CN107407632B - 用于生物仪器校准的方法和系统 - Google Patents

Abstract

在一个示例性实施例中，提供了一种用于校准仪器的方法(100)。所述仪器包括一个能够对多个反应位点荧光发射进行成像的光学系统。该方法包括执行感兴趣区域(ROI)校准(102)以确定图像中的反应位点位置。该方法还包括执行纯染料校准(108)以通过比较荧光染料的原始谱图与荧光染料的纯谱图校准数据来确定各个反应位点处所用荧光染料的贡献。该方法还包括执行仪器归一化校准(110)以测定滤光器归一化因子。该方法还包括执行RNase P验证(112)以验证仪器能否区分两种不同数量的样本。

Description

用于生物仪器校准的方法和系统

背景技术

一般来讲，简化生物分析系统的安装和设置的需求越来越大，这使得操作人员可更快速高效地使用生物分析系统完成其预期目的。

实验室仪器的安装和校准可能是一个耗时且昂贵的过程。在许多情况下，仪器供应商的工程师必须到现场执行这些过程。其成本通常转嫁给了用户。在一些情况下，经验丰富的用户可使用多步程序成功地校准正常制造的仪器。在此类校准过程中，可以将物理标准和孔板与手动程序结合使用。手动校准处理和数据检查容易出错，并且可能依赖于临时或主观的测量。虽然最终的系统验证步骤可提供接受次优校准的恢复能力，但是在此类活动中，自动化可提供改善的客观性和均匀性。

发明内容

在一个示例性实施例中，提供了一种用于校准仪器的方法。该仪器包括能够对多个反应位点荧光发射成像的光学系统。该方法包括执行感兴趣区域(ROI)校准以确定图像中的反应位点位置。该方法还包括执行纯染料校准以通过比较荧光染料的原始谱图与荧光染料的纯谱图校准数据来确定各个反应位点处所用的荧光染料的贡献。该方法还包括执行仪器归一化校准以测定滤光器归一化因子。该方法还包括执行RNase P验证以验证仪器能否区分两种不同数量的样本。

在另一个示例性实施例中，提供了一种用于校准仪器，编码有处理器可执行指令的计算机可读存储介质。该仪器包括能够对多个反应位点荧光发射成像的光学系统。该指令包括用于执行感兴趣区域(ROI)校准以确定图像中的反应位点位置的指令。该指令还包括用于执行纯染料校准以通过比较荧光染料的原始谱图与荧光染料的纯谱图校准数据来确定各个反应位点处所用的荧光染料的贡献的指令。该指令还包括用于执行仪器归一化校准以测定滤光器归一化因子的指令。该指令还包括用于执行RNase P验证以验证仪器能否区分两种不同数量的样本的指令。

在另一个示例性实施例中，提供了一种用于校准仪器的系统。该仪器包括能够对多个反应位点荧光发射成像的光学系统。该系统包括处理器和编码有处理器可执行指令的存储器。该指令包括用于执行下列操作的指令：执行感兴趣区域(ROI)校准以确定图像中的反应位点位置，以及执行纯染料校准以通过比较荧光染料的原始谱图与荧光染料的纯谱图校准数据来确定各个反应位点处所用的荧光染料的贡献。该指令还包括用于执行下列操作的指令：执行仪器归一化校准以测定滤光器归一化因子，以及执行RNase P验证以验证仪器能否区分两种不同数量的样本。

在另一个示例性实施例中，提供了一种用于校准仪器的系统。该仪器包括能够对多个反应位点荧光发射成像的光学系统。该系统包括ROI校准器，该ROI校准器配置为确定图像中的反应位点位置。该系统还包括纯染料校准器，该纯染料校准器配置为通过比较荧光染料的原始谱图与荧光染料的纯谱图校准数据来确定各个反应位点处所用的荧光染料的贡献。该系统还包括仪器归一化校准器，该仪器归一化校准器配置为测定滤光器归一化因子。该系统还包括RNase P验证器，该RNase P验证器配置为验证仪器能否区分两种不同数量的样本。该系统还包括显示引擎，该显示引擎配置为显示校准结果。

附图说明

图1示出根据本文所述的各种实施例的生物仪器的校准工作流程。

图2为示出PCR仪器200的框图，根据该PCR仪器200可实现本教导内容的实施例。

图3示出根据本文所述的实施例可用于成像的示例性光学系统300。

图4示出用于实现本文所述的各种实施例的示例性计算系统。

图5示出根据本文所述的各种实施例的示例性分布式网络系统。

图6示出qPCR仪器校准中使用的一系列步骤。

图7示出96孔样本容器的感兴趣区域。

图8为校准板的图像，其中FAM染料占据96孔校准板中的每个孔。

图9和图10示出根据本公开的一个实施例的示例性工作流程。

图11A示出根据本公开的一个实施例具有棋盘构形的校准板。

图11B为一块包含FAM、VIC、ROX和SYBR染料的四染料棋盘96孔校准板之图像，该校准板与图11A所示的板1100具有相同的构形。

图12A示出本教导内容的各种实施例中使用的染料混合物。

图12B示出用于本教导内容的各种实施例的纯染料和主通道滤光器组合。

图13示出根据本教导内容的各种实施例在归一化之前染料混合物的％偏差。

图14示出根据本教导内容的各种实施例在归一化之后染料混合物的％偏差。

图15示出根据本教导内容的各种实施例在归一化之后染料混合物的％偏差的近距离视图。

图16为示出根据本教导内容的各种实施例的归一化处理的流程图。

图17示出根据本文所述的各种实施例用于验证仪器的一种示例性方法。

图18示出根据本文所述的各种实施例用于验证仪器的另一种示例性方法。

图19示出根据本文所述的各种实施例由扩增数据确定多个荧光阈值。

图20示出根据本文所述的各种实施例用于验证仪器的系统。

图21示出根据本文所述的各种实施例用于校准仪器的系统。

具体实施方式

用于与本文所述的各种实施例相关的方法的示例性系统包括下列专利申请中所述的那些：美国外观设计专利申请号___(生命技术公司(Life Technologies)，案卷号LTOIOOO DES)，和美国临时专利申请号___(生命技术公司(Life Technologies)，案卷号LT01011 PRO)，和美国临时专利申请号___(生命技术公司(Life Technologies)，案卷号LT01023 PRO)，和美国临时专利申请号___(生命技术公司(Life Technologies)，案卷号LT01025 PRO)，和美国临时专利申请号___(生命技术公司(Life Technologies)，案卷号LT01028 PRO)，和美国临时专利申请号___(生命技术公司(Life Technologies)，案卷号LT01029 PRO)，和美国临时专利申请号___(生命技术公司(Life Technologies)，案卷号LT01032 PRO)，和美国临时专利申请号___(生命技术公司(Life Technologies)，案卷号LT01033 PRO)，所有这些专利申请均提交于2015年2月6日并且全文也以引用方式并入本文中。

为了更全面地理解本发明，以下描述阐述了众多具体细节，诸如具体配置、参数、实例等。然而，应当认识到，此类说明并非旨在限制本发明的范围，而是旨在提供对示例性实施例的更好的描述。

生物分析仪器校准的进步有利于减少操作人员错误、减少操作人员输入、减少校准生物分析仪器及其各种部件所需的时间，实现正确高效的安装。

因此，根据本教导内容的各种实施例，可以将专业知识结合到自动校准和验证系统中，在识别出故障时提供通过/失败状态和故障排除反馈。如果仪器未能通过校准过程，则可以致电服务工程师。本教导内容可最大程度减小安装和校准程序所需的成本和时间。

应当认识到，本文所述的方法和系统可以在各种类型的系统、仪器和机器，诸如生物分析系统中实现。例如，各种实施例可以在对多个样本进行聚合酶链反应(PCR)的仪器、系统或机器中实现。虽然通常适用于对大量样本进行处理的定量聚合酶链反应(qPCR)，但是应当认识到，根据本文所述的各种实施例可使用任何合适的PCR方法。合适的PCR方法包括但不限于例如数字PCR、等位基因特异性PCR、不对称PCR、连接介导PCR、多重PCR、巢式PCR、qPCR、基因组步移和桥式PCR。此外，如本文所用，扩增可包括使用例如热循环仪、等温扩增、热对流、红外介导的热循环或解链酶扩增。

总体校准工作流程

通常依赖生物仪器产生准确可靠的实验数据。生物仪器的定期校准和维护确保仪器处于正常和最佳运行状态，可最大程度提高用户工作效率，通过在潜在问题出现前将其解决而最大程度减少昂贵的维修，并且提高结果质量。

根据本教导内容的各种实施例，本文所述的校准方法可以单独进行，也可以任意组合进行。此外，本文所述的校准方法可以在制造后的初始校准过程中或在初始安装和使用后的任意时间进行。本文所述的校准方法可以例如每周、每月、每半年、每年或根据需要进行。

根据本教导内容中所述的各种实施例，使用诸如感兴趣区域(ROI)校准、背景校准、均匀性校准、纯染料校准、仪器归一化等校准方法来确定每次读数中荧光信号的位置和强度、与每个荧光信号相关联的染料以及信号的意义。另外，根据各种实施例，可以执行自动染料校正、自动背景校准和板检测，以进一步完善检测和染料读数并测定误差。使用RNase P验证的系统也可以自动执行适当性能的仪器验证。

图1示出可以在根据本文所述的各种实施例的仪器上执行的示例性校准工作流程100。应当认识到，校准工作流程100是一个实例，并且本文所述的校准方法可以单独地或作为子集以任何组合和顺序来执行。

在步骤102中，执行ROI校准。一般来说，ROI校准将在检测器的视场中产生限定孔的位置的信息。本教导内容可通过最大程度减少或消除用户干预而自动完成ROI校准。各种实施例可通过提供使用直方图分析和二进制搜索模式确定每个滤光器的最佳曝光时间的方法和系统来实现该过程的自动化。根据本文所述的各种实施例的ROI校准，相比于之前的方法能够更准确地识别图像中的孔并且减少错误。根据各种实施例所述的ROI校准方法和系统如下文所详述。

在步骤104中，执行背景校准。通常，即使不存在发出可检测信号的样本，检测器也将读取一定量的信号。导致背景信号可以非常重要的原因是可以从样本信号读数中扣除背景信号以便获得更准确的样本信号测量结果。可使用一个水板测定每个滤光器/孔组合的背景信号，进行背景校准。该步骤可自动完成以最大程度减少或消除用户干预。可提供将测试是否采用了正确的校准板进行背景校准的自动化操作。例如，步骤104可以查看信号电平并消除使用错误测试板的可能性，诸如在ROI校准中使用发射强信号的测试板。如果信号电平远超出背景的预期电平，将警示用户插入正确的测试板。这一阶段还可通过检查信号电平的宽趋异度来测试测试板中一个或多个孔的污染，如果发现污染，将触发一个警告，指示可能存在脏的或受污染的孔。受污染的孔可导致从所述样本信号电平中扣除不正确的背景信号电平。

在步骤106中，执行均匀性校准。在一些情况下，尽管每个孔中存在等量的荧光染料，但是板几何形状(翘曲、厚度)的变化可导致板上强度读数变化。均匀性校准可校准使用多染色板的仪器，因而可以校正板变化引起的强度变化。步骤106可自动完成并且减少或消除用户干预。该自动化操作的一部分可包括检测错误校准板的使用以及检测和调整校准板中空的或受污染的孔。

在步骤108中，执行纯染料校准。校准qPCR仪器中所用的荧光染料使该仪器软件能够使用由染料标样采集的校准数据来表征和区分每种染料在仪器所采集的总荧光中各自的贡献。根据本教导内容的各种实施例，在一样本运行完成后，该仪器软件呈每个读数的一原始光谱信号形式的数据。该软件通过将每种染料贡献的原始光谱与纯光谱校准数据进行对比来确定每个反应位点中所用每种荧光染料的贡献。当一用户在分析后保存一项实验时，该仪器软件将所述纯光谱与采集的实验荧光数据以及每个孔中每种荧光染料的贡献一起存储。该方法如下文所详述。根据本教导内容的各种实施例，使用纯染料校准，可使用较少的纯校准板，节省用户成本，并且消除校准过程中的误差来源。

在步骤110中，执行仪器归一化校准。研究人员通常面临的一个难题是无法轻松比较在多个仪器上运行得到的实验结果。诸如光源、光学元件和荧光检测器等部件的参数的物理变化可导致可能为完全相同的生物样本的分析结果的变化。因此，始终需要有助于最大程度减少部件变化的方法和装置。

在qPCR中，通过将一种报告染料的信号归一化到相同溶液中的一种被动参比染料来测定扩增曲线。该归一化结果可以被报告为带标记的归一化荧光值或“Rn”。即使总体信号电平受液体体积或总体照明强度的影响，被动参比归一化也能实现一致的Rn值。如果所述报告染料与参比染料之间的信号比率不同，诸如照明光谱中的仪器之间差异，则被动参比归一化无法正常工作。根据本文所述的各种实施例，仪器归一化校准包括从所述染料混合物中读取荧光以得到“归一化因子”到调整Rn值需要另外的费用。

在步骤112中，执行RNase P验证。执行验证测试检查以确定一个仪器是否正常工作。例如，RNase P验证确定一个仪器能否准确区分两个不同数量的样本。过去使用标准曲线手动执行RNase P验证，由用户进行统计计算以验证所述仪器。根据本教导内容所述的各种实施例，可以由系统自动执行RNase P验证，且无需使用标准曲线。RNase P验证的各种实施例如下文所详述。

图21示出根据本文所述的各种实施例用于校准仪器的系统2100。系统2100包括ROI校准器2102、纯染料校准器2104、仪器归一化校准器2108、RNase P验证器2110和显示引擎/GUI 2106。ROI校准器2102配置为测定图像中的反应位点位置。纯染料校准器2104配置为通过对比荧光染料的原始谱图与荧光染料的纯谱图校准数据来确定各个反应位点处所使用荧光染料的贡献。仪器归一化校准器2108配置为测定滤光器归一化因子。RNase P验证器2110配置为验证仪器能否区分两个不同数量的样本。显示引擎2106配置为显示器校准结果。

本教导内容参考实时聚合酶链反应(RT-PCR)仪器进行描述。具体地，本教导内容的一个实施例由采用孔板光学成像的RT-PCR仪器实现。此类仪器能够同时测量来自多个样本或斑点的信号以作分析目的，并且通常需要校准，包括但不限于下列过程：在多组分分析中识别ROI(感兴趣区域)、测定背景信号、均匀性和纯染料光谱校准。校准还可涉及使用具有预期结果的已知样本板的RT-PCR验证反应。本领域的技术人员将理解，虽然本教导内容已经结合有关RT-PCR仪器的实例来描述，但是它们的原理广泛适用于可能需要校准和验证的其他形式的实验室仪器，以确保准确性和/或结果最优化。

PCR仪器

如上文所述，根据各种实施例可利用的仪器包括但不限于聚合酶链反应(PCR)仪器。图2为示出PCR仪器200的框图，根据该PCR仪器200可实现本教导内容的实施例。PCR仪器200可包括加热的盖子210，该加热的盖子210被置于基板(未示出)中所容纳的多个样本212上。在各种实施例中，基板可是具有多个样品区域的玻璃或塑料滑片，其样品区域具有介于样本区域和加热的盖子210之间的盖子。基板的一些实例可包括但不限于多孔板，诸如标准微量滴定96孔、384孔板或微卡，或基本平面载体，诸如玻璃或塑料滑片。在基板的各种实施例中，反应位点可以包括凹陷、凹痕、脊以及它们的组合，在所述基板的表面上形成规则或不规则阵列。PCR仪器的各种实施例包括样本块214、用于加热和冷却的元件216、热交换器218、控制系统220和用户界面222。根据本教导内容的热块组件的各种实施例包括图2所示的PCR仪器200的部件214-218。

实时PCR仪器200具有光学系统224。在图2中，光学系统224可具有发射电磁能量的照明源(未示出)、用于接收来自基板上样本212的电磁能量的光学传感器、检测器或成像器件(未示出)以及用于将电磁能量从每个DNA样本引导至成像器件的光学器件240。对于图2所示的PCR仪器200和图2所示的实时PCR仪器200的实施例，可用控制系统220控制检测器系统、加热的盖子和热块组件的功能。控制系统220可由最终用户通过图2所示的PCR仪器200和图2所示的实时PCR仪器200的用户界面222进行访问。另外，如图2所示的计算机系统200可用于控制图2所示的PCR仪器200的功能以及用户界面功能。另外，图4的计算机系统400可提供数据处理、显示和报告准备功能。所有此类仪器控制功能可局部专用于PCR仪器，或图4的计算机系统400可提供对控制、分析和报告功能中的一部分或全部的远程控制，如随后所详述。

用于成像的光学系统

图3示出根据本文所述的实施例可用于成像的示例性光学系统300。应当认识到，光学系统300为示例性的光学系统，并且本领域中的技术人员将认识到，可以使用其他光学系统捕获目标对象的图像。根据各种实施例，目标对象可为样本固持器，例如本文所述的校准板。光学传感器302包括在相机304中，例如可以对目标对象310成像。光学传感器302可为CCD传感器，并且相机304可为CCD相机。此外，光学传感器包括相机透镜306。

根据目标对象，根据各种实施例，可选择发射滤光器308以对目标对象310进行成像。在其他实施例中，可将发射滤光器308更改为对目标对象发射301的荧光射线进行成像。

光学系统300可使用反射光源312以对目标对象310成像。来自光源312的光可通过非球面314、聚焦器/发散器316和激发滤光器318进行过滤，再由分束器320反射到目标对象310。光学系统300还可包括场透镜322。根据目标对象，根据各种实施例，可选择或改变激发滤光器318以对目标对象310进行成像。

以下关于本教导内容各种实施例的描述旨在供说明和描述之用。其并非详尽无遗，也并不将本教导内容限制为所公开的确切形式。修改和变化可以根据上述教导内容，或者可从本教导内容的实践中习得。此外，所描述的实现包括软件，但本教导内容可以实现为硬件和软件的组合或仅硬件。本教导内容可通过面向对象和非面向对象的编程系统实现。

计算系统

图4为示出根据各种实施例可用于执行处理功能的计算机系统400的框图。执行实验的仪器可以连接至示例性计算系统400。计算系统400可包括一个或多个处理器，诸如处理器404。例如，处理器404可使用通用或专用处理引擎诸如微处理器、控制器或其它控制逻辑部件来实施。在该实例中，处理器404连接至总线402或其他通信媒介。

另外，应当理解，图4的计算系统400可以实现为多种形式中的任一种，诸如机架式计算机、大型机、超级计算机、服务器、客户端、台式计算机、笔记本电脑、平板计算机、手持式计算设备(例如，PDA、蜂窝电话、智能电话、掌上电脑等)、集群网格、上网本、嵌入式系统或给定应用或环境可能期望的或适当的任何其他类型的专用或通用计算设备。另外，计算系统400可包括传统网络系统或与LIS/LIMS基础设施的集成，其中传统网络系统包括客户端/服务器环境和一个或多个数据库服务器。多种传统网络系统在本领域中是已知的，其中包括局域网(LAN)或广域网(WAN)，并且包括无线和/或有线部件。另外，客户端/服务器环境、数据库服务器和网络在本领域中已有充分记载。根据本文所述的各种实施例,计算系统400可以被配置为连接至分布式网络中的一个或多个服务器。计算系统400可接收来自分布式网络的信息或更新。计算系统400还可以传输待存储于分布式网络内的信息，该信息可以由连接至分布式网络的其它客户端来访问。

计算系统400可包括用于传输信息的总线402或其他通信装置，以及与总线402耦合以用于处理信息的处理器404。

计算系统400还包括存储器406，该存储器406可为随机存取存储器(RAM)或其他动态存储器，耦合至总线402，用于存储指令，以供处理器404执行。存储器406还可用于在执行将由处理器404执行的指令的过程中存储临时变量或其它中间信息。计算系统400还包括耦合到总线402用于存储处理器404的静态信息和指令的只读存储器(ROM)408或其他静态存储设备。

计算系统400还可包括存储设备410，诸如提供并且耦合到总线402以存储信息和指令的磁盘、光盘、或固态驱动器(SSD)。存储设备410可包括介质驱动器和移动存储接口。介质驱动器可包括支持固定或移动存储介质的驱动器或其它机构，如硬盘驱动器、软盘驱动器、磁带驱动器、光盘驱动器、CD或DVD驱动器(R或RW)、闪盘驱动器或其它移动或固定介质驱动器。如这些实例所示，存储介质可包括计算机可读存储介质，该计算机可读存储介质中具有特定的计算机软件、指令或数据。

在另选的实施例中，存储设备410可包括其它类似的工具以允许计算机程序或其它指令或数据加载到计算系统400中。此类工具可包括例如移动存储单元和接口，诸如程序盒式存储器和盒式存储器接口、移动存储器(例如，闪速存储器或其它移动存储模块)和存储器插槽，以及用于允许将软件和数据从存储设备410传送至计算系统400的其它移动存储单元和接口。

计算系统400还可包括通信接口418。通信接口418可用于允许软件和数据在计算系统400和外部设备之间传输。通信接口418的实例可包括调制解调器、网络接口(诸如以太网或其它NIC卡)、通信端口(诸如USB端口、RS-232C串行端口)、PCMCIA插槽和PCMCIA卡、蓝牙等。通过通信接口418传送的软件和数据可以是能够由通信接口418接收的电子、电磁、光学及其它信号的形式。这些信号可以由通信接口418通过诸如无线介质、线材或线缆、光纤，或其他通信媒介的信道来发送和接收。信道的一些实例包括电话线、蜂窝电话链路、RF链路、网络接口、局域网或广域网及其它通信信道。

计算系统400可通过总线402耦合到显示器412，诸如阴极射线管(CRT)或液晶显示器(LCD)，该显示器412用于向计算机用户显示信息。例如，包括字母数字键及其它键的输入设备414耦合到总线402，用于将信息和命令选择传输至处理器404。输入设备还可以是具有触摸屏输入能力的显示器，诸如LCD显示器。另一种类型的用户输入设备为光标控制装置416，诸如用于将方向信息和命令选择传递至处理器404并且用于控制光标在显示器412上移动的鼠标、轨迹球或光标方向键。该输入设备通常具有两个轴上的两种自由度以使设备指定平面的位置，所述两个轴为第一轴(例如，x轴)和第二轴(例如，y轴)。计算系统400提供数据处理并且提供此类数据的置信水平。与本教导内容的实施例的某些具体实施一致的是，数据处理和置信度值由计算系统400提供以响应处理器404执行包含在存储器406中的一个或多个指令的一个或多个序列。此类指令可以由另一个计算机可读介质诸如存储设备410读入存储器406中。执行包含在存储器406中的指令序列引起处理器404执行本文所述的过程。另选地，硬连线电路可用于代替软件指令或与软件指令结合以实施本教导的实施例。因此，本教导内容的实施例的具体实施不限于硬件电路和软件的任何特定组合。

本文中使用的术语“计算机可读介质”和“计算机程序产品”通常是指涉及向处理器404提供用于执行的一个或多个序列或一个或多个指令的任何介质。在执行时，通常被称为“计算机程序代码”的此类指令(其可以以计算机程序的形式或其它分组的形式分组)使计算系统400能够执行本发明的实施例的特征或功能。这些及其他形式的非暂态计算机可读介质可采取多种形式，包括但不限于非易失性介质、易失性介质和传输介质。非易失性介质包括例如固态光盘或磁盘，诸如存储设备410。易失性介质包括动态存储器，诸如存储器406。传输介质包括同轴线缆、铜线和光纤，该光纤包括线材，该线材包括总线402。

计算机可读介质的常见形式包括例如软盘(floppy disk)、软磁盘(flexibledisk)、硬盘、磁带、或任何其它磁介质、CD-ROM、任何其它光学介质、穿孔卡、纸带、任何其它具有孔图案的物理介质、RAM、PROM以及EPROM、FLASH-EPROM、任何其它存储器芯片或盒式存储器、如下文所述的载波、或计算机可读取的任何其它介质。

各种形式的计算机可读介质可涉及将一个或多个指令的一个或多个序列携带至用于执行的处理器404。例如，指令最初可携带在远程计算机的磁盘上。远程计算机可将指令加载到其动态存储器中并且使用调制解调器通过电话线路发送指令。计算系统400的本地调制解调器可接收电话线的数据并且使用红外发射器将数据转换为红外信号。耦合到总线402的红外检测器可接收红外信号中携带的数据并且将该数据置于总线402上。总线402将该数据携带至存储器406，处理器404从存储器406中检索并且执行指令。由存储器406接收的指令可选地在处理器404执行之前或执行之后存储于存储设备410上。

应当理解，为清楚起见，上述说明参考不同的功能单元和处理器描述本发明的实施例。然而，显而易见的是，在不脱离本发明的情况下可使用不同的功能单元、处理器或域之间的任何合适的功能分布。例如，示出的由独立的处理器或控制器执行的功能可以由相同的处理器或控制器来执行。因此，对特定功能单元的引用仅应视为对提供所述功能的合适装置的引用，而非指示严格的逻辑或物理结构或组织。

分布式系统

典型的互联网网络配置500的一些元素如图5所示，其中可能处于远程本地办公室中的多个客户端机器502被示出为连接至网关/集线器/隧道服务器等510，网关/集线器/隧道服务器等510本身通过一些互联网服务提供商(ISP)连接510连接到互联网508。还示出了类似地通过ISP连接514连接到互联网508的其他可能的客户端512，其中这些单元与可能的中心实验室或办公室进行通信，例如，通过ISP连接516连接到网关/隧道服务器518，网关/隧道服务器518已连接520至各种企业应用服务器522，其可通过另一个集线器/路由器526连接到各种本地客户端530。这些服务器522中的任一种可用作用于分析本发明中所述的潜在内容管理和传输设计解决方案的开发服务器，下文提供了更为全面的描述。

感兴趣区域(ROI)校准

如上文所述，本教导内容参考实时聚合酶链反应(RT-PCR)仪器进行描述。具体地，本教导内容的一个实施例由采用孔板光学成像的RT-PCR仪器实现。此类仪器能够同时测量来自多个样本或斑点的信号以作分析目的，并且通常需要校准。可能需要校准的过程的一个实例是识别ROI或感兴趣区域。

一般来说，ROI校准可以使用在对应于所有滤光器的每个室中具有强发射的一块板来执行。该过程可以是有用的，因为每个滤光器的ROI可能不同。滤光器之间的ROI差异可以由滤光器和其他滤光器光谱特性中的微小角度差引起。因此，各种实施例执行全滤光器/全孔(PFPR)-ROI校准。这些PFPW-ROI校准用于测定每个滤光器的96孔板中孔的位置。ROI校准可使用诸如美国专利No.6,518,068Bl中所述的自适应掩模制备技术等方法来执行。

本教导内容可通过最大程度减少或消除用户干预而自动完成ROI校准。各种实施例可通过提供使用直方图分析和二进制搜索模式测定每个滤光器的最佳曝光时间的软件来自动完成该过程。曝光时间为捕捉板的一个图像所需的时间量。同样，该值可根据一个滤光器的光谱特征而变化。一般来说，ROI校准将在检测器的视场中产生限定孔的位置的信息。在304中，该信息可存储为掩模文件，其具有对应于不同滤光器的全局掩模或多个掩模。

诸如上文所述的校准过程通常使用行和列投影以及强度分布。这可导致ROI测定结果易受孔内的伪影和饱和度、网格旋转、放大系数的变化和光学径向畸变的影响。因此，有利的是具有更稳定的ROI测定结果，以最大程度减小此类敏感性并且消除检测到的发射数据中的畸变及其他不需要的背景噪音。

背景噪音可指固有的系统噪音及其他不需要的噪音。例如，数据中的一些背景噪音可能是归因于基板的物理来源，诸如灰尘颗粒或划痕。可提供背景噪音的物理来源的另一个实例是固定或包封样本的固持器或壳体。数据中的其他背景噪音可能归因于仪器表面的自然辐射，诸如反射和自然荧光。其他背景噪音也可是例如来自检测发射数据或光源的光学系统所致。

生物仪器可检测数百至数千个样本，所有这些样本的体积可能非常小，比如小于1纳升。因此，其他背景噪音去除方法可以单独使用或结合本文所述的校准方法根据各种实施例来使用，以便能够由样本体积测定和分析发射数据。在一些实施例中，可更准确地测定基板内样本体积的位置以执行更准确的分析。例如，在数字PCR分析中，能够更准确地区分样本体积中的反应与非反应，可得到更准确的结果。根据本文所述的各种实施例，甚至还可区分空孔或通孔与不反应的孔或通孔中的样品体积，其还可与反应的孔或通孔中的样品体积区分开来。

根据本文所述的各种实施例,背景噪音去除可包括图像数据分析和处理。该方法可包括分析图像数据的强度值以内推可从所述基板的图像中去除的背景噪音。通过这种方式，还可确定图像内感兴趣区域的位置。背景噪音去除还可包括从已知包括感兴趣区域的图像区域内推数据。确定图像上的背景噪音后，可从图像数据中扣除背景噪音。

图6示出根据本发明的一个实施例所述的一种示例性计算机模拟方法600。计算机模拟方法600包括计算机可读格式的多组工作流子程序，其可以包括用于生物技术过程的子程序。图6仅为示例性方法，并且本领域的技术人员鉴于本公开将认识到，实际数目的子程序可以从至少约2个子程序变为许多个子程序(例如2-10、2-20、2-30、2-n(其中n可以是3-100、3-1000等任何数量的子程序)。每组子程序310-370可包括单个步骤或任务，或者任选地可包括多于1个步骤或任务，其同样为计算机可读格式，并且每个步骤还可包括另外可选的可定制步骤或任务。每个可选/可定制的步骤或任务可具有一个或多个可由用户查看、审核、设置或定制的可选参数(选项)。在一些实施例中，本发明的计算机模拟方法包括由用户使用图形用户界面(GUI)选择生物技术过程的每个可选/可定制步骤的至少一个参数，以选择用于每个可选/可定制步骤的至少一个参数。在某些实施例中，工作流程的子程序的每个步骤和每个参数都可供用户查看并且可选地编辑。生物信息学程序通常对用户隐藏这些参数和/或步骤中的一部分，导致用户失望和效率低下，当计算机模拟设计实验的结果并非用户预期的结果时尤其如此。

如图6一般性示出的本公开的一种计算机模拟方法可通过下列步骤来进行(执行)：在计算机系统(如图4所示)上生成至少一个方法文件，该方法文件包括用于可定制步骤(A、B、C)的多个子程序(10、20、30或更多)的计算机可读指令，每个可定制步骤可具有可被查看、选择、更改或输入的一个或多个参数；以及利用计算机系统通过计算机模拟执行生物技术过程以获得至少一种生物技术产品，该执行过程包括执行至少一个包括计算机可读指令的方法文件。

在一些实施例中，从默认参数中选择至少一个可定制/可选参数，其中默认参数存储于计算机系统的组件(诸如存储器、数据库等)中。

再次参见图6，计算ROI位置的第一步是由步骤610中的荧光阈值估计初始ROI中心。提供配置为容纳多个生物样本的样本板，并且将其插入能够在PCR过程中分析生物样本的分析仪器中。每个生物样本都包含在一个样本孔中，并且可被一个光源激发，并且可响应于可在预定波长发出荧光的激发，该荧光可由荧光检测器检测。如上文相对于图2所述，光源202可为激光、LED或其他类型的激发源，其能够发射与待由系统200检测的光谱物质相互作用的光谱。另外，生物样本可包括光谱可分辨染料，诸如FAM、SYBR Green、VIC、JOE、TAMRA、NED、CY-3、德克萨斯红、CY-5、ROX(被动参比)或发出能够被检测的信号的任何其他荧光染料中的一种或多种。

在激发生物样本之前，设置输入参数和算法参数以提供ROI测定的起始点。输入参数可包括孔尺寸、孔中心至中心距离、每毫米的光学像素和板布局。所述板布局可包括孔的总数和样本孔的配置。常用的配置可为包括多个行和多个列的矩形阵列，但是本领域的技术人员将理解，该配置可为适合所用仪器的任何几何形状。另外，孔的总数可以变化。本领域的技术人员将熟悉在单个样本板或样品容纳结构中总共包含1个孔到数千个孔的配置。所述ROI查找算法参数可为孔尺寸、孔中心至中心距离和最小圆度设置可接受的范围。圆度是一个计算值，可为周长与面积之比。

一旦确定了输入参数和算法参数，即可利用来自一个适当光源的能量激发多个样本，并且采集样本板中每个样本孔发出的荧光。进一步分析样本板的荧光图像，以基于输入参数和算法参数选择ROI候选项。保存满足参数要求的ROI候选项以供进一步分析，并且在步骤620中测定每个孔的尺寸和圆度。不满足参数要求的ROI候选项可与不发出荧光的任何位置一起被丢弃。进一步评估保留的ROI候选项，以基于孔与孔的间距参数和允许的孔与孔的间距范围参数来确定ROI之间的距离。具有基于孔与孔之间参数彼此靠近的中心的ROI可被视为相同的样本，并且选择具有最佳圆度的ROI作为该孔的ROI。一旦确定了所有的ROI候选项，即可计算平均孔尺寸，在步骤630中将平均值分配给每个样本孔ROI，并且保存初始估计的ROI。

将预期的孔位置布置为基于板布局参数确定的网格图案。该参数可包括孔数、列数和行数，其中每个孔具有基于板布局参数的XY网格坐标的预期的组。现在可对初始估计的ROI进行进一步分析，以更好地定义每个初始ROI的位置，并且可称为全局网格化。全局网格化的第一步是分析初始估计的ROI以查找相邻的ROI。这可以通过基于板布局对ROI之间的中心至中心距离与网格坐标进行比较来确定。然后可基于ROI之间的空间关系来确定每个初始估计的ROI的XY网格坐标。

为提高ROI位置的精度，有利的将中心至中心的ROI坐标与板布局的网格坐标关联起来。这可通过确定并且应用映射函数来实现。映射函数是一对二维二次多项式函数。计算这些函数以将X(或Y)网格位置映射到X(或Y)方向上的ROI中心位置。一旦确定了映射函数，它们即可应用于预期的网格坐标以提供两点益处。首先，可提高ROI中心位置的精度；其次，能够恢复初始ROI查找过程中丢失的ROI。

进一步调整ROI可为光学性能提供附加有益效果。本发明人发现，ROI尺寸与光学系统的信噪比(SNR)之间存在一定关系。本领域的技术人员将知道，有若干公式用于计算电子系统和光学系统的SNR。SNR可通过下列公式1来表征，例如：

其中SNR＝信噪比

Sdye plate＝染料图像中ROI内所有像素密度的总和

SBG＝背景图像中ROI内所有像素密度的总和

Sdye＝染料中ROI内所有像素密度的总和

N＝ROI内像素的数量

offset＝相机偏移量

G＝相机增益

δ2R，y＝读数噪音

使用一个包括六对滤光器的光学系统开展一项实验。每对滤光器包括一个激发滤光器(Xn)和一个发射滤光器(Mn)。每个滤光器对波长的一窄波段敏感，该波段对应于配置为与PCR过程兼容的染料之所述激发频率和发射频率。此外，根据本文所述的教导内容对ROI进行了优化。为研究ROI尺寸对信噪比的影响，使用6对激光器对来自一块96孔样本板的荧光进行检测。每个ROI的半径以1像素为增量逐渐增加。利用公式1计算6对滤光器中的每一个以及每个像素增量的SNR。所述实验结果如下表1所示：

表1

SNR	X1M1	X2M2	X3M3	X4M4	X5M5	X6M6
							ΔR＝0	1709.5	2502.7	1840.3	1613.8	1632.4	475.5
ΔR＝1	1808.2	2642.0	1942.7	1706.3	1709.2	496.8
							ΔR＝2	1826.6	2677.8	1964.2	1722.7	1718.8	491.2
ΔR＝3	1818.7	2678.7	1958.4	1714.4	1708.2	479.0
							ΔR＝4	1802.5	2667.3	1943.1	1697.6	1690.8	464.7

粗体条目表示6对滤光器中的每一个的最高SNR，并且一2像素半径扩展在6对滤光器中提供大约6％SNR的总体改善。

图7示出具有96个孔710的一样本板的一个图像。所述孔710的每一个产生一张荧光图像。在应用本文的教导内容后，对ROI进行优化，并且蓝色圆圈标识每个孔位置的所述ROI。

纯染料校准

如上所述，简化生物分析系统的安装和设置的需求越来越大，这使得操作人员可更快速高效地使用生物分析系统完成其预期目的。此需求在例如校准一生物分析仪器及相关联的部件方面很明显。一种示例性校准是校准用于生物分析系统诸如qPCR系统中荧光检测的荧光染料。

校准qPCR仪器中所用的荧光染料使该仪器软件能够使用由染料标样采集的校准数据来表征和区分每种染料在所述仪器所采集的总荧光中各自的贡献。在一样本运行完成后，该仪器软件接收呈每个读数的一原始光谱信号形式的数据。该软件通过将每种染料贡献的原始光谱与纯光谱校准数据进行对比来确定每个反应位点中所用每种荧光染料的贡献。当一用户在分析后保存一项实验时，该仪器软件将所述纯光谱与采集的实验荧光数据以及每个孔中每种荧光染料的贡献一起存储。

例如，一qPCR仪器中一种染料校准的产物为表示每个反应位点的每种染料标样之所述荧光特征的一系列光谱曲线。每条曲线由一组对应于从诸如一校准板或阵列卡的一个样本固持器的诸如孔等反应位点采集的荧光之光谱所组成。在每种染料的校准之后，仪器软件“提取”每个反应位点处的每种染料的光谱曲线。该软件将每条曲线的所得数据绘制于一张荧光对比滤光器的图中。当该软件提取所述染料校准数据时，它根据整个校准板或阵列卡的总光谱来评估每个孔所产生的荧光信号。如果染料光谱在与它们的组一样在相同的滤光器中产生峰值，但是在其他波长处稍微发散，则该染料光谱通常是可接受的。

在一样本固持器诸如一校准板上运行染料校准时，所述反应位点(例如，孔)通常包含相同浓度的染料以使得在该板的每个孔处生成一个纯光谱值。图8显示一校准板的一个图像，其中一种单一染料(在本例中，为FAM染料)占据一块96孔校准板中的每个孔。这使得能够对运行中每个孔所生成的荧光信号与该孔的一个纯光谱读数进行对比。通过对一校准板的每个孔使用一种单一染料，所述孔的所得信号应当相似。光谱位置和峰位的变化可例如由所述单个孔之间的光学特性和激发能量上的细微差异而引起。在染料校准中考虑这些变化在理论上将获得一个更准确的染料校准。

然而，每个校准板使用单一染料可能费时且复杂，在校准大量染料时尤其如此。荧光染料的非限制性实例包括FAM、VIC、ROX、SYBR、MP、ABY、JUN、NED、TAMRA和CY5。因此，需要简化染料校准过程并且减少校准所需的时间，同时保持染料校准的结果具有相同的质量。

图9和图10示出一个流程图，其中示出根据本文所述的实施例校准一种或多种荧光染料的示例性方法900。方法900的步骤可能由处理器404实现，如图2所示4所示。此外，用于由处理器404执行所述方法的指令可能被存储于存储器406中。

参见图9，在步骤902中，通过将染料加载进一块待处理基板的反应位点中来制备校准板。在本例中，基板为96孔板，但是可以使用不同的基板，包括例如384孔板。在各种实施例中，所述基板可能是具有多个样本区域的一个玻璃或塑料滑片。一块基板的一些实例可能包括但不限于一块多孔板诸如一标准微量滴定96孔板、一384孔板或一微卡，一基本平面载体诸如一玻璃或塑料滑片，或任何其他类型的阵列或微阵列。在一基板的各种实施例中，所述反应位点可能包括孔、凹陷、凹痕、脊以及它们的组合，在所述基板的表面上形成规则或不规则阵列。迄今为止，对孔或板的标引仅为示例性目的，而非以任何方式限制本文可用的反应位点或样本固持器的类型。

所述校准板可以制备成一个棋盘图案，如图11A所示如校准板1100、1120和1140所示，所述板本身可以为96孔形式，但是所述校准板上的孔数可根据需要进行改变，其取决于例如需要校准的染料数量、容纳该样本板的样本块314(见图3)形式，或对不同孔密度的板进行成像的仪器(例如，PCR仪器300)所具备的功能。

染料分布的棋盘图案允许每块校准板对多种染料进行校准。相对于每块校准板校准一种染料，所述棋盘图案有利地允许一用户使用较少的板来校准一个染料组，从而减少染料校准所需的时间和处理步骤。

在图11A所示的实施例中，利用三块板对十种独立的染料进行校准。每块校准板1100/1120/1140被配置为容纳四种不同的染料，这四种染料沿所述板每行中的孔以重复图案交替布置，使得每个孔表示该重复图案中的一种特定染料(存在染料的孔)。例如，板1100将FAM、VIC、ROX和SYBR染料容纳于由孔1102(FAM)、1104(VIC)、1106(ROX)和1108(SYBR)所示出的交替孔中；板1120将一份缓冲液、MP染料、ABY染料和JUN染料容纳于由孔1122(缓冲液)、1124(MP)、1126(ABY)和1128(JUN)所示出的交替孔中；并且板1140将NED染料、TAMRA染料、CY5染料和一份缓冲液容纳于由孔1142(NED)、1144(TAMRA)、1146(CY5)和1148(缓冲液)所示出的交替孔中。在该实施例中，由于仅校准十种染料，因此板1120和1140中使用缓冲液作为孔的填料，其中不容纳待校准的一种染料。

应当理解，图11A和11B中的实施例仅仅为一个实例，并且校准的染料总数、每块板的染料数量以及板数都可基于例如根据用户的校准需要、所述板上的孔数、处理所述校准之仪器的容量而变化。例如，如果要在图11A所示的实施例中校准12种染料，则板1120和1140中将无需缓冲液，因为三块校准板1100/1120/1140中的每块校准板可校准四种染料，总共可校准12种染料。

此外，每块板的染料数量可以为两种或更多种，其中每块板的最多染料数量基于例如所述校准板上的孔数、用以对整块板进行正确建模之仪器的功能(见下文进一步说明)，以及成像系统由所选的板获得可用荧光数据的能力。例如，与图11A所示使用一96孔板相反，可能有一个足够稳定的仪器及相关联的成像系统能够支持使用一384孔校准板。在提供附加孔密度的情况下，每块板可以校准更多种染料，例如每板16种染料，并且仍可获得所需的每种染料(例如，24)相同数量的数据点(即，存在染料的孔)以获得足够的全局模型(如下文所详述)。例如，对于一384孔板，使用两块板可校准10种染料，并且每块板可校准5种染料。

甚至样本固持器的类型和反应位点的类型也可能影响合适的染料的数量。如上文所述，可使用其他类型的样本固持器和反应位点进行校准。

返回图9，在步骤904中，可将制得的棋盘状校准板装载进所述仪器中。一次可装载进一个仪器中的板数取决于所用仪器的功能和容量。例如，一个具有一96孔块的标准qPCR热循环仪每次仅容纳一块校准板。然而，多块热循环仪可能提供多个块，每个块各自容纳一块校准板。此外，如果不使用一校准板，则根据所用的样本固持器的形式(例如，微阵列或微芯片阵列)，可以一个单一仪器中使用例如一个适用于所述仪器的加载组件容纳多个样本固持器。

在图9的步骤906中，该仪器使用其相关联的光学成像系统(参见例如图3)连续或并行采集所述已装载校准板或板的图像。所采集的图像及相关联的数据可存储于例如图4中计算系统400的存储器406或存储设备410上。该光学成像系统可在每个光学通道处采集每块板的图像。通道的数量取决于所述成像系统中所提供的激发和发射滤光器的数量。例如，对于一个具有6个激发滤光器(X滤光器)和6个发射滤光器(M滤光器)的成像系统，通道的总数为21个，用下列滤光器组合来表示：X1Ml、X1M2、X1M3、X1M4、X1M5、X1M6、X2M2、X2M3、X2M4、X2M5、X2M6、X3M3、X3M4、X3M5、X3M6、X4M4、X4M5、X4M6、X5M5、X5M6和X6M6。每个通道处所采集的图像或曝光的数量可以是变化的。例如，所述成像系统可在每个通道中采集两个图像或曝光。拍摄的图像数量或曝光次数取决于用户需求，因为每个通道拍摄较少的图像或曝光可能减少采集图像或曝光所需的时间，而每个通道拍摄较多的图像或曝光则更有可能获得高质量数据。

在图9的步骤908中，该仪器使用从所述光学成像系统(参见例如图3)采集的图像或曝光中所收集的数据，识别所述校准板上每种染料的峰通道。每个反应位点的这一峰通道是其中所分析的特定染料在该反应位点表现出最强荧光的通道。峰通道识别可能发生在例如95％或更多的反应位点被染料占用时，在此例中允许在校准过程中存在不超过5％的异常反应位点。允许的异常值百分比可以是变化的。然后可以从将来的计算和分析中剔除异常反应位点。异常值可能发生在例如装载错误的染料、染料被装载为不正确的配置、染料的装载不正确或光学部件变脏(例如，灰尘颗粒)的情况下。可通过例如计算系统400的处理器404利用存储器406中存储的数据识别所述校准板上每种染料的峰通道。识别结果可存储于例如计算系统400的存储器406或存储设备410上。

或者，可通过使用本领域中已知背景和均匀性校准方法测定的背景组分和均匀性校准因子，在峰通道识别之前进行背景和均匀性校正，以对从光学成像系统采集的每个反应位点上每种滤光器组合的图像或曝光中所收集的荧光数据进行校正。

在图9的步骤910中，该仪器使用从所述光学成像系统(参见例如图2)采集的图像或曝光中所收集的数据，针对所有存在染料的孔，将每个通道归一化到步骤908的所述已识别的峰通道。通过例如计算系统200的处理器404利用存储器406中存储的数据可将每个通道归一化到所识别的峰通道。所述归一化的结果可存储于例如计算系统400的存储器406或存储设备410上。

所有存在染料的孔均给出了一个基线量值，由该基线量值进行归一化。一般来讲，该量值越大，则检测到的荧光越强。因此，一种给定染料的已识别峰通道将具有所述存在染料的孔中的该染料之最大量值，峰通道异常值除外。不管该峰通道中的量值如何，为了归一化，该通道处的该量值被重置为1。然后根据峰通道的重置值1来调整其他通道处相同染料的剩余量值。例如，如果对于染料X，峰通道A在所述孔中具有一个100的量值，并且其他通道B在所述孔中具有一个40的量值，则在归一化时，峰通道A被设置为1.0，并且通道B被设置为0.40。此归一化值也被称为校准系数，如上文所述，该峰通道的校准系数被设置为1.0。

在图11A和图11B所示的实施例中，其中四种染料均匀分散于一块96孔板的孔中，每种染料存在染料的孔数为24个。存在染料的孔数可由于前文所述的原因而变化，所述原因诸如所述样本固持器(例如，校准板)上反应位点(例如，孔)的数量、分散于所述样本固持器上的染料数量。例如，在一块96孔板上，如果分散三种染料，则每种染料存在染料的孔数为32个。如果所述96孔板上分散有六种染料，则每种染料存在染料的孔数为16个。

现在参见图10，在步骤912中，该仪器对每种染料的所有孔进行全局建模。为校准一种样本固持器形式的所有孔的一种染料，该仪器可使用一种特定染料的所述存在染料的孔中之数据对所有孔建模，包括不含特定染料的孔。通过计算系统400的处理器404使用存在染料的孔中特定染料的数据进行全局建模，可对所有孔进行建模。所得的模型可存储于例如存储器406或存储设备410上。参见图11A，对于存在于板1100的24个孔1102中的所述FAM染料，该板上的其他112孔将不存在FAM染料。相同的24个存在/72个不存在的分布将适用于图11A中的每种染料。不存在染料的孔数取决于存在染料的孔数，如上文所述，存在染料的孔数可取决于多种因素。无论如何，一块给定板上存在染料的孔和不存在染料的孔的总和等于该板上的孔数。图11B为一块包含FAM、VIC、ROX和SYBR染料的四染料棋盘96孔校准板之图像，该校准板与图11A所示的板1100具有相同的构形。

在一个另选的实施例中，该仪器对所有通道或具有例如大于已识别峰通道0.01％或1％的归一化值的那些通道进行全局建模。对于低于此阈值的那些通道，该仪器将执行局部建模(见图10的步骤922)而非执行全局建模。在某些通道处电平如此之低的情况下，全局建模可能变得不必要，在此情况下检测到的荧光主要是例如噪音或其他干扰的结果，而不是被校准的实际染料的贡献。

一种全局建模算法可用于染料校准中，以基于所述测定的存在特定染料的孔的染料校准系数导出每种染料的每个滤光器通道的染料校准系数之模型。例如，如果所述96孔棋盘状板上存在特定染料的孔为24个，则全局建模利用这24个孔的染料校准系数导出包括其他检测到不存在染料的72个孔在内的所有孔的校准系数，从而生成针对每种染料每个通道的整块板的模型。

二维(2D)二次多项式函数是可用作染料校准因子的全局模型的函数的一个实例。其他全局建模函数是已知的，并且可用于本文中。可使用一个非线性最小二乘法求解器以通过最大程度减小模型残差(出于所述模型所计算的值与测定的染料校准系数之差)，从测定的特定存在染料的孔的染料校准系数来导出2D二次多项式函数。Levenberg-Marquardt置信域算法可用作此求解器中的优化算法。但是本文可以使用许多其他优化算法，另一个实例是Dogleg方法，该方法的关键在于使用高斯-牛顿和Cauthy方法以计算优化步骤从而优化非线性对象。此方法使用称为置信域的搜索空间之子集上的模型函数(通常为二次式)近似得到目标函数。如果该模型函数成功使真实的目标函数最小化，则置信域得到扩展。相反，如果近似结果不理想，则缩小该域并且再次应用所述模型函数。一个损失函数，例如，也可能用以减小高残差(计算得到的校准系数和测定的校准系数之间的最大差值)的影响。这些高残差通常基于所述优化构成异常值。

在图10的步骤914中，针对一种给定染料和多种染料对所有孔建模后，该仪器执行一次拟合优度(GOF)检验。这样可确保所述全局建模步骤足够可靠。通过例如计算系统400的处理器404使用存储于例如存储器406或存储设备410中的结果，可执行一次GOF检验。拟合优度的量度通常总结了观测值与所考虑的模型之预期值之间的差异。GOF可通过多种方式测定，包括例如确定系数R平方和均方根误差(RMSE)值。例如，R平方是一个统计量，可提供有关一个模型之拟合优度的一些信息。在回归分析中，所述R平方确定系数是一种统计量度，涉及的是回归线接近实际数据点的程度。一个R平方等于1指示所述回归线与数据完全吻合。RMSE是观测值与所考虑的模型之预期值之间的差异或残差的均方的平方根。RMSE是所述模型之预测精度的一个良好衡量标准。一个RMSE等于0指示模型预期的值与观测值精确匹配。

在图10的步骤916中，如果拟合良好，则该仪器在图9的步骤918中输出一个染料矩阵。在统计学上拟合良好的结果可发生在以下情况下：例如在R平方分析中，当R平方值大于或等于0.85时；或RMSE值为例如小于或等于0.01时，如图10所示。可通过例如计算系统200的处理器204创建染料矩阵并且输出到显示器212。

在图10的步骤920中，如果拟合结果不佳，则仪器在图10中的步骤922中执行局部建模。这可能是必要的，例如，如果一次GOF校验的计算所得R值小于0.85以及例如RMSE值大于0.01。通过计算系统400的处理器404使用所述存在染料的孔中之一种特定染料的数据对剩余不存在染料的孔进行建模。所得的模型可存储于例如存储器406或存储设备410上。

局部建模方法可包括例如使用所述校准因子，这些校准因子来自所述板上相同染料之周围存在染料的孔。例如，为对一种特定染料测定一个不存在染料的孔之校准因子值，所述局部模型可以取周围孔的一个5×5局部窗口内或整个板中相同染料的所有特定存在染料的孔之中值。测定该中值直至完成该板的一个完整建模。然后所述局部建模输出可替代全局建模输出。

在局部建模完成时，该染料矩阵足以使得仪器在图10的步骤918中输出染料矩阵。此染料矩阵用作每种经校准染料之所述荧光特征图的一个分布图。在每次运行后，该仪器软件接收呈每个读数的一原始光谱信号形式的数据。仪器通过比较所述原始光谱与染料矩阵的纯光谱校准数据来确定每次反应中所用荧光染料的贡献。仪器使用从染料标样(即，染料矩阵)所采集的校准数据来表征和区分每种染料在该仪器所采集的总荧光中的单独贡献。

仪器归一化校准

当前，包括约30000个人类基因的基因组学分析是基础及应用生物化学和药物研究的一个主要焦点。此类分析可能有助于开发多种疾病的诊断、药物和疗法。然而，人类基因组的复杂性和基因相互关联的功能往往使得这项任务非常困难。研究人员通常面临的一个难题是无法轻松比较在多个仪器上运行得到的实验结果。诸如光源、光学元件和荧光检测器等部件的参数的物理变化可导致可能为完全相同的生物样本的分析结果的变化。因此，始终需要有助于最大程度减少部件变化的方法和装置。

在qPCR中，通过将一种报告染料的信号归一化到相同溶液中的一种被动参比染料来测定扩增曲线。报告基因染料的实例可包括但不限于FAM、SYBR绿、VIC、JOE、TAMRA、NEDCY-3、德克萨斯红、CY-5。被动参比的一个实例可以为但不限于ROX。该归一化结果可以被报告为带标记的归一化荧光值或“Rn”。即使总体信号电平受液体体积或总体照明强度的影响，被动参比归一化也能实现一致的Rn值。如果所述报告染料与参比染料之间的信号比率不同，诸如照明光谱中的仪器之间差异，则被动参比归一化无法正常工作。为解决这一问题，可制备归一化溶液，以对报告基因与被动参比的比率进行归一化。此类归一化溶液的一个实例可以为50:50FAM和ROX的混合物，该混合物可称为“FAM/ROX”归一化溶液。

这种现有的仪器归一化方法包括读取来自所述染料混合物的荧光以得到调整Rn值所需的“归一化因子”，其需要额外的费用。通常，该方法需要制备归一化溶液和归一化板，并且花费时间运行额外的校准。另外，此方法仅适用于利用一个标准的成对滤光器组进行校准的所述染料混合物。一个成对滤光器组可以是一激发滤光器和一发射滤光器的一个组合。本领域的技术人员应当理解，加入另外的染料将需要不同的归一化溶液和校准。

制备归一化溶液的生产过程还导致染料响应的变化。已发现，由于缺乏一个绝对荧光标准，因此难以控制染料浓度。为最大程度减小这些误差和变化，可能有利的是将所述溶液的染料比目标设置在所需混合物的+/-15％以内，或者设置在所述生产过程中所需混合物的+/-10％以内。该生产过程通常不能得到足够控制，故无法简单地混制一种50:50的染料混合物并满足这些规格，因此在该过程中需要额外的步骤以采用一个荧光计对所述染料混合物进行调节。

通过研究染料混合物和Ct的变化之间的关系，确定了上文所公开的可接受的百分比变化。C_t为“阈值循环”的常用缩写。定量PCR(qPCR)可提供一种测定一个样本中所存在一种靶序列或一种基因的量的方法。在PCR过程中，一个生物样本要经受一系列35或40个温度循环。一个循环可具有多种温度。对于每个温度循环，目标序列的数量在理论上可以加倍，且取决于本文未提及的多种因素。由于所述目标序列包含荧光染料，因此随着靶序列的量增加，即在35或40个温度循环中扩增，所述样本溶液在每个热循环中发出越来越亮的荧光。通过荧光检测器测量的荧光量通常被称为“阈值”，并且检出荧光的循环数量称为“阈值循环”或Ct。因此通过了解扩增效率和Ct，即可测定原始样本中靶序列的量。

上述容许的百分比变化也可能与仪器中C_t偏移的标准偏差有关。已经确定，染料混合物的+/-15％变化可导致0.2Ct的标准偏差，其可以为2倍标准偏差。

如上文所述，期望可靠地比较多台仪器的实验结果，仪器与仪器之间的变异性常常是一个问题。这种变异性可以由两个来源产生：仪器内部件的变异，例如灯和滤光器，以及随时间的推移例如灯和滤光器老化的变异。实现一种可以可靠、容易和廉价地比较多个仪器之实验结果的过程将十分有利。本文所述的教导内容公开了此一过程。

光学系统中样本的荧光信号的量可取决于若干因素。部分此类因素可包括但不限于所述荧光的波长、荧光波长处的检测器效率、所述发射滤光器的效率、所述激发滤光器的效率和所述染料的效率。本教导内容表明，如果仪器的物理光学元件可以归一化，则仪器与仪器之间变异性可以最小化。

在一个实施例中，归一化因子可以从纯染料光谱而非染料混合物导出。纯染料可以比染料混合物更容易制造，因为浓度不必精确，并且仅含一种荧光组分。这一概念通过使用10种纯染料对一台仪器中的2个滤光器组进行归一化来测试，并将结果与使用染料混合物获得的归一化结果进行比较。通过测定每个激发滤光器和发射滤光器的一个校正因子来实现所述归一化。所得的校正因子可用以对染料的任何组合进行归一化，即使来自不同仪器也可实现。

在另一个实施例中，上文教导的归一化方法适用于多种不同类型的仪器。制备8种染料混合物溶液和10种纯染料溶液。将每种溶液移入三块96孔板的8个孔中。通过移入每个其他孔中，可最大程度减小潜在的空间串扰。所用的染料混合物如图12A所示，且所用的纯染料如图4B所示。此外，使用的仪器包括6组滤光器。图12B还标识出每种纯染料的主光学通道的所述滤光器对。所述激发滤光器以一个“X”示出，且所述发射滤光器以一个“M”示出。

为了所述量化归一化过程的有效性，在归一化前后测量染料比。图13示出根据17台经验定仪器之平均比率的染料混合物百分比偏差。这些仪器标记于所述X轴上，而该百分比偏差标记于所述Y轴上。本领域的技术人员将注意到，这些仪器之间的偏差通常大于前文所述的+/-15％的期望值。因此，此数据表明需要改善归一化过程诸如当前的教导内容。

将当前的教导内容应用于所有17台仪器。所述归一化方法测定每个单个滤光器而非每个染料比的一个校准因子。由于这些仪器提供了6个激发滤光器和6个发射滤光器，因此测定了12个因子。结果如图16和流程图1600所示。在步骤1605中，在多种滤光器组合下，生成了多种染料的校准光谱。对于被归一化的所述仪器，存在10种纯染料和21个滤光器组合。在步骤1610中，对所述光谱进行归一化，因此最大信号为1。在步骤1615中，对多个孔的所述染料光谱进行平均。这一平均化将使每种染料生成一幅光谱。总而言之，所述染料光谱可以称为包含染料和滤光器组合的一个染料矩阵“M”。此时，鉴别出一个参比仪器。该参比仪器为一台仪器或一个仪器组，所述测试仪器将归一化为该仪器或仪器组。该测试仪器中所用相同组的染料光谱可以由所述参比仪器获得。在一些实施例中，所述参比仪器可为一组仪器。在此一实施例中，可在所述组中对每种染料的光谱进行平均化。此步骤由流程图1600中的步骤1620来表示。例如，所述参比光谱可称为矩阵“Mref”。

在步骤1625中，12个滤光器中的每个滤光器具有初始设置为1的调整因子。期望的是，将调整因子乘以矩阵“M”，同时在0和最小值之间迭代地修改调整因子，优选地在0.04和1之间，直至矩阵“M”和矩阵Mref之差最小化，如步骤1630所示。在步骤1635中，计算每个滤光器对的校正因子。每个滤光器对的该校正因子是所述发射滤光器因子与激发滤光器因子的乘积。主通道滤光器对如图4B所示。一旦确定了每个滤光器对的所述校正因子，即在所述测试仪器以及纯染料光谱中，将每个滤光器对因子乘以所述荧光数据。然后将经过校正的纯染料光谱重新归一化到一个最大值1，如步骤1645所示。在该过程的最后一步(步骤1650)中，生成多组分数据。本领域技术人员将理解，该多组分方法是所述荧光数据与染料矩阵之伪逆的乘积。该多组分值已经被归一化，由于数据已经被归一化到滤光器电平，因此无需进行特定染料校正。

完成归一化后，针对所有17台仪器，根据所述平均比率计算了染料混合物的％偏差。结果如图14所示。这些结果相比于图13所示归一化之前的数据得到明显改善。归一化数据的近距离视图如图15所示，其中归一化之后的偏差已经减小值+/8％，远低于前文所述的+/-15％的目标值。

RNase P验证

如上所述，务必要验证仪器以确保其工作正常，在新安装或多次使用后尤其如此。通过这种方式，用户可能确保实验结果和分析准确可靠。以前，由用户对该仪器进行一项验证测定，并且该用户基于验证分析的扩增数据手动进行数据分析以验证所述仪器。由于所述数据分析由用户手动进行，因此该验证过程更容易出错且花费的时间更多。

根据本教导内容的各种实施例，提供了自动验证方法和系统。一项验证测定的一个实例是一项RNase P测定。然而，如本文所用，验证测定可能为具有已知且可靠性质并且可用以验证一台仪器的任何测定。

在安装和经过多次使用后，验证仪器是否正常工作非常重要。通常，一个用户将手动运行一项已知测定以验证一台仪器，诸如一项RNase P测定。所述RNase P基因是对RNaseP酶的RNA部分进行编码的一个单拷贝基因。尤其由于其已知性质和特性，因而通常用作一项验证测定。

在一块验证板上预先装载检测和定量分析样本的基因组拷贝所需的试剂。例如，在一块RNase P验证板中，每个孔中包含PCR主混合物、RNase P引物、FAM^TM染料标记的探针以及一个已知浓度的人类基因组DNA模板。

在传统的RNase P测定示例中，根据由一组重复测定标准品(1250、2500、5000、10000和20000个拷贝)获得的C_t(循环阈值)值生成一条标准曲线。然后该标准曲线被用以测定两组已知模板的拷贝数(5000个和10000个重复群体)。如果能够证明该仪器有能力对在一个单孔中运行的一个后续样本以99.7％的置信水平区分5000个和10000个基因组等同物，那么该仪器将验证成功。

要通过安装，仪器必须证实有能力在对单孔中运行的后续样本以99.7％的置信水平区分5000个和10000个基因组当量。

根据各实施例，本教导内容可以将专业知识结合到自动校准和验证系统中，在识别出故障时提供通过/失败状态和故障排除反馈。如果一台仪器未能通过所述验证过程，则该用户可以例如致电维修工程师。本教导内容可最大程度减小安装和校准程序所需的成本和时间。

如上所述，根据本文所述的各种实施例，验证分析的目标是确认该仪器是否充分可区分相同样本的两个数量。通过这种方式，可以验证仪器性能。

根据本教导内容的各种实施例，提供了一个自动验证方法和系统。由系统分析和比较验证测定的循环阈值(Ct)以确定仪器是否充分可区分两种数量的样本。一项验证测定的一个实例是所述RNase P测定。在此实例中，系统确定针对5000个和10000个基因组拷贝的RNase P样本生成的C_t值，以确定5000个和10000个基因组拷贝的数据是否充分可区分。根据本文所述的实施例，充分可区分是指5000个和10000个基因组拷贝扩增数据相差至少3倍标准偏差(3σ)(～99.7％)。根据各种实施例所述的方法如下文参见图17和图18进一步所述。

图17示出根据本文所述的各种实施例用于验证仪器的一种示例性方法。一般而言，在步骤1702开始时，通过接收来自一块验证测定板的扩增数据来生成多条扩增曲线，每条扩增曲线对应于所述板上的一个孔。

板包含多个孔。在一些实施例中，板包含96个孔。在其它实施例中，板包含384个孔。所述板中的一部分孔中可包含一第一数量的一个样本，并且板中的另一部分孔可包含一第二数量的一个样本。所述第一数量和第二数量是不同的。在本文所述的各种实施例中，所述第二数量大于第一数量。在一些实施例中，所述第二数量可能为第一数量的1.5倍。在其他实施例中，所述第二数量可能为第一数量的2倍。根据本文所述的各种实施例，所述第二数量可能为第一数量的任意倍。在一些实施例中，所述第一数量可能为每个孔5000个基因组拷贝，并且第二数量可能为每个孔10000个基因组拷贝。

重新参见图17，在步骤1704中，基于所述多条生成的扩增曲线测定多个荧光阈值。比较所述多条扩增曲线的指数区域以确定该指数区域下降的荧光值的范围。例如，确定从所述多条扩增曲线的指数区域底部的最低荧光值到该指数区域顶部的最高荧光值的荧光值范围。根据本教导内容的实施例，所述荧光值范围用于所述多条扩增曲线的自动分析中以验证该仪器。

参见图19，示出多条扩增曲线以及荧光值和对应循环阈值之范围的测定。所述多条扩增曲线中的每条均包括该曲线的一个指数区域。轴1902指示荧光值。轴1904示出循环次数。荧光范围1906示出从所述多个指数区域中的一个指数区域的一个已测定底部的最低荧光值到所述多个指数区域中的一个指数区域的一个已测定顶部的最高荧光值之荧光值范围。根据各种实施例，荧光值的范围均由一个预定数值均分，以便由所述系统生成一组用于自动分析的荧光值。在一个实例中，荧光值的范围1906由100均分，以确定一组荧光阈值的100个荧光值。在一些实施例中，剔除最高的5个荧光值和最低的5个荧光值，使得以一组90个荧光阈值进行分析。

重新参见图17，在步骤1706中，对于所述荧光值组中的每个荧光值，测定根据包含所述样本之第一数量的孔所生成的所述多条扩增曲线中的每条扩增曲线的循环阈值(C_t)。相似地，对于所述荧光值组中的每个荧光值，测定根据包含所述样本之第二数量的孔所生成的所述多条扩增曲线中的每条扩增曲线的循环阈值(C_t)。

在步骤1708中，使用所述组中每个荧光值的第一数量和第二数量的C_t值，确定第一数量和第二数量是否充分可区分。根据各种实施例，充分可区分意指使用公式(1)使所述组中的至少一个荧光值得到正的结果：

((μC_tquant1-3σC_tquant1)-(μC_tquant2+3σC_tquant2)) (1)

公式1确定第一数量和第二数量是否充分可区分，根据本文所述的实施例，其中quant2大于quantl。充分可区分意指第一数量和第二数量的C_t值相差至少3倍标准偏差(3σ)(～99.7％)。如果发现所述数量充分可区分，则向该用户提供一则仪器验证通过的指示。

图18示出根据本文所述的各种实施例用于验证仪器的另一种示例性方法。在步骤1802中，接收来自一块验证板的孔中所包含的多个样本的扩增数据。所述验证板中的一部分孔包含一种具有一个第一数量的样本。所述验证板中的另一部分孔包含一种具有一个第二数量的样本。所述第一数量和第二数量是不同的。在一些实施例中，所述第二数量可能为第一数量的1.5倍。在其他实施例中，所述第二数量可能为第一数量的2倍。根据本文所述的各种实施例，所述第二数量可能为第一数量的任意倍。在一些实施例中，所述第一数量可能为每个孔5000个基因组拷贝，并且第二数量可能为每个孔10000个基因组拷贝。

在步骤1804中，基于所述多条生成的扩增曲线测定第一组荧光阈值。比较所述多条扩增曲线的指数区域以确定该指数区域下降的荧光值的范围。例如，确定从所述多条扩增曲线的指数区域底部的最低荧光值到该指数区域顶部的最高荧光值的荧光值范围。根据本教导内容的实施例，所述荧光值范围用于所述多条扩增曲线的自动分析中以验证该仪器。

根据各种实施例，荧光值的范围均由一个预定数值均分，一遍由系统生成一组用于自动分析的荧光值。在一个实例中，荧光值的范围1906由100均分，以确定一组荧光阈值的100个荧光值。在一些实施例中，剔除最高的5个荧光值和最低的5个荧光值，使得以一组90个荧光阈值进行分析。

在步骤1806中，对于所述组中的每个荧光阈值，扩增曲线的第一组C_t值对应于测定的第一数量。相似地，对于所述组中的每个荧光阈值，扩增曲线的第二组C_t值对应于测定的第一数量。所述组中的每个荧光阈值均重复这种关系。

在一些实施例中，进行进一步计算之前，从每组C_t中去除预先确定数量的异常C_t值。例如，在一些实施例中，如果使用96孔板，则从每组C_t值中去除6个异常值。异常值为距离该组C_t值之平均值最远的C_t值。又如，如果使用364孔板，则从每组C_t值中去除10个异常值。去除异常值后，在该方法剩余的步骤中使用每组中剩余的C_t值。

在步骤1808中，计算每组C_t值的平均值。换句话讲，对于在步骤1804中测定的组的每个荧光阈值，计算第一数量扩增曲线的第一C_t平均值，并且计算第二数量扩增曲线的第二C_t平均值。

类似于步骤1808，在步骤1810中，计算每组C_t值的3倍标准偏差。换言之，对于在步骤1804中所测定的组的每个荧光阈值，计算所述第一数量扩增曲线的一个第一3倍标准偏差，并且计算所述第二数量扩增曲线的一个第二3倍标准偏差。

为确定第一数量和第二数量的C_t值是否为荧光值处充分可区分的C_t值，根据各种实施例，对C_t值进行比较。根据各种实施例，采用公式(2)进行比较。

((μC_tquant1-3σC_tquant1)-(μC_tquant2-3σC_tquant2))。

根据本文所述的实施例，公式2确定第一数量和第二数量是否充分可区分。充分可区分意指所述第一数量和第二数量的C_t值相差至少3倍标准偏差(3σ)(-99.7％)。

在步骤1814中，对采用公式(2)得到的组中所有荧光阈值的结果进行比较以确定最大值。如果该最大值为正数，则仪器可充分辨识第一数量和第二数量，并且在步骤1816中向用户提供仪器验证通过的指示。如果该最大值为负数，则仪器无法充分辨识第一数量和第二数量，并且在步骤1818中向用户提供仪器验证失败的指示。

图20示出根据本文所述的各种实施例用于校准仪器的系统2000。系统2000包括PCR仪器接口2002、C_t数据库2004、显示引擎/GUI2006、C_t计算器2008和验证器2010。

PCR仪器接口2002接收来自PCR的扩增数据以生成扩增曲线。如上所述，该PCR仪器对所述验证板中包含的样本进行扩增。该验证板包括包含第一数量的样本的孔的一部分以及包含第二数量的样本的孔的另一部分。PCR仪器接口2002接收由样本扩增生成的荧光数据。

在步骤1704和步骤1804中测定一组荧光阈值后(分别参见图17和图18)，C_t计算器2006计算对应于分别由第一数量和第二数量的样本生成的扩增曲线的第一组和第二组C_t值。计算该组荧光阈值中的每个荧光阈值的第一组和第二组C_t值。所述多组C_t值存储于C_t数据库2004中。

验证器2010确定第一数量和第二数量是否充分可区分，如图17的步骤1708以及图18的步骤1810和1812所示。

显示引擎/GUI显示将所述多条扩增曲线显示给用户。另外，在验证器2010确定第一数量和第二数量是否充分可区分后，显示引擎/GUI 2006向用户显示验证通过或验证失败的指示。

另外，可确定最佳荧光阈值。根据各种实施例，提供可以确定最佳荧光阈值的方法，其方法为选择在一定范围内导致最大分离度的C_t值，其范围为(μC_tquant1+3σC_tquant1)到(μC_tquant2+3σC_tquant2)之间。此外，最佳荧光阈值也可以基于导致测定的异常值数量最少的C_t值来选择。最佳荧光阈值也可以基于在具有最少数量已确定异常值的一定范围内导致最大分离度的C_t值来选择，其范围为(μC_tquant1-3σC_tquant1)到(μC_tquant2+3σC_tquant2)之间。

自动染料校正

根据本教导内容的各种实施例，可以使用自动染料校正方法对多组分数据进行实时光谱校正。自动染料校正可以实时执行或在采集扩增数据和二次分析后执行。在所述自动染料校正算法中，生成多组分相关矩阵。根据各种实施例，一次自动染料校正算法调整了所述染料矩阵的元素，从而最大程度减少多组分相关矩阵中的非对角项。通过这种方式，最大程度减小了C_t测定的误差。

自动背景校准

根据本教导内容的各种实施例，可以进行自动背景校准以减少对背景校准板的需要并且提高背景校正的总体效率。

在所述仪器使用中产生的块(颗粒物或化学物质)中的物理污染物可能会对系统的分析结果产生负面影响，通过人为导致由污染影响的分析孔的某些光谱分量提高而实现。一次重新校准可解决这一问题。然而，为延长所需校准之间的周期，描述了一种在背景校准之后自动计算/补偿背景变化的方法。为完成自动背景校准，执行一种使用空/未占据块的方法。针对耗材的有效信号渗通是已知的(由经验确定)，并且有效的背景校准斜率和偏移可使用缩放因子来近似，该缩放因子解决了有效的信号渗通。

板检测

根据本文所述的各种实施例，可执行板检测方法以识别仪器中板布置的错误。

在仪器使用过程中，系统的光学器件位于行程的上限(空闲期间)或下限(运行期间)。根据设计，所述硬件无法读出介于行程限值之间的中间位置处的光学器件位置；因此，无法依靠电机位置值来确定板或管存在与否(其中光学器件的位置差异将由存在的管或板增加的材料厚度引起)。在板或管检测中无需采用另外的部件(诸如，按压开关或定位传感器)，所述系统中的检测相机即可用于样本检测。然而，由于仅通过使用离散和分离的孔透镜阵列(阵列中的每个透镜聚焦并收集来自一个孔和仅来自一个孔的光)来捕获块区域的一小部分，因此无法采集一张捕获整个块区域的耗材平面的传统“照片”进行图像处理。由于仅采集每个孔的聚焦光并且在所述检测器上表现为圆形亮斑，因此在检测到的图像中不存在空间或动态范围。然而，如果所述光学器件移动至允许聚焦在一个容器的密封件或盖子上的中间位置，则该焦点可被捕获为反射图像(与荧光形成对比，荧光是由系统采集的正常信号)，并且用于板/管检测。所述焦点将小于孔，并且相对于孔的尺寸将在捕获的图像中显示出一块小的明亮区域(称为研究区域，ROI)。根据本文所述的各种实施例，应当理解，焦点将产生亮像素并且所有其他区域将产生较暗的像素，对所述像素级信息的数值分析可得到存在与否的结果。

使用反射材料进行仪器归一化

根据本教导内容的各种实施例，使用诸如光电二极管等反射材料的仪器归一化可用于在完成制造或安装后的任何初始校准之后对仪器进行自动校准。

根据各种实施例，在制造过程中测量稳定的反射材料作为对照。可以将该反射材料置于加热的盖子之上。随后，可在所有通道中测量该稳定的反射材料以检测任何变化或变异。任何变化或变异均可用于调整色彩平衡因子，如上文在仪器归一化校准方法中所述，以对激发光的变化进行重新归一化。

实例

在实例1中，提供了一种用于校准仪器的方法，其中所述仪器包括能够对多个反应位点的荧光发射进行成像的光学系统，该方法包括：执行感兴趣区域(ROI)校准以确定图像中的反应位点位置；执行纯染料校准以通过比较荧光染料的原始谱图与荧光染料的纯谱图校准数据来确定各个反应位点处所用的荧光染料的贡献；执行仪器归一化校准以测定滤光器归一化因子；以及执行RNase P验证以验证仪器能否区分两种不同数量的样本。

在实例2中，提供了实例1所述的方法，其中ROI校准包括：根据每个样本孔的荧光阈值估计初始感兴趣区域(ROI)；估计每个ROI的中心位置；估计每个ROI的尺寸；测定多个反应位点的ROI的平均尺寸；导出全局网格模型；将全局网格模型应用于ROI，其中全局网格模型的应用提高了ROI中心位置的精度；恢复丢失的ROI；并且调整ROI的半径，其中该调整改善了光学系统的信噪比。

在实例3中，提供了实例1所述的方法，其中ROI校准通过最大程度减小以下组中的至少一者来改善反应位点的测定误差：所述多个反应位点内的染料饱和度、网格旋转、放大倍数的变化以及光学径向畸变。

在实例4中，提供了实例1所述的方法，其中纯染料校准包括：在多于一个通道中对装载到仪器中的样本固持器成像，该样本固持器包括多个反应位点和多于一种类型的染料，每种染料占据多于一个反应位点；鉴定该样本固持器中每种染料的峰通道；将每种染料的各个通道相对于峰通道归一化；并且产生包括一组染料参比值的染料矩阵。

在实例5中，提供了实例4所述的方法，其中对样本固持器执行四次成像以对四个不同的样本固持器进行成像。

在实例6中，提供了实例1所述的方法，其中光学系统包括多个激发滤光器和多个发射滤光器，并且其中仪器归一化校准包括：确定用于每个激发滤光器和发射滤光器的第一校正因子；计算一对滤光器的第二校正因子，其中每对滤光器包括一个激发滤光器和一个发射滤光器；并且将第二校正因子应用于滤光器数据。

在实例7中，提供了实例1所述的方法，其中滤光器归一化因子允许对来自该仪器的数据与来自第二仪器的数据进行比较。

在实例8中，提供了实例1所述的方法，其中RNase P验证包括：接收来自验证板的扩增数据以生成多条扩增曲线，其中验证板包括第一数量和第二数量的样本，并且每条扩增曲线包括指数区域；基于所述多条扩增曲线的指数区域确定一组荧光阈值；对于该组荧光阈值中的每个荧光阈值，确定由第一数量的样本生成的扩增曲线的第一组循环阈值(C_t)以及由第二数量的样本生成的扩增曲线的第二组C_t值；并且基于所述多个荧光阈值中每个荧光阈值的C_t值计算第一数量和第二数量是否足以区分开。

在实例9中，提供了实例1所述的方法，其中RNase P验证由连接至仪器的处理器来执行。

在实例10中，提供了实例8所述的方法，其中RNase P验证还包括：在显示屏上显示仪器验证或失败的指示。

在实例11中，提供了实例1所述的方法，还包括：执行多组分数据的实时光谱校准的自动染料校正；执行板检测以确定是否存在板装载错误；执行自动背景校正以补偿背景变化；以及使用反射材料执行仪器归一化以检测荧光发射中的任何变化或变异。

在实例12中，提供了用于校准仪器的系统，其中仪器包括包括能够对多个反应位点的荧光发射进行成像的光学系统，所述用于校准仪器的系统包括：处理器；以及编码有处理器可执行指令的存储器，该指令包括用于下列操作的指令：执行感兴趣区域(ROI)校准以确定图像中的反应位点位置；执行纯染料校准以通过比较荧光染料的原始谱图与荧光染料的纯谱图校准数据来确定各个反应位点处所用的荧光染料的贡献；执行仪器归一化校准以测定滤光器归一化因子；以及执行RNase P验证以验证仪器能否区分两种不同数量的样本。

在实例13中，提供了实例12所述的方法，其中用于ROI校准的指令包括用于下列操作的指令：根据每个样本孔的荧光阈值估计初始感兴趣区域(ROI)；估计每个ROI的中心位置；估计每个ROI的尺寸；测定多个反应位点的ROI的平均尺寸；导出全局网格模型；将全局网格模型应用于ROI，其中全局网格模型的应用提高了ROI中心位置的精度；恢复丢失的ROI；以及调整ROI的半径，其中该调整改善了光学系统的信噪比。

在实例14中，提供了实例12所述的方法，其中ROI校准通过最大程度减小以下组中的至少一者来改善反应位点的测定误差：所述多个反应位点内的染料饱和度、网格旋转、放大倍数的变化以及光学径向畸变。

在实例15中，提供了实例12所述的方法，其中用于纯染料校准的指令包括用于下列操作的指令：在多于一个通道中对装载到仪器中的样本固持器成像，该样本固持器包括多个反应位点和多于一种类型的染料，每种染料占据多于一个反应位点；鉴定样本固持器中每种染料的峰通道；将每种染料的各个通道相对于峰通道归一化；以及产生包括一组染料参比值的染料矩阵。

在实例16中，提供了实例15所述的方法，其中对样本固持器执行四次成像以对四个不同的样本固持器进行成像。

在实例17中，提供了实例12所述的方法，其中光学系统包括多个激发滤光器和多个发射滤光器，并且其中仪器归一化校准包括：确定用于每个激发滤光器和发射滤光器的第一校正因子；计算一对滤光器的第二校正因子，其中每对滤光器包括一个激发滤光器和一个发射滤光器；并且将第二校正因子应用于滤光器数据。

在实例18中，提供了实例12所述的方法，其中滤光器归一化因子允许对来自该仪器的数据与来自第二仪器的数据进行比较。

在实例19中，提供了实例12所述的方法，其中用于RNase P验证的指令包括用于下列操作的指令：接收来自验证板的扩增数据以生成多条扩增曲线，其中验证板包括第一数量和第二数量的样本，并且每条扩增曲线包括指数区域；基于所述多条扩增曲线的指数区域确定一组荧光阈值；对于该组荧光阈值中的每个荧光阈值，确定由第一数量的样本生成的扩增曲线的第一组循环阈值(C_t)以及由第二数量的样本生成的扩增曲线的第二组C_t值；以及基于所述多个荧光阈值中每个荧光阈值的C_t值计算第一数量和第二数量是否充分可区分。

在实例20中，提供了实例12所述的方法，其中RNase P验证由连接至仪器的处理器来执行。

在实例21中，提供了实例19所述的方法，其中用于RNase P验证的指令还包括用于下列操作的指令：在显示屏上显示仪器验证或失败的指示。

在实例22中，提供了实例12所述的方法，还包括用于下列操作的指令：执行多组分数据的实时光谱校准的自动染料校正；执行板检测以确定是否存在板装载错误；执行自动背景校正以补偿背景变化；以及使用反射材料执行仪器归一化以检测荧光发射中的任何变化或变异。

在实例23中，提供了一种用于校准仪器的编码有处理器可执行指令的计算机可读存储介质，其中仪器包括能够对多个反应位点的荧光发射进行成像的光学系统，所述指令还包括用于下列操作的指令：执行感兴趣区域(ROI)校准以确定图像中的反应位点位置；执行纯染料校准以通过比较荧光染料的原始谱图与荧光染料的纯谱图校准数据来确定各个反应位点处所用的荧光染料的贡献；执行仪器归一化校准以测定滤光器归一化因子；以及执行RNase P验证以验证仪器能否区分两种不同数量的样本。

在实例24中，提供了实例23所述的方法，其中用于ROI校准的指令包括用于下列操作的指令：根据每个样本孔的荧光阈值估计初始感兴趣区域(ROI)；估计每个ROI的中心位置；估计每个ROI的尺寸；测定多个反应位点的ROI的平均尺寸；导出全局网格模型；将全局网格模型应用于ROI，其中全局网格模型的应用提高了ROI中心位置的精度；恢复丢失的ROI；以及调整ROI的半径，其中该调整改善了光学系统的信噪比。

在实例25中，提供了实例23所述的方法，其中ROI校准通过最大程度减小以下组中的至少一者来改善反应位点的测定误差：所述多个反应位点内的染料饱和度、网格旋转、放大倍数的变化以及光学径向畸变。

在实例26中，提供了实例23所述的方法，其中用于纯染料校准的指令包括用于下列操作的指令：在多于一个通道中对装载到仪器中的样本固持器成像，该样本固持器包括多个反应位点和多于一种类型的染料，每种染料占据多于一个反应位点；鉴定样本固持器中每种染料的峰通道；将每种染料的各个通道相对于峰通道归一化；以及产生包括一组染料参比值的染料矩阵。

在实例27中，提供了实例26所述的方法，其中对样本固持器执行四次成像以对四个不同的样本固持器进行成像。

在实例28中，提供了实例23所述的方法，其中光学系统包括多个激发滤光器和多个发射滤光器，并且其中用于仪器归一化校准的指令包括用于下列操作的指令：确定用于每个激发滤光器和发射滤光器的第一校正因子；计算一对滤光器的第二校正因子，其中每对滤光器包括一个激发滤光器和一个发射滤光器；并且将第二校正因子应用于滤光器数据。

在实例29中，提供了实例23所述的方法，其中滤光器归一化因子允许对来自该仪器的数据与来自第二仪器的数据进行比较。

在实例30中，提供了实例23所述的方法，其中用于RNase P验证的指令包括用于下列操作的指令：接收来自验证板的扩增数据以生成多条扩增曲线，其中验证板包括第一数量和第二数量的样本，并且每条扩增曲线包括指数区域；基于所述多条扩增曲线的指数区域确定一组荧光阈值；对于该组荧光阈值中的每个荧光阈值，确定由第一数量的样本生成的扩增曲线的第一组循环阈值(C_t)以及由第二数量的样本生成的扩增曲线的第二组C_t值；以及基于所述多个荧光阈值中每个荧光阈值的C_t值计算第一数量和第二数量是否充分可区分。

在实例31中，提供了实例23所述的方法，其中RNase P验证由连接至仪器的处理器来执行。

在实例32中，提供了实例30所述的方法，其中用于RNase P验证的指令还包括用于下列操作的指令：在显示屏上显示仪器验证或失败的指示。

在实例33中，提供了实例23所述的方法，还包括用于下列操作的指令：执行多组分数据的实时光谱校准的自动染料校正；执行板检测以确定是否存在板装载错误；执行自动背景校正以补偿背景变化；以及使用反射材料执行仪器归一化以检测荧光发射中的任何变化或变异。

在实例34中，提供了一种用于校准仪器的系统，其中所述仪器包括能够对多个反应位点的荧光发射进行成像的光学系统，所述用于校准仪器的系统包括：配置为确定图像中的反应位点位置的感兴趣区域(ROI)校准器；配置为通过比较荧光染料的原始谱图与荧光染料的纯谱图校准数据来确定每个反应位点处所用荧光染料的贡献的纯染料校准器；配置为测定滤光器归一化因子的仪器归一化校准器；配置为验证仪器能否区分两种不同数量的样本的RNase P验证器；以及配置为显示校准结果的显示引擎。

在实例35中，提供了实例34所述的系统，其中ROI校准器被配置为：根据每个样本孔的荧光阈值估计初始感兴趣区域(ROI)；估计每个ROI的中心位置；估计每个ROI的尺寸；测定多个反应位点的ROI的平均尺寸；导出全局网格模型；将全局网格模型应用于ROI，其中全局网格模型的应用提高了ROI中心位置的精度；恢复丢失的ROI；并且调整ROI的半径，其中该调整改善了光学系统的信噪比。

在实例36中，提供了实例34所述的系统，其中ROI校准器通过最大程度减小以下组中的至少一者来改善反应位点的测定误差：所述多个反应位点内的染料饱和度、网格旋转、放大倍数的变化以及光学径向畸变。

在实例37中，提供了实例34所述的系统，其中纯染料校准器被配置为：在多于一个通道中对装载到仪器中的样本固持器成像，该样本固持器包括多个反应位点和多于一种类型的染料，每种染料占据多于一个反应位点；鉴定样本固持器中每种染料的峰通道；将每种染料的各个通道相对于峰通道归一化；并且产生包括一组染料参比值的染料矩阵。

在实例38中，提供了实例37所述的系统，其中校准器被配置为对样本固持器成像四次以对四个不同的样本固持器进行成像。

在实例39中，提供了实例34所述的系统，其中光学系统包括多个激发滤光器和多个发射滤光器，并且其中仪器归一化校准器被配置为：确定用于每个激发滤光器和发射滤光器的第一校正因子；计算一对滤光器的第二校正因子，其中每对滤光器包括一个激发滤光器和一个发射滤光器；并且将第二校正因子应用于滤光器数据。

在实例40中，提供了实例34所述的方法，其中滤光器归一化因子允许对来自该仪器的数据与来自第二仪器的数据进行比较。

在实例41中，提供了实例34所述的系统，其中RNase P验证器被配置为于：接收来自验证板的扩增数据以生成多条扩增曲线，其中验证板包括第一数量和第二数量的样本，并且每条扩增曲线包括指数区域；基于所述多条扩增曲线的指数区域确定一组荧光阈值；对于该组荧光阈值中的每个荧光阈值，确定由第一数量的样本生成的扩增曲线的第一组循环阈值(C_t)以及由第二数量的样本生成的扩增曲线的第二组C_t值；以及基于所述多个荧光阈值中每个荧光阈值的C_t计算第一数量和第二数量是否足以区分开。

在实例42中，提供了实例41所述的系统，其中RNase P验证器还被配置为：在显示引擎上显示仪器验证或失败的指示。

在实例43中，提供了实例34所述的系统，还包括被配置为执行多组分数据的实时光谱校准的自动染料校正器；配置为确定是否存在板装载错误的板检测器；配置为补偿背景变化的自动背景校准器；以及配置为使用反射材料来检测荧光发射中的任何变化或变异的仪器规整器。

在另选的实例44中，提供了一种用于校准仪器的方法，其中仪器包括能够对多个反应位点的荧光发射进行成像的光学系统，该方法包括：执行感兴趣区域(ROI)校准以确定图像中的反应位点位置；执行纯染料校准以通过比较荧光染料的原始谱图与荧光染料的纯谱图校准数据来确定各个反应位点处所用的荧光染料的贡献；执行仪器归一化校准以测定滤光器归一化因子；以及执行RNase P验证以验证仪器能否区分两种不同数量的样本。

在实例45中，提供了用于校准仪器的系统，其中仪器包括包括能够对多个反应位点的荧光发射进行成像的光学系统，所述用于校准仪器的系统包括：处理器；以及编码有处理器可执行指令的存储器，该指令包括用于下列操作的指令：执行感兴趣区域(ROI)校准以确定图像中的反应位点位置；执行纯染料校准以通过比较荧光染料的原始谱图与荧光染料的纯谱图校准数据来确定各个反应位点处所用的荧光染料的贡献；执行仪器归一化校准以测定滤光器归一化因子；以及执行RNase P验证以验证仪器能否区分两种不同数量的样本。

在实例46中，提供了一种用于校准仪器的编码有处理器可执行指令的计算机可读存储介质，其中仪器包括能够对多个反应位点的荧光发射进行成像的光学系统，所述指令还包括用于下列操作的指令：执行感兴趣区域(ROI)校准以确定图像中的反应位点位置；执行纯染料校准以通过比较荧光染料的原始谱图与荧光染料的纯谱图校准数据来确定各个反应位点处所用的荧光染料的贡献；执行仪器归一化校准以测定滤光器归一化因子；以及执行RNase P验证以验证仪器能否区分两种不同数量的样本。

在实例47中，提供了一种用于校准仪器的系统，其中所述仪器包括能够对多个反应位点的荧光发射进行成像的光学系统，所述用于校准仪器的系统包括：配置为确定图像中的反应位点位置的感兴趣区域(ROI)校准器；配置为通过比较荧光染料的原始谱图与荧光染料的纯谱图校准数据来确定每个反应位点处所用荧光染料的贡献的纯染料校准器；配置为测定滤光器归一化因子的仪器归一化校准器；配置为验证仪器能否区分两种不同数量的样本的RNase P验证器；以及配置为显示校准结果的显示引擎。

在另选的实例48中，提供了实例44、实例45、实例46、实例47或任一前述实例所述的方法，其中ROI校准包括：根据每个样本孔的荧光阈值估计初始感兴趣区域(ROI)；估计每个ROI的中心位置；估计每个ROI的尺寸；测定多个反应位点的ROI的平均尺寸；导出全局网格模型；将全局网格模型应用于ROI，其中全局网格模型的应用提高了ROI中心位置的精度；恢复丢失的ROI；并且调整ROI的半径，其中该调整改善了光学系统的信噪比。

在另选的实例49中，提供了实例44、实例45、实例46、实例47或任一前述实例所述的方法，其中ROI校准通过最大程度减小以下组中的至少一者来改善反应位点的测定误差：所述多个反应位点内的染料饱和度、网格旋转、放大倍数的变化以及光学径向畸变。

在另选的实例50中，提供了实例44、实例45、实例46、实例47或任一前述实例所述的方法，其中纯染料校准包括：在多于一个通道中对装载到仪器中的样本固持器成像，该样本固持器包括多个反应位点和多于一种类型的染料，每种染料占据多于一个反应位点；鉴定样本固持器中每种染料的峰通道；将每种染料的各个通道相对于峰通道归一化；并且产生包括一组染料参比值的染料矩阵。

在另选的实例51中，提供了实例44、实例45、实例46、实例47、实例50或任一前述实例所述的方法，其中对样本固持器执行四次成像以对四个不同的样本固持器进行成像。

在另选的实例52中，提供了实例44、实例45、实例46、实例47或任一前述实例所述的方法，其中光学系统包括多个激发滤光器和多个发射滤光器，并且其中仪器归一化校准包括：确定用于每个激发滤光器和发射滤光器的第一校正因子；计算一对滤光器的第二校正因子，其中每对滤光器包括一个激发滤光器和一个发射滤光器；并且将第二校正因子应用于滤光器数据。

在另选的实例53中，提供了实例44、实例45、实例46、实例47或任一前述实例所述的方法，其中滤光器归一化因子允许对来自该仪器的数据与来自第二仪器的数据进行比较。

在另选的实例54中，提供了实例44、实例45、实例46、实例47或任一前述实例所述的方法，其中RNase P验证包括：接收来自验证板的扩增数据以生成多条扩增曲线，其中验证板包括第一数量和第二数量的样本，并且每条扩增曲线包括指数区域；基于所述多条扩增曲线的指数区域确定一组荧光阈值；对于该组荧光阈值中的每个荧光阈值，确定由第一数量的样本生成的扩增曲线的第一组循环阈值(C_t)以及由第二数量的样本生成的扩增曲线的第二组C_t值；并且基于所述多个荧光阈值中每个荧光阈值的C_t值计算第一数量和第二数量是否充分可区分。

在另选的实例55中，提供了实例44、实例45、实例46、实例47或任一前述实例所述的方法，其中RNase P验证由连接至仪器的处理器来执行。

在另选的实例56中，提供了实例44、实例45、实例46、实例47、实例54或任一前述实例所述的方法，其中RNase P验证还包括：在显示屏上显示仪器验证或失败的指示。

在另选的实例57中，提供了实例44、实例45、实例46、实例47或任一前述实例所述的方法，还包括：执行多组分数据的实时光谱校准的自动染料校正；执行板检测以确定是否存在板装载错误；执行自动背景校正以补偿背景变化；以及使用反射材料执行仪器归一化以检测荧光发射中的任何变化或变异。

用于与本文所述的各种实例相关的方法的示例性系统包括下列专利申请中所述的那些：

·美国外观设计专利申请号29/516,847，提交于2015年2月6日；和

·美国外观设计专利申请号29/516,883，提交于2015年2月6日；和

·美国临时专利申请号62/112,910，提交于2015年2月6日；和

·美国临时专利申请号62/113,006，提交于2015年2月6日；和

·美国临时专利申请号62/113,077，提交于2015年2月6日；和

·美国临时专利申请号62/113,058，提交于2015年2月6日；和

·美国临时专利申请号62/112,964，提交于2015年2月6日；和

·美国临时专利申请号62/113,118，提交于2015年2月6日；和

·美国临时专利申请号62/113,212，提交于2015年2月6日；和

·美国专利申请号___(生命技术公司(Life Technologies)，案卷号LT01011)，提交于2016年2月5日；和

·美国专利申请号___(生命技术公司(Life Technologies)，案卷号LT01023)，提交于2016年2月5日；和

·美国专利申请号___(生命技术公司(Life Technologies)，案卷号LT01025)，提交于2016年2月5日；和

·美国专利申请号___(生命技术公司(Life Technologies)，案卷号LT01028)，提交于2016年2月5日；和

·美国专利申请号___(生命技术公司(Life Technologies)，案卷号LT01029)，提交于2016年2月5日；和

·美国专利申请号___(生命技术公司(Life Technologies)，案卷号LT01032)，提交于2016年2月5日；和

·美国专利申请号___(生命技术公司(Life Technologies)，案卷号LT01033)，提交于2016年2月5日，

所有这些专利申请全文也以引用方式并入本文中。

尽管已经相对于某些示例性实施例、实例和应用描述了各种实施例，但是对于本领域的技术人员来讲显而易见的是，在不脱离本教导内容的情况下可以进行各种修改和更改。

Claims (39)

1.一种用于校准仪器的方法，其中所述仪器包括一个能够对多个反应位点发射的荧光进行成像的光学系统，所述方法包括：

执行感兴趣区域(ROI)校准以确定图像中的反应位点位置，其中所述ROI校准减小以下反应位点的测定误差的组中的至少一者：所述多个反应位点内的染料饱和度、网格旋转、放大倍数的变化以及光学径向畸变；

执行纯染料校准以通过比较所述荧光染料的原始谱图与所述荧光染料的纯谱图校准数据，来确定各个反应位点处所用的荧光染料的贡献；

执行仪器归一化校准以测定滤光器归一化因子；以及

执行验证测定以验证所述仪器能否区分两种不同数量的样本，

其中，所述ROI校准包括：

根据每个样本孔的荧光阈值估计初始感兴趣区域(ROI)；

估计每个ROI的中心位置；

估计每个ROI的尺寸；

测定多个反应位点的ROI平均尺寸；

推导出全局网格模型；

将所述全局网格模型应用于ROI；

恢复丢失的ROI；并且

调整ROI的半径。

2.根据权利要求1所述的方法，其中，所述验证测定包括RNase P基因的测定。

3.根据权利要求1所述的方法，其中，所述纯染料校准包括：在多于一个通道中对装载到仪器中的样本固持器成像，所述样本固持器包括多个反应位点和多于一种类型的染料，每种染料占据多于一个反应位点；

识别所述样本固持器中每种染料的峰通道；

将每种染料的每个通道相对于所述峰通道归一化；并且

产生包括一组染料参比值的染料矩阵。

4.根据权利要求3所述的方法，其中，对所述样本固持器执行四次成像以对四个不同的样本固持器进行成像。

5.根据权利要求1所述的方法，其中，所述光学系统包括多个激发滤光器和多个发射滤光器，并且其中所述仪器归一化校准包括：

确定用于每个所述激发滤光器和发射滤光器的第一校正因子；

计算一对滤光器的第二校正因子，其中每对滤光器包括一个激发滤光器和一个发射滤光器；并且

将所述第二校正因子应用于滤光器数据。

6.根据权利要求1所述的方法，其中，所述滤光器归一化因子允许对来自所述仪器的数据与来自第二台仪器的数据进行比较。

7.根据权利要求1所述的方法，其中，所述验证测定包括：

接收来自一块验证板的扩增数据以生成多条扩增曲线，其中所述验证板包括第一数量和第二数量的样本，且每条扩增曲线均包括一个指数区域；

基于所述多条扩增曲线的指数区域确定一组荧光阈值；

对于该组每一个荧光阈值，确定所述第一数量样本生成的扩增曲线的第一组循环阈值(C_t)和所述第二数量样本生成的扩增曲线的第二组C_t值；并且

基于所述多个荧光阈值中每个荧光阈值的C_t值计算所述第一数量和所述第二数量是否充分可区分。

8.根据权利要求1所述的方法，其中，所述验证测定由连接至所述仪器的处理器来执行。

9.根据权利要求7所述的方法，其中，所述验证测定还包括：

在显示屏上显示仪器验证或失败的指示。

10.根据权利要求1所述的方法，进一步包括：

执行多组分数据的实时光谱校准的自动染料校正；

执行板检测以确定是否存在板装载错误；

执行自动背景校准以补偿背景变化；以及

使用反射材料执行仪器归一化以检测荧光发射中的任何变化或变异。

11.一种用于校准仪器的系统，其中所述仪器包括一个能够对多个反应位点荧光发射进行成像的光学系统，所述用于校准仪器的系统包括：

一个处理器；以及

编码有处理器可执行指令的存储器，所述指令包括用于下列操作的指令：

执行感兴趣区域(ROI)校准以确定图像中的反应位点位置，其中所述ROI校准减小以下反应位点的测定误差的组中的至少一者：所述多个反应位点内的染料饱和度、网格旋转、放大倍数的变化以及光学径向畸变；

执行纯染料校准以通过比较所述荧光染料的原始谱图与所述荧光染料的纯谱图校准数据，来确定各个反应位点处所用的荧光染料的贡献；

执行仪器归一化校准以测定滤光器归一化因子；以及

执行验证测定以验证所述仪器能否区分两种不同数量的样本，

其中，所述用于ROI校准的指令包括用于下列操作的指令：

根据每个样本孔的荧光阈值估计初始感兴趣区域(ROI)；

估计每个ROI的中心位置；

估计每个ROI的尺寸；

测定多个反应位点的ROI平均尺寸；

推导出全局网格模型；

将所述全局网格模型应用于ROI；

恢复丢失的ROI；并且

调整ROI的半径。。

12.根据权利要求11所述的系统，其中，所述验证测定包括RNase P基因的测定。

13.根据权利要求11所述的系统，其中，所述用于纯染料校准的指令包括用于下列操作的指令：

在多于一个通道中对装载到仪器中的样本固持器成像，所述样本固持器包括多个反应位点和多于一种类型的染料，每种染料占据多于一个反应位点；

识别所述样本固持器中每种染料的峰通道；

将每种染料的每个通道相对于所述峰通道归一化；并且

产生包括一组染料参比值的染料矩阵。

14.根据权利要求13所述的系统，其中，对所述样本固持器执行四次成像以对四个不同的样本固持器进行成像。

15.根据权利要求11所述的系统，其中，所述光学系统包括多个激发滤光器和多个发射滤光器，并且其中所述仪器归一化校准包括：

确定用于每个所述激发滤光器和发射滤光器中的第一校正因子；

计算一对滤光器的第二校正因子，其中每对滤光器包括一个激发滤光器和一个发射滤光器；并且

将所述第二校正因子应用于滤光器数据。

16.根据权利要求11所述的系统，其中，所述滤光器归一化因子允许对来自所述仪器的数据与来自第二仪器的数据进行比较。

17.根据权利要求11所述的系统，其中，所述用于验证测定的指令包括用于下列操作的指令：

接收来自一块验证板的扩增数据以生成多条扩增曲线，其中所述验证板包括第一数量和第二数量的样本，且每条扩增曲线均包括一个指数区域；

基于所述多条扩增曲线的指数区域确定一组荧光阈值；

对于该组每一个荧光阈值，确定所述第一数量样本生成的扩增曲线的第一组循环阈值(C_t)和所述第二数量样本生成的扩增曲线的第二组C_t值；并且

基于所述多个荧光阈值中每个荧光阈值的C_t值计算所述第一数量和所述第二数量是否充分可区分。

18.根据权利要求11所述的系统，其中，所述验证测定由连接至所述仪器的处理器来执行。

19.根据权利要求17所述的系统，其中，所述用于验证测定的指令还包括用于下列操作的指令：

在显示屏上显示仪器验证或失败的指示。

20.根据权利要求11所述的系统，还包括用于下列操作的指令：

执行多组分数据的实时光谱校准的自动染料校正；

执行板检测以确定是否存在板装载错误；

执行自动背景校准以补偿背景变化；以及

使用反射材料执行仪器归一化以检测荧光发射中的任何变化或变异。

21.一种编码有用于校准仪器的处理器可执行指令的计算机可读存储介质，其中所述仪器包括一个能够对多个反应位点的荧光发射进行成像的光学系统，所述指令还包括用于下列操作的指令：

执行感兴趣区域(ROI)校准以确定图像中的反应位点位置，其中所述ROI校准减小以下反应位点的测定误差的组中的至少一者：所述多个反应位点内的染料饱和度、网格旋转、放大倍数的变化以及光学径向畸变；

执行纯染料校准以通过比较所述荧光染料的原始谱图与所述荧光染料的纯谱图校准数据，来确定各个反应位点处所用的荧光染料的贡献；

执行仪器归一化校准以测定滤光器归一化因子；以及

执行验证测定以验证所述仪器能否区分两种不同数量的样本，

其中，所述用于ROI校准的指令包括用于下列操作的指令：

根据每个样本孔的荧光阈值估计初始感兴趣区域(ROI)；

估计每个ROI的中心位置；

估计每个ROI的尺寸；

测定多个反应位点的ROI平均尺寸；

推导出全局网格模型；

将所述全局网格模型应用于ROI；

恢复丢失的ROI；并且

调整ROI的半径。

22.根据权利要求21所述的计算机可读存储介质，其中，所述验证测定包括RNase P基因的测定。

23.根据权利要求21所述的计算机可读存储介质，其中，所述用于纯染料校准的指令包括用于下列操作的指令：

在多于一个通道中对装载到仪器中的样本固持器成像，所述样本固持器包括多个反应位点和多于一种类型的染料，每种染料占据多于一个反应位点；

识别所述样本固持器中每种染料的峰通道；

将每种染料的每个通道相对于所述峰通道归一化；并且

产生包括一组染料参比值的染料矩阵。

24.根据权利要求23所述的计算机可读存储介质，其中，对所述样本固持器执行四次成像以对四个不同的样本固持器进行成像。

25.根据权利要求21所述的计算机可读存储介质，其中，所述光学系统包括多个激发滤光器和多个发射滤光器，并且其中所述用于仪器归一化校准的指令包括用于下列操作的指令：

确定用于每个激发滤光器和发射滤光器中的第一校正因子；

计算一对滤光器的第二校正因子，其中每对滤光器包括一个激发滤光器和一个发射滤光器；并且

将所述第二校正因子应用于滤光器数据。

26.根据权利要求21所述的计算机可读存储介质，其中，所述滤光器归一化因子允许对来自所述仪器的数据与来自第二仪器的数据进行比较。

27.根据权利要求21所述的计算机可读存储介质，其中，所述用于验证测定的指令包括用于下列操作的指令：

接收来自一块验证板的扩增数据以生成多条扩增曲线，其中所述验证板包括第一数量和第二数量的样本，且每条扩增曲线均包括一个指数区域；

基于所述多条扩增曲线的指数区域确定一组荧光阈值；

对于该组每一个荧光阈值，确定所述第一数量样本生成的扩增曲线的第一组循环阈值(C_t)和所述第二数量样本生成的扩增曲线的第二组C_t值；并且

基于所述多个荧光阈值中每个荧光阈值的C_t值计算所述第一数量和所述第二数量是否充分可区分。

28.根据权利要求21所述的计算机可读存储介质，其中，所述验证测定由连接至所述仪器的处理器来执行。

29.根据权利要求27所述的计算机可读存储介质，其中，所述用于验证测定的指令还包括用于下列操作的指令：

在显示屏上显示仪器验证或失败的指示。

30.根据权利要求21所述的计算机可读存储介质，还包括用于下列操作的指令：

执行多组分数据的实时光谱校准的自动染料校正；

执行板检测以确定是否存在板装载错误；

执行自动背景校准以补偿背景变化；以及

使用反射材料执行仪器归一化以检测荧光发射中的任何变化或变异。

31.一种用于校准仪器的系统，其中所述仪器包括一个能够对多个反应位点荧光发射进行成像的光学系统，所述用于校准仪器的系统包括：

一个配置为测定图像中反应位点位置的感兴趣区域(ROI)校准器，其中所述ROI校准减小以下反应位点的测定误差的组中的至少一者：所述多个反应位点内的染料饱和度、网格旋转、放大倍数的变化以及光学径向畸变；

一个配置为通过比较荧光染料的原始谱图与荧光染料的纯谱图校准数据来确定各个反应位点处所用荧光染料贡献的纯染料校准器；

一个配置为测定滤光器归一化因子的仪器归一化校准器；

一个配置为验证所述仪器能否区分两种不同数量样本的测定验证器；

以及一个配置为显示校准结果的显示引擎，

其中，所述ROI校准器被配置为：

根据每个样本孔的荧光阈值估计初始感兴趣区域(ROI)；

估计每个ROI的中心位置；

估计每个ROI的尺寸；

测定多个反应位点的ROI平均尺寸；

推导出全局网格模型；

将所述全局网格模型应用于ROI；

恢复丢失的ROI；并且

调整ROI的半径。

32.根据权利要求31所述的系统，其中，所述测定验证器包括RNase P基因验证器。

33.根据权利要求31所述的系统，其中，所述纯染料校准器被配置为：

在多于一个通道中对装载到仪器中的样本固持器成像，所述样本固持器包括多个反应位点和多于一种类型的染料，每种染料占据多于一个反应位点；

识别所述样本固持器中每种染料的峰通道；

将每种染料的各个通道相对于所述峰通道归一化；并且

产生包括一组染料参比值的染料矩阵。

34.根据权利要求33所述的系统，其中，所述校准器配置为对所述样本固持器成像四次以对四个不同的样本固持器进行成像。

35.根据权利要求31所述的系统，其中，所述光学系统包括多个激发滤光器和多个发射滤光器，并且其中所述仪器归一化校准器配置为：

确定用于每个所述激发滤光器和发射滤光器中的第一校正因子；

计算一对滤光器的第二校正因子，其中每对滤光器包括一个激发滤光器和一个发射滤光器；并且

将所述第二校正因子应用于滤光器数据。

36.根据权利要求31所述的系统，其中，滤光器归一化因子允许对来自该仪器的数据与来自第二仪器的数据进行比较。

37.根据权利要求31所述的系统，其中，所述测定验证器配置为：接收来自验证板的扩增数据以生成多条扩增曲线，其中所述验证板包括第一数量和第二数量的样本，并且每条扩增曲线包括指数区域；

基于所述多条扩增曲线的指数区域确定一组荧光阈值；

对于所述荧光阈值组中的每个荧光阈值，确定所述第一数量样本生成的扩增曲线的第一组循环阈值(C_t)以及由所述第二数量样本生成的扩增曲线的第二组C_t值；并且

基于所述多个荧光阈值中每个荧光阈值的C_t值计算所述第一数量和第二数量是否充分可区分。

38.根据权利要求37所述的系统，其中，所述测定验证器还配置为：

在所述显示引擎上显示仪器验证或失败的指示。

39.根据权利要求31所述的系统，还包括：

一个配置为执行所述多组分数据的实时光谱校准的自动染料校正器；

一个配置为确定是否存在板装载错误的板检测器；

一个配置为补偿背景变化的自动背景校准器；以及

一个配置为使用反射材料检测荧光发射中任何变化或变异的仪器规整器。

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