，孔的总数可以变化。本领域的技术人员将熟悉在单个样本板或样本容纳结构中总共包含1个孔到数千个孔的配置。所述ROI查找算法参数可为孔尺寸、孔中心至中心距离和最小圆度设置可接受的范围。圆度是一个计算值，可为周长与面积之比。
一旦确定了输入参数和算法参数，即可利用来自一个适当光源的能量激发多个样本，并且采集样本板中每个样本孔发出的荧光。进一步分析该样本板的荧光图像，以基于输入参数和算法参数选择ROI候选项。保存满足所述参数要求的ROI候选项以供进一步分析，并且在步骤2620中测定每个孔的尺寸和圆度。不满足所述参数要求的ROI候选项可与不发出荧光的任何位置一起被丢弃。进一步评估保留的ROI候选项，以基于孔与孔的间距参数和允许的孔与孔的间距范围参数来确定ROI之间的距离。具有基于孔与孔之间参数彼此靠近的中心的ROI可被视为相同的样本，并且选择具有最佳圆度的ROI作为该孔的ROI。一旦确定了所有ROI候选项，即可计算平均孔尺寸，在步骤2630中将平均值分配给每个样本孔ROI，并且保存初始估计的ROI。
将预期的孔位置布置为基于板布局参数确定的网格图案。该参数可包括孔数、列数和行数，其中每个孔具有一个基于板布局参数的XY网格坐标的预期组。现在可对初始估计的ROI进行进一步分析，以更好地定义每个初始ROI的位置，并且可称为全局网格化。全局网格化的第一步是分析初始估计的ROI以查找相邻的ROI。这可以通过对ROI之间的中心至中心距离与基于板布局的网格坐标进行比较来确定。然后可基于ROI之间的空间关系来确定每个初始估计的ROI的XY网格坐标。
为提高ROI位置的精度，将中心至中心的ROI坐标与板布局的网格坐标关联起来是有利的。这可通过确定并且应用映射函数来实现。映射函数是一对二维二次多项式函数。计算这些函数以将X(或Y)网格位置映射到X(或Y)方向上的ROI中心位置。一旦确定了所述映射函数，它们即可应用于预期的网格坐标以提供两点益处。首先，可提高ROI中心位置的精度；其次，能够恢复初始ROI查找过程中丢失的ROI。
进一步调整ROI可为光学性能提供附加有益效果。本发明人发现，ROI尺寸与光学系统的信噪比(SNR)之间存在一定关系。本领域的技术人员将知道，存在若干用于计算电子系统和光学系统SNR的公式。SNR可通过下列公式1来表征，例如：
Figure GDA0002541354320000471
其中SNR＝信噪比
Sdye plate＝染料图像中ROI内所有像素密度的总和
SBG＝背景图像中ROI内所有像素密度的总和
Sdye＝染料图像中ROI内所有像素密度的总和
N＝ROI内像素的数量
offset＝相机偏移量
G＝相机增益
δ2R,y＝读数噪音
使用一个包括六对滤光器的光学系统开展一项实验。每对滤光器包括一个激发滤光器(Xn)和一个发射滤光器(Mn)。每个滤光器对波长的一窄波段敏感，该波段对应于配置为与PCR过程兼容的染料之所述激发频率和发射频率。此外，根据本文所述的教导内容对ROI进行了优化。为研究ROI尺寸对信噪比的影响，使用6对激光器对来自一块96孔样本板的荧光进行检测。每个ROI的半径以1像素为增量逐渐增加。利用公式1计算6对滤光器中的每一个以及每个像素增量的SNR。所述实验结果如下表1所示：
表1
Figure GDA0002541354320000481
粗体条目表示6对滤光器中的每一个的最高SNR，并且一2像素半径扩展在6对滤光器中提供大约6％SNR的总体改善。
图23示出具有96个孔2710的一样本板的一个图像。所述孔2710的每一个产生一张荧光图像。在应用本文的教导内容后，对ROI进行优化，并且蓝色圆圈标识每个孔位置的所述ROI。
纯染料校准
如上所述，简化生物分析系统的安装和设置的需求越来越大，这使得操作人员可更快速高效地使用生物分析系统完成其预期目的。此需求在例如校准一生物分析仪器及相关联的部件方面很明显。一种示例性校准是校准用于生物分析系统诸如qPCR系统中荧光检测的荧光染料。
校准qPCR仪器中所用的荧光染料使该仪器软件能够使用由染料标样采集的校准数据来表征和区分每种染料在所述仪器所采集的总荧光中各自的贡献。在一样本运行完成后，该仪器软件接收呈每个读数的一原始光谱信号形式的数据。该软件通过将每种染料贡献的原始光谱与纯光谱校准数据进行比较来确定每个反应位点中所用每种荧光染料的贡献。当一用户在分析后保存一项实验时，该仪器软件将所述纯光谱与采集的实验用荧光数据以及每个孔中每种荧光染料的贡献一起存储。
例如，一qPCR仪器中一种染料校准的产物为表示每个反应位点的每种染料标样之所述荧光特征的一系列光谱曲线。每条曲线由一组对应于从诸如一校准板或阵列卡的一个样本固持器的诸如孔等反应位点采集的荧光之光谱所组成。在每种染料的校准之后，仪器软件“提取”每个反应位点处的每种染料的光谱曲线。该软件将每条曲线的所得数据绘制于一幅荧光对比滤光器的图中。当该软件提取所述染料校准数据时，它根据整个校准板或阵列卡的总光谱来评估每个孔所产生的荧光信号。如果染料光谱在与它们的组一样在相同的滤光器中产生峰值，但是在其他波长处稍微发散，则该染料光谱通常是可接受的。
在一样本固持器诸如一校准板上运行染料校准时，所述反应位点(例如，孔)通常包含相同浓度的染料以使得在该板的每个孔处生成一个纯光谱值。图24显示一校准板的一个图像，其中一种单一染料(在本例中，为FAM染料)占据一块96孔校准板中的每个孔。这使得能够对运行中每个孔所生成的荧光信号与该孔的一个纯光谱读数进行比较。通过对一校准板的每个孔使用一种单一染料，所述孔的所得信号应当相似。光谱位置和峰位的变化可例如由所述单个孔之间的光学特性和激发能量上的细微差异而引起。在染料校准中考虑这些变化在理论上将获得一个更准确的染料校准。
然而，每个校准板使用一种单一染料可能费时且复杂，在校准大量染料时尤其如此。荧光染料的非限制性示例包括FAM、VIC、ROX、SYBR、MP、ABY、JUN、NED、TAMRA和CY5。因此，需要简化染料校准过程并且减少校准所需的时间，同时保持染料校准的结果具有相同的质量。
图25和图26示出一个流程图，其中示出根据本文所述的实施例校准一种或多种荧光染料的示例性方法900。方法的所述步骤2900可能由处理器204实现，如图2所示。此外，用于由处理器204执行所述方法的指令可能被存储于存储器206中。
参见图25，在步骤2902中，通过将染料加载进一块待处理基板的反应位点中来制备校准板。在本例中，所述基板为一96孔板，但是可以使用不同的基板，包括例如一384孔板。在各种实施例中，所述基板可能是具有多个样本区域的一个玻璃或塑料滑片。一块基板的一些示例可能包括但不限于一块多孔板诸如一标准微量滴定96孔板、一384孔板或一微卡，一基本平面载体诸如一玻璃或塑料滑片，或任何其他类型的阵列或微阵列。在一基板的各种实施例中，所述反应位点可能包括孔、凹陷、凹痕、脊以及它们的组合，在所述基板的表面上形成规则或不规则阵列。迄今为止，对孔或板的标引仅为示例性目的，而非以任何方式限制本文可用的反应位点或样本固持器的类型。
所述校准板可以制备成一个棋盘图案，如图27A所示。如校准板3100、3120和3140所示，所述板本身可以为一96孔形式，但是所述校准板上的孔数可根据需要进行改变，其取决于例如需要校准的染料数量、容纳该校准板的样本块114(见图1)形式，或对不同孔密度的板进行成像的仪器(例如，PCR仪器100)所具备的功能。
染料分布的棋盘图案允许每块校准板对多种染料进行校准。相对于每块校准板校准一种染料，所述棋盘图案有利地允许一用户使用较少的板来校准一个染料组，从而减少染料校准所需的时间和处理步骤。
在图27A所示的实施例中，利用三块板对十种独立的染料进行校准。每块校准板3100/3120/3140被构造成容纳四种不同的染料，这四种染料沿所述板每行中的孔以重复图案交替布置，使得每个孔表示该重复图案中的一种特定染料(存在染料的孔)。例如，板3100将FAM、VIC、ROX和SYBR染料容纳于由孔3102(FAM)、3104(VIC)、3106(ROX)和3108(SYBR)所示出的交替孔中；板3120将一份缓冲液、MP染料、ABY染料和JUN染料容纳于由孔3122(缓冲液)、3124(MP)、3126(ABY)和3128(JUN)所示出的交替孔中；并且板3140将NED染料、TAMRA染料、CY5染料和一份缓冲液容纳于由孔3142(NED)、3144(TAMRA)、3146(CY5)和3148(缓冲液)所示出的交替孔中。在该实施例中，由于仅校准十种染料，因此板3120和3140中使用缓冲液作为孔的填料，其中不容纳待校准的一种染料。
应当理解，图27A和27B中的实施例仅为一个实例，并且校准的染料总数、每块板的染料数量以及板数都可基于例如根据一用户的校准需求、所述板上的孔数、处理所述校准之仪器的容量而变化。例如，如果要在图27A所示的实施例中校准12种染料，则板3120和3140中将无需缓冲液，因为三块校准板3100/3120/3140中的每块校准板可校准四种染料，总共可校准12种染料。
此外，每块板的染料数量可以为两种或更多种，其中每块板的最多染料数量基于例如所述校准板上的孔数、用以对一块整板进行正确建模之仪器的功能(见下文的进一步说明)，以及成像系统由所选的板获得可用荧光数据的能力。例如，与图27A所示使用一96孔板相反，可能有一个足够稳定的仪器及相关联的成像系统能够支持使用一384孔校准板。在提供附加孔密度的情况下，每块板可以校准更多种染料，例如每板16种染料，并且仍可获得所需的每种染料(例如，24)相同数量的数据点(即，存在染料的孔)以获得足够的全局模型(如下文所详述)。例如，对于一384孔板，使用两块板可校准10种染料，并且每块板可校准5种染料。
甚至样本固持器的类型和反应位点的类型也可能影响合适的染料的数量。如上文所述，可使用其他类型的样本固持器和反应位点进行校准。
返回图25，在步骤2904中，可将制得的棋盘状校准板装载进所述仪器中。可一次装载进一台仪器中的板数取决于所用仪器的功能和容量。例如，一个具有一96孔块的标准qPCR热循环仪每次仅容纳一块校准板。然而，多块热循环仪可能提供多个块，每个块各自容纳一块校准板。此外，如果不使用一校准板，则根据所用的样本固持器的形式(例如，微阵列或微芯片阵列)，可以一个单一仪器中使用例如一个适用于所述仪器的加载组件容纳多个样本固持器。
在图25的步骤2906中，该仪器使用其相关联的光学成像系统(参见例如图3)连续或并行采集所述已装载校准板或板的图像。所采集的图像及相关联的数据可存储于例如图2中计算系统200的存储器206或存储设备210上。该光学成像系统可在每个光学通道处采集每块板的图像。通道的数量取决于所述成像系统中所提供的激发和发射滤光器的数量。例如，对于一个具有6个激发滤光器(X滤光器)和6个发射滤光器(M滤光器)的成像系统，通道的总数为21个，用下列滤光器组合来表示：X1Ml、X1M2、X1M3、X1M4、X1M5、X1M6、X2M2、X2M3、X2M4、X2M5、X2M6、X3M3、X3M4、X3M5、X3M6、X4M4、X4M5、X4M6、X5M5、X5M6和X6M6。每个通道处所采集的图像或曝光的数量可以是变化的。例如，所述成像系统可在每个通道中采集两个图像或曝光。拍摄的图像数量或曝光次数取决于用户需求，因为每个通道拍摄较少的图像或曝光可能减少采集图像或曝光所需的时间，而每个通道拍摄较多的图像或曝光则更有可能获得高质量数据。
在图25的步骤2908中，该仪器使用从所述光学成像系统(参见例如图7)采集的图像或曝光中所收集的数据，识别所述校准板上每种染料的峰通道。每个反应位点的这一峰通道是其中所分析的特定染料在该反应位点表现出最强荧光的通道。峰通道识别可能发生在例如95％或更多的反应位点被染料占用时，在此例中允许在校准过程中存在不超过5％的异常反应位点。允许的异常值百分比可以是变化的。然后可以从将来的计算和分析中剔除异常反应位点。异常值可能发生在例如装载错误的染料、染料被装载为不正确的配置、染料的装载不正确或光学部件变脏(例如，灰尘颗粒)的情况下。可通过例如计算系统200的处理器204利用存储器206中存储的数据识别所述校准板上每种染料的峰通道。识别结果可存储于例如计算系统200的存储器206或存储设备210上。
或者，可通过使用本领域中已知背景和均匀性校准方法测定的背景组分和均匀性因子，在峰通道识别之前进行背景和均匀性校正，以对从光学成像系统采集的每个反应位点上每种滤光器组合的图像或曝光中所收集的荧光数据进行校正。
在图25的步骤2910中，该仪器使用从所述光学成像系统(参见例如图7)采集的图像或曝光中所收集的数据，针对所有存在染料的孔，将每个通道归一化到步骤2908的所述已识别的峰通道。通过例如计算系统200的处理器204利用存储器206中存储的数据可将每个通道归一化到所识别的峰通道。所述归一化的结果可存储于例如计算系统200的存储器206或存储设备210上。
所有存在染料的孔均给出了一个基线量值，由该基线量值进行归一化。一般来讲，该量值越大，则检测到的荧光越强。因此，一种给定染料的已识别峰通道将具有所述存在染料的孔中的该染料之最大量值，峰通道异常值除外。不管该峰通道中的量值如何，为了归一化，该通道处的该量值被重置为1。然后根据峰通道的重置值1来调整其他通道处相同染料的剩余量值。例如，如果对于染料X，峰通道A在所述孔中具有一个100的量值，并且其他通道B在所述孔中具有一个40的量值，则在归一化时，峰通道A被设置为1.0，并且通道B被设置为0.40。此归一化值也被称为校准因子，如上文所述，该峰通道的校准因子被设置为1.0。
在图27A和27B所示的实施例中，其中四种染料均匀分散于一块96孔板的孔中，每种染料存在染料的孔数为24个。存在染料的孔数可由于前文所述的原因而变化，所述原因诸如所述样本固持器(例如，校准板)上反应位点(例如，孔)的数量、分散于所述样本固持器上的染料数量。例如，在一块96孔板上，如果分散三种染料，则每种染料存在染料的孔数为32个。如果所述96孔板上分散有六种染料，则每种染料存在染料的孔数为16个。
现在参见图26，在步骤2912中，该仪器对每种染料的所有孔进行全局建模。为校准一种样本固持器形式的所有孔的一种染料，该仪器可使用一种特定染料的所述存在染料的孔中之数据对所有孔建模，包括不含特定染料的孔。通过计算系统2400的处理器2404使用存在染料的孔中特定染料的数据进行全局建模，可对所有孔进行建模。所得的模型可存储于例如存储器2406或存储设备2410上。参见图27A，对于存在于板3100的24个孔3102中的所述FAM染料，该板上的其他312孔将不存在FAM染料。相同的24个存在/72个存在的分布将适用于图27A中的每种染料。不存在染料的孔数取决于存在染料的孔数，如上文所述，存在染料的孔数可取决于多种因素。无论如何，一块给定板上存在染料的孔和不存在染料的孔的总和等于该板上的孔数。图27B为一块包含FAM、VIC、ROX和SYBR染料的四染料棋盘96孔校准板之图像，该校准板与图27A所示的板3100具有相同的构形。
在一个另选的实施例中，该仪器对所有通道或具有例如大于已识别峰通道0.01％或1％的归一化值的那些通道进行全局建模。对于低于此阈值的那些通道，该仪器将执行局部建模(见图26的步骤2922)而非执行全局建模。在某些通道处电平如此之低的情况下，全局建模可能变得不必要，在此情况下检测到的荧光主要是例如噪音或其他干扰的结果，而不是被校准的实际染料的贡献。
一种全局建模算法可用于一次染料校准中，以基于所述测定的特定存在染料的孔的染料校准因子推导出每种染料的每个滤光器通道的染料校准因子之模型。例如，如果所述96孔棋盘状板上存在特定染料的孔为24个，则全局建模利用这24个孔的染料校准因子推导出包括其他检测到不存在染料的孔在内的所有孔的校准因子，从而生成一个针对每种染料每个通道的整块板的模型。
二维(2D)二次多项式函数是一个实例，所涉及的是可用作染料校准因子的一个全局模型的一个函数。其他全局建模函数是已知的，并且可用于本文中。可使用一个非线性最小二乘法求解器以通过最大程度减小模型残差(出于所述模型所计算的值与测定的染料校准因子之差)，从测定的特定存在染料的孔的染料校准因子来导出2D二次多项式函数。Levenberg-Marquardt置信域算法可用作此求解器中的优化算法。但是本文可以使用许多其他优化算法，另一个实例是Dogleg方法，该方法的关键在于使用高斯-牛顿和Cauthy方法以计算优化步骤从而优化非线性对象。此方法使用称为置信域的搜索空间之子集上的模型函数(通常为二次式)近似得到目标函数。如果该模型函数成功使真实的目标函数最小化，则置信域得到扩展。相反，如果近似结果不理想，则缩小该域并且再次应用所述模型函数。一个损失函数，例如，也可能用以减小高残差(计算得到的校准因子和测定的校准因子之间的最大差值)的影响。这些高残差通常基于所述优化构成异常值。
在图26的步骤2914中，针对一种给定染料和多种染料对所有孔建模后，该仪器执行一次拟合优度(GOF)检验。这样可确保所述全局建模步骤足够可靠。通过例如计算系统200的处理器204使用存储于例如存储器206或存储设备210中的结果，可执行一次GOF检验。拟合优度的量度通常总结了观测值与所考虑的模型之预期值之间的差异。GOF可通过多种方式测定，包括例如确定系数R平方和均方根误差(RMSE)值。例如，R平方是一个统计量，可提供有关一个模型之拟合优度的一些信息。在回归分析中，所述R平方确定系数是一种统计量度，涉及的是回归线接近实际数据点的程度。一个R平方等于1指示所述回归线与数据完全吻合。RMSE是观测值与所考虑的模型之预期值之间的差异或残差的均方的平方根。RMSE是所述模型之预测精度的一个良好衡量标准。一个RMSE等于0指示模型预期的值与观测值精确匹配。
在图26的步骤2916中，如果拟合良好，则该仪器在图26的步骤2918中输出一个染料矩阵。在统计学上拟合良好的结果可发生在以下情况下：例如在R平方分析中，当R平方值大于或等于0.85时；或RMSE值为例如小于或等于0.01时，如图9所示。可通过例如计算系统200的处理器204建立染料矩阵并且输出到显示器212。
在图26的步骤2920中，如果拟合不佳，则该仪器在图26中的步骤2922中执行一个局部建模。这可能是必要的，例如，如果一次GOF校验的计算所得R值小于0.85以及例如RMSE值大于0.01。可通过计算系统200的处理器204使用所述存在染料的孔中之一种特定染料的数据对剩余不存在染料的孔进行建模。所得模型可存储于例如存储器206或存储设备210上。
一种局部建模方法可包括例如使用所述校准因子，这些校准因子来自所述板上相同染料之周围存在染料的孔。例如，为对一种特定染料测定一个不存在染料的孔之校准因子值，所述局部模型可以取周围孔的一个5×5局部窗口内或整个板中相同染料的所有特定存在染料的孔之中值。测定该中值直至完成该板的一个完整建模。然后所述局部建模输出可替代全局建模输出。
在所述局部建模完成时，该染料矩阵足以使得仪器在图26的步骤2918中输出所述染料矩阵。此染料矩阵用作每种经校准染料之所述荧光特征图的一个分布图。在每次运行后，该仪器接收呈每个读数的一个原始光谱信号形式的数据。仪器通过比较所述原始光谱与染料矩阵的纯光谱校准数据来确定每次反应中所用荧光染料的贡献。仪器使用从染料标样(即，染料矩阵)所采集的校准数据来表征和区分每种染料在该仪器所采集的总荧光中的单独贡献。
仪器归一化校准
当前，基因组学分析，包括约30,000个人类基因的基因组学分析是基础及应用生物化学和药物研究的一个主要焦点。此类分析可能有助于开发多种疾病的诊断、药物和疗法。然而，人类基因组的复杂性和基因相互关联的功能往往使得这项任务非常困难。研究人员通常面临的一个难题是无法轻松比较在多台仪器上运行所得的实验结果。诸如光源、光学元件和荧光检测器等部件的参数之物理变化例如可导致分析结果的变化，这种分析可能基于相同的生物样本。因此，始终需要有助于最大程度减少所述部件之变化的方法和装置。
在qPCR中，通过将一种报告基因染料的所述信号归一化到相同溶液中的被动参比染料来测定扩增曲线。报告基因染料的实例可包括但不限于FAM、SYBR绿、VIC、JOE、TAMRA、NED CY-3、德克萨斯红、CY-5。一被动参比的一个实例可以为但不限于ROX。此归一化可以被报告为带标记的归一化荧光值或“Rn”。即使所述总体信号电平受液体体积或总体照明强度的影响，被动参比归一化也能实现一致的Rn值。如果所述报告基因染料与参比染料之间的信号比率不同，诸如所述照明光谱中的仪器之间差异，则被动参比归一化无法正常工作。为解决这一问题，可制备归一化溶液，以对报告基因与被动参比的比率进行归一化。此类归一化溶液的一个实例可以为50:50FAM和ROX的混合物，该混合物可称为“FAM/ROX”归一化溶液。
这种现有的仪器归一化方法包括读取来自所述染料混合物的荧光以得到调整Rn值所需的“归一化因子”，其需要额外的费用。通常，该方法需要制备归一化溶液和归一化板，并且花费时间运行额外的校准。另外，此方法仅适用于利用一个标准的成对滤光器组进行校准的所述染料混合物。一个成对滤光器组可以是一激发滤光器和一发射滤光器的一个组合。本领域的技术人员应当理解，加入另外的染料将需要不同的归一化溶液和校准。
产生所述归一化溶液的生产过程还导致染料响应的变化。已发现，由于缺乏一个绝对荧光标准，因此难以控制染料浓度。为最大程度减小这些误差和变化，可能有利的是将所述溶液的染料比目标设置在所需混合物的+/-15％以内，或者设置在所述生产过程中所需混合物的+/-10％以内。该生产过程通常不能得到足够控制，故无法简单地混制一种50:50的染料混合物并满足这些规格，因此在该过程中需要额外的步骤以采用一个荧光计对所述染料混合物进行调节。
通过研究染料混合物和Ct的变化之间的关系，确定了上文所公开的可接受的百分比变化。一个Ct为一个“阈值循环”的常用缩写。定量PCR(qPCR)可提供一种测定一个样本中所存在一种靶序列或一种基因的量的方法。在PCR过程中，一个生物样本要经受一系列35或40个温度循环。一个循环可具有多种温度。对于每个温度循环，目标序列的数量在理论上可以加倍，且取决于本文未提及的多种因素。由于所述目标序列包含一种荧光染料，因此随着靶序列量的增加，即在35或40个温度循环中扩增，所述样本溶液在每个热循环中发出越来越亮的荧光。通过一个荧光检测器测量的荧光量通常被称为“阈值”，并且检出荧光的循环数量称为“阈值循环”或Ct。因此通过了解扩增效率和Ct，即可测定原始样本中靶序列的量。
上述容许的百分比变化也可与仪器中Ct偏移的标准偏差有关。已经确定，染料混合物的+/-15％变化可导致0.2Ct的标准偏差，其可以为2倍标准偏差。
如上文所述，期望可靠地比较多台仪器的实验结果，而仪器与仪器之间变异性常常是一个问题。这种变异性可以由两个来源产生：仪器内部件的变异，例如灯和滤光器，以及随时间的推移例如灯和滤光器老化的变异。实现一种可以可靠、容易和廉价地比较多个仪器之实验结果的过程将十分有利。本文所述的教导内容公开了此一过程。
一个光学系统中一个样本的荧光信号的量可取决于若干因素。部分此类因素可包括但不限于所述荧光的波长、荧光波长处的检测器效率、所述发射滤光器的效率、所述激发滤光器的效率和所述染料的效率。本教导内容表明，如果仪器的物理光学元件可以归一化，则仪器与仪器之间变异性可以最小化。
在一个实施例中，所述归一化因子可以从纯染料光谱而非染料混合物导出。纯染料可以比染料混合物更容易制造，因为浓度不必精确，并且仅含一种荧光组分。这一概念通过使用10种纯染料对一台仪器中的2个滤光器组进行归一化来测试，并将结果与使用染料混合物获得的归一化结果进行比较。通过测定每个激发滤光器和发射滤光器的一个校正因子来实现所述归一化。所得的校正因子可用以对染料的任何组合进行归一化，即使来自不同仪器也可实现。
在另一个实施例中，上文教导的归一化适用于多种不同类型的仪器。制备8种染料混合物溶液和10种纯染料溶液。将每种溶液移入三块96孔板的8个孔中。通过移入每个其他孔中，可最大程度减小潜在的空间串扰。所用的染料混合物如图28A所示，且所用的纯染料如图28B所示。此外，所用的仪器包括6组滤光器。图28B还标识出每种纯染料的主光学通道的所述滤光器对。所述激发滤光器以一个“X”示出，且所述发射滤光器以一个“M”示出。
为了量化所述归一化过程的有效性，在归一化前后测量所述染料比。图29示出根据17台经验定仪器之平均比率的染料混合物百分比偏差。这些仪器标记于所述X轴上，而该百分比偏差标记于所述Y轴上。本领域的技术人员将注意到，这些仪器之间的偏差通常大于前文所述+/-15％的期望值。因此，此数据表明需要改善归一化过程诸如当前的教导内容。
将当前的教导内容应用于所有17台仪器。所述归一化方法测定每个单个滤光器而非每个染料比的一个校准因子。由于这些仪器提供了6个激发滤光器和6个发射滤光器，因此测定了12个因子。该过程如图32和流程图3600所示。在步骤3605中，在多种滤光器组合下，生成了多种染料的校准光谱。对于被归一化的所述仪器，存在10种纯染料和21个滤光器组合。在步骤3610中，对所述光谱进行归一化，因此最大信号为1。在步骤3615中，对多个孔的所述染料光谱进行平均。这一平均化将使每种染料生成一幅光谱。总而言之，所述染料光谱可以称为包含染料和滤光器组合的一个染料矩阵“M”。此时，鉴别出一个参比仪器。该参比仪器为一台仪器或一个仪器组，所述测试仪器将归一化为该仪器或仪器组。该测试仪器中所用相同组的染料光谱可以由所述参比仪器获得。在一些实施例中，所述参比仪器可为一组仪器。在此一实施例中，可在所述组中对每种染料的光谱进行平均化。此步骤由流程图3600中的步骤3620来表示。例如，所述参比光谱可被称为矩阵“Mref”。
在步骤3625中，12个滤光器中的每个滤光器均具有初始设置为1的一个调整因子。期望的是，将该调整因子乘以矩阵“M”，同时在0和最小值之间迭代地修改所述调整因子，优选地在0.04和1之间，直至矩阵“M”和矩阵Mref之差最小化，如步骤3630所示。在步骤3635中，计算每个滤光器对的校正因子。每个滤光器对的该校正因子是所述发射滤光器因子与激发滤光器因子的乘积。所述主通道滤光器对如图28B所示。一旦确定了每个滤光器对的所述校正因子，即在所述测试仪器以及纯染料光谱中，将每个滤光器对因子乘以所述荧光数据。然后将经过校正的纯染料光谱重新归一化到一个最大值1，如步骤3645所示。在该过程的最后一步(步骤3650)中，生成多组分数据。本领域技术人员将理解，该多组分方法是所述荧光数据与染料矩阵之伪逆的乘积。该多组分值已经被归一化，由于数据已经被归一化到滤光器电平，因此无需进行特定染料校正。
完成归一化后，针对所有17台仪器，根据所述平均比率计算了染料混合物的％偏差。结果如图30所示。这些结果相比于图29所示归一化之前的数据得到明显改善。归一化数据的近距离视图如图31所示，其中归一化之后的偏差已经减小至+/-8％，其远低于前文所述+/-15％的目标值。
RNase P验证
如上所述，重要的是验证一台仪器以确保其工作正常，在新安装或多次使用后尤其如此。通过这种方式，一个用户可能确保实验结果和分析准确可靠。以前，由一个用户对该仪器进行一项验证测定，并且该用户基于验证分析的扩增数据手动进行数据分析以验证所述仪器。由于所述数据分析由用户手动进行，因此该验证过程更容易出错且花费的时间更多。
根据本教导内容的各种实施例，提供了自动验证方法和系统。一项验证测定的一个实例是一项RNase P测定。然而，如本文所用，验证测定可能为具有已知且可靠性质并且可用以验证一台仪器的任何测定。
在安装和经过多次使用后，验证该仪器是否正常工作非常重要。通常，一个用户将手动运行一项已知测定以验证一台仪器，诸如一项RNase P测定。所述RNase P基因是对RNase P酶的RNA部分进行编码的一个单拷贝基因。尤其由于其已知性质和特性，因而通常用作一项验证测定。
在一块验证板上预先装载检测和定量分析样本的基因组拷贝所需的试剂。例如，在一块RNase P验证板中，每个孔均包含PCR主混合物、RNase P引物、FAMTM染料标记的探针以及一个已知浓度的人类基因组DNA模板。
在一个传统的RNase P测定实例中，根据由一组重复标样(1250、2500、5000、10000和20000个拷贝)获得的所述Ct(循环阈值)值生成一条标准曲线。然后该标准曲线被用以测定两组已知模板的拷贝数(5000个和10000个重复群体)。如果能够证明该仪器有能力对在一个单孔中运行的一个后续样本以99.7％的置信水平区分5000个和10000个基因组等同物，那么该仪器将验证成功。
要通过安装，必须证明该仪器有能力对在一个单孔中运行的一个后续样本以99.7％的置信水平区分5000个和10000个基因组等同物。
根据各种实施例，本教导内容可以将专业知识结合到一个自动校准和验证系统中，并在识别出故障时提供通过/失败状态和故障排除反馈。如果一台仪器未能通过所述验证过程，则该用户可以例如致电维修工程师。本教导内容可最大程度减小所述安装和校准程序所需的成本和时间。
如上所述，根据本文所述的各种实施例，一项验证分析的目标是确认该仪器是否充分辨识相同样本的两个数量。通过这种方式，可以验证仪器性能。
根据本教导内容的各种实施例，提供了一个自动验证方法和系统。由一个系统分析和比较一项验证测定的循环阈值(Cts)以确定一台仪器是否可充分辨识一种样本的两个数量。一项验证测定的一个实例是所述RNase P测定。在此实例中，一个系统确定针对5000个和10000个基因组拷贝的RNase P样本所生成的Ct值，以确定5000和10000个基因组拷贝的数据是否充分可辨识。根据本文所述的实施例，充分可辨识意指两个数量下的数据相差至少3倍标准偏差(3σ)(～99.7％)。在此实例中，所述两个数量为5000个和10000个基因组拷贝。根据各种实施例的方法如下文参见图33和34所述。
图33示出根据本文所述的各种实施例，用于验证一台仪器的一种示例性方法。一般而言，在步骤3702开始时，通过接收来自一块验证测定板的扩增数据来生成多条扩增曲线，每条扩增曲线对应于所述板上的一个孔。
板包含多个孔。在一些实例中，一块板包含96个孔。在其他实例中，一块板包含384个孔。所述板中的一部分孔中可包含一第一数量的一个样本，并且板中的另一部分孔可包含一第二数量的一个样本。所述第一数量和第二数量是不同的。在本文所述的各种实施例中，所述第二数量大于第一数量。在一些实施例中，所述第二数量可能为第一数量的1.5倍。在其他实施例中，所述第二数量可能为第一数量的2倍。根据本文所述的各种实施例，所述第二数量可能为第一数量的任意倍。在一些实施例中，所述第一数量可能为每个孔5000个基因组拷贝，并且第二数量可能为每个孔10000个基因组拷贝。
重新参见图33，在步骤3704中，基于所述多条生成的扩增曲线测定多个荧光阈值。比较所述多条扩增曲线的指数区域以确定该指数区域下降的荧光值的范围。例如，确定从所述多条扩增曲线的指数区域底部的最低荧光值到该指数区域顶部的最高荧光值的荧光值范围。根据本教导内容的实施例，所述荧光值范围用于所述多条扩增曲线的自动分析中以验证该仪器。
参见图35，示出多条扩增曲线以及荧光值和对应循环阈值之范围的测定。所述多条扩增曲线中的每条均包括该曲线的一个指数区域。轴3902指示荧光值。轴3904示出循环次数。荧光范围3906示出从所述多个指数区域中的一个指数区域的一个已测定底部的最低荧光值到所述多个指数区域中的一个指数区域的一个已测定顶部的最高荧光值之荧光值范围。根据各种实施例，荧光值的范围均由一个预定数值均分，以便由所述系统生成一组用于自动分析的荧光值。在一个实例中，荧光值的范围3906由100均分，以确定一组荧光阈值的100个荧光值。在一些实施例中，剔除最高的5个荧光值和最低的5个荧光值，使得以一组90个荧光阈值进行分析。
重新参见图33，在步骤3706中，对于所述荧光值组中的每个荧光值，测定根据包含所述样本之第一数量的孔所生成的所述多条扩增曲线中的每条扩增曲线的循环阈值(Ct)。相似地，对于所述荧光值组中的每个荧光值，测定根据包含所述样本之第二数量的孔所生成的所述多条扩增曲线中的每条扩增曲线的循环阈值(Ct)。
在步骤3708中，使用所述组中每个荧光值的第一数量和第二数量的Ct值，确定所述第一和第二数量是否充分可辨识。根据各种实施例，充分可辨识意指使用公式(1)使所述组中的至少一个荧光值得到正的结果：
((μCtquant1-3σCtquant1)-(μCtquant2-3σCtquant2)) (1)
公式1确定一个第一和第二数量是否充分可辨识，根据本文所述的实施例，其中quant2大于quant1。充分可辨识意指所述第一和第二数量的Ct值相差至少3倍标准偏差(3σ)(～99.7％)。如果发现所述数量充分可辨识，则向该用户提供一则仪器验证通过的指示。该指示可能在显示屏上提供给该用户。
图34示出根据本文所述的各种实施例，用于验证一台仪器的另一种示例性方法。在步骤3802中，接收来自一块验证板的孔中所包含的多个样本的扩增数据。所述验证板中的一部分孔包含一种具有一个第一数量的样本。所述验证板中的另一部分孔包含一种具有一个第二数量的样本。所述第一数量和第二数量是不同的。在本文所述的各种实施例中，所述第二数量大于第一数量。在一些实施例中，所述第二数量可能为第一数量的1.5倍。在其他实施例中，所述第二数量可能为第一数量的2倍。根据本文所述的各种实施例，所述第二数量可能为第一数量的任意倍。在一些实施例中，所述第一数量可能为每个孔5000个基因组拷贝，并且第二数量可能为每个孔10000个基因组拷贝。
在步骤3804中，基于所述多条生成的扩增曲线测定一个第一组荧光阈值。比较所述多条扩增曲线的指数区域以确定该指数区域下降的荧光值的范围。例如，确定从所述多条扩增曲线的指数区域底部的最低荧光值到该指数区域顶部的最高荧光值的荧光值范围。根据本教导内容的实施例，所述荧光值范围用于所述多条扩增曲线的自动分析中以验证该仪器。
根据各种实施例，荧光值的范围均由一个预定数值均分，以便由所述系统生成一组用于自动分析的荧光值。在一个实例中，荧光值的范围3906由100均分，以确定一组荧光阈值的100个荧光值。在一些实施例中，剔除最高的5个荧光值和最低的5个荧光值，使得以一组90个荧光阈值进行分析。
在步骤3806中，对于所述组中的每个荧光阈值，测定对应于所述第一数量的扩增曲线的一个第一组Ct值。相似地，对于所述组中的每个荧光阈值，测定对应于所述第二数量的扩增曲线的一个第二组Ct值。所述组中的每个荧光阈值均重复这种关系。
在一些实施例中，执行进一步计算之前，从每组Ct值中去除预定数量的异常Ct值。例如，在一些实施例中，如果使用一块96孔板，则从每组Ct值中去除6个异常值。一个异常值为距离该组Ct值之平均值最远的Ct值。又如，如果使用一块364孔板，则从每组Ct值中去除10个异常值。去除所述异常值后，在该方法剩余的步骤中使用每组中剩余的Ct值。
在步骤3808中，计算每组Ct值的平均值。换言之，对于在步骤3804中所测定的组的每个荧光阈值，计算所述第一数量扩增曲线的一个第一Ct平均值，并且计算所述第二数量扩增曲线的一个第二Ct平均值。
类似于步骤3808，在步骤3810中，计算每组Ct值的3倍标准偏差。换言之，对于在步骤3804中所测定的组的每个荧光阈值，计算所述第一数量扩增曲线的一个第一3倍标准偏差，并且计算所述第二数量扩增曲线的一个第二3倍标准偏差。
为确定所述第一数量和第二数量的Ct值是否为一个荧光值处充分可辨识的Ct值，根据各种实施例，对该Ct值进行比较。根据各种实施例，采用公式(1)进行比较。
((μCtquant1-3σCtquant1)-(μCtquant2-3σCtquant2)) (1)
公式2确定第一数量和第二数量是否充分可辨识，根据本文所述的实施例，其中quant2大于quant1。充分可辨识意指所述第一和第二数量的Ct值相差至少3倍标准偏差(3σ)(～99.7％)。
在步骤3814中，对采用公式(2)得到组中所有荧光阈值的结果进行比较以确定最大值。如果该最大值为正数，则仪器可充分辨识第一数量和第二数量，并且在步骤3816中向用户提供仪器验证通过的指示。如果该最大值为负数，则仪器无法充分辨识第一数量和第二数量，并且在步骤3818中向用户提供仪器验证失败的指示。
图36示出根据本文所述的各种实施例用于验证仪器的系统4000。系统4000包括PCR仪器接口4002、Ct数据库4004、显示引擎/GUI 4006、Ct计算器4008和验证器4010。
PCR仪器接口4002接收来自PCR的扩增数据以生成扩增曲线。如上所述，该PCR仪器对所述验证板中包含的样本进行扩增。该验证板包括包含第一数量的样本的孔的一部分以及包含第二数量的样本的孔的另一部分。PCR仪器接口4002接收由样本扩增生成的荧光数据。
在步骤1704和步骤1804中测定一组荧光阈值后(分别参见图33和图34)，Ct计算器4006计算对应于分别由第一数量和第二数量的样本生成的扩增曲线的第一组和第二组Ct值。计算该组荧光阈值中的每个荧光阈值的第一组和第二组Ct值。所述多组Ct值存储于Ct数据库4004中。
验证器4010确定第一数量和第二数量是否充分可辨识，如图33的步骤3708以及图34的步骤3810和步骤3812所述。
显示引擎/GUI将所述多条扩增曲线显示给用户。另外，在验证器4010确定第一数量和第二数量是否充分可辨识后，显示引擎/GUI 4006向用户显示验证通过或验证失败的指示。
自动染料校正
根据本教导内容的各种实施例，可以使用自动染料校正方法对多组分数据进行实时光谱校正。自动染料校正可以实时执行或在采集扩增数据和二次分析后执行。在所述自动染料校正算法中，生成多组分相关矩阵。根据各种实施例，一次自动染料校正算法调整了所述染料矩阵的元素，从而最大程度减少多组分相关矩阵中的非对角项。通过这种方式，最大程度减小了Ct测定的误差。
自动背景校正
根据本教导内容的各种实施例，可以执行一次自动背景校准以减少对背景校准板的需要并且提高背景校正的总体效率。
在所述仪器使用中产生的块(颗粒物或化学物质)中的物理污染物可对系统的分析结果产生负面影响，人为导致受污染物影响的分析孔的某些光谱分量提高。一次重新校准可解决这一问题。然而，为延长所需校准之间的周期，描述了一种在背景校准之后自动计算/补偿背景变化的方法。为完成自动背景校准，执行一种使用空/未占据块的方法。针对耗材的有效信号渗通是已知的(由经验确定)，并且有效的背景校准斜率和偏移可使用缩放因子来近似，该缩放因子解决了有效的信号渗通。
板检测
根据本文所述的各种实施例，可执行板检测方法以识别仪器中板布置的错误。
在仪器使用过程中，所述系统的光学器件位于行程的上限(空闲期间)或下限(运行期间)。根据设计，所述硬件无法读出介于行程限值之间的中间位置处的光学器件位置；因此，无法依靠电机位置值来确定板或管存在与否(其中光学器件的位置差异将由存在的管或板增加的材料厚度引起)。在板或管检测中无需采用另外的部件(诸如，按压开关或定位传感器)，所述系统中的检测相机即可用于样本检测。然而，由于仅通过使用离散和分离的孔透镜阵列(阵列中的每个透镜聚焦并收集来自一个孔和仅来自一个孔的光)来捕获块区域的一小部分，因此无法采集一张捕获整个块区域的耗材平面的传统“照片”进行图像处理。由于仅采集每个孔的聚焦光并且在所述检测器上表现为圆形亮斑，因此在检测到的图像中不存在空间或动态范围。然而，如果所述光学器件移动至允许聚焦在一个容器的密封件或盖子上的中间位置，则该焦点可被捕获为反射图像(与荧光形成对比，荧光是由系统采集的正常信号)，并且用于板/管检测。所述焦点将小于孔，并且相对于孔的尺寸将在捕获的图像中显示出一块小的明亮区域(称为研究区域，ROI)。根据本文所述的各种实施例，应当理解，焦点将产生亮像素并且所有其他区域将产生较暗的像素，对所述像素级信息的数值分析可得到存在与否的结果。
使用反射材料进行仪器归一化
根据本教导内容的各种实施例，使用诸如光电二极管等反射材料的仪器归一化可用于在完成制造或安装后的任何初始校准之后对所述仪器进行自动校准。
根据各种实施例，在制造过程中测量一种稳定的反射材料作为对照。可以将该反射材料置于加热的盖子之上。随后，可在所有通道中测量该稳定的反射材料以检测任何变化或变异。任何变化或变异均可用于调整色彩平衡因子，如上文在仪器归一化校准方法中所述，以对激发光的变化进行重新归一化。
热块托盘
如上文所概述并且如图1所示，热循环仪系统100可包括样本盖子114、加热/冷却元件116和热交换器118。
用于分析生物样本的仪器经常为研究人员提供了手动或自动将生物样本放入仪器的样本装载区域进行分析的能力。在一些实施例中，可提起盖子，并且将一个能够容纳生物样本的容器放置到一台仪器的样本装载区域中。在其他实施例中，可打开门以将一个能够容纳生物样本的容器插入一台仪器的样本装载区域中。
在另一个实施例中，抽屉或托盘可滑出仪器，允许将一个能够容纳生物样本的容器插入一台仪器的样本装载区域中，其中在关闭抽屉时将容器插入仪器中。在另一个实施例中，能够容纳生物样本的容器可通过使用例如弹簧、闩锁、手柄和杠杆来插入仪器中。在其他实施例中，可自动触及仪器的样本装载区域。这经常用于在高通量环境中使用机器人技术的仪器中。通过使用电机可自动操作盖子、门和抽屉。自动化实施例也可用于用户友好的仪器中，以协助研究人员将生物样本装载到仪器中进行分析。可通过将所述仪器与一个计算机系统进行对接来控制自动化过程，该计算机系统被编程为提供运动以协助装载生物样本。
如上所述，图5示出热循环仪系统100的一个实施例，其中可移动抽屉或托盘160处于打开的暴露位置。图38示出其中设置有样本块组件的一个自动抽屉或托盘的一个实施例。如下文所述，一个样本块组件可包括那些有助于控制所述样本块温度的部件。样本块114可用于固定一个生物样本的容器。样本块114还可提供加热和冷却以影响生物样本的温度变化。在分析过程中改变生物样本的温度是本领域中执行聚合酶链反应(也称为PCR)时已知的。电子器件128可通过例如线材和连接器系统连接到样本块，以控制样本块的温度。图38的组件可为构成一个分析仪器的若干组件中的一者。一台仪器中的附加组件可包括但不限于电源、光学激发、光学发射、数据通信和用户界面。所有提及的组件也可连接到计算机以控制仪器的数据采集和定时。
图39示出图38的组件，其中移除了块组件114和电子器件128。图39示出一个自动系统的一个实例，该自动系统可使用户触及仪器的样本装载区域，例如块组件114。图39示出电机500、耦接头505、滑片510和块支撑件515。在此类配置中，块支撑件515可通过本领域中已知的任意数量的紧固件机械连接至滑片510。紧固件的一些实例可为但不限于螺钉、螺栓、铆钉以及任何其他适于将块支撑件515牢固地固定到滑片510的紧固件。通过将块支撑件515牢固地固定到滑片510，块支撑件可沿箭头520所指示的方向移动。通过使用轴承或诸如特氟隆(未示出)等光滑表面可有利于提高块支撑件的移动容易程度。图39还示出电机500。电机500可为本领域中已知的任何合适的电机，举例来说，诸如直流电机或步进电机等。不管怎样，电机500可连接到上文所述的电子器件以提供电机轴的旋转运动。如果需要，电机500还可连接到一个计算机系统，该计算机系统被编程为用于精确控制电机的方向和速度。如上文所述，电机500可提供旋转运动，该旋转运动可转化成如箭头520所示的线性运动。由旋转运动转化成线性运动可通过耦接头505和一个或多个导螺杆(未示出)来实现。因此，此类配置可以可控的方式提供块支撑件的自动运动。另外，耦接头505可补偿电机500和导螺杆(未示出)之间的任何不对准。
转到图40，示出所述组件的侧视图。可以看到样本块114、电机500和耦接头505。另外，还示出轴承530。如前文所述，轴承530可有助于提供块组件的平滑平移运动。轴承530的尺寸和类型取决于所述轴承必须支撑的负荷。轴承530的更多细节如下文所述。
本领域的技术人员将理解，自动系统通常包括向一个运动控制器提供的某种类型的位置反馈。该反馈可针对细部或过程或两者的组合，其取决于被控制的系统。例如，步进电机可基于电机运动的步长大小和数量提供精确定位。对于步进系统，计算机可被编程为计算步长以确定作旋转或线性运动装置的位置。图41A示出如前文所述的块组件114和电子器件128的顶视图。如上所述，块组件114和电子器件128固定到图39的导轨510并且耦合到图39的电机500以提供根据图41A的箭头570所示的运动。箭头570用于表示块组件114和电子器件128“接入”和“退出”仪器的移动。如图41A所示，所述组件处于接入位置，并且由区域560得以证明，其闭合状态如下文所述的图41B所示。
图41B示出2个光学传感器575和580。光学传感器连续发射并且检测跨一个间隙的红外线。该间隙的一侧是一个发射器，而另一侧为一个接收器。只要将电力施加于该装置，则所述发射器不断发射红外线，并且所述接收器连续检测该红外线。如果在该间隙中插入一个不透明物体，则该发射器继续发射红外线，但是光被阻挡而无法到达该接收器。可通过一台被编程为检测差异的计算机来检测和识别接收到光与未接收到光之间的差异。因此，所述计算机可检测光是否被阻挡。自动系统可利用这种效果，通过安装或提供一个连接到一运动物体的不透明物体来检测该运动物体是否处于光学开关的位置，并且电机500将被关闭。
重新参见图41B，可概略地看到突片540。突片540还可在图40中看到，并且是风道550的不透明突片。如图所示，突片540处于光学开关575的间隙中，并且由此表示所述块组件和电子器件的“接入”位置。本领域的技术人员将理解，电子部件的操作可能发生故障。无法“接入”的开关将无法检测到“接入”状态，并且电机500将不被关闭。为防止损坏组件，硬障碍物585提供在滑片510后方。这如图41C所示。
图41B还示出光学开关580，并且可被构造以检测组件何时完全“退出”。光学开关580的工作原理如上针对光开关575的部分所述，其在一个间隙上发射和检测红外线。如果在间隙中插入一个不透明物体，则一台已编程的计算机可检测光路是否被阻挡。对于“退出”状态，突片590设置在导轨510的后部，如图41C所示。
图42A示出处于“退出”位置的组件。这很明显，因为可以看到电机500、耦接头505和一个导螺杆594。在图41A的“接入”位置处，这些部件不可见。“退出”位置的检测显示在区域592中，并且其特写如图42B所示。图42B示出如前文所述处于“接入”状态的光学开关575。此外，概括地示出不透明突片590，其附接到导轨510并且位于光学开关580的间隙中。如上所述，已编程的计算机可检测突片590是否处于间隙中，从而“了解”组件何时处于全部“退出”状态。
热块
如上文所概述并且如图1所示，热循环仪系统100可包括样本块114、加热/冷却元件116和热交换器118。这些元件可一起称为样本块组件。图43示出根据本文所述的各种实施例的样本块组件600的一个实施例。组件600可包括一个样本块(或多个块)605、一个热电冷却器(TEC)(或多个TEC)610以及相关联的框架630和一个散热器615。框架630被设计为容纳目的并且将TEC 610与块605和散热器615对准。
虽然样本块605可为单个一体的块，但是图43示出共同构成样本块605的多个块，其中密封件620装配在多个块和块605下方一界面箔片625之间的间隙中。同样，根据块605的设计(单个块或多个块)，箔片625可为具有与块605基本相同的尺寸的单个箔片，或者可为多个箔片，每个箔片具有与多个块设计中的各个块基本相同的尺寸。相似地，箔片625的数量和尺寸可模仿所用的TEC 610的数量和尺寸。箔片625可由例如铝等材料制成。
块605可固定、夹紧到所述块组件的其他部件，例如散热器615。另选地，块605可浮置。浮置块605可不受螺钉和/或其他附接件的约束或受其完全约束。浮置块605可位于所提供的一个或多个平坦表面上，以保持块605基本上与块组件的其他部件对准。然而，浮置块605可在各个侧面侧向地运动。一般来讲，此类运动将受到限制，以防止块605与例如加热的盖子、散热器和/或TEC等无法对准。所述组件可提供例如限制侧向运动的基台。所有侧面的运动可限制在例如1mm以内。通过允许此类受约束的侧向运动，所述浮置块可适应由于如上所述的滑动导轨的自动进出运动而导致块可能对加热的盖子的任何堆叠的公差和不对准。
图43的组件600还包括夹具635，其沿着块605和夹具TEC 610的主体长度安置到块605。浮置加热器640还设置在组件600中，并且可沿着块605的外周凸部布置，该凸部位于块的底部最靠近块上孔的基部处。加热器640可为例如一侧涂覆有铝箔的聚酰亚胺加热器，并且相比于更靠中心的孔，可用于抵消围绕周边孔的低温。
第二界面箔片645可设置在TEC 610和散热器615之间。与箔片625相似，箔片645的尺寸可接近所用的TEC 610的数量和尺寸。它也可是沿TEC 610的总表面区域的单件箔片。箔片645可由例如铝等材料制成。
密封件650可设置在散热器615的顶部表面上。该密封件可连接至例如围绕样本块605周边的滴液盘。样本块和散热器之间的密封件有助于防止水分进入密封室并且损坏TEC功能。
加热的盖子
如上文所概述并且如图1所示，热循环仪系统100可包括加热的盖子110。
在大量PCR仪器中，将样本管或微量滴定板插入一热块组件上的样本孔中。为执行PCR过程，根据用户在PCR方案文件中所指定的规定温度和时间循环所述热块组件的温度。该循环可通过计算系统及相关联的电子器件来控制。随着热块组件温度的变化，在理想情况下，各个管或板中的样本的温度发生相似的变化。然而，可存在多种因素可影响从热块到样本的热传递效率以及样本反应效率。所述多种因素的实例可包括所述样本管在热块组件上与样本的接触程度，以及随样本被加热和冷却，样本管或板内发生的冷凝或蒸发量。出于至少这些原因，仪器通常还包括一个加热的盖子，该加热的盖子可位于样本管或板上方并与样本管或板接触。所示的加热的盖子可向管或板提供向下的力以改善热块组件与样本之间的热接触，并且还向管或板的顶部提供热量以最大程度减少冷凝和蒸发。
此类加热的盖子的一个实例如图44A所示。加热的盖子组件700根据本教导内容示出。下部板720提供了一可紧密配合样本管或板的上表面的表面。在一个实施例中，下部板720可包括一平坦不间断的配对表面。在另一个实施例中，下部板720可包括凹陷。在另一个实施例中，凹陷可为通孔。在一些仪器中，通孔对于样本容器中容纳的样本的光学检测可以是有利的。在另一个实施例中，通孔的数量可为96个孔。在另一个实施例中，孔的数量可为384个。在另一个实施例中，通孔的数量可等于样本容器的数量。如上所述，加热的盖子的一个益处在于向样本容器的顶部提供足够的热量以最大程度减少样本的冷凝和蒸发。同样地，可加热下部板720。在图44A中，可由加热器715提供对下部板720的加热。加热器715可为本领域中已知的任意多个类型。加热器715可通过本领域已知的任何技术进一步附接到下部板715，所述技术例如硫化、压敏粘合剂、环氧树脂和胶带。加热器715可由编程计算机控制以提供防止蒸发和蒸发所需的一定量热量。在一些实施例中，加热器715可加热至95℃。在另一个实施例中，加热器715可加热至95℃和105℃之间。在另一个实施例中，加热器715可加热至高于105℃。
加热的盖子组件700还包括顶板725。顶板725被示出为上表面中的凹陷。该凹入部可与下部板720的凹陷对准，如前文所述。在一个实施例中，上部板725中的凹陷可为通孔。在另一个实施例中，通孔可允许对样本孔中包含的样本进行光学检测。在另一个实施例中，通孔的数量可为96个孔。在另一个实施例中，孔的数量可为384个。在另一个实施例中，通孔的数量可等于样本容器的数量。在另一个实施例中，通孔可为圆形。在另一个实施例中，通孔可为矩形。在另一个实施例中，通孔可为正方形。在另一个实施例中，正方形孔可为96孔和384孔形式的样本提供光学通道。图44B示出正方形孔如何与热块组件中的96个样本孔对准。每个正方形孔被示出为与1个样本孔对准。图44C示出正方形孔如何与热块组件中的384个样本孔对准。每个正方形孔被示出为与4个样本孔对准。此类配置可增加加热的盖子部件在多种仪器上的可用性，并且可降低每个部件的成本。
加热的盖子700的第二功能是在样本容器的顶部提供向下的力，以使样本溶液与样本块牢固接合，最大程度减少样本孔和样本之间的热阻。必要的力的大小可取决于用于形成所述样本容器的一种或多种材料的类型。在一个实施例中，力的大小可为90磅。在另一个实施例中，力可介于90磅和150磅之间。在另一个实施例中，力可大于150磅。盖子700可垂直移动以接合样本容器，从而提供必要的力。盖子700可以通过使用凸轮、杠杆、活塞、螺线管或电机来移动。本领域的技术人员将认识到，这些元件并非能够提供必要运动的唯一机构，并且可利用提供运动的任何机构。一种此类机构如图45所示。
图45的图示示出自动系统800，该系统用于使加热的盖子700在不接合样本容器的位置与接合样本容器的位置之间平移。系统800可包括电机815、带810、滑轮806、滑轮830和导螺杆820。一个第二导螺杆(未示出)也包括在滑轮805中，与导螺杆820处于一个相似的位置。每个导螺杆及相关联的滑轮位于加热的盖子700的各侧。可修改系统800以提供该应用所需的任何速度和力。本领域的技术人员将知道，所述电机的尺寸、滑轮比和导螺杆的规格都有助于决定可提供的有势力。因此，如图45所示的系统可被设计为在样本容器的顶部提供150磅的力。这样的力需要遍布于所述系统并且集中于所述样本容器。可通过包括位于2个导螺杆周围的轴承825来协助力的分布。施加于所述样本块组件的力也可以通过支撑支架(未示出)来分布，这些支撑支架有助于将所述力传递至图39所示的导轨510。因此，导轨510将必须支持该力而不影响图38所示的块114和电子器件128的平稳运动。
重新参见图44A，其示出光学传感器710。光学传感器连续发射并且检测跨一个间隙的红外线。该间隙的一侧是一个发射器，而另一侧为一个接收器。只要将电力施加于该装置，则所述发射器不断发射红外线，并且所述接收器连续检测该红外线。如果在该间隙中插入一个不透明物体，则该发射器继续发射红外线，但是光被阻挡而无法到达该接收器。可通过一台被编程为检测差异的计算机来检测和识别接收到光与未接收到光之间的差异。因此，所述计算机可检测光是否被阻挡。自动系统可利用这种效果，通过安装或提供一个连接到一运动物体的不透明物体来检测该运动物体是否处于光学开关的位置，并且电机500将被关闭。
如上所述，加热的盖子700和系统800可一起向所述样本容器的顶部提供至少150磅的力。无论该样本容器的尺寸如何，若可以一致地提供该力都是有利的。包括弹簧组件730和光学开关710以向所有样本容器提供所需的力。弹簧组件可被设计为响应于所述系统所需的力。弹簧组件730还包括位于光学开关710的所述间隙中的不透明突片735。当盖子700被降低并且接合所述样本容器时，所施加的力随盖子700降低而增加。随着该力的增加，弹簧组件730产生响应并且在一个向上方向上运动。当施加所需的力时，弹簧组件730将向上运动足够的距离，使得突片735将阻挡光学开关710的光路。如上所述，可通过一台已编程的计算机来检测受阻挡的光路，并且可关闭电机815。
在一台具有诸如本教导内容所公开之自动功能的仪器中，有利的是在加热的盖子提起时防止所述样本块打开。针对这种情形的保护由图45所示的光学开关835和不透明突片840来提供。光学开关835可安装于一个固定位置，以覆盖支撑件845。不透明突片840可位于盖子700上并且与光学开关835的所述间隙对准。完成PCR后，可提起所述加热的盖子和不透明突片840直至不透明突片840进入光学开关835的所述间隙。当不透明突片840提起足够的高度以阻挡光学开关835的光路时，一台已编程的计算机可检测待完全提起的所述盖子的位置并且可关闭电机815。
在第一实施例中，提供了一种生物分析系统，该系统包括一个样本块组件，该组件包含一个构造成容纳样本固持器的样本块，其中样本固持器构造成接纳多个样本；一个控制系统，该系统被配置为使所述多个样本在一系列温度之间循环；以及一个托盘，该托盘构造成使样本块组件可逆地从闭合位置滑动至打开位置，以允许用户接触所述多个样本固持器。
在第二实施例中，提供了根据第一实施例所述的生物分析系统，其中托盘为一个自动系统。
在第三实施例中，提供了根据第二实施例所述的生物分析系统，其中托盘包含一个滑动组件，该组件构造成可逆地滑动样本块组件。
在第四实施例中，提供了根据第三实施例所述的生物分析系统，其中滑动组件为一个单件挤出物。
在第五实施例中，提供了根据前述实施例所述的生物分析系统，其中托盘还包含一个定位传感器，该传感器构造成确定所述自动托盘何时达到限定的闭合位置和限定的打开位置。
在第六实施例中，提供了根据第五实施例所述的生物分析系统，其中定位传感器为一个光学传感器。
在第七实施例中，提供了根据第五实施例和第六实施例中任一项所述的生物分析系统，其中定位传感器为一个光学开关。
在第八实施例中，提供了根据第五实施例和第七实施例中任一项所述的生物分析系统，还包括一个加热的盖子，其中定位传感器构造成确定所述自动托盘何时达到限定的闭合位置，由此使得样本块与加热的盖子对准。
在第九实施例中，提供了根据第六实施例和第七实施例中任一项所述的生物分析系统，其中托盘或样本块组件还包含一个突片，该突片被构造成能够阻挡来自定位传感器的射光。
在第十实施例中，提供了一种生物分析系统，该系统包括一个块组件，该组件包含一个具有多个块孔的样本块，该样本块构造成容纳一个样本固持器，该固持器构造成接纳多个样本；一个控制系统，该系统被配置为使所述多个样本在一系列温度之间循环；一个光学系统，该系统构造成将激发光传输至所述多个样本并检测所述多个样本中每个样本所发出的荧光水平；以及一个加热的盖子，该盖子包含一块下部板，该下部板具有一个用于配合所述样本固持器一个上表面的配对表面，该配对表面具有多个下部板孔，每个下部板孔与所述多个块孔中相关联的一个对准以允许激发光传送到该块孔；一个加热器；以及一块具有多个上部板孔的上部板。
在第十一实施例中，提供了根据第十实施例所述的生物分析系统，其中样本块具有96个孔。
在第十二实施例中，提供了根据第十实施例所述的生物分析系统，其中样本块具有384个孔。
在第十三实施例中，提供了根据第十实施例所述的生物分析系统，其中下部板具有96个下部板孔。
在第十四实施例中，提供了根据第十实施例所述的生物分析系统，其中下部板具有384个下部板孔。
在第十五实施例中，提供了根据第十实施例至第十四实施例中任一项所述的生物分析系统，其中上部板孔的数量等于样本块孔的数量。
在第十六实施例中，提供了根据第十实施例至第十四实施例中任一项所述的生物分析系统，其中提供了具有上部板孔的单块上部板，这些板孔构造为允许发射光传送到一个选定样本块孔形式中的任一种。
在第十七实施例中，提供了根据第十六实施例所述的生物分析系统，其中样本块孔形式为96孔形式或384孔形式。
在第十八实施例中，提供了根据第十实施例至第十七实施例中任一项所述的生物分析系统，其中加热的盖子还包含一个位置传感器，该传感器被构造成检测该加热的盖子何时向样本固持器的上表面提供一个限定的压力。
在第十九实施例中，提供了根据第十八实施例所述的生物分析系统，其中样本固持器的上表面为该样本固持器上所提供多个样本孔的上表面。
在第二十实施例中，提供了根据第十八实施例至第十九实施例中任一项所述的生物分析系统，其中位置传感器为一个光学传感器。
在第二十一实施例中，提供了根据第十八实施例至第十九实施例中任一项所述的生物分析系统，其中加热器盖子还包含一个弹簧组件，该弹簧组件包括一个突片，弹簧组件构造成在加热的盖子向下移动至样本固持器上时接合样本固持器的上表面，其中所述突片被构造成能够阻挡来自位置传感器的射光以停止该加热的盖子的向下移动。
在第二十二实施例中，提供了一种生物分析系统，该系统包括多个系统模块，这些模块包含一个检测器模块；一个发射模块；一个激发模块；和一个基座模块；所述多个系统模块构造成可逆地连接以形成第一生物分析装置类型。
在第二十三实施例中，提供了根据第二十二实施例所述的生物分析系统，还包括一块面板。
在第二十四实施例中，提供了根据第二十二实施例至第二十三实施例中任一项所述的生物分析系统，其中所述模块中的至少一者为用于一个第二生物分析装置类型的一个模块。
在第二十五实施例中，提供了根据第二十二实施例至第二十四实施例中任一项所述的生物分析系统，其中检测器模块包含一个发射传感器。
在第二十六实施例中，提供了根据第二十二实施例至第二十四实施例中任一项所述的生物分析系统，其中检测器模块包含一个发射检测器。
在第二十七实施例中，提供了根据第二十二实施例至第二十四实施例中任一项所述的生物分析系统，其中发射模块包含一个相机。
在第二十八实施例中，提供了根据第二十二实施例至第二十四实施例中任一项所述的生物分析系统，其中发射模块包含一个发射滤光轮。
在第二十九实施例中，提供了根据第二十二实施例至第二十四实施例中任一项所述的生物分析系统，其中激发模块包含一个激发源。
在第三十实施例中，提供了根据第二十二实施例至第二十四实施例中任一项所述的生物分析系统，其中激发模块包含一个激发滤光轮。
在第三十一实施例中，提供了根据第二十二实施例至第二十四实施例中任一项所述的生物分析系统，其中激发模块包含一个分束器。
在第三十二实施例中，提供了根据第二十二实施例至第二十四实施例中任一项所述的生物分析系统，其中激发模块包含一个折叠式反射镜。
在第三十三实施例中，提供了根据第二十二实施例至第二十四实施例中任一项所述的生物分析系统，其中基座模块包含一个样本块。
在第三十四实施例中，提供了根据第二十二实施例至第二十四实施例中任一项所述的生物分析系统，其中基座模块包含块加热和冷却元件。
在第三十五实施例中，提供了根据第二十二实施例至第二十四实施例中任一项所述的生物分析系统，其中基座模块包含一个分束器。
在第三十六实施例中，提供了根据第二十二实施例至第二十四实施例中任一项所述的生物分析系统，其中基座模块包含一个折叠式反射镜。
在第三十七实施例中，提供了根据第二十二实施例至第二十四实施例中任一项所述的生物分析系统，其中基座模块包含一个加热的盖子。
在第三十八实施例中，提供了根据第二十二实施例至第二十四实施例中任一项所述的生物分析系统，其中基座模块包含一个散热器。
在第三十九实施例中，提供了根据第二十二实施例至第二十四实施例中任一项所述的生物分析系统，其中基座模块包含一个控制系统。
在第四十实施例中，提供了一种生物分析系统，该系统包括一台仪器，该仪器包含一个块组件，该块组件包含一个构造成容纳一个样本固持器的样本块，该样本固持器具有多个反应位点；以及一个能够对来自多个反应位点的荧光发射成像的光学系统；以及一个用于校准所述仪器的校准系统，该校准系统包含一个构造成确定图像中反应位点位置的感兴趣区域(ROI)校准器；一个构造成通过比较荧光染料的原始谱图与荧光染料的纯谱图校准数据来确定各个反应位点处所用荧光染料之贡献的纯染料校准器；一个构造成测定滤光器归一化因子的仪器归一化校准器；一个构造成验证所述仪器能够区分两个不同数量样本的RNase P验证器；以及一个构造成显示校准结果的显示引擎。
在第四十一实施例中，提供了根据第四十实施例所述的生物分析系统，其中ROI校准器构造成根据每个样本孔的荧光阈值估计初始感兴趣区域(ROI)；估计每个ROI的中心位置；估计每个ROI的尺寸；从多个反应位点测定ROI的平均尺寸；导出全局网格模型；将所述全局网格模型应用于ROI，其中该全局网格模型的应用提高了ROI中心位置的精度；恢复丢失的ROI；并且调整ROI的半径，其中该调整改善了所述光学系统的信噪比。
在第四十二实施例中，提供了根据第四十实施例至第四十一实施例中任一项所述的生物分析系统，其中ROI校准器通过最大程度减小以下组中的至少一者来改善反应位点的测定误差：所述多个反应位点内的染料饱和度、网格旋度、放大倍数的变差以及光学径向畸变。
在第四十三实施例中，提供了根据第四十实施例至第四十二实施例中任一项所述的生物分析系统，其中纯染料校准器构造成对装载到仪器的多个通道处的样本固持器成像，该样本固持器包含多个反应位点和多于一种类型的染料，每种染料占据多于一个反应位点；鉴定样本固持器中每种染料的一个峰值通道；将各个通道归一化到每种染料的所述峰值通道；并且产生包括一组染料参比值的染料矩阵。
在第四十四实施例中，提供了根据第四十三实施例所述的生物分析系统，其中校准器构造成对所述样本固持器成像四次，以对四个不同的样本固持器成像。
在第四十五实施例中，提供了根据第四十实施例至第四十四实施例中任一项所述的生物分析系统，其中光学系统包含多个激发滤光器和多个发射滤光器，并且其中仪器归一化校准器构造成确定用于每个激发滤光器和发射滤光器的第一校正因子；计算一对滤光器的第二校正因子，其中每对滤光器包括一个激发滤光器和一个发射滤光器；并且将第二校正因子应用于滤光器数据。
在第四十六实施例中，提供了根据第四十实施例至第四十五实施例中任一项所述的生物分析系统，其中滤光器归一化因子允许对所述仪器的数据与第二仪器的数据进行比较。
在第四十七实施例中，提供了根据第四十实施例至第四十六实施例中任一项所述的生物分析系统，其中RNase P验证器构造成接收来自验证板的扩增数据以生成多条扩增曲线，其中所述验证板包括一个第一数量和一个第二数量的样本，并且每条扩增曲线包括一个指数区域；基于所述多条扩增曲线的指数区域确定一组荧光阈值；对于该组荧光阈值中的每个荧光阈值，确定由第一数量的样本生成之扩增曲线的第一组循环阈值(Ct)以及由第二数量的样本生成之扩增曲线的第二组Ct值；并且基于所述多个荧光阈值中每个荧光阈值的Ct值计算所述第一数量和第二数量是否足以区分开。
在第四十八实施例中，提供了根据第四十实施例至第四十七实施例中任一项所述的生物分析系统，其中RNase P验证器还构造成在显示引擎上显示仪器验证或失败的一条指示。
在第四十九实施例中，提供了根据第四十实施例至第四十八实施例中任一项所述的生物分析系统，还包括一个构造成执行所述多组分数据之实时光谱校准的自动染料校正器；一个构造成确定是否存在板装载错误的板检测器；一个构造成补偿背景变化的自动背景校准器；以及一个构造成使用反射材料来检测荧光发射中的任何变化或变率的仪器规整器。

Claims (4)

1.一种生物分析系统，包括：
一个样本块组件，该组件包含一个构造成容纳一个样本固持器的样本块，该样本固持器构造成接纳多个样本；
一个控制系统，构造成使所述多个样本在一系列温度之间循环；
一个自动托盘，该托盘包含一个滑动组件和一个托盘定位传感器，所述托盘构造成使所述样本块组件可逆地从闭合位置滑动至打开位置，以允许用户接触所述多个样本固持器，所述托盘定位传感器构造成确定所述自动托盘何时达到限定的闭合位置和限定的打开位置；以及
一个加热的盖子，
其中所述样本块组件还包含一个第一突片，所述第一突片构造成阻挡来自所述托盘定位传感器的射光，并且其中所述托盘定位传感器构造成确定所述自动托盘何时达到所述限定的闭合位置，由此使得所述样本块与所述加热的盖子对准；
其中所述加热的盖子包含：
一块下部板，具有一个用于配合所述样本固持器的一个上表面之配对表面，所述配对表面具有多个下部板孔，每个下部板孔与多个块孔中相关联的一个对准以允许激发光传送到所述块孔；
一个加热器；
一块具有多个上部板孔的上部板；
一个盖位置传感器，该盖位置传感器被如此构造以检测所述加热的盖子何时向所述样本固持器的上表面提供一个限定的压力；以及
一个弹簧组件，该弹簧组件包含一个第二突片，并被如此构造以在所述加热的盖子向下移动至所述样本固持器上时接合该样本固持器的上表面，其中所述第二突片被如此构造成以阻挡来自所述盖位置传感器的射光以停止所述加热的盖子的向下移动。
2.根据权利要求1所述的生物分析系统，其中，所述托盘定位传感器为一个光学传感器。
3.根据权利要求2所述的生物分析系统，其中，所述托盘定位传感器为一个光学开关。
4.根据权利要求1所述的生物分析系统，其中，所述盖位置传感器为一个光学传感器。
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