KR20170134359A - 생물학적 장비 보정을 위한 방법 및 시스템 - Google Patents

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Abstract

일 구현예에서, 장비를 보정하는 방법이 제공된다. 상기 장비는 복수의 반응 부위로부터 형광 방출을 이미징할 수 있는 광학 시스템을 포함한다. 상기 방법은 관심 영역(ROI) 보정을 수행하여 이미지에서 반응 부위 위치를 결정하는 단계를 포함한다. 상기 방법은 순수 염료 보정을 수행하여 형광 염료의 원시 스펙트럼을 상기 형광 염료의 순수 스펙트럼 보정 데이터와 비교함으로써 각각의 반응 부위에서 사용된 형광 염료의 기여도를 결정하는 단계를 더 포함한다. 상기 방법은 장비 정규화 보정을 수행하여 필터 정규화 계수를 결정하는 단계를 더 포함한다. 상기 방법은 RNase P 검증을 수행하여 상기 장비가 샘플의 서로 다른 두 개의 수량을 구별할 수 있는지 검증하는 단계를 포함한다.

Description

생물학적 장비 보정을 위한 방법 및 시스템
일반적으로, 조작자가 그들의 의도된 목적을 위해 생물학적 분석 시스템을 더 빠르고 효율적으로 사용할 수 있도록 하기 위해 생물학적 분석 시스템의 설치 및 셋업을 간소화할 필요성이 증가하고 있다.
실험실 장비의 설치 및 보정은 시간과 비용이 많이 소요되는 프로세스일 수 있다. 많은 경우, 장비 공급업체의 엔지니어들은 이러한 프로세스를 수행하기 위해 현장에 있어야만 한다. 이 비용은 일반적으로 사용자에게 전가된다. 일부 경우, 숙련된 사용자는 적절히 제조된 장비를 다단계 절차를 이용하여 성공적으로 보정할 수 있다. 이러한 보정 중에, 물리적인 표준 및 웰 플레이트(well plates)가 수동 절차와 함께 사용될 수 있다. 수동 보정 과정 및 데이터 검사는 오류가 발생하기 쉽고 특별한 조치(ad-hoc) 또는 주관적인 조치에 의존할 수 있다. 최종 시스템 확인 단계는 차선의 보정 수용에 대한 탄력성을 제공할 수 있고, 자동화는 이러한 활동 중에 개선된 객관성과 통일성을 제공한다.
하나의 예시적인 구현예에서, 장비를 보정하는 방법이 제공된다. 상기 장비는 복수의 반응 부위로부터 형광 방출을 이미징할 수 있는 광학 시스템을 포함한다. 상기 방법은 관심 영역(ROI) 보정을 수행하여 이미지에서 반응 부위 위치를 결정하는 단계를 포함한다. 상기 방법은 순수 염료 보정을 수행하여 형광 염료의 원시 스펙트럼을 상기 형광 염료의 순수 스펙트럼 보정 데이터와 비교함으로써 각각의 반응 부위에서 사용된 형광 염료의 기여도를 결정하는 단계를 더 포함한다. 상기 방법은 장비 정규화 보정을 수행하여 필터 정규화 계수를 결정하는 단계를 더 포함한다. 상기 방법은 RNase P 검증을 수행하여 상기 장비가 샘플의 서로 다른 두 개의 수량을 구별할 수 있는지 검증하는 단계를 포함한다.
다른 예시적인 구현예에서, 장비를 보정하기 위한 프로세서-실행 가능한 명령으로 인코딩된 컴퓨터 판독 가능한 저장 매체가 제공된다. 상기 장비는 복수의 반응 부위로부터 형광 방출을 이미징할 수 있는 광학 시스템을 포함한다. 상기 명령은 관심 영역(ROI) 보정을 수행하여 이미지에서 반응 부위 위치를 결정하기 위한 명령을 포함한다. 상기 명령은 순수 염료 보정을 수행하여 형광 염료의 원시 스펙트럼을 상기 형광 염료의 순수 스펙트럼 보정 데이터와 비교함으로써 각각의 반응 부위에서 사용된 형광 염료의 기여도를 결정하기 위한 명령을 포함한다. 상기 명령은 장비 정규화 보정을 수행하여 필터 정규화 계수를 결정하기 위한 명령을 더 포함한다. 상기 명령은 RNase P 검증을 수행하여 상기 장비가 샘플의 서로 다른 두 개의 수량을 구별할 수 있는지 검증하기 위한 명령을 포함한다.
다른 예시적인 구현예에서, 장비를 보정하는 시스템이 제공된다. 상기 장비는 복수의 반응 부위로부터 형광 방출을 이미징할 수 있는 광학 시스템을 포함한다. 상기 시스템은 프로세서, 및 프로세서-실행 가능한 명령으로 인코딩된 메모리를 포함한다. 상기 명령은, 관심 영역(ROI) 보정을 수행하여 이미지에서 반응 부위 위치를 결정하기 위한 명령, 및 순수 염료 보정을 수행하여 형광 염료의 원시 스펙트럼을 상기 형광 염료의 순수 스펙트럼 보정 데이터와 비교함으로써 각각의 반응 부위에서 사용된 형광 염료의 기여도를 결정하기 위한 명령을 포함한다. 상기 명령은, 장비 정규화 보정을 수행하여 필터 정규화 계수를 결정하기 위한 명령, 및 RNase P 검증을 수행하여 상기 장비가 샘플의 서로 다른 두 개의 수량을 구별할 수 있는지 검증하기 위한 명령을 더 포함한다.
다른 예시적인 구현예에서, 장비를 보정하는 시스템이 제공된다. 상기 장비는 복수의 반응 부위로부터 형광 방출을 이미징할 수 있는 광학 시스템을 포함한다. 상기 시스템은 이미지에서 반응 부위 위치를 결정하도록 구성된 관심 영역(ROI) 보정부를 포함한다. 상기 시스템은 형광 염료의 원시 스펙트럼을 상기 형광 염료의 순수 스펙트럼 보정 데이터와 비교함으로써 각각의 반응 부위에서 사용된 형광 염료의 기여도를 결정하도록 구성된 순수 염료 보정부를 포함한다. 상기 시스템은 필터 정규화 계수를 결정하도록 구성된 장비 정규화 보정부를 더 포함한다. 상기 장비는 장비가 샘플의 서로 다른 두 개의 수량을 구별할 수 있는지 검증하도록 구성된 RNase P 검증부를 포함한다. 상기 시스템은 보정 결과를 표시하도록 구성된 디스플레이 엔진을 더 포함한다.
도 1은 본원에 설명된 다양한 구현예에 따른 생물학적 장비를 위한 보정 작업흐름을 도시한다.
도 2는 본 교시의 구현예가 구현될 수 있는 PCR 장비(200)를 도시하는 블록 구성도이다.
도 3은 본원에 설명된 구현예에 따른 이미징에 사용될 수 있는 예시적인 광학 시스템(300)을 묘사한다.
도 4는 본원에 설명된 다양한 구현예를 구현하기 위한 예시적인 컴퓨팅 시스템을 도시한다.
도 5는 본원에 설명된 다양한 구현예에 따른 예시적인 분산 네트워크 시스템을 도시한다.
도 6은 qPCR 장비의 보정에 사용되는 일련의 단계를 도시한다.
도 7은 96 웰 샘플 용기에 대한 관심 영역(regions-of-interest)을 도시한다.
도 8은 96-웰 보정 플레이트의 각각의 웰이 FAM 염료로 점유된 보정 플레이트의 이미지이다.
도 9 및 도 10은 본 개시의 일 구현예에 따른 예시적인 작업흐름을 묘사한다.
도 11a는 본 개시의 일 구현예에 따른 체커보드(checker board) 구성을 갖는 보정 플레이트를 도시한다.
도 11b는 도 11a의 플레이트(1100)에 의해 도시된 것과 동일한 구성으로, FAM, VIC, ROX, 및 SYBR 염료를 갖는 4-염료 체커보드 96-웰 보정 플레이트의 이미지이다.
도 12a는 본 교시의 다양한 구현예에 사용된 염료 혼합물을 도시한다.
도 12b는 본 교시의 다양한 구현예에 대한 순수 염료 및 메인 채널 필터 조합을 도시한다.
도 13은 본 교시의 다양한 구현예에 따른, 정규화(nomalization) 전의 염료 혼합물의 %편차를 도시한다.
도 14는 본 교시의 다양한 구현예에 따른, 정규화 후의 염료 혼합물의 %편차를 도시한다.
도 15는 본 교시의 다양한 구현예에 따른, 정규화 후의 염료 혼합물에 대한 %편차의 확대도이다.
도 16은 본 교시의 다양한 구현예에 따른, 정규화 과정을 묘사하는 순서도이다.
도 17은 본원에 설명된 다양한 구현예에 따른 장비를 검증하기 위한 예시적인 방법을 도시한다.
도 18은 본원에 설명된 다양한 구현예에 따른 장비를 검증하기 위한 다른 예시적인 방법을 도시한다.
도 19는 본원에 설명된 다양한 구현예에 따른 증폭 데이터로부터 복수의 형광 임계치를 결정하는 과정을 도시한다.
도 20은 본원에 설명된 다양한 구현예에 따른 장비를 검증하기 위한 시스템을 도시한다.
도 21은 본원에 설명된 다양한 구현예에 따른 장비를 보정하기 위한 시스템을 도시한다.
본 문서에 설명된 다양한 구현예와 관련된 방법을 위한 예시적인 시스템은, 미국 디자인 특허 출원 번호___(Life Technologies사의 관리 번호 LT01000 DES), 미국 특허 가출원 번호___(Life Technologies사의 관리 번호 LT01011 PRO), 미국 특허 가출원 번호___(Life Technologies사의 관리 번호 LT01023 PRO), 미국 특허 가출원 번호___(Life Technologies사의 관리 번호 LT01025 PRO), 미국 특허 가출원 번호___(Life Technologies사의 관리 번호 LT01028 PRO), 미국 특허 가출원 번호___(Life Technologies사의 관리 번호 LT01029 PRO), 미국 특허 가출원 번호___(Life Technologies사의 관리 번호 LT01032 PRO), 및 미국 특허 가출원 번호___(Life Technologies사의 관리 번호 LT01033 PRO)에서 설명된 것들을 포함하고, 상기 출원들 모두 2015년 2월 6일 출원되었고, 또한 그 전체가 본원에 참조로 포함된다.
본 발명의 보다 철저한 이해를 제공하기 위해, 다음의 설명은 특정 구성, 파라미터, 및 예 등과 같은 다수의 특정 세부 사항을 설명한다. 그러나, 이러한 설명은 본 발명의 범주를 제한하려는 것은 아니며, 예시적인 구현예의 보다 나은 설명을 제공하려는 의도로 인식되어야 한다.
생물학적 분석 기구의 보정에 있어서의 발전은, 유리하게도, 적절하고 효율적인 설치를 위해, 조작자 오류의 감소, 조작자 입력의 감소, 및 생물학적 분석 기구와 분석 기구의 다양한 부품을 보정하는 데 필요한 시간의 감소를 가능하게 한다.
이와 같이, 본 교시의 다양한 구현예에 따르면, 전문 지식을 자동화 보정 및 검증 시스템에 통합시켜 고장이 확인되었을 때 합격/불합격 상태 및 문제 해결 피드백을 제공할 수 있다. 장비가 보정 과정에서 실패될 경우, 서비스 엔지니어를 호출할 수 있다. 본 교시는 설치 및 보정 절차에 필요한 비용 및 시간을 최소화할 수 있다.
본원에 설명된 방법 및 시스템은, 생물학적 분석 시스템과 같은 다양한 유형의 시스템, 장비 및 기기로 구현될 수 있음을 인식해야 한다. 예를 들면, 다양한 구현예는 복수의 샘플에 대해 중합효소 연쇄 반응(PCR)을 수행하는 장비, 시스템, 또는 기기에서 구현될 수 있다. 다수의 샘플이 처리되고 있는 정량적 중합효소 연쇄 반응(qPCR)에 일반적으로 적용 가능하지만, 본원에 설명된 다양한 구현예에 따른 임의의 적합한 PCR 방법이 이용될 수 있음을 인식해야 한다. 적합한 PCR 방법으로는, 예를 들면, 디지털 PCR, 대립형질 특이적(allele- specific) PCR, 비대칭(asymmetric) PCR, 결찰-매개성(ligation-mediated) PCR, 복합(multiplex) PCR, 네스티드(nested) PCR, qPCR, 게놈 워킹(genome walking), 및 브리지(bridge) PCR이 포함되지만, 이에 한정되지 않는다. 또한, 본원에서 사용되는 바와 같이, 증폭에는, 예를 들면, 열 순환기, 등온 증폭, 열 대류, 적외선 매개성 열 사이클링, 또는 헬리카제(helicase) 의존적 증폭을 이용하는 것을 포함할 수 있다.
전체적인 보정 작업흐름
정확하고 신뢰성 있는 실험용 데이터를 생성하기 위해, 생물학적 장비에 종종 의존한다. 생물학적 장비의 정기적인 보정 및 유지보수는 장비의 적절한 최적의 작동을 보장하고, 이는 사용자의 생산성을 극대화하고, 잠재적인 문제가 드러나기 전에 해결함으로써 많은 비용이 드는 수리를 최소화하며, 결과물의 품질을 향상시킬 수 있다.
본 교시의 다양한 구현예에 따르면, 본 문서에 설명된 보정 방법은 개별적으로 또는 임의의 조합으로 수행될 수 있다. 또한, 본원에 설명된 보정 방법은, 초기 보정을 위한 생산 후, 또는 초기 설치 및 사용 후의 임의의 시간에 수행될 수 있다. 본원에 설명된 보정 방법은 예를 들면, 매주, 매월, 반년마다, 매년, 또는 필요에 따라 수행될 수 있다.
본 교시의 다양한 구현예에 따르면, 관심 영역(ROI) 보정, 백그라운드 보정, 균일성 보정, 순수 염료 보정, 장비 정규화와 같은 보정 방법은, 각각의 판독에서 형광 신호의 위치 및 세기, 각각의 형광 신호와 연관된 염료, 및 신호의 중요도를 결정하기 위해 사용된다. 또한, 다양한 구현예에 따르면, 자동 염료 교정, 자동 백그라운드 보정, 및 플레이트 검출은, 검출 및 염료 판독을 더욱 세분화하고 오류를 결정하기 위해 수행될 수 있다. 적절한 성능에 대한 장비 검증은 RNase P 검증을 이용하는 시스템에 의해 자동으로 수행될 수도 있다.
도 1은 본원에 설명된 다양한 구현예에 따른 장비에서 수행될 수 있는 예시적인 보정 작업흐름(100)을 도시한다. 보정 작업흐름(100)은 하나의 예이며, 본원에 설명된 보정 방법은, 임의의 조합 또는 순서로, 개별적 또는 부분 집합으로서 수행될 수 있다는 것을 인식해야 한다.
단계(102)에서, ROI 보정이 수행된다. 일반적으로 ROI 보정은 검출부의 시야에서 웰(well)의 위치를 정의하는 정보를 생성할 것이다. 본 교시는 사용자 상호작용(user interaction)의 최소화 또는 제거를 통해 ROI 보정을 자동화할 수 있다. 다양한 구현예는, 히스토그램 분석 및 이진 검색 패턴을 이용하여 필터 당 최적의 노출 시간을 결정하는 방법 및 시스템을 제공함으로써, 프로세스를 자동화할 수 있다. 본원에 설명된 다양한 구현예에 따른 ROI 보정은, 이전의 방법보다 더 정확하고 더 적은 오류로, 이미지에서 웰을 식별한다. 다양한 구현예에 따른 ROI 보정 방법 및 시스템이 아래에서 추가로 설명된다.
단계(104)에서, 백그라운드 보정이 수행된다. 검출부는 검출 가능한 신호를 방출하는 샘플이 존재하지 않는 경우에도, 종종 일부 신호를 읽을 수 있을 것이다. 샘플 신호의 보다 정확한 측정을 얻기 위해서 샘플 신호 판독으로부터 백그라운드 신호를 취출할 수 있으므로, 이러한 백그라운드 신호에 대한 설명은 중요할 수 있다. 백그라운드 보정은 모든 필터/웰 조합에 대한 장비 백그라운드 신호를 결정하기 위해 워터 플레이트(water plate)를 사용하여 수행될 수 있다. 이러한 단계는 사용자 상호 작용을 최소화하거나 제거하기 위해 자동화될 수 있다. 백그라운드 보정을 위해 정확한 플레이트가 사용되었는지를 시험할 자동화가 제공될 수 있다. 예를 들면, 단계(104)에서는, 신호 레벨을 살펴볼 수 있고, ROI 보정에서 사용된 강한 신호를 방출하는 시험 플레이트와 같은 부정확한 시험 플레이트를 사용하게 될 가능성을 제거할 수 있다. 신호 레벨이 예측되는 백그라운드에서의 레벨을 훨씬 초과하는 경우, 사용자는 적절한 시험 플레이트를 삽입하라는 경고를 받을 수 있다. 또한, 이 단계에서는, 신호 레벨의 광범위한 발산 여부를 확인하여, 시험 플레이트에서 하나 이상의 웰의 오염에 대한 시험을 할 수 있으며, 그렇게 발견된 경우, 더럽혀지거나 오염된 웰의 존재 가능성을 표시하는 경고가 촉발된다. 오염 된 웰은 샘플 신호 레벨로부터 취출되는 부적절한 백그라운드 신호 레벨을 초래할 수 있다.
단계(106)에서, 균일성 보정이 수행된다. 일부 경우에서, 플레이트의 기하학적 구조(뒤틀림, 두께)의 변화는, 각 웰에 동일한 양의 형광 염료가 존재함에도 불구하고, 플레이트를 걸쳐 세기 판독 값의 변화를 야기할 수 있다. 플레이트 변화에 의한 세기 변화가 교정될 수 있도록, 균일성 보정은 다중 염료 플레이트를 사용하는 장비를 보정할 수 있다. 단계(106)는 자동화될 수 있으며, 사용자 상호 작용을 감소시키거나 제거할 수 있다. 이러한 자동화의 일부는, 잘못된 보정 플레이트의 사용에 대한 검출과, 보정 플레이트에서 비어 있거나 오염된 웰의 감지 및 조정이 포함될 수 있다.
단계(108)에서, 순수 염료 보정이 수행된다. qPCR 장비에서 사용된 형광 염료의 보정을 통해, 장비에 의해 수집된 총 형광에서 각 염료의 개별 기여도를 특징짓고 구별하도록, 장비 소프트웨어는 염료 표준으로부터 수집된 보정 데이터를 사용하도록 허용한다. 본 교시의 다양한 구현예에 따르면, 샘플의 시행 후, 장비 소프트웨어는 각각의 판독에 대한 원시 스펙트럼 신호의 형태로 데이터를 수신한다. 소프트웨어는 각각의 염료가 기여한 원시 스펙트럼을 순수 스펙트럼 보정 데이터와 비교하여 각각의 반응 부위에 사용된 형광 염료의 기여도를 결정한다. 사용자가 분석 후 실험을 저장하면, 장비 소프트웨어는 웰 당 각각의 형광 염료의 기여도는 물론 그 실험에 대해 수집된 형광 데이터와 함께 순수 스펙트럼을 저장한다. 이러한 방법은 아래에서 추가로 설명된다. 본 교시의 다양한 구현예에 따른 순수 염료 보정을 통해, 보다 적은 순수 보정 플레이트가 사용될 수 있고, 사용자 비용이 절약되며, 보정에서 오류의 근원이 제거될 수 있다.
단계(110)에서, 장비 정규화 보정이 수행된다. 흔히 접하는 한 가지 어려움은 다수의 장비에서 실행된 실험의 결과를 연구자들이 용이하게 비교할 수 없다는 것이다. 광원, 광학 요소, 및 형광 검출기와 같은 구성 요소의 파라미터에 있어서 물리적 변화는, 예를 들어, 동일한 생물학적 샘플일 수 것에 대한 분석 결과에 있어서 변화를 초래한다. 따라서, 구성 요소의 변화를 최소화하는 데 도움이 되는 방법 및 장치에 대한 끊임없는 요구가 존재한다.
RT-PCR에서, 증폭 곡선은 보통 리포터 염료의 신호를 동일한 용액에서 수동 기준 염료(passive reference dye)에 대해 정규화함으로써 결정된다. 이러한 정규화는 “Rn”으로 표시되는 정규화된 형광 값으로서 보고될 수 있다. 전체 신호 레벨이 액체 부피, 또는 전체 조도에 영향을 받을지라도, 수동 기준 정규화는 일관된 Rn 값을 가능하게 한다. 그러나, 리포터 염료와 기준 염료 간의 신호의 비가 변할 경우(예컨대, 조명 스펙트럼에서 장비 간 차이), 수동 기준 정규화가 제대로 작용하지 않을 수 있다. 본원에 설명된 다양한 구현예에 따르면, 염료 혼합물로부터 형광을 판독하여 “정규화 계수”를 얻어서 Rn 값을 조정하는 것을 포함하는 장비 정규화 방법은 추가적인 비용을 필요로 한다.
단계(112)에서, RNase P 검증이 수행된다. 검증 시험의 수행으로 장비가 적절하게 기능을 하는지의 여부를 확인한다. 예를 들면, RNase P 검증은 장비가 샘플의 서로 다른 두 개의 수량을 정확하게 구별할 수 있는지의 여부를 결정한다. 이전에는, 표준 곡선을 사용하여 RNase P 검증을 수동으로 수행되었고, 사용자는 장비를 검증하기 위해 통계적으로 계산하였다. 본 교시에 설명된 다양한 구현예에 따르면, RNase P 검증은 표준 곡선을 사용하지 않고 시스템에 의해 자동으로 수행될 수 있다. RNase P 검증의 다양한 구현예는 아래에서 추가적으로 설명된다.
도 21은 본원에 설명된 다양한 구현예에 따른 장비의 보정을 위한 시스템(2100)을 도시한다. 시스템(2100)은 ROI 보정부(2102), 순수 염료 보정부(2104), 장비 정규화 보정부(2108), RNase P 검증부(2110), 및 디스플레이 엔진/GUI(2106)를 포함한다. ROI 보정부(2102)는 이미지에서 반응 부위 위치를 결정하기 위해 구성된다. 순수 염료 보정부(2104)는 형광 염료의 원시 스펙트럼을 상기 형광 염료의 순수 스펙트럼 보정 데이터와 비교함으로써 각각의 반응 부위에서 사용된 형광 염료의 기여도를 결정하기 위해 구성된다. 장비 정규화 보정부(2108)는 필터 정규화 계수를 결정하기 위해 구성된다. RNase P 검증부(2110)는 장비가 샘플의 서로 다른 두 개의 수량을 구별할 수 있는지 검증하기 위해 구성된다. 디스플레이 엔진(2106)은 보정 결과를 표시하기 위해 구성된다.
본 교시는 실시간 중합효소 연쇄 반응(RT-PCR) 장비를 참조하여 설명된다. 특히, 본 교시의 일 구현예는 웰 플레이트의 광학 이미징을 채용하는 RT-PCR 장비에 대해 구현된다. 이러한 장비는 분석 목적의 복수의 샘플 또는 스폿으로부터 신호를 동시에 측정할 수 있고, 대개 보정을 필요로 하는데, 이러한 보정은 관심 영역(ROI)을 식별하는 단계, 다성분 분석을 위한 백그라운드 신호, 균일성 및 순수 염료 스펙트럼 보정을 결정하는 단계를 포함하는 단계들을 포함하지만, 이에 한정되는 것은 아니다. 보정은 또한, 결과가 예상되는 알려진 샘플 플레이트를 이용한 RT-PCR 검증 반응을 수반할 수 있다. 본 교시내용이 RT-PCR 장비에 관한 예들로 설명되었지만, 그 원칙은 결과의 정확성 및/또는 최적성을 보장하기 위해 보정 및 검증을 필요로 할 수 있는 다른 형태의 실험실 장비에 폭넓게 적용될 수 있다는 것을 당업자라면 이해할 것이다.
PCR 장비
상술한 바와 같이, 다양한 구현예에 따라 활용될 수 있는 장비는 중합효소 연쇄 반응(PCR) 장비이나, 이에 한정되지 않는다. 도 2는 본 교시의 구현예가 구현될 수 있는 PCR 장비(200)를 도시하는 블록 구성도이다. PCR 장비(200)는 기판(미도시)에 포함된 복수의 샘플(212) 위에 놓이는 가열된 커버(210)를 포함할 수 있다. 다양한 구현예에서, 기판은 복수의 샘플 영역을 갖는 유리 또는 플라스틱 슬라이드일 수 있고, 샘플 영역은 샘플 영역과 가열된 커버(210) 사이의 커버를 갖는다. 기판의 일부 예는 다중-웰 플레이트, 예컨대 표준 마이크로역가(microtiter) 96-웰, 384-웰 플레이트, 또는 마이크로카드, 또는 실질적으로 평면인 지지부, 예컨대 유리 또는 플라스틱 슬라이드를 포함할 수 있지만, 이에 한정되지 않는다. 기판의 다양한 실시예에서의 반응 부위는 기판의 표면 상에 형성된 규칙적 또는 불규칙적 어레이로 패턴화되는 함몰부(depression), 압입부(indentation), 융부(ridge), 및 이들의 조합을 포함할 수 있다. PCR 장비의 다양한 구현예는 샘플 블록(214), 가열 및 냉각을 요소(216), 열 교환기(218), 제어 시스템(200), 및 사용자 인터페이스(222)를 포함한다. 본 교시에 따른 열 블록 어셈블리의 다양한 구현예는 도 2의 PCR 장비(200)의 구성요소(214~218)를 포함한다.
실시간 PCR 장비(200)는 광학 시스템(224)를 갖는다. 도 2에서, 광학 시스템(224)은 기판 내의 샘플(212)로부터 전자기 에너지를 수신하기 위한, 전자기 에너지를 방출하는 조명원(미도시), 광학 센서, 검출부, 또는 촬상기(imager)(미도시), 및 각각의 DNA 샘플로부터의 전자기 에너지를 촬상기로 가이드하기 위해 사용되는 광학 기기(240)를 가질 수 있다. 도 2의 PCR 장비(200) 및 도 2의 실시간 PCR 장비(200)의 구현예에 대해서, 제어 시스템(220)은 검출 시스템, 가열된 커버, 및 열 블록 어셈블리의 기능을 제어하는 데 사용될 수 있다. 도 2의 PCR 장비(200) 및 도 2의 실시간 PCR 장비(200)의 사용자 인터페이스(222)를 통해, 최종 사용자는 제어 시스템(220)에 엑세스할 수 있다. 또한, 도 2에 묘사된 컴퓨터 시스템(200)은 사용자 인터페이스 기능은 물론 도 2의 PCR 장비(200)의 기능의 제어를 제공하는 역할을 할 수 있다. 또한, 도 4의 컴퓨터 시스템(400)은 데이터 프로세싱을 제공할 수 있고, 준비 기능을 표시 및 보고할 수 있다. 이후 더 상세히 논의되는 바와 같이, 모든 그러한 장비 제어 기능은 PCR 장비에 대해 국부적으로 전용될 수 있고, 또는 도 4의 컴퓨터 시스템(400)은 제어, 분석, 및 보고 기능 중 일부 또는 전부의 원격 제어를 제공할 수 있다.
이미징을 위한 광학 시스템
도 3은 본원에 설명된 구현예에 따른 이미징에 사용될 수 있는 예시적인 광학 시스템(300)을 묘사한다. 광학 시스템(300)이 예시적인 광학 시스템임을 인식해야 하고, 당업자는 다른 광학 시스템이 관심 객체의 이미지를 캡처하는 데 사용될 수 있음을 인식할 것이다. 다양한 구현예에 따르면, 관심 객체는, 예를 들어 본원에 기재된 보정 플레이트와 같은 샘플 홀더일 수 있다. 카메라(304) 내에 포함된 광학 센서(302)는, 예를 들어 관심 객체(310)를 이미징할 수 있다. 광학 센서(302)는 CCD 센서일 수 있고, 카메라(304)는 CCD 카메라(304)일 수 있다. 또한, 광학 센서는 카메라 렌즈(306)를 포함한다.
관심 객체에 따라, 다양한 구현예에 따라 관심 객체(310)를 이미징하기 위해 방출 필터(308)가 선택될 수 있다. 방출 필터(308)는 다른 구현예에서 관심 객체(301)로부터 방출된 형광 발광을 이미징하도록 변경될 수 있다.
광학 시스템(300)은 반사광원(312)을 사용하여 관심 객체(310)를 이미징할 수 있다 광원(312)으로부터의 광은 빔스플리터(320)에 의해 관심 객체(310)에 반사되기 전에 비구면체(314), 포커서(focuser)/다이버저(diverger)(316), 및 여기 필터(318)를 통해 필터링될 수 있다. 광학 시스템(300)은, 또한, 필드 렌즈(322)를 포함할 수 있다. 관심 객체에 따라, 다양한 구현예에 따라 관심 객체(310)를 이미징하기 위해 여기 필터(318)가 선택 또는 변경될 수 있다.
본 교시의 다양한 구현에 대한 다음의 설명은 예증 및 설명의 목적으로 제시되었다. 그것은 배타적이지 않고, 본 교시내용을 개시된 정밀한 형태로 한정하지 않는다. 수정 및 변형이 위의 교시의 관점에서 가능하고, 본 교시의 실시로부터 획득될 수 있다. 또한, 설명된 구현은 소프트웨어를 포함하지만 본 교시는 하드웨어와 소프트웨어의 조합으로서 또는 하드웨어 단독으로 구현될 수 있다. 본 교시는 객체 지향 및 비객체 지향 프로그래밍 시스템 모두와 함께 구현될 수 있다.
컴퓨팅 시스템
도 4는 다양한 구현예에 따른, 프로세싱 기능성을 이행하기 위해 채용될 수 있는 컴퓨터 시스템(400)을 도시하는 블록 구성도이다. 실험을 수행하기 위한 장비가 예시적인 컴퓨팅 시스템(400)에 연결될 수 있다. 컴퓨팅 시스템(400)은 프로세서(404)와 같은 하나 이상의 프로세서를 포함할 수 있다. 프로세서(404)는, 예를 들면, 마이크로 프로세서, 제어기 또는 다른 제어 로직과 같은 범용 또는 전용 프로세싱 엔진을 사용하여 구현될 수 있다. 이러한 예에서, 프로세서(404)는 버스(402) 또는 다른 통신 매체에 연결된다.
또한, 주어진 애플리케이션 또는 환경에 대해 바람직하거나 적절할 수 있는 바와 같이, 도 4의 컴퓨팅 시스템(400)이 랙(rack)-장착 컴퓨터, 메인프레임, 수퍼컴퓨터, 서버, 클라이언트, 데스크톱 컴퓨터, 랩톱 컴퓨터, 태블릿 컴퓨터, 핸드헬드 컴퓨팅 장치(예컨대, PDA, 셀룰러폰, 스마트폰, 팜톱 등), 클러스터 그리드, 넷북, 임베디드 시스템, 또는 임의의 다른 유형의 전용 또는 범용 컴퓨팅 장치와 같은 다수의 형태 중 임의의 형태로 구체화될 수 있는 것을 이해해야 한다. 또한, 컴퓨팅 시스템(400)은 클라이언트/서버 환경 및 하나 이상의 데이터베이스 서버를 비롯한 종래의 네트워크 시스템, 또는 LIS/LIMS 인프라구조와의 통합을 포함할 수 있다. 근거리 통신망(LAN) 또는 광역 통신망(WAN)을 포함하고 무선 및/또는 유선 부품을 포함하는 다수의 종래의 네트워크 시스템은 당업계에 공지되어 있다. 또한, 클라이언트/서버 환경, 데이터베이스 서버, 및 네트워크가 당업계에 문서로 잘 기록되어 있다. 본원에 기재된 다양한 구현예에 따르면, 컴퓨팅 시스템(400)은 분산형 네트워크 내의 하나 이상의 서버에 접속하도록 구성될 수 있다. 컴퓨팅 시스템(400)은 분산 네트워크로부터 정보 또는 업데이트를 수신할 수 있다. 컴퓨팅 시스템(400)은 분산형 네트워크에 접속된 다른 클라이언트에 의해 액세스될 수 있는 분산형 네트워크 내에 저장될 정보를 전송할 수도 있다.
컴퓨팅 시스템(400)은 정보를 전달하기 위한 버스(402) 또는 다른 통신 메커니즘, 및 정보를 프로세싱하기 위해 버스(402)와 연결된 프로세서(404)를 포함할 수 있다.
컴퓨팅 시스템(400)은, 또한, 프로세서(404)에 의해 실행될 명령어를 저장하기 위해 버스(402)에 연결되는 메모리(406)(랜덤 액세스 메모리(RAM) 또는 다른 동적 메모리일 수 있음)를 포함한다. 메모리(406)는, 또한, 프로세서(404)에 의해 실행될 명령어의 실행 동안에 일시적 변수 또는 다른 중간 정보를 저장하는 데 사용될 수 있다. 컴퓨팅 시스템(400)은 정적 정보 및 프로세서(404)를 위한 명령을 저장하기 위한 것으로서 버스(402)에 연결된 읽기 전용 메모리(ROM)(408) 또는 다른 정적 저장 장치를 더 포함한다.
컴퓨팅 시스템(400)은 또한, 정보 및 명령어를 저장하기 위해 제공되고 버스(402)에 연결되는 저장 장치(410), 예컨대 자기 디스크, 광 디스크, 또는 솔리드 스테이트 드라이브(SSD)를 포함할 수 있다. 저장 장치(410)는 매체 드라이브 및 착탈식 저장 인터페이스를 포함할 수 있다. 매체 드라이브는 고정식 또는 착탈식 저장 매체를 지원하는 드라이브 또는 다른 메커니즘, 예컨대 하드 디스크 드라이브, 플로피 디스크 드라이브, 자기 테이프 드라이브, 광 디스크 드라이브, CD 또는 DVD 드라이브(R 또는 RW), 플래시 드라이브, 또는 다른 착탈식 또는 고정식 매체 드라이브를 포함할 수 있다. 이들 예가 도시됨에 따라, 저장 매체는 특정 컴퓨터 소프트웨어, 명령어, 또는 데이터를 내부에 저장하는 컴퓨터 판독 가능한 저장 매체를 포함할 수 있다.
다른 대안적 구현예에서, 저장 장치(410)는 컴퓨터 프로그램 또는 다른 명령어 또는 데이터가 컴퓨팅 시스템(400)에 로딩될 수 있게 하는 다른 유사한 수단을 포함할 수 있다. 이러한 수단은, 예를 들어, 착탈식 저장 유닛과 인터페이스, 예컨대 프로그램 카트리지와 카트리지 인터페이스, 착탈식 메모리(예를 들어, 플래시 메모리 또는 다른 착탈식 메모리 모듈)와 메모리 슬롯, 및 소프트웨어 및 데이터가 저장 장치(410)에서 컴퓨팅 시스템(400)으로 전송될 수 있게 하는 다른 착탈식 저장 유닛과 인터페이스를 포함할 수 있다.
컴퓨팅 시스템(400)은, 또한, 통신 인터페이스(418)를 포함할 수 있다. 통신 인터페이스(418)는 컴퓨팅 시스템(400)과 외부 장치 간에 소프트웨어 및 데이터가 전송될 수 있도록 하는 데 사용될 수 있다. 통신 인터페이스(418)의 예로는 모뎀, 네트워크 인터페이스(예컨대, 이더넷 또는 다른 NIC 카드), (예를 들어 USB 포트, RS-232C 직렬 포트와 같은) 통신 포트, PCMCIA 슬롯 및 카드, 블루투스 등이 포함될 수 있다. 통신 인터페이스(418)를 통해 전송되는 소프트웨어 및 데이터는 신호 형태로서, 통신 인터페이스(418)에 의해 수신될 수 있는 전자, 전자기, 광학, 또는 기타 신호일 수 있다. 이들 신호는 무선 매체, 유선 또는 케이블, 광섬유, 또는 다른 통신 매체와 같은 채널을 통해 통신 인터페이스(418)에 의해 송신 및 수신될 수 있다. 채널의 일부 예로는 전화선, 셀룰러폰 링크, RF 링크, 네트워크 인터페이스, 근거리 또는 광역 통신망, 및 다른 통신 채널이 포함된다.
컴퓨팅 시스템(400)은 버스(402)를 통해, 음극선관(CRT) 또는 액정 디스플레이(LCD)와 같이 컴퓨터 사용자에게 정보를 표시하기 위한 디스플레이(412)에 연결될 수 있다. 문자/숫자 및 다른 키를 포함하는 입력 장치(414)는 예를 들어, 정보 및 명령 선택을 프로세서(404)에 전달하기 위해 버스(402)에 연결된다. 입력 장치는, 또한, 터치스크린 입력 능력을 갖도록 구성된 디스플레이, 예컨대 LCD 디스플레이일 수 있다. 다른 종류의 사용자 입력 장치는 방향 정보 및 명령 선택을 프로세서(404)에 전달하고 디스플레이(412) 상의 커서 이동을 제어하기 위한 마우스, 트랙볼 또는 커서 방향 키와 같은 커서 제어부(416)이다. 일반적으로 이러한 입력 장치는 2개의 축, 제1 축(예컨대, x) 및 제2 축(예컨대, y)에서 장치가 평면에서의 위치를 특정할 수 있도록 하는 2개의 자유도를 갖는다. 컴퓨팅 시스템(400)은 데이터 프로세싱을 제공하고, 이러한 데이터에 대한 신뢰 수준을 제공한다. 본 교시의 구현예의 특정 구현에 따라, 데이터 처리 및 신뢰도 값은 메모리(406)에 포함된 하나 이상의 명령어의 하나 이상의 시퀀스를 실행하는 프로세서(404)에 응답하여 컴퓨팅 시스템(400)에 의해 제공된다. 이러한 명령은 저장 장치(410)와 같은 또 다른 컴퓨터 판독가능 매체로부터 메모리(406)로 읽혀질 수 있다. 메모리(406)에 포함된 명령의 시퀀스의 실행은 프로세서(404)로 하여금 본원에 설명된 프로세스 상태를 수행하게 만든다. 대안적으로, 소프트웨어 명령 대신 또는 이와 함께 하드웨어에 내장 회로를 사용하여 본 교시의 구현예를 구현할 수 있다. 따라서, 본 교시의 구현예의 구현이 하드웨어 회로 및 소프트웨어의 임의의 특정 조합으로 제한되는 것은 아니다.
본원에 사용된 용어 "컴퓨터 판독 가능한 매체" 및 "컴퓨터 프로그램 제품"은, 일반적으로, 실행을 위해 하나 이상의 시퀀스 또는 하나 이상의 명령어를 프로세서(404)에 제공하는 데 수반되는 임의의 매체를 지칭한다. 일반적으로 "컴퓨터 프로그램 코드"(컴퓨터 프로그램 또는 다른 그룹으로 그룹화될 수 있음)로 지칭되는 이러한 명령어는, 실행될 때, 컴퓨팅시스템(400)이 본 발명의 구현예의 특징 또는 기능을 수행하게 할 수 있다. 이들 및 다른 형태의 비일시적 컴퓨터 판독가능 매체는 비휘발성 매체, 휘발성 매체, 및 전송 매체를 포함할 수 있지만 이로 한정되지 않는다. 비휘발성 매체는, 예를 들어 솔리드 스테이트, 광 또는 자기 디스크, 예컨대 저장 장치(410)를 포함한다. 휘발성 매체는 동적 메모리, 예컨대 메모리(406)를 포함한다. 전송 매체는 버스(402)를 포함하는 전선을 포함하여, 동축 케이블, 구리선, 및 광섬유를 포함한다.
컴퓨터 판독 가능한 매체의 일반적인 형태는 예를 들어, 플로피 디스크, 플렉시블 디스크, 하드 디스크, 자기 테이프, 또는 임의의 다른 자기 매체, CD-ROM, 임의의 다른 광학 매체, 펀치 카드, 종이 테이프, 홀 패턴을 갖는 임의의 다른 물리적 매체, RAM, PROM, 및 EPROM, FLASH-EPROM, 임의의 다른 메모리 칩 또는 카트리지, 이하에 기술되는 바와 같은 반송파, 또는 컴퓨터가 판독할 수 있는 임의의 다른 매체를 포함한다.
다양한 형태의 컴퓨터 판독 가능한 매체가 실행을 위한 프로세서(404)에 하나 이상의 명령의 하나 이상의 시퀀스를 전달하는 데 관여할 수 있다. 예를 들어, 초기에 원격 컴퓨터의 자기 디스크 상에 명령이 전달될 수 있다. 원격 컴퓨터는 그의 동적 메모리 내로 명령어를 로딩할 수 있고, 모뎀을 사용하여 전화선을 통해 명령어를 전송할 수 있다. 컴퓨팅 시스템(400)에 대해 국부적인 모뎀은 전화선 상에서 데이터를 수신할 수 있고, 적외선 송신기를 사용하여 데이터를 적외선 신호로 변환할 수 있다. 버스(402)에 연결된 적외선 검출기는 적외선 신호로 전달되는 데이터를 수신하고 이 데이터를 버스(402) 상에 배치할 수 있다. 버스(402)는 데이터를 메모리(406)에 전달하고, 프로세서(404)는 메모리로부터 명령을 검색하고 실행한다. 메모리(406)에 의해 수신된 명령은 선택적으로 프로세서(404)에 의한 실행 전 또는 후에 저장 장치(410)에 저장될 수 있다.
명료성을 위해, 위의 설명은 상이한 기능 유닛들 및 프로세서들을 기준으로 본 발명의 구현예를 설명했음을 이해할 것이다. 그러나, 상이한 기능 유닛들, 프로세서들, 또는 도메인들 사이의 임의의 적합한 기능성 분포가 본 발명을 손상시키지 않고서 이용될 수 있음은 명백할 것이다. 예를 들어, 개별 프로세서 또는 제어부에 의해 수행되는 것으로 예시된 기능성이 동일한 프로세서 또는 제어기에 의해 수행될 수 있다. 따라서, 특정 기능 유닛에 대한 언급은 엄격한 논리적 또는 물리적 구조 또는 조직을 나타내는 것이 아니라, 단지, 기술된 기능성을 제공하기 위한 적합한 수단에 대한 언급으로만 이해되어야 한다.
분배 시스템
전형적인 인터넷 네트워크 구성(500)의 요소 중 일부는 도 5에 도시되어 있고, 도면에서, 가능하게는 원격 지역 사무실에 있는 다수의 클라이언트 기기(502)는 자체가 일부 인터넷 서비스 제공자(ISP) 접속(510)을 통해 인터넷(508)에 접속되는 게이트웨이/허브/터널-서버/기타(510)에 접속된 것으로 도시되어 있다. ISP 접속(514)을 통해 인터넷(508)에 유사하게 접속된 다른 가능한 클라이언트(512)도 또한 도시되어 있고, 이때 이들 유닛은 가능하게는 중앙 연구실 또는 사무실로, 예를 들어 ISP 접속(516)을 통해 게이트웨이/터널-서버(518)로 통신하고, 게이트웨이/터널-서버(1318)는 다른 허브/라우터(526)를 통해 다양한 로컬 클라이언트(530)에 접속될 수 있는 다양한 기업 애플리케이션 서버(522)에 접속된다(520). 이들 서버(522) 중 임의의 것은, 아래에 더 충분히 기술되는 바와 같이, 본 발명에서 기술되는 바와 같은, 잠재적 콘텐츠 관리 및 전달 설계 솔루션의 분석을 위한 개발 서버로서 기능할 수 있다.
관심 영역(ROI) 보정
위에서 제시된 바와 같이, 본 교시는 실시간 중합효소 연쇄 반응(RT-PCR) 장비를 참조하여 설명된다. 특히, 본 교시의 구현예는 웰 플레이트의 광학 이미징을 채용하는 RT-PCR 장비를 위해 구현된다. 이러한 장비는 분석 목적의 복수의 샘플 또는 스폿으로부터 신호를 동시에 또는 순차적으로 측정할 수 있고, 대개 보정을 필요로 한다 보정이 필요할 수 있는 과정의 예는 ROI 또는 관심 영역의 식별이다.
일반적으로, ROI 보정은 모든 필터에 대응하는 각각의 셀에서 강한 방출을 갖는 플레이트를 사용하여 수행된다. ROI가 각각의 필터와 동일하지 않을 수 있기 때문에, 이는
유용할 수 있다. 필터에서의 약간의 각도 차이 및 기타 필터 스펙트럼 특성에 의해 필터들 간에 ROI 차이가 발생할 수 있다. 따라서, 다양한 구현에는 필터 당/웰(PFPW)당-ROI 보정을 수행한다. 이러한 PFPW-ROI 보정은 각각의 필터에 대한 96 웰-플레이트에서 웰의 위치를 결정하는데 유용하다. ROI 보정은 미국 특허 6,518,068 B1에서 설명된 적응형 마스크 제작의 교시와 같은 방법을 사용하여 수행될 수 있다.
본 교시는 사용자 상호작용의 최소화 또는 제거를 통해 ROI 보정을 자동화할 수 있다. 다양한 구현예는, 히스토그램 분석 및 이진 검색 패턴을 이용하여 필터 당 최적의 노출 시간을 결정하는 소프트웨어를 제공함으로써, 프로세스를 자동화할 수 있다. 이러한 노출 시간은 플레이트의 이미지를 캡쳐하는 데 필요한 시간이다. 다시 말하면, 이러한 값은 필터의 스펙트럼 특성에 따라 달라질 수 있다. 일반적으로 ROI 보정은 검출부의 시야에서 웰의 위치를 정의하는 정보를 생성할 것이다. 이러한 정보는 글로벌 마스크 또는 서로 다른 필터에 대응하는 다중 마스크를 갖는 마스크 파일로서 저장될 수 있다.
상술된 것과 같은 보정 과정은 행과 열 프로젝션 및 세기 프로파일을 흔히 사용한다. 이로 인해 ROI 결정이 웰 내의 인공물 및 포화물, 격자 회전, 배율 계수 및 광학 방사 왜곡(optical radial distortion)에 영향을 받기 쉬울 수 있다. 따라서, 이러한 민감성을 최소화하고 검출된 방출 데이터에서의 왜곡 및 원하지 않는 다른 백그라운드 노이즈를 제거하기 위해서는 보다 견고한 ROI의 결정을 갖는 것이 유리할 수 있다.
백그라운드 노이즈는 예를 들어, 고유의 시스템 노이즈뿐만 아니라 기타 원하지 않는 신호를 지칭할 수 있다. 예를 들어, 데이터의 일부 백그라운드 노이즈는 기판 상의 물리적 원인, 예컨대 먼지 입자 또는 스크래치에 기인할 수 있다. 백그라운드 노이즈를 초래할 수 있는 물리적 원인의 다른 예는 샘플을 담거나 봉입하는 홀더 또는 케이스이다. 데이터의 다른 백그라운드 노이즈는 장비의 표면으로부터의 자연 방사선, 예컨대 반사 및 자연 형광에 기인할 수 있다. 다른 백그라운드 노이즈는 예를 들어, 방출 데이터 또는 광원을 검출하는 광학 시스템으로부터의 결과일 수도 있다.
생물학적 장비는 수백에서 수천의 샘플을 감지할 수 있고, 이들 모두는 1 나노리터 미만의 매우 작은 부피를 가질 수 있다. 이와 같이, 다른 백그라운드 노이즈 제거 방법을 단독으로 또는 다양한 구현예에 따른 본 문서에 설명된 보정 방법과 함께 이용하여 샘플 부피로부터 방출 데이터를 결정하고 분석할 수 있다. 보다 정확한 분석을 수행하기 위해 샘플 부피의 위치를 기판 내에서 보다 정확히 결정할 수 있다. 예를 들어, 디지털 PCR 분석에서, 비반응에 대해 샘플 부피에서의 반응을 보다 정확히 구별할 수 있으므로, 보다 정확한 결과를 얻을 수 있다 더욱이, 본원에 기재된 여러 구현예에 따르면, 비어 있는 웰 또는 관통홀은 반응하지 않은 웰 또는 관통홀의 샘플 부피와 구별될 수 있으며, 이는 또한 반응한 웰 또는 관통홀의 샘플 부피와 구별될 수도 있다.
본원에 기재된 다양한 구현예에 따르면, 백그라운드 노이즈 제거는 이미지 데이터 분석 및 프로세싱을 포함할 수 있다. 이 방법은 기판의 이미지로부터 제거될 수 있는 백그라운드 노이즈를 보간(interpolate) 하기 위해 이미지 데이터의 세기 값을 분석하는 것을 포함할 수 있다. 이러한 방식으로, 이미지 내의 관심 영역의 위치가 또한 결정될 수 있다. 백그라운드 노이즈 제거는 또한 관심 영역을 포함하는 것으로 알려진 이미지의 영역으로부터 데이터를 보간하는 것을 포함할 수 있다. 이미지 상에서 백그라운드 노이즈를 결정한 후, 백그라운드 노이즈를 이미지 데이터로부터 취출할 수 있다.
도 6은 본 발명의 일 구현예에 따른 인 실리코(in silico) 방법(600)의 예시를 묘사한다. 인 실리코 방법(600)은 생명공학 프로세스에 대한 서브루틴을 포함할 수 있는 컴퓨터 판독 가능한 형식으로 복수의 설정 작업흐름 서브루틴을 포함한다. 도 6은 단지 예시적인 방법이며, 당업자는, 본 개시에 비추어, 서브루틴의 실제 수가 적어도 약 2개의 서브루틴부터 여러 개(예를 들어, 2~10, 2~20, 2~30, 2~n (여기에서 n은 3~100, 3~1000 등의 임의의 서브루틴 수일 수 있음))의 서브루틴까지 다양할 수 있음을 이해할 것이다. 각각의 세트 서브루틴(310~370)은, 또한 컴퓨터 판독 가능한 형식으로, 단일 단계 또는 작업을 포함하거나, 또는 선택적으로 하나 보다 많은 단계 또는 작업을 포함할 수 있고, 각각의 단계는 추가의 선택적 사용자 정의(customizable) 단계 또는 작업을 더 포함할 수 있다. 각각의 선택적/사용자 정의 단계 또는 작업은 사용자가 검사, 검토, 설정 또는 사용자 정의할 수 있는 하나 이상의 선택적 파라미터(옵션)를 가질 수 있다. 일부 구현예에서, 본 발명의 인 실리코 방법은 그래픽 사용자 인터페이스(GUI)를 이용하여 각각의 선택적/사용자 정의 단계에 대한 적어도 하나의 파라미터를 선택하는 생명공학 프로세스의 각각의 선택적/사용자 정의 단계에 대해 사용자가 적어도 하나의 파라미터 각각을 선택하는 것을 포함한다. 작업흐름의 서브루틴의 모든 단계 및 모든 파라미터를 사용자가 검사하고, 선택적으로 편집할 수 있다. 당해 분야에 잘 알려진 바와 같이, 바이오인포매틱스 프로그램은 일반적으로 이러한 파라미터 및/또는 단계의 일부를 사용자에게 감추는데, 이는 특히 인 실리코 설계된 실험의 결과가 사용자의 예상 결과가 아닌 경우, 사용자 불만 및 비효율을 초래한다.
도 6에 개괄적으로 도시된 본 발명의 예시적 인 실리코 방법은, 예를 들어, 검사, 선택, 변경 또는 입력할 수 있는 하나 이상의 파라미터를 각각 가질 수 있는 사용자 정의 단계(A, B, C)의 복수의 서브루틴(10, 20, 30..)에 대한 컴퓨터 판독 가능한 명령을 포함하는 적어도 하나의 방법 파일을 컴퓨터 시스템에서 생성하고; 적어도 하나의 생명공학 생성물을 얻기 위해 컴퓨터 판독 가능한 명령을 포함하는 적어도 하나의 방법 파일의 실행을 포함하는 인 실리코 생명과학 프로세스를 컴퓨터 시스템에 의해 수행함으로써 이행, 수행 또는 실행될 수 있다.
일부 구현예에서, 적어도 하나의 사용자 정의/선택적 파라미터는 기본 파라미터로부터 선택되며, 기본 파라미터는 컴퓨터 시스템의 구성요소(예컨대, 기억 장치, 데이터베이스 등)에 저장된다.
다시 도 6을 참조하면, ROI 위치를 계산하는 제1 단계는 단계(610)에서 형광 임계치로부터 초기 ROI 중심을 추정하는 것이다. 복수의 생물학적 샘플을 함유하도록 구성된 샘플 플레이트가 제공되고, PCR 공정을 통해 생물학적 샘플을 분석할 수 있는 분석 장비에 삽입된다. 각각의 생물학적 샘플은 샘플 웰에 담기고, 광원에 의해 여기(excitation)될 수 있으며, 여기에 반응하여, 형광 검출부에 의해 검출될 수 있는 소정의 파장의 형광을 낼 수 있다. 도 2와 관련하여 위에서 제시된 바와 같이, 광원(202)은 레이저, LED, 또는 시스템(200)에 의해 검출될 스펙트럼 종과 상호 작용하는 스펙트럼을 방출할 수 있는 다른 형태의 여기 소스가 될 수 있다. 또한, 생물학적 샘플은 스펙트럼으로 구별 가능한 염료, 예컨대 FAM, SYBR Green, VIC, JOE, TAMRA, NED CY-3, Texas Red, CY-5, ROX(수동 기준) 또는 검출될 수 있는 신호를 방출하는 임의의 다른 형광색소 중의 하나 이상을 포함할 수 있다.
생물학적 샘플을 여기시키기 전에, ROI 결정에 대한 시작점을 제공하기 위해 입력 파라미터 및 알고리즘 파라미터가 설정된다. 입력 파라미터는 웰 크기, 웰 중심 간 거리, 밀리미터 당 광 픽셀, 및 플레이트 레이아웃을 포함할 수 있다. 플레이트 레이아웃은 웰의 총 개수 및 샘플 웰의 구성을 포함할 수 있다. 주로 이용되는 구성은 복수의 행과 복수의 열을 포함하는 직사각형 어레이일 수 있지만, 당업자는 사용되는 장비에 적합한 임의의 형상의 구성일 수 있음을 이해할 것이다. 또한, 웰의 총 개수는 달라질 수 있다. 당업자는 단일 샘플 플레이트 또는 샘플 수납 구조에서 총 1개 내지 수천 개의 웰 구성에 익숙할 것이다. ROI 탐색 알고리즘 파라미터는 웰 크기, 웰 중심 간 거리 및 최소 원형도(minimum circularity)에 대한 허용 가능한 범위를 설정할 수 있다. 원형도는 계산된 값이고 면적에 대한 둘레의 비일 될 수 있다.
입력 파라미터 및 알고리즘 파라미터가 일단 결정되면, 복수의 샘플이 적절한 광원의 에너지로 여기되고, 샘플 플레이트의 각각의 샘플로부터 방출된 형광의 이미지가 수집된다. 입력 파라미터 및 알고리즘 파라미터를 기초로 ROI 후보를 선택하기 위해 샘플 플레이트의 형광 이미지를 추가로 분석한다. 파라미터를 만족하는 ROI 후보는 추가 분석을 위해 저장되며, 각각의 웰의 크기 및 원형도는 단계(620)에서 결정된다. 파라미터를 만족하지 않는 ROI 후보는 형광을 내지 않은 모든 위치와 함께 폐기될 수 있다. 웰 사이의 간격 파라미터 및 웰 사이의 간격에 대한 허용 범위 파라미터를 기초로 ROI 사이의 거리를 결정하기 위해 잔류 ROI 후보를 추가로 평가한다. 웰 대 웰 파라미터를 기초로 서로 근접한 중심을 갖는 ROI는 동일한 샘플 웰로 간주될 수 있으며, 원형도가 가장 좋은 것이 해당 웰에 대한 ROI로 선택된다. 모든 ROI 후보가 일단 결정되면, 평균 웰 크기가 계산되고, 단계(630)에서 각각의 샘플 웰 ROI에 평균이 할당되며, 초기 추정 ROI가 저장된다.
예측된 웰 위치는 플레이트 레이아웃 파라미터에 기초하여 결정된 격자 패턴에 배열된다. 이 파라미터는 전체 플레이트 또는 서브어레이에서의 웰의 수, 열의 수, 및 행의 수를 포함할 수 있고, 각각의 웰은 플레이트 레이아웃 파라미터를 기초로 예상되는 XY 격자 좌표 세트를 갖는다. 이제는 각각의 초기 ROI의 위치를 더 잘 정의하기 위해 초기 추정 ROI에 대해 추가 분석이 개시될 수 있으며, 이를 글로벌 그리딩(global gridding)이라 할 수 있다. 글로벌 그리딩의 제1 단계는 초기 추정 ROI의 중심을 분석하여 인접한 ROI를 찾는 것이다. 이는 ROI 사이의 중심 간 거리를 플레이트 레이아웃 기반의 격자 좌표와 비교하여 결정될 수 있다. 이어서, ROI 간의 공간적 관계를 기초로 각각의 초기 추정 ROI에 대해 XY 격자 좌표가 결정될 수 있다.
ROI 위치의 정밀도를 향상시키기 위해서, 중심 간 ROI 좌표를 플레이트 레이아웃의 격자 좌표와 연관시키는 것이 유리할 것이다. 이는 매핑 함수(mapping function)를 결정하고 적용함으로써 달성될 수 있다. 매핑 함수는 2차원 이차 다항식 함수의 쌍이다. 이 함수는 X(또는 Y) 격자 위치를 X(또는 Y) 방향으로 ROI 중심 위치에 맵핑하도록 계산된다. 일단 매핑 함수가 결정되었다면, 예측된 격자 좌표에 적용하여 두 가지의 이점을 제공할 수 있다. 첫째로, ROI 중심 위치의 정밀도가 향상될 수 있고, 둘째로, 초기 ROI 탐색 중 누락된 ROI를 복구하는 것이 가능해질 수 있다.
ROI를 추가로 조정하면 광학 성능에 추가적인 이점을 제공 할 수 있다. 본 발명자들은 ROI 크기와 광학 시스템의 신호 대 노이즈 비(SNR) 사이에 관계가 있다는 것을 발견하였다. 당업자는 전기 및 광학 시스템의 SNR을 계산하는 여러 식들이 있다는 것을 알 것이다. SNR은 아래의 식 1로 특징지어질 수 있다.
Figure pct00001
여기서: SNR = 노이즈에 대한 신호의 비
Sdye plate = 염료 이미지의 ROI 내 모든 픽셀 세기의 합
SBG = 백그라운드 이미지의 ROI 내 모든 픽셀 세기의 합
Sdye = 염료의 ROI 내 모든 픽셀 세기의 합
N = ROI 내 픽셀의 개수
offset = 카메라 오프셋
G = 카메라 게인(gain)
δ2R,y = 판독 노이즈
여섯 쌍 필터를 포함하는 광학 시스템을 사용하여 실험을 수행하였다. 각각의 필터 쌍은 여기 필터(Xn) 및 방출 필터(Mn)를 포함하였다. 각각의 필터는 PCR 프로세스에 적합하도록 구성된 형광 염료에 해당하는 여기 주파수 및 방출 주파수에 해당된 좁은 파장 대역에 민감했다. 또한, 본 문서에 제시된 본 교시에 따라 ROI를 최적화하였다. 신호 대 노이즈에 미치는 ROI 크기의 영향을 검토하기 위해, 6쌍의 필터를 이용하여 96 웰 샘플 플레이트로부터 형광을 검출하였다. 각각의 ROI의 반경을 1 픽셀씩 점진적으로 확대하였다. 식 1을 이용하여 6개의 필터 쌍 각각 및 각각의 픽셀 증가에 대한 SNR을 계산하였다. 실험의 결과를 아래 표 1에 나타내었다:
Figure pct00002
굵은 글씨로 표시된 항목은 6개의 필터 쌍 각각에 대한 가장 높은 SNR을 나타내며, 2 픽셀 반경 확대()는 6개의 필터 쌍에 걸쳐 약 6%의 전반적인 SNR 개선을 제공한다.
도 7은 96 웰(710)을 갖는 샘플 플레이트의 이미지를 나타낸다. 각각의 웰(710)이 형광 이미지를 생성하였다. 본 명세서의 교시를 적용한 후, ROI는 최적화 되었고, 청색 원은 각각의 웰 위치에 대한 ROI를 식별한다.
순수 염료 보정
상술한 바와 같이, 생물학적 분석 시스템의 설치 및 셋업을 간소화하여 조작자가 그들의 의도된 목적을 위해 생물학적 분석 시스템을 더 빠르고 효율적으로 사용할 수 있게 할 필요성이 증가하고 있다. 이러한 필요성은, 예를 들어 생물학적 분석 장비 및 연관된 부품을 보정할 시에 명백하다. 하나의 예시적인 보정은, 예를 들어 qPCR 시스템과 같은 생물학적 분석 시스템에서의 형광 검출에 사용되는 형광 염료의 보정이다.
qPCR 장비에서 사용되는 형광 염료를 보정하는 것은, 장비 소프트웨어가 염료 표준으로부터 수집된 보정 데이터를 이용하여, 장비에 의해 수집된 총 형광 내의 각각의 염료의 개별적인 기여도를 특성화 및 구별하게 한다. 샘플이 실행된 후에, 장비 소프트웨어는 각각의 판독 동안에 원시 스펙트럼 신호의 형태로 데이터를 수신한다. 소프트웨어는 각각의 염료에 의해 기여되는 원시 스펙트럼을 순수 스펙트럼 보정 데이터와 비교함으로써 각각의 반응 부위에서 사용되는 형광 염료 각각의 기여도를 판정한다. 사용자가 분석 후에 실험을 저장하는 경우에, 장비 소프트웨어는 웰 당 각각의 형광 염료의 기여도뿐 아니라 그 실험에 대한 수집된 형광 데이터와 함께 순수 스펙트럼을 저장한다.
qPCR 장비에서의 염료 보정의 산물은, 예를 들어, 각각의 반응 부위에 대해 각각의 염료 표준의 형광 시그너처를 표현하는 스펙트럼 프로파일들의 수집이다. 각각의 프로파일은, 예를 들어 보정 플레이트 또는 어레이 카드와 같은 샘플 홀더의 웰과 같은 반응 부위로부터 형광에 대응하는 스펙트럼의 세트로 이루어진다. 각각의 염료의 보정에 이어서, 장비 소프트웨어는 각각의 반응 부위에서 각각의 염료에 대한 스펙트럼 프로파일을 "추출"한다. 소프트웨어는 각 프로파일에 대한 결과 데이터를 형광 대 필터의 그래프에 도표화한다. 소프트웨어가 염료 보정 데이터를 추출하는 경우에, 그것은 전체 보정 플레이트 또는 어레이 카드에 대한 공통 스펙트럼과 관련하여 각각의 웰에 의해 생성된 형광 신호를 평가한다. 염료 스펙트럼은, 일반적으로, 그들이 그들의 그룹과 동일한 필터 내에서 피크이지만 다른 파장에서는 약간 발산하는 경우에 수용가능하다.
보정 플레이트와 같은 샘플 홀더 상에서 염료 보정을 실행할 때, 반응 부위(예컨대, 웰)는, 일반적으로, 플레이트의 각각의 웰에서의 순수 스펙트럼 값의 생성을 허용하도록 동일한 농도의 염료를 함유한다. 도 8은 단일 염료(이 경우에는, FAM 염료)가 96-웰 보정 플레이트의 각각의 웰을 점유한 보정 플레이트의 이미지를 표시한다. 이는, 실행 시의 각각의 웰에 의해 생성된 형광 신호와 그 웰에 대해 판독된 순수 스펙트럼의 비교를 가능하게 한다. 보정 플레이트의 각각의 웰에 대해 단일 염료를 이용함으로써, 웰에 대해 수득된 신호들은 유사해야 한다. 스펙트럼 위치 및 피크 위치의 변동은, 예를 들어, 개별 웰들 사이에서의 광학 속성 및 여기 에너지의 최소 차이만큼 야기될 수 있다. 염료 보정 시에 이들 변형을 고려하는 것은, 이론적으로, 더 정확한 염료 보정을 가져온다.
그러나, 보정 플레이트당 단일 염료의 사용은, 특히 다수의 염료를 보정할 때 시간 집약적이고 복잡할 수 있었다. 형광 염료의 비-제한적인 예로는, FAM, VIC, ROX, SYBR, MP, ABY, JUN, NED, TAMRA 및 Cy5이 포함된다. 따라서, 동일한 품질의 염료 보정 결과를 유지하면서, 염료 보정 과정을 단순화하고 보정에 요구되는 시간을 단축시킬 필요가 있다.
도 9 및 도 10은 본원에 설명된 구현예에 따른 형광 염료(들)를 보정하는 예시적인 방법(900)을 묘사하는 순서도이다. 방법(900)의 단계는 도 4에서 나타나는 프로세서(404)에 의해 구현될 수 있다. 또한, 프로세서(404)에 의해 방법을 실행하기 위한 명령은 메모리(406)에 저장될 수 있다.
도 9를 참조하면, 단계(902)에서, 프로세싱을 위해 염료를 기판의 반응 부위 내로 로딩함으로써 보정 플레이트가 마련된다. 이러한 경우에 있어서의 기판은 96-웰 플레이트이지만, 예를 들어 384-웰 플레이트를 비롯한 상이한 기판이 사용될 수 있다. 다양한 구현예에서, 기판은 복수의 샘플 영역을 갖는 유리 또는 플라스틱 슬라이드일 수 있다. 기판의 일부 예는 다중-웰 플레이트, 예컨대 표준 마이크로역가(microtiter) 96-웰 플레이트, 384-웰 플레이트, 또는 마이크로카드, 또는 실질적으로 평면인 지지부, 예컨대 유리 또는 플라스틱 슬라이드, 또는 임의의 다른 유형의 어레이 또는 마이크로어레이를 포함할 수 있지만, 이들로 한정되지 않는다. 기판의 다양한 구현예에서의 반응 부위는 기판의 표면 상에 형성된 규칙적 또는 불규칙적 어레이로 패턴화되는 함몰부(depression), 압입부(indentation), 융부(ridge), 및 이들의 조합을 포함할 수 있다. 지금까지, 웰 또는 플레이트에 대한 언급은 단지 예시적인 목적을 위한 것일 뿐이고, 어떠한 방식으로든, 본원에서 사용가능한 반응 부위 또는 샘플 홀더의 유형을 한정하지 않는다.
보정 플레이트는 도 11a에 도시된 바와 같은 체커보드 패턴으로 마련될 수 있다. 보정 플레이트(1100, 1120, 1140)에 도시된 바와 같이, 플레이트 자체는 96-웰 포맷일 수 있지만, 보정 플레이트 상의 웰의 개수는, 예를 들어 보정을 필요로 하는 염료의 개수에 따라 필요하다면 변화될 수 있고, 샘플 블록(314)(도 3 참조)의 포맷은 보정 플레이트, 또는 상이한 웰 밀도의 플레이트를 이미징하기 위한 장비(예를 들어 PCR 장비(300))의 능력을 수용할 수 있다.
염료 분포의 체커보드 패턴은 보정 플레이트 당 다수의 염료가 보정되게 한다. 보정 플레이트당 하나의 염료를 보정하는 것과는 반대로, 체커보드 패턴은, 유리하게도, 사용자가 더 적은 플레이트를 사용하여 염료 세트를 보정하게 함으로써, 염료 보정에 필요한 시간 및 프로세스 단계를 감소시킨다.
도 11a에 도시된 구현예에서, 3개의 플레이트가 10개의 개별 염료를 보정하는 데 사용된다. 각각의 보정 플레이트(1100/1120/1140)는 각각의 웰이 반복적인 패턴으로 특정 염료를 나타내도록(염료가 존재하는 웰(dye presented well)) 플레이트의 각각의 행 내의 웰을 따라 반복적인 패턴의 교번 염료들 중의 4개의 상이한 염료를 수용하도록 구성된다. 예를 들어, 플레이트(1100)는 웰(1102)(FAM), 웰(1104)(VIC), 웰(1106)(ROX), 및 웰(1108)(SYBR)에 의해 예시되는 교번 웰 내에 FAM, VIC, ROX, 및 SYBR 염료를 수용하고; 플레이트(1120)는 웰(1122)(완충제, buffer), 웰(1124)(MP), 웰(1126)(ABY), 및 웰(1128)(JUN)에 의해 예시되는 교번 웰 내에 완충제, MP 염료, ABY 염료, 및 JUN 염료를 수용하고; 플레이트(1140)는 웰(1142)(NED), 웰(1144)(TAMRA), 웰(1146)(CY5), 및 웰(1148)(완충제)에 의해 예시되는 교번 웰 내에 NED 염료, TAMRA 염료, CY5 염료, 및 완충제를 수용한다. 오로지 10개의 염료만이 보정되고 있으므로, 완충제는 보정될 염료를 수용하지 않는 웰에 대한 충전재(filler)로서 플레이트(1120, 1140)에서 사용된다.
도 11a 및 도 11b의 구현예는 단지 예시일 뿐이고, 보정된 염료의 총 개수, 플레이트당 염료의 개수, 및 플레이트의 개수는 모두가, 예를 들어 사용자의 보정 필요성, 플레이트 상의 웰의 개수, 및 보정을 다루는 장비의 용량에 기초하여 필요에 따라 변화할 수 있다는 것을 이해해야 한다. 예를 들면, 도 11a에 도시된 구현예에서, 12개의 염료가 보정되고 있는 경우에, 플레이트(1120, 1140)에서는 완충제가 필요하지 않을 것인데, 이는 4개의 염료가 총 12개의 염료에 대해 3개의 보정 플레이트(1100/1120/1140) 각각에서 보정될 수 있기 때문이다.
더욱이, 플레이트당 염료의 개수는 2개 이상일 수 있고, 플레이트당 염료의 최대 개수는, 예를 들어 보정 플레이트 상의 웰의 개수, 전체 플레이트를 적절히 모델링하는 데 사용되는 장비의 능력(추가 설명을 위해 아래를 참조), 및 선택된 플레이트로부터 사용가능한 형광 데이터를 획득하기 위한 이미징 시스템의 능력에 기초한다. 예를 들면, 도 11a에 도시된 96-웰 플레이트를 사용하는 것 대신, 384-웰 보정 플레이를 사용할 수 있을 정도로 충분히 견고한 장비 및 연관된 이미징 시스템을 가질 수 있다. 추가적인 웰 밀도가 제공됨에 따라, 플레이트당 더 많은 염료, 예를 들어 플레이트당 16개의 염료를 보정할 수 있고, 여전히, 충분한 글로벌 모델(아래에서 더 상세히 논의됨)을 얻는 데 필요한 염료당 동일한 수(예컨대, 24개)의 데이터 포인트(즉, 염료가 존재하는 웰)를 얻을 수 있다. 예를 들면, 384-웰 플레이트로, 10개의 염료를 두 개의 플레이트와 플레이트 당 5개의 염료를 사용하여 보정할 수 있다.
샘플 홀더의 유형 및 반응 부위의 유형조차도 가능한 염료의 개수에 영향을 미칠 수 있다. 위에서 제시한 바와 같이, 보정을 위해, 다른 유형의 샘플 홀더 및 반응 부위가 이용될 수 있다.
도 9로 돌아가면, 단계(904)에서, 마련된 체커보드 보정 플레이트가 기구 내로 로딩될 수 있다. 장비 내에 한번에 로딩 가능한 플레이트의 개수는 사용된 장비의 능력 및 용량에 의존한다. 96-웰 블록을 갖는 표준 qPCR 열 순환기는 한번에 하나만이 보정 플레이트 상에 수용될 것이다. 그러나, 다중 블록 열 순환기는 보정 플레이트를 각각 수용할 수 있는 다수의 블록을 제공할 수 있다. 더욱이, 보정 플레이트가 사용되지 않는 경우에, 사용된 샘플 홀더의 포맷(예컨대, 마이크로어레이 또는 마이크로칩 어레이)에 따라, 다수의 샘플 홀더들이, 예를 들어 장비 내에 맞는 로딩용 어셈블리를 사용하여, 단일 장비 내에 수용될 수 있다.
도 9의 단계(906)에서, 장비는, 그의 연관된 광학 이미징 시스템(예를 들어, 도 3를 참조)을 사용하여, 로딩된 보정 플레이트 또는 플레이트들의 이미지들을 직렬로 또는 병렬로 획득한다. 획득된 이미지 및 연관된 데이터는, 예를 들어 도 4의 컴퓨팅 시스템(400)의 메모리(406) 또는 저장 장치(410) 에 저장될 수 있다. 광학 이미징 시스템은 각각의 광학 채널에서의 각각의 플레이트의 이미지를 획득할 수 있다. 채널의 개수는 이미징 시스템에 제공된 여기 및 방출 필터의 개수에 의존한다. 예를 들면, 6개의 여기 필터(X 필터) 및 6개의 방출 필터(M 필터)를 갖는 광학 이미징 시스템에 대해서, 채널의 총 개수는 다음의 필터 조합으로 표현되는 21개이다: X1Ml, X1M2, X1M3, X1M4, X1M5, X1M6, X2M2, X2M3, X2M4, X2M5, X2M6, X3M3, X3M4, X3M5, X3M6, X4M4, X4M5, X4M6, X5M5, X5M6, 및 X6M6. 각 채널에서 획득된 이미지 또는 노출의 개수는 다를 수 있다. 예를 들면, 이미징 시스템은 채널당 2개의 이미지 또는 노출을 획득할 수 있다. 취해진 이미지 또는 노출의 개수는 사용자 필요에 의존하는데, 이는 채널당 더 적은 이미지 또는 노출을 취하는 것이 이미지 또는 노출을 획득하는 데 필요한 시간을 감소시키는 반면에 채널당 더 많은 이미지 또는 노출은 품질이 좋은 데이터를 제공할 가능성을 증가시킨다.
도 9의 단계(908)에서, 장비는, 광학 이미징 시스템(예를 들어, 도 3를 참조)에 의해 획득된 이미지 또는 노출로부터 수집된 데이터를 이용하여, 보정 플레이트 상의 각각의 염료에 대한 피크 채널을 식별한다. 각각의 반응 부위에 대한 이러한 피크 채널은 분석된 특정 염료가 그 반응 부위에 대한 최대 형광을 보여주는 채널이다. 피크 채널 식별은, 예를 들어 95% 이상의 반응 부위가 점유된 염료이고, 이러한 경우에 보정 동안에 5% 미만의 이상치 반응 부위를 허용할 때 발생할 수 있다. 허용 가능한 이상치의 백분율은 변화할 수 있다. 이후, 이상치 반응 부위는 향후 계산 및 분석으로부터 폐기될 수 있다 이상치는, 예를 들어, 잘못된 염료가 로딩될 때, 염료가 부정확한 구성물 내로 로딩될 때, 염료의 부적절한 로딩이 있을 때, 또는 광학 구성요소가 더럽혀졌을 때(예컨대, 먼지 입자)되게 될 때 발생할 수 있다. 보정 플레이트 상의 각각의 염료에 대한 피크 채널은, 예를 들어 메모리(406) 상에 저장된 데이터를 활용하여 컴퓨팅 시스템(400)의 프로세서(404)에 의해 식별될 수 있다. 식별 결과는, 예를 들어 컴퓨팅 시스템(400)의 메모리(406) 또는 저장 장치(410) 상에 저장될 수 있다.
대안으로, 각각의 반응 부위 상에서 각각의 필터 조합에 대해 광학 이미징 시스템에 의해 획득된 이미지 또는 노출로부터 모인 수집된 형광 데이터는 본 기술 분야에 공지되어 있는 배경 및 균일성 보정 방법을 이용하여 결정된 배경 부품 및 균일성 계수를 이용하여 피크 채널 식별 전에 배경 및 균일성 정정에 의해 교정될 수 있다.
도 9의 단계(910)에서, 장비는, 광학 이미징 시스템(예를 들어, 도 2 참조)에 의해 획득된 이미지 또는 노출로부터 수집된 데이터를 이용하여, 각각의 채널을, 모든 염료 표현 웰에 대한 단계(908)의 식별된 피크 채널로 정규화한다. 각각의 채널은, 예를 들어 메모리(406) 상에 저장된 데이터를 활용하여 컴퓨팅 시스템(200)의 프로세서(404)에 의해 식별된 피크 채널로 정규화될 수 있다. 정규화 결과는, 예를 들어 컴퓨팅 시스템(400)의 메모리(406) 또는 저장 장치(410) 상에 저장될 수 있다.
모든 염료기 존재하는 모든 웰은 정규화하게 되는 기준선 퀀트(baseline quant) 값을 부여받는다. 일반적으로, 퀀트 값이 더 클수록, 검출된 형광이 더 커진다. 따라서, 주어진 염료에 대한 식별된 피크 채널은 피크 채널 이상치를 배제하고서 염료 표현 웰 내의 그 염료에 대한 최대 퀀트 값을 가질 것이다. 그 피크 채널에서의 퀀트 값과는 무관하게, 정규화를 위해, 그 채널에서의 그 퀀트 값은 1의 값으로 재설정된다. 이어서, 다른 채널에서의 그 동일한 염료에 대한 남은 퀀트 값은 피크 채널에 대해 1의 재설정 값에 따라 조정된다. 예를 들어, 염료 X에 대해, 피크 채널 A가 웰 내에서 100의 퀀트 값을 가졌고, 다른 채널 B가 웰 내에서 40의 퀀트 값을 가졌다면, 정규화 시에, 피크 채널 A는 1.0으로 설정되게 되고, 채널 B는 0.40으로 설정되게 된다. 이러한 정규화 값은 보정 계수로도 지칭될 수 있고, 피크 채널에 대한 보정 계수는 위에서 논의된 바와 같이 1.0으로 설정된다.
도 11a 및 11b에 도시된 구현예에서, 4개의 염료가 96-웰 플레이트의 웰 사이에 동등하게 분산 된 경우에, 염료당 염료 표현 웰의 개수는 24일 것이다. 염료 존재하는 웰의 개수는, 예를 들어 샘플 홀더(예컨대, 보정 플레이트) 상의 반응 부위(예컨대, 웰)의 개수, 샘플 홀더 상에 분산된 염료의 개수와 같은 앞에서 논의된 이유로 변화할 수 있다. 예를 들면, 96-웰 플레이트 상에서, 3개의 염료가 분산된 경우에, 염료 표현 웰의 개수는 염료당 32개일 것이다. 96-웰 플레이트 상에 6개의 염료가 분산되는 경우에, 염료당 16개의 염료가 존재하는 웰이 있을 것이다.
이제 도 10을 참조하면, 단계(912)에서, 장비는 염료당 모든 웰에 대한 글로벌 모델링을 수행한다. 샘플 홀더 포맷의 모든 웰에 대한 염료를 보정하기 위해, 장비는 특정 염료에 대한 염료 표현 웰로부터의 데이터를 이용하여, 특정 염료가 없는 웰을 비롯한 모든 웰에 대해 모델링할 수 있다. 글로벌 모델링은, 예를 들어 컴퓨팅 시스템(400)의 프로세서(404)에 의해, 모든 웰에 대해 모델링할 특정 염료에 대한 염료 표현 웰로부터의 데이터를 이용함으로써 수행될 수 있다. 예를 들어 메모리(406) 또는 저장 장치(410) 상에 저장될 수 있다. 도 11a를 참조하면, 플레이트(1100)의 24개의 웰(1102) 내에 존재하는 FAM 염료에 대해, 그 플레이트 상의 다른 112개의 웰은 FAM 염료가 존재하지 않을 것이다. 동일한 24개의 존재/72개의 미존재의 분포가 도 11a에서 각각의 염료에 적용될 것이다. 염료가 존재하지 않는 웰의 개수는 염료가 존재하는 웰의 개수에 의존하는데 이는, 위에서 논의된 바와 같이, 다양한 이유에 의존할 수 있다. 이와는 무관하게, 주어진 플레이트에 대한 염료가 존재하는 그리고 염료가 존재하지 않는 웰의 합은 그 플레이트 상의 웰의 개수와 동일하다 도 11b는, 도 11a에서 플레이트(1100)에 의해 도시된 것과 동일한 구성으로 FAM, VIC, ROX 및 SYBR 염료를 갖는 4- 염료 체커보드 96-웰 보정 플레이트의 이미지이다.
대안적인 구현예에서, 장비는 모든 채널, 또는 식별된 피크 채널의, 예를 들면, 0.01 또는 1%를 초과하는 정규화된 값을 갖는 채널에 대한 글로벌 모델링을 수행한다. 이러한 임계치 미만의 그들 채널에 대해, 장비는 글로벌 모델링을 수행하는 대신에 로컬 모델링(도 10의 단계(922) 참조)을 수행할 것이다. 글로벌 모델링은 소정 채널에서 그러한 낮은 레벨에서 불필요하게 되어, 검출된 형광이, 예를 들어 실제 염료가 보정되는 기여도가 아니라, 주로 노이즈 또는 다른 교란의 결과가 되게 할 수 있다.
글로벌 모델링 알고리즘은, 특정 염료 표현 웰의 측정된 염료 보정 계수에 기초하여, 염료 보정 시에, 각각의 염료에 대해 각각의 필터 채널에 대한 염료 보정 계수의 모델을 유도하도록 기능할 수 있다. 예를 들어, 24개의 웰이 특정 염료에 대한 96-웰 체커보드 플레이트 상에 표현되는 경우에, 글로벌 모델링은 그들 24개의 웰의 염료 보정 계수를 활용하여, 염료가 존재하지 않는 다른 72개의 웰을 비롯한 모든 웰에 대해 보정 계수를 유도하고, 그에 따라, 염료당 채널당 전체 플레이트에 대한 모델을 생성하게 한다.
이차원(2D) 이차 다항식 함수는 염료 보정 계수에 대한 글로벌 모델링으로서 적용될 수 있는 함수의 일 예이다. 다른 글로벌 모델링 함수가 알려져 있고 본원에 사용될 수 있다. 비선형 최소 자승 솔버(non-linear least square solver)는, 모델링 잔차(모델로부터 계산된 값과 측정된 염료 보정 계수의 차이)를 최소화하여 특정 염료가 존재하는 웰 상의 염료 보정 계수로부터 2D 이차 다항식 함수를 유도하기 위해 사용될 수 있다. 레벤버그-마쿼르트(Levenberg-Marquardt) 신뢰 영영 알고리즘이 이러한 솔버의 최적화 알고리즘으로서 사용될 수 있다. 많은 다른 최적화 알고리즘이 본원에서 사용가능하지만, 하나의 다른 예가 도그렉(Dogleg) 방법인데, 이 방법의 핵심 아이디어는 가우스-뉴턴(Gauss-Newton) 방법과 코시(Cauthy) 방법 모두를 이용하여, 최적화 단계를 계산함으로써 비선형 목적을 최적화하는 것이다. 이러한 접근법은 신뢰 영역으로 알려진 검색 공간의 부분 집합에 대해서 모델 함수(종종 이차식)를 이용하여 목적 함수를 근사화하는 것이다. 모델 함수가 진(true) 목적 함수를 최소화하는 데 성공하는 경우에, 신뢰 영역이 확대된다. 역으로, 근사화가 불량한 경우에, 영역은 축소되고, 모델 함수는 다시 적용된다. 예를 들어, 손실 함수가, 또한, 높은 잔차(계산된 보정 계수와 측정된 보정 계수 사이의 최대 차이)의 영향을 감소시키는 데 이용될 수 있다. 이들 높은 잔차는, 보통, 최적화 시에 이상치를 구성한다.
도 10의 단계(914)에서, 모든 웰이 주어진 염료 또는 염료들에 대해 모델링된 후에, 장비는 적합도(goodness of fit, GOF) 검사를 수행한다. 이는 글로벌 모델링 단계가 충분히 신뢰할 수 있다는 것을 보장한다. 적합도 확인은, 예를 들면, 컴퓨팅 시스템(400)의 프로세서(404)에 의해 수행될 수 있고, 결과는, 예를 들면, 메모리(406) 또는 저장 장치(410)에 저장된다. 적합도 측정은 전형적으로, 관측된 값과 논의하고 있는 모델에서 예측되는 값 사이의 불일치를 요약한다. GOF는, 예를 들면, 결정계수 R-제곱 및 평균 제곱근 오차(RMSE) 값을 포함하는 여러 방법으로 결정될 수 있다. R-제곱은, 예를 들면, 모델의 적합도에 대한 일부 정보를 제공할 통계 자료이다. 회귀 분석에서, R-제곱 결정 계수는 회귀선이 실제 데이터 지점에 얼마나 잘 근사화되는지에 대한 통계적 척도이다. 1의 R-제곱은 회귀선이 완벽하게 데이터에 부합됨을 지시한다. RMSE는 관측된 값과 논의하고 있는 모델에서 예측되는 값의 차이 또는 잔차의 평균 제곱의 제곱근이다. RMSE는 모델의 예측 정확도에 대한 좋은 척도이다. 0의 RMSE는 모델에서 예측되는 값이 관측된 값과 정확하게 일치함을 지시한다.
도 10의 단계(916)에서, 양호한 적합(good fit)이 존재하면, 장비는 도 9의 단계(918)에서 염료 행렬을 출력한다. 예를 들면, 통계적으로 양호한 적합은, R-제곱 값이 예를 들어 0.85 이상이거나 RMSE 값이 예를 들어 0.01 이하인 경우, 도 10에 도시되는 바와 같이 R-제곱 분석에서 일어날 수 있다. 염료 행렬은, 예를 들면, 컴퓨팅 시스템(200)의 프로세서(204)에 의해 준비되고, 디스플레이(212)로 출력된다.
도 10의 단계(920)에서, 불량한 적합(bad fit)이 존재하면, 장비는 도 10의 단계(922)에서 로컬 모델링을 수행한다. 이는 예를 들면, GOF 확인에 대한 계산된 R 값이 예를 들어 0.85 미만이고 RMSE 값이 예를 들어 0.01을 초과하는 경우, 필요할 수 있다. 로컬 모델링은, 예를 들면, 염료가 존재하지 않는 나머지 웰에 대한 모델링을 위해 특정 염료에 대한 염료가 존재하는 웰로부터의 데이터를 사용함으로써, 컴퓨팅 시스템(400)의 프로세서(404)에 의해 수행될 수 있다. 수득된 모델은, 예를 들면, 메모리(406) 또는 저장 장치(410)에 저장될 수 있다.
로컬 모델링 방법은, 예를 들면, 플레이트 상의 동일한 염료에 대해 염료가 존재하는 주변 웰로부터의 보정 계수를 사용하는 것을 포함할 수 있다. 예를 들면, 특정 염료에 대해서 염료가 존재하지 않는 웰에서의 보정 계수 값을 결정하기 위해, 로컬 모델은 주변 웰의 5x5 로컬 윈도우 내에 있거나 모든 플레이트로부터의 동일한 염료의 특정 염료가 존재하는 모든 웰의 중앙값을 취할 수 있다. 그 중앙값은 플레이트의 완전한 모델링이 완료될 때가지 결정된다. 이후, 로컬 모델링 출력은 글로벌 모델링 출력을 대체할 수 있다.
로컬 모델링의 결론에서, 염료 행렬은, 도 10의 단계(918)에서 장비가 염료 행렬을 출력하기에 충분하다. 이러한 염료 행렬은 각각의 보정된 염료의 형광 서명의
프로파일로서 역할을 한다. 각각의 샘플 시행 후, 장비는 각각의 판독에 대한 원시 스펙트럼 신호의 형태로 데이터를 수신한다. 장비는, 원시 스펙트럼을 염료 행렬의 순수 스펙트럼 보정 데이터와 비교함으로써 각각의 반응에서 사용된 형광 염료의 기여도를 결정한다. 이 장비는 염료 표준(즉, 염료 행렬)으로부터 수집된 보정 데이터를 사용하여, 장비에 의해 수집된 전체 형광에서 각 염료의 개별 기여도를 특징짓고 구별한다.
장비 정규화 보정
최근, 게놈 분석(약 30,000개 인간 유전자의 게놈 분석 포함)은 기초 및 응용 생화학 및 약학 연구의 주요 관심사이다. 이러한 분석은 매우 다양한 장애에 대한 진단법, 약품, 및 치료법을 개발하는 데 도움을 줄 수 있다. 그러나, 인간 게놈의 복잡성 및 상호 연관된 유전자 기능은 대개 이러한 작업을 어렵게 한다. 흔히 접하는 한 가지 어려움은 다수의 장비에서 실행된 실험의 결과를 연구자들이 용이하게 비교할 수 없다는 것이다. 광원, 광학 요소, 및 형광 검출기와 같은 구성 요소의 파라미터에 있어서 물리적 변화는, 예를 들어, 동일한 생물학적 샘플일 수 것에 대한 분석 결과에 있어서 변화를 초래한다. 따라서, 구성 요소의 변화를 최소화하는 데 도움이 되는 방법 및 장치에 대한 끊임없는 요구가 존재한다.
RT-PCR에서, 증폭 곡선은 보통 리포터 염료의 신호를 동일한 용액에서 수동 기준 염료에 대해 정규화함으로써 결정된다. 리포터 염료의 예는 FAM, SYBR Green, VIC, JOE, TAMRA, NED CY-3, Texas Red, Cy-5를 포함할 수 있지만, 이에 한정되는 것은 아니다. 수동 기준의 예는 예를 들어 ROX일 수 있지만, 이에 한정되는 것은 아니다. 이러한 정규화는 “Rn”으로 표시되는 정규화된 형광 값으로서 보고될 수 있다. 전체 신호 레벨이 액체 부피, 또는 전체 조도에 영향을 받을지라도, 수동 기준 정규화는 일관된 Rn 값을 가능하게 한다. 그러나, 리포터 염료와 기준 염료 간의 신호의 비가 변할 경우(예컨대, 조명 스펙트럼에서 장비 간 차이), 수동 기준 정규화가 제대로 작용하지 않을 수 있다. 이것을 조정하기 위해서, 정규화 용액을 제조하여 수동 기준에 대한 리포터의 비를 정규화할 수 있다. 이러한 정규화 용액의 예는 "FAM/ROX” 정규화 용액으로 지칭될 수도 있는 FAM과 ROX의 50:50 혼합물일 수 있다.
염료 혼합물로부터 형광을 판독하여 “정규화 계수”를 얻어서 Rn 값을 조정하는 것을 포함하는 이러한 현재의 장비 정규화 방법은 추가적인 비용을 필요로 한다. 일반적으로, 이는 정규화 용액 및 정규화 플레이트의 제조, 추가 보정을 실행하기 위한 추가 시간을 필요로 할 수 있다. 또한, 이러한 방법은 표준 쌍 필터 세트로 보정하는 염료 혼합물에 대해서만 작용한다. 쌍 필터 세트는 여기 필터와 방출 필터의 조합일 수 있다. 부가적인 연료가 추가되면 다른 정규화 용액 및 보정이 필요할 것이라는 것을 당업자는 이해할 것이다.
정규화 용액을 제조하는 제조 프로세스는 염료의 반응에서 변화의 원인을 제공할 수도 있다. 절대 형광 표준이 없기 때문에 염료 농도를 제어하기 어려울 수 있다는 것이 밝혀졌다. 이러한 오류 및 변화를 최소화하기 위해, 용액의 염료 비를 제조 프로세스로부터 원하는 혼합의 +/-15% 이내, 또는 원하는 혼합의 +/-10% 이내로 목표 설정하는 것이 유리할 수 있다. 제조 프로세스는 일반적으로 50:50 염료 혼합물을 단순히 혼합하고 이러한 사양을 충족시키기에 충분할 정도로 잘 제어되지 않아서, 형광계로 염료 혼합물을 조정하기 위해 프로세스에서 추가 단계가 필요하다.
상기 개시된 허용 가능한 퍼센트 변화는 염료 혼합물의 변화와 Ct 간의 관계를 연구함으로써 결정되었다. Ct는 "임계 사이클(threshold cycle)"의 일반적인 약어이다. 정량적 PCR(qPCR)은 샘플에 존재하는 표적 서열 또는 유전자의 양을 결정하는 방법을 제공할 수 있다. PCR 중에, 생물학적 샘플은 일련의 35 또는 40 온도 사이클을 거치게 된다. 한 사이클은 여러 온도를 가질 수 있다. 각각의 온도 사이클에 대하여, 표적 서열의 양은 이론적으로 두 배가 될 수 있으며, 여기에 제시되지 않은 여러 요인에 의존한다. 표적 서열은 형광 염료를 함유하고 있으므로, 표적 서열의 양이 35 또는 40 온도 사이클에 걸쳐 증가함에 따라 즉, 증폭됨에 따라, 샘플 용액은 각각의 온도 사이클에서 점점 밝게 형광을 낸다. 형광 검출기로 측정할 필요가 있는 형광의 양을 흔히 “임계값”이라고 하며, 형광이 검출되는 사이클 수를 “임계 사이클” 또는 Ct라고 한다. 따라서, 증폭이 얼마나 효율적인지와 Ct를 알면, 원래 샘플 내의 표적 서열의 양을 결정할 수 있다.
전술한 허용 퍼센트 변화는 장비의 Ct 변이의 표준 편차와 관련될 수도 있다. 염료 혼합물에서 +/- 15% 변화는 2 표준 편차일 수 있는 0.2 Ct의 표준 편차를 초래할 수 있는 것으로 판단되었다.
위에서 제시된 바와 같이, 여러 장비로부터 실험 결과를 신뢰할 수 있게 비교하는 능력은 바람직한 것이나 장비간 변동성은 때때로 문제가 된다. 이러한 변동성은 두 가지 원인으로부터 기인된다; 예를 들어 램프 및 필터와 같은 장비 내 구성요소의 변동성, 및 예를 들어 램프 및 필터 노화와 같은 시간에 따른 변동성. 다수의 장비로부터의 실험 결과를 안정적으로, 용이하게, 그리고 저렴하게 비교할 수 있는 프로세스를 구현하는 것이 유리할 것이다. 본원의 교시는 이러한 프로세스를 개시한다.
광학 시스템에서 샘플의 형광 신호의 양은 여러 요인에 따라 달라질 수 있다. 일부 요인은 형광의 파장, 그 형광 파장에서의 검출기 효율성, 방출 필터의 효율성, 여기 필터의 효율성, 및 염료의 효율성을 포함할 수 있지만, 이에 한정되는 것은 아니다. 본 교시는, 장비의 물리적 광학 요소가 정규화될 수 있는 경우 장치 간 변동성이 최소화될 수 있음을 제안한다.
일 구현예에서,정규화 계수는 염료 혼합물 보다는 순수 염료 스펙트럼으로부터 유도될 수 있다. 순수 염료는 농도가 정확할 필요가 없고 하나의 형광 성분만 존재하기 때문에 염료 혼합물보다 제조하기에 더 용이할 수 있다. 장비의 2개의 필터 세트를 10개의 순수 염료를 사용하여 정규화하고, 그 결과를 염료 혼합물을 사용하여 얻은 정규화와 비교함으로써 이 개념을 시험하였다. 각각의 여기 필터 및 방출 필터에 대한 교정 계수를 결정함으로써 정규화를 구현하였다. 수득된 교정 계수는 심지어 서로 다른 장비로부터의 임의의 염료 조합을 정규화하는 데 사용될 수 있다.
다른 구현예에서, 상기 정규화를 여러 종류의 다수의 장비에 적용하였다. 8개의 염료 혼합물 용액 및 10개의 순수 염료 용액을 만들었다. 각각의 용액을 3개의 96 웰 플레이트의 8개의 웰에 피펫팅하였다. 하나 걸러 웰에 피펫팅함으로써 잠재적인 공간적 크로스토크(crosstalk)를 최소화하였다. 사용된 염료 혼합물은 도 12a에 나타내고, 사용된 순수 염료는 도 4b에 나타내었다. 또한, 사용된 장비는 6개 세트의 필터를 포함하였다. 도 12b에서는 각각의 순수 염료에 대한 주요 광학 채널용 필터 쌍을 식별한다. 여기 필터는 "X"로 묘사되고, 방출 필터는 "M"으로 묘사된다.
정규화 과정의 유효성을 정량화하기 위한 노력의 일환으로, 정규화 전후에 염료 비를 측정하였다. 도 13은 17개의 시험 장비에 대해 평균 비로부터의 염료 혼합물의 퍼센트 편차를 나타낸다. 장비는 X축에 표시되어 있고, 퍼센트 편차는 Y축에 표시되어 있다. 당업자는 장비에 걸친 편차가 앞서 설명한 바람직한 +/-15%보다 대체로 더 크다는 것을 알 것이다. 따라서, 이 데이터는 본 교시에서와 같은 개선된 정규화 과정에 대한 필요성을 보여준다.
본 교시는 17개의 장비 모두에 적용되었다. 정규화 방법은 각각의 염료 비에 대해서가 아니라 각각의 개별 필터에 대한 교정 계수를 결정한다. 장비가 6개의 여기 필터 및 6개의 방출 필터를 제공했기 때문에, 12개의 계수를 결정하였다. 이 과정은 도 16 및 순서도(1600)에 도시되어 있다. 단계(1605)에서, 다수의 필터 조합에 걸쳐 다수의 염료에 대한 보정 스펙트럼이 생성되었다. 정규화되는 장비에 있어서, 10개의 순수 염료 및 21개의 필터 조합이 존재하였다. 단계(1610)에서, 스펙트럼은 정규화되었고 최대 신호는 1이었다. 단계(1615)에서, 염료 스펙트럼이 다수의 웰에 걸쳐 평균화된다. 이러한 평균화는 결과적으로 염료 당 하나의 스펙트럼을 생성할 것이다. 총괄하여, 염료 스펙트럼은 염료 및 필터 조합을 포함하는 염료 행렬 "M"으로 지칭될 수 있다. 이 시점에서, 기준 장비가 식별된다. 기준 장비는 시험 장비를 정규화 할 장비 또는 장비의 그룹일 수 있다. 시험 장비에 사용된 동일한 세트의 염료 스펙트럼을 기준 장비(들)로부터 획득될 수 있다. 일부 구현예에서, 기준은 장비의 그룹일 수 있다. 이러한 구현예에서, 각각의 염료에 대한 스펙트럼은 그룹에 걸쳐 평균화될 수 있다. 이 단계는 순서도(1600)에서 단계(1620)로 표현된다. 예로서, 기준 스펙트럼은 행렬 "Mref"로 지칭될 수 있다.
단계(1625)에서 12개의 필터 각각은 초기에 1로 설정된 조정 계수를 가진다. 요구되는 것은, 단계(1630)에서 나타난 바와 같이 행렬 "M"과 행렬 Mref 간의 차이가 최소가 될 때까지 교정 계수를 0과 랜드값 사이, 바람직하게는 0.04와 1 사이에서 반복적으로 수정하면서, 행렬 “M”에 조정 계수를 곱하는 것이 바람직할 수 있다. 단계(1635)에서 각각의 필터 쌍에 대한 교정 계수가 계산된다. 각각의 필터 쌍에 대한 교정 계수는 방출 필터와 여기 필터 계수의 곱이다. 주요 채널 필터 쌍이 도 4b에 나타난다. 각각의 필터 쌍에 대한 교정 계수가 일단 결정되면, 시험 장비에 대한 형광 데이터 및 순수 염료 스펙트럼에 대한 형광 데이터에 각각의 필터 쌍 계수를 곱할 수 있다. 이후, 단계(1645)에 나타낸 바와 같이, 교정된 순수 염료 스펙트럼은 최대값 1로 재정규화될 수 있다. 단계(1650)에서의 과정의 마지막 단계는 다성분 데이터를 생성하는 것이다. 당업자는 형광 데이터와 염료 행렬의 의사 역행렬(pseudo-inverse)의 곱이 될 다성분화 절차를 이해할 것이다. 다성분 값은 이미 정규화되어 있고, 따라서 데이터가 필터 수준으로 정규화되어 있으므로 염료 특이적 교정을 할 필요가 없을 것이다.
정규화 완료시, 평균 비로부터의 염료 혼합물의 %편차를 17개의 장비 모두에 걸쳐 계산하였다. 이 결과를 도 14에 나타내었다. 도 13에서의 정규화 이전의 데이터와 비교했을 때, 이 결과는 상당히 개선되었다. 정규화 데이터의 확대도를 도 15에 나타내었는데, 정규화 후의 편차는 앞서 제시된 +/- 15% 목표보다 훨씬 낮은 +/- 8%로 감소되었다.
RNASE P 검증
전술된 바와 같이, 장비를 검증하여, 그것이 특히 새로운 설치 후에 또는 여러 번의 사용 후에 작동하고 있음을 확인하는 것이 중요하다. 이러한 방식으로, 사용자는 실험 결과 및 분석이 정확하고 신뢰성 있다는 것을 확신할 수 있다. 이전에는, 사용자에 의해 장비에 대한 검증 어셈블리가 실행되었고, 사용자는 검증 어셈블리로부터 증폭 데이터에 대한 데이터 분석을 수동으로 수행하여 장비를 검증했다. 데이터 분석이 사용자에 의해 수동으로 수행되었기 때문에, 검증 과정은 오류가 발생하기 더 쉽고 시간이 걸렸다.
본 교시의 다양한 구현예에 따르면, 자동화된 검증 방법 및 시스템이 제공된다. 검증 어셈블리의 일 예는 RNase P 어셈블리이다. 그러나, 본원에 사용되는 바와 같이, 검증 어셈블리는 공지되고 신뢰할 수 있는 속성을 갖고 장비를 검증하는 데 이용될 수 있는 임의의 어셈블리가 될 수 있다.
설치 후에 그리고 여러 번의 사용 후에, 장비가 적절하게 작동하고 있음을 검증하는 것이 중요하다. 종종, 사용자는 장비를 검증하기 위해 공지된 어셈블리, 예컨대 RNase P 어셈블리를 수동으로 실행시킬 것이다. RNase P 유전자는 RNase P 효소의 RNA 모이어티(moiety)를 인코딩하는 단일 카피 유전자이다. RNase P 유전자는 그 속성 및 특성이 알려져 있기 때문에 검증 어셈블리로서 흔히 사용된다.
검증 플레이트에는 샘플의 게놈 카피의 검출 및 정량화에 필요한 시약이 미리 로딩된다. 예를 들어, RNase P 검증 플레이트에서, 각각의 웰은 PCR 마스터 믹스, RNase P 프라이머, FAM™ 염료-표기 프로브, 및 기지 농도의 인간 게놈 DNA 템플릿을 함유한다.
일반적인 RNase P 검정의 예에서, 한 세트의 복제 표준(1,250개, 2,500개, 5,000개, 10,000개 및 20,000개 카피)으로부터 얻어진 Ct(사이클 임계치, cycle threshold) 값으로부터 표준 곡선이 생성된다. 이어서, 표준 곡선은 두 세트의 미지의 템플릿(5,000개 및 10,000개의 복제 개체군)에 대한 카피 수를 판정하는 데 사용된다. 장비가 단일 웰 내의 후속 샘플 실행에 대해 5,000개 및 10,000개 게놈 등가물을 99.7% 신뢰도 수준으로 구별할 수 있는 능력을 입증할 수 있다면 장비는 검증된다.
설치를 통과하기 위해, 장비는 단일 웰 내의 후속 샘플 실행에 대해 5,000개 및 10,000개 게놈 등가물을 99.7% 신뢰도 수준으로 구별할 수 있는 능력을 입증해야 한다.
다양한 구현예에 따르면, 본 교시는 전문 지식을 자동화 보정 및 검증 시스템에 통합시켜 실패가 확인되었을 때 합격/불합격 상태 및 문제 해결 피드백을 제공할 수 있다. 장비가 검증 과정에서 실패될 경우, 사용자는 예를 들어 서비스 엔지니어가 호출될 수 있음을 알고 있다. 본 교시는 설치 및 보정 절차에 필요한 비용 및 시간을 최소화할 수 있다.
전술된 바와 같이, 본원에 기재된 다양한 구현예에 따르면, 검증 분석의 목표는 동일한 샘플의 2개의 수량이 장비에 의해 충분히 구별 가능하다는 것을 확인하는 것이다. 이러한 방식으로, 장비 성능이 검증될 수 있다.
본 교시의 다양한 구현예에 따르면, 자동화된 검증 방법 및 시스템이 제공된다. 검증 어셈블리의 사이클 임계치 값(Ct)이 시스템에 의해 분석되고 비교되어, 장비가 샘플의 2개의 수량을 충분히 구별할 수 있는지가 결정된다. 검증 어셈블리의 일 예는 RNase P 어셈블리이다. 이러한 예에서, 시스템은, 5000개 및 1000개의 게놈 카피의 RNase P 샘플에 대해 생성된 Ct 값을 결정하여, 5000개 및 1000개의 게놈 카피로부터의 데이터가 충분히 구별 가능한지 결정한다. 본원에 설명된 구현예에 따르면, 충분히 구별 가능하다는 것은 적어도 3-표준 편차(3σ)(-99.7%)가 5000개 및 10000개의 게놈 카피 증폭 데이터를 분리한다는 것을 의미한다. 다양한 구현예에 따른 방법을 도 17 및 도 18을 참조하여 아래에 추가로 설명한다.
도 17은 본원에 기재된 다양한 구현예에 따른, 장비를 검증하기 위한 예시적인 방법을 도시한다. 일반적으로, 검증 어셈블리 플레이트로부터 증폭 데이터를 수신하여 복수의 증폭 곡선을 생성함으로써 단계(1702)에서 시작되고 , 각각의 증폭 곡선은 플레이트 상의 웰에 대응한다.
플레이트는 복수의 웰을 포함한다. 일부 예에서, 플레이트는 96 웰을 포함한다. 다른 예에서, 플레이트는 384 웰을 포함한다. 플레이트의 일부 웰은 제1 수량의 샘플을 함유할 수 있고, 플레이트의 일부 다른 웰은 제2 수량의 샘플을 함유할 수 있다. 제1 수량 및 제2 수량은 서로 다르다. 본원에 설명된 다양한 구현예에서, 제2 수량은 제1 수량보다 크다. 일부 구현예에서, 제2 수량은 제1 수량보다 1.5배의 차이가 날 수 있다. 다른 구현예에서, 제2 수량은 제1 수량보다 2배 차이가 날 수 있다. 본원에 설명된 다양한 구현예에 따르면, 제2 수량은 제1 수량과 임의의 배수 차이가 날 수 있다. 일부 구현예에서, 제1 수량은 웰 당 5000개의 게놈 카피일 수 있고, 제2 수량은 웰 당 10000개의 게놈 카피일 수 있다.
다시 도 17을 참조하면, 단계(1704)에서, 복수의 생성된 증폭 곡선에 기초하여 복수의 형광 임계치가 결정된다. 복수의 증폭 곡선의 지수 영역((exponential region))을 비교하여 지수 영역이 속하는 형광 값의 범위를 결정한다. 예를 들면, 복수의 증폭 곡선에서 지수 영역 하단의 최저 형광 값으로부터 지수 영역 상단의 최고 형광 값까지의 형광 값의 범위가 결정된다. 형광 값의 범위는 본 교시의 구현예에 따라 복수의 증폭 곡선의 자동 분석에 사용되어 장비를 검증한다.
도 19를 참조하면, 복수의 증폭 곡선 및 형광 값의 범위와 해당 사이클 임계치의 결정이 도시되어 있다. 복수의 증폭 곡선 각각은 곡선의 지수 영역을 포함한다. 축(1902)은 형광 값을 표시한다. 축(1904)은 사이클 수를 표시한다. 형광 범위(1906)는, 복수의 지수 영역 중 하나의 지수 영역의 결정된 하단의 최저 형광 값으로부터 복수의 지수 영역 중 하나의 지수 영역의 결정된 상단의 최고 형광 값까지의 형광 값의 범위를 나타낸다. 다양한 구현예에 따르면, 형광 값의 범위는 소정의 개수로 균등하게 분할되어 시스템에 의한 자동 분석을 위한 형광 값의 세트를 생성한다. 일례에서, 형광 값의 범위(1906)는 100개로 분할되어 형광 임계치의 세트에 대한 100개의 형광 값을 결정한다. 일부 구현예에서, 상단 5개의 형광 값 및 하단 5개의 형광 값은 폐기되어 90개의 형광 임계치의 세트로 분석이 진행된다.
다시 도 17을 참조하면, 단계(1706)에서, 형광 값의 세트의 각 형광 값에 대해, 샘플의 제1 수량을 함유한 웰로부터 생성된 복수의 증폭 곡선 각각에 대한 사이클 임계치(Ct)가 결정된다. 유사하게, 형광 값의 세트의 각 형광 값에 대해, 샘플의 제2 수량을 함유한 웰로부터 생성된 복수의 증폭 곡선 각각에 대한 사이클 임계치(Ct)가 결정된다.
단계(1708)에서, 세트의 형광 값 각각에 대한 제1 수량 및 제2 수량의 Ct 값을 이용하여, 제1 수량과 제2 수량이 충분히 구별 가능한지가 결정된다. 다양한 구현예에 따르면, 충분히 구별 가능하다는 것은, 식 (1)을 이용하여, 세트의 형광 값들 중 적어도 하나에 대해 양의 결과를 산출한다는 것을 의미한다:
Figure pct00003
본원에 설명된 구현예에 따르면, 식 1은 제1 수량과 제2 수량(quant2는 quant1을 초과함)이 충분히 구별 가능한지 여부를 결정한다. 충분히 구별 가능하다는 것은 적어도 3-표준 편차(3σ)(-99.7%)가 제1 수량 및 제2 수량의 Ct 값을 분리한다는 것을 의미한다. 수량이 충분히 구별 가능하다는 것이 확인되면, 장비가 검증되었다는 표시가 사용자에게 제공된다.
도 18은 본원에 설명된 다양한 구현예에 따른,장비를 검증하기 위한 다른 예시적인 방법을 도시한다. 단계(1802)에서, 검증 플레이트의 웰 내에 포함된 복수의 샘플로부터 증폭 데이터가 수신된다. 검증 플레이트 웰들의 일부는 제1 수량의 샘플을 함유한다. 검증 플레이트 웰들의 다른 일부는 제2 수량의 샘플을 함유한다. 제1 수량과 제2 수량은 서로 다르다. 일부 구현예에서, 제2 수량은 제1 수량과 1.5배 차이가 날 수 있다. 다른 구현예에서, 제2 수량은 제1 수량과 2배 차이가 날 수 있다. 본원에 설명된 다양한 구현예에 따르면, 제2 수량은 제1 수량과 임의의 배수 차이가 날 수 있다. 일부 구현예에서, 제1 수량은 웰 당 5000개의 게놈 카피일 수 있고, 제2 수량은 웰 당 10000개의 게놈 카피일 수 있다.
단계(1804)에서, 복수의 생성된 증폭 곡선에 기초하여 형광 임계치의 제1 세트가 결정된다. 복수의 증폭 곡선의 지수 영역을 비교하여 지수 영역이 속하는 형광 값의 범위를 결정한다. 예를 들면, 복수의 증폭 곡선에서 지수 영역 하단의 최저 형광 값으로부터 지수 영역 상단의 최고 형광 값까지의 형광 값의 범위가 결정된다. 형광 값의 범위는 본 교시의 구현예에 따라 복수의 증폭 곡선의 자동 분석에 사용되어 장비를 검증한다.
다양한 구현예에 따르면, 형광 값의 범위는 소정의 개수로 균등하게 분할되어 시스템에 의한 자동 분석을 위한 형광 값의 세트를 생성한다. 일례에서, 형광 값의 범위(1906)는 100개로 분할되어 형광 임계치의 세트에 대한 100개의 형광 값을 결정한다. 일부 구현예에서, 상단 5개의 형광 값 및 하단 5개의 형광 값은 폐기되어 90개의 형광 임계치의 세트로 분석이 진행된다.
단계(1806)에서, 세트의 각각의 형광 임계치에 대해, 제 1 수량에 대응하는 증폭 곡선에 대한 Ct 값의 제1 세트가 결정된다. 유사하게, 세트의 각각의 형광 임계치에 대해, 제 1 수량에 대응하는 증폭 곡선에 대한 Ct 값의 제2 세트가 결정된다. 세트 내의 모든 형광 임계치에 대해 이것이 반복된다.
일부 구현예에서, 소정의 개수의 이상치 Ct 값은 추가 계산이 수행되기 전에 Ct 값의 각각의 세트로부터 제거된다. 예를 들면, 일부 구현예에서, 96 웰 플레이트가 사용되는 경우, Ct 값의 각각의 세트로부터 6개의 이상치가 제거된다. 이상치는 Ct 값의 세트의 평균 값으로부터 가장 먼 Ct 값이다. 다른 실시예에서, 364 웰 플레이트가 사용되는 경우, Ct 값의 각각의 세트로부터 10개의 이상치가 제거된다. 이상치가 제거된 후, 각각의 세트의 남은 Ct 값이 방법의 나머지 단계에서 사용된다.
단계(1808)에서, Ct 값의 각각의 세트에 대해, 평균이 계산된다. 즉, 단계(1804)에서 결정된 세트의 각각의 형광 임계치에 대해, 제1 수량 증폭 곡선에 대한 제1 Ct 평균이 계산되고, 제2 수량 증폭 곡선에 대한 제2 Ct 평균이 계산된다.
단계(1808)과 유사하게, 단계(1810)에서, Ct 값의 각각의 세트의 3-표준 편차가 계산된다. 즉, 단계(1804)에서 결정된 세트의 각각의 형광 임계치에 대해, 제1 수량 증폭 곡선에 대한 제1 3-표준 편차가 계산되고, 제2 수량 증폭 곡선에 대한 제2 3-표준 편차가 계산된다.
제1 수량 및 제2 수량의 Ct값이 충분히 구별 가능한지 결정하기 위해, 다양한 구현예에 따른, 형광 값에서의 Ct 값들이 비교된다. 다양한 구현예에 따르면, 비교를 위해 식 (2)이 사용된다.
Figure pct00004
본원에 설명된 구현예에 따르면, 식 2는 제1 수량과 제2 수량이 충분히 구별 가능한지 여부를 결정한다. 충분히 구별 가능하다는 것은 적어도 3-표준 편차(3σ)(-99.7%)가 제1 수량 및 제2 수량의 Ct 값을 분리한다는 것을 의미한다.
단계(1814)에서, 세트의 모든 형광 임계치에 대한 식(2)의 결과들이 비교되어 최대 값이 결정된다. 최대 값이 양수인 경우, 장비는 제1 수량과 제2 수량을 충분히 구별할 수 있으며, 장비가 검증되었다는 표시가 단계(1816)에서 사용자에게 제공된다. 최대 값이 음수인 경우, 장비는 제1 수량과 제2 수량을 충분히 구별할 수 없으며, 장비가 검증에 실패했다는 표시가 단계(1818)에서 사용자에게 제공된다.
도 20은 본원에 설명된 다양한 구현예에 따른 장비의 검증을 위한 시스템(2000)을 도시한다. 장비(2000)은 PCR 장비 인터페이스(2002), Ct 데이터베이스(2004), 디스플레이 엔진/GUI(2006), Ct 계산부(2008) 및 검증부(2010)를 포함한다.
PCR 장비 인터페이스(2002)는 PCR 장비로부터 증폭 데이터를 수신하여 증폭 곡선을 생성한다. 상술한 바와 같이, PCR 장비는 검증 플레이트에 포함된 샘플을 증폭한다. 검증 플레이트는 제1 수량의 샘플을 함유하는 일부 웰 및 제2 수량의 샘플을 포함하는 다른 일부 웰을 포함한다. 샘플의 증폭으로부터 생성된 형광 데이터가 PCR 장비 인터페이스(2002)에 의해 수신된다.
도 17 및 도 18를 각각 참조하여, 단계(1704) 및 단계(1804)에서와 같이 형광 임계치의 세트가 결정된 후, Ct 계산부(2006)는 제1 수량 및 제2 수량의 샘플로부터 생성된 증폭 곡선에 대응하는 Ct 값의 제1 세트 및 제2 세트를 각각 계산한다. 형광 임계치의 세트에서의 각각의 형광 임계치에 대해 Ct 값의 제1 세트 및 제2 세트가 계산된다. 복수 세트의 Ct 값이 Ct 데이터베이스(2004)에 저장된다.
검증부(2010)는, 도 17의 단계(1708) 및 도 18의 단계(1810)와 단계(1812)에서 설명된 바와 같이, 제1 수량과 제2 수량이 충분히 구별 가능한지 여부를 결정한다.
디스플레이 엔진/GUI는 사용자에게 복수의 증폭 곡선을 표시한다. 또한, 검증부(2010)가 제1 및 제2 수량이 충분이 구별 가능한지 여부를 결정한 후, 디스플레이 엔진/GUI(2006)는 검증 또는 검증 실패의 표시를 사용자에게 표시한다.
또한, 최적의 형광 임계치가 결정될 수 있다. 다양한 구현예에 따르면, 최적의 형광 임계치는,
Figure pct00005
및
Figure pct00006
사이에서 최대로 구분하는 결과를 나타내는 Ct 값을 선택함으로써 결정될 수 있다. 또한, 최적의 형광 임계치는 결정된 이상치의 개수가 가장 적은 Ct 값에 기초하여 선택될 수도 있다. 최적의 형광 임계치는, 가장 적은 수의 결정된 이상치와 더불어
Figure pct00007
및
Figure pct00008
사이에서 최대로 구분하는 결과를 나타내는 Ct 값에 기초하여 선택될 수도 있다.
자동 염료 교정
본 교시의 다양한 구현예에 따르면, 자동 염료 교정 방법은 다성분 데이터의 실시간 스펙트럼 보정을 수행하기 위해 사용될 수 있다. 실시간으로 또는 증폭 데이터가 수집되고 2차 분석이 수행된 이후에, 자동 염료 보정이 수행될 수 있다. 자동 염료 교정 알고리즘에서, 다성분 상관 행렬(multicomponent correlation matrix)이 생성된다. 다양한 구현예에 따르면, 다성분 상관 행렬에서 비대각 요소를 최소화하기 위해, 자동 염료 교정 알고리즘이 염료 행렬의 성분을 조정한다. 이러한 방식으로, Ct 결정에서 오류는 최소화된다.
자동 백그라운드 보정
본 교시의 다양한 구현예에 따르면, 자동 백그라운드 보정은 백그라운드 보정 플레이트의 필요성을 줄이고 백그라운드 보정의 전반적인 효능을 향상시키기 위해 수행될 수 있다.
오염에 의해 영향을 받은 분석된 웰의 특정 스펙트럼 성분을 인위적으로 부풀려져서, 장비를 사용하는 동안에 발생되는 블록에서의 물리적 오염(입자 또는 화학물)이 시스템의 분석 결과에 부정적인 영향을 줄 수 있다. 재보정이 이러한 문제를 해결할 수 있다. 그러나, 필요한 보정 간의 기간을 연장하기 위해서, 백그라운드 보정 후에, 백그라운드 변화를 자동으로 계산하고/보상하는 방법이 설명된다. 자동 백그라운드 보정을 달성하기 위해서, 비어 있는/점유되지 않은 블록을 사용하는 방법이 수행된다. 상용화된 유효 신호 블리드-스루(bleed-through)가 알려져 있고(경험적으로 결정됨), 효과적인 백그라운드 보정 기울기 및 오프셋은 유효 신호 블리드-스루를 다루는 스케일링 계수를 사용하여 근사화 할 수 있다.
플레이트 검출
본원에 설명된 다양한 구현예에 따르면, 플레이트 검출 방법은 장비에서 플레이트 배치의 오류를 식별하기 위해 수행된다.
장비 사용 중, 시스템의 광학기기(optics)는 이동의 상한(유휴 기간 중) 또는 하한(동작 중) 중 어느 하나에 위치한다. 하드웨어에는 이동 상하한 사이의 중간 지점에서의 광학 위치를 기록하는 능력이 설계되어 있지 않다; 이와 같이 플레이트 또는 튜브가 존재하는지 또는 존재하지 않는지를 판단하기 위해서 모터 위치 값을 신뢰할 수는 없다(광학 위치의 차이는 튜브 또는 플레이트의 존재로부터 추가되는 물질의 두께에 의해 야기될 것이다). 플레이트 또는 튜브 검출용으로 추가되는 구성요소(예컨대 누름 스위치 또는 위치 센서)를 필요로 하지 않고, 시스템 내의 검출 카메라가 샘플 검출을 위해 사용된다. 그러나, 분리 및 격리된 웰 렌즈 어레이(어레이의 각각의 렌즈는 하나 및 단지 하나의 웰로로부터 빛을 집중시키고 수집함)의 사용으로부터 블록 영역의 작은 부분만이 캡쳐되기 때문에, 전체 블록을 캡쳐하는 상용화된 평면의 전통적인 '사진'은 이미지 프로세싱을 위해 획득될 수 없다. 각각의 웰로부터 집중된 빛만이 수집되어 검출부 상에 밝기의 순환하는 점으로 나타나기 때문에, 검출된 이미지에는 공간적 또는 동적 범위가 없다. 그러나, 광학이 용기의 밀폐부 및 뚜껑으로의 초점이 허용되는 중간 위치로 이동되면, 이러한 초점 스폿이 반사 이미지(시스템에 의해 수집되는 정상 신호인 형광과 대조됨)로 캡쳐될 수 있고, 플레이트/튜브 검출에 사용될 수 있다. 초점의 스폿은 웰보다 작을 수 있고, 이는 캡쳐된 이미지에서 웰의 크기에 비해 작고 밝은 영역(조사 영역(ROI)으로 알려짐)으로 나타날 것이다. 초점 스폿은 밝은 픽셀을 산출하고 다른 모든 영역은 어두운 픽셀을 산출할 것이라는 것을 이해하기 때문에, 본원에 설명된 다양한 구현예에 따라, 픽셀-수준 정보의 수치 해석은 유/무 결정을 산출할 수 있다.
반사 물질을 이용한 장비의 정규화
본 교시의 다양한 구현예에 따르면, 제조 또는 설치 후 실행된 임의의 초기 보정 후에, 광다이오드와 같은 반사 물질을 사용하는 장비 정규화가 장비를 자동으로 보정하기 위해 사용될 수 있다.
다양한 구현예에 따르면, 안정적인 반사 물질이 제조 중 대조(control)로서 측정된다. 이러한 반사 물질은 가열된 커버 상에 놓여질 수 있다. 이후, 임의의 변화 또는 변동성을 검출하기 위해, 안정적인 반사 물질이 모든 채널에서 측정될 수 있다. 임의의 변화 또는 변동성은 장비 정규화 보정 방법에서 상술된 색상 균형 계수를 조절하기 위해 사용되어 여기 광에서의 변화에 대한 재정규화를 할 수 있다.
실시예
실시예 1에서, 복수의 반응 부위로부터 형광 방출을 이미징할 수 있는 광학 시스템을 포함하는 장비를 보정하는 방법으로서, 관심 영역(ROI) 보정을 수행하여 이미지에서 반응 부위 위치를 결정하는 단계; 순수 염료 보정을 수행하여 형광 염료의 원시 스펙트럼을 상기 형광 염료의 순수 스펙트럼 보정 데이터와 비교함으로써 각각의 반응 부위에서 사용된 형광 염료의 기여도를 결정하는 단계; 장비 정규화 보정을 수행하여 필터 정규화 계수를 결정하는 단계; 및 RNase P 검증을 수행하여 상기 장비가 샘플의 서로 다른 두 개의 수량을 구별할 수 있는지 검증하는 단계를 포함하는, 방법이 제공된다.
실시예 2에서, 상기 ROI 보정이, 각 샘플 웰에서의 형광 임계치로부터 초기 관심 영역(ROI)을 추정하는 단계; 각 ROI의 중심 위치를 추정하는 단계; 각 ROI의 크기를 추정하는 단계; 각 ROI의 크기를 추정하는 단계; 상기 복수의 반응 부위로부터 상기 ROI의 평균 크기를 결정하는 단계; 글로벌 그리딩 모델을 유도하는 단계; 글로벌 그리딩 모델을 상기 ROI에 적용하는 단계로서, 상기 글로벌 그리딩 모델의 적용은 상기 ROI의 중심 위치의 정밀도를 향상시키는 단계; 누락된 ROI를 복구하는 단계; 및 상기 ROI의 반경을 조정하는 단계로서, 상기 광학 시스템의 신호 대 노이즈 비를 향상시키는 단계를 포함하는, 실시예 1이 제공된다.
실시예 3에서, 상기 ROI 보정이, 상기 복수의 반응 부위 내의 염료 포화, 격자 회전, 배율 계수의 변화, 및 광학 방사 왜곡으로 이루어진 그룹 중 적어도 하나를 최소화하여 반응 부위 결정 오류를 개선하는, 실시예 1이 제공된다.
실시예 4에서, 상기 순수 염료 보정이 1개 초과의 채널에서 상기 장비 내로 로딩된 샘플 홀더를 이미징하는 단계(상기 샘플 홀더는 복수의 반응 부위 및 1개 초과의 염료 타입을 포함하고, 각각의 염료는 1개 초과의 반응 부위를 점유함); 상기 샘플 홀더 상의 각각의 염료에 대한 피크 채널을 식별하는 단계; 각각의 채널을 각각의 염료에 대한 상기 피크 채널로 정규화하는 단계; 및 염료 기준 값의 세트를 포함하는 염료 행렬을 생성하는 단계를 포함하는, 실시예 1이 제공된다.
실시예 5에서, 상기 샘플 홀더의 이미징은 서로 다른 네 개의 샘플 홀더를 이미징하기 위해 4회 수행되는, 실시예 4가 제공된다.
실시예 6에서, 상기 광학 시스템이 복수의 여기 필터 및 복수의 방출 필터를 포함하고, 상기 장비 정규화 보정은, 상기 여기 필터 및 상기 방출 필터 각각에 대한 제1 교정 계수를 결정하는 단계; 한 쌍의 필터에 대한 제2 교정 계수를 계산하는 단계(각각의 필터 쌍은 하나의 여기 필터 및 하나의 방출 필터를 포함함); 및 상기 제2 교정 계수를 필터 데이터에 적용하는 단계를 포함하는, 실시예 1이 제공된다.
실시예 7에서, 상기 필터 정규화 계수에 의해 상기 장비로부터의 데이터가 제2 장비로부터의 데이터와 비교될 수 있는, 실시예 1이 제공된다.
실시예 8에서, 상기 RNase P 검증이, 검증 플레이트로부터 증폭 데이터를 수신하여 복수의 증폭 곡선을 생성하는 단계(상기 검증 플레이트는 제1 수량 및 제2 수량의 샘플을 포함하고, 각각의 증폭 곡선은 지수 영역을 포함함); 상기 복수의 증폭 곡선의 지수 영역에 기초하여 형광 임계치의 세트를 결정하는 단계; 상기 세트의 각 형광 임계치에 대해, 상기 제1 수량의 샘플로부터 생성된 증폭 곡선의 사이클 임계(Ct) 값의 제1 세트, 및 상기 제2 수량의 샘플로부터 생성된 증폭 곡선의 Ct 값의 제2 세트를 결정하는 단계; 및 상기 복수의 형광 임계치 각각에서의 Ct 값에 기초하여 상기 제1 수량과 상기 제2 수량이 충분히 구별 가능한지 계산하는 단계를 포함하는, 실시예 1이 제공된다.
실시예 9에서, 상기 RNase P 검증이 상기 장비에 연결된 프로세서에 의해 수행되는, 실시예 1이 제공된다.
실시예 10에서, 상기 RNase P 검증이 장비 검증 또는 실패의 표시를 디스플레이 화면 상에 표시하는 단계를 더 포함하는, 실시예 8이 제공된다.
실시예 11에서, 다성분 데이터의 실시간 스펙트럼 보정에 대한 자동 염료 교정을 수행하는 단계; 플레이트 검출을 수행하여 플레이트 로딩 오류가 있는지 판단하는 단계; 자동 백그라운드 보정을 수행하여 백그라운드 변화를 보상하는 단계; 및 형광 방출에서의 임의의 변화 또는 변동성을 검출하기 위해 반사 물질을 사용하는 장비 정규화를 수행하는 단계를 더 포함하는, 실시예 1이 제공된다.
실시예 12에서, 복수의 반응 부위로부터 형광 방출을 이미징할 수 있는 광학 시스템을 포함하는 장비를 보정하는 시스템으로서, 프로세서; 및 프로세서-실행 가능한 명령으로 인코딩된 메모리를 포함하고, 상기 명령은, 관심 영역(ROI) 보정을 수행하여 이미지에서 반응 부위 위치를 결정하기 위한 명령; 순수 염료 보정을 수행하여 형광 염료의 원시 스펙트럼을 상기 형광 염료의 순수 스펙트럼 보정 데이터와 비교함으로써 각각의 반응 부위에서 사용된 형광 염료의 기여도를 결정하기 위한 명령; 장비 정규화 보정을 수행하여 필터 정규화 계수를 결정하기 위한 명령; 및 RNase P 검증을 수행하여 상기 장비가 샘플의 서로 다른 두 개의 수량을 구별할 수 있는지 검증하기 위한 명령을 포함하는, 시스템이 제공된다.
실시예 13에서, 상기 ROI 보정에 대한 명령이, 각 샘플 웰에서의 형광 임계치로부터 초기 관심 영역(ROI)을 추정하기 위한 명령; 각 ROI의 중심 위치를 추정하기 위한 명령; 각 ROI의 크기를 추정하기 위한 명령; 상기 복수의 반응 부위로부터 상기 ROI의 평균 크기를 결정하기 위한 명령; 글로벌 그리딩 모델을 유도하기 위한 명령; 글로벌 그리딩 모델을 상기 ROI에 적용하여 상기 ROI의 중심 위치의 정밀도를 향상시키기 위한 명령; 누락된 ROI를 복구하기 위한 명령; 및 상기 ROI의 반경을 조정하여 상기 광학 시스템의 신호 대 노이즈 비를 향상시키기 위한 명령을 포함하는, 실시예 12가 제공된다.
실시예 14에는, 상기 ROI 보정이 상기 복수의 반응 부위 내의 염료 포화, 격자 회전, 배율 계수의 변화, 및 광학 방사 왜곡으로 이루어진 그룹 중 적어도 하나를 최소화하여 반응 부위 결정 오류를 개선하는, 실시예 12가 제공된다.
실시예 15에서, 순수 염료 보정을 위한 상기 명령이, 1개 초과의 채널에서 상기 장비 내로 로딩된 샘플 홀더를 이미징하기 위한 명령(상기 샘플 홀더는 복수의 반응 부위 및 1개 초과의 염료 타입을 포함하고, 각각의 염료는 1개 초과의 반응 부위를 점유함); 상기 샘플 홀더 상의 각각의 염료에 대한 피크 채널을 식별하기 위한 명령; 각각의 채널을 각각의 염료에 대한 상기 피크 채널로 정규화하기 위한 명령; 및 염료 기준 값의 세트를 포함하는 염료 행렬을 생성하기 위한 명령을 포함하는, 실시예 12가 제공된다.
실시예 16에서, 상기 샘플 홀더의 이미징은 서로 다른 네 개의 샘플 홀더를 이미징하기 위해 4회 수행되는, 실시예 15가 제공된다.
실시예 17에서, 상기 광학 시스템이, 복수의 여기 필터 및 복수의 방출 필터를 포함하고, 상기 장비 정규화 보정은, 상기 여기 필터 및 상기 방출 필터 각각에 대한 제1 보정 계수를 결정하는 단계; 한 쌍의 필터에 대한 제2 교정 계수를 계산하는 단계(각각의 필터 쌍은 하나의 여기 필터 및 하나의 방출 필터를 포함함); 및 상기 제2 교정 계수를 필터 데이터에 적용하는 단계를 포함하는, 실시예 12가 제공된다.
실시예 18에서, 상기 필터 정규화 계수에 의해 상기 장비로부터의 데이터가 제2 장비로부터의 데이터와 비교될 수 있는, 실시예 12가 제공된다.
실시예 19에서, RNase P 검증을 위한 상기 명령이, 검증 플레이트로부터 증폭 데이터를 수신하여 복수의 증폭 곡선을 생성하기 위한 명령(상기 검증 플레이트는 제1 수량 및 제2 수량의 샘플을 포함하고, 각각의 증폭 곡선은 지수 영역을 포함함); 상기 복수의 증폭 곡선의 지수 영역에 기초하여 형광 임계치의 세트를 결정하기 위한 명령; 상기 세트의 각 형광 임계치에 대해, 상기 제1 수량의 샘플로부터 생성된 증폭 곡선의 사이클 임계(Ct) 값의 제1 세트, 및 상기 제2 수량의 샘플로부터 생성된 증폭 곡선의 Ct 값의 제2 세트를 결정하기 위한 명령; 및 상기 복수의 형광 임계치 각각에서의 Ct 값에 기초하여 상기 제1 및 제2 수량이 충분히 구별 가능한지 계산하기 위한 명령을 포함하는, 실시예 12가 제공된다.
실시예 20에서, 상기 RNase P 검증이 상기 장비에 연결된 프로세서에 의해 수행되는, 실시예 12가 제공된다.
실시예 21에서, RNase P 검증을 위한 상기 명령이 장비 검증 또는 실패의 표시를 디스플레이 화면 상에 표시하기 위한 명령을 더 포함하는, 실시예 19가 제공된다.
실시예 22에서, 다성분 데이터의 실시간 스펙트럼 보정에 대한 자동 염료 교정을 수행하기 위한 명령; 플레이트 검출을 수행하여 플레이트 로딩 오류가 있는지 판단하기 위한 명령; 자동 백그라운드 보정을 수행하여 백그라운드 변화를 보상하기 위한 명령; 및 형광 방출에서의 임의의 변화 또는 변동성을 검출하기 위해 반사 물질을 사용하는 장비 정규화를 수행하기 위한 명령을 더 포함하는, 실시예 12가 제공된다.
실시예 23에서, 복수의 반응 부위로부터 형광 방출을 이미징할 수 있는 광학 시스템을 포함하는 장비를 보정하기 위한 프로세서-실행 가능한 명령으로 인코딩된 컴퓨터 판독 가능한 저장 매체로서, 상기 명령은 관심 영역(ROI) 보정을 수행하여 이미지에서 반응 부위 위치를 결정하기 위한 명령; 순수 염료 보정을 수행하여 형광 염료의 원시 스펙트럼을 상기 형광 염료의 순수 스펙트럼 보정 데이터와 비교함으로써 각각의 반응 부위에서 사용된 형광 염료의 기여도를 결정하기 위한 명령; 장비 정규화 보정을 수행하여 필터 정규화 계수를 결정하기 위한 명령; 및 RNase P 검증을 수행하여 상기 장비가 샘플의 서로 다른 두 개의 수량을 구별할 수 있는지 검증하기 위한 명령을 포함하는, 컴퓨터 판독 가능한 저장 매체가 제공된다.
실시예 24에서, ROI 보정을 위한 상기 명령이, 각 샘플 웰에서의 형광 임계치로부터 초기 관심 영역(ROI)을 추정하기 위한 명령; 각 ROI의 중심 위치를 추정하기 위한 명령; 각 ROI의 크기를 추정하기 위한 명령; 상기 복수의 반응 부위로부터 상기 ROI의 평균 크기를 결정하기 위한 명령; 글로벌 그리딩 모델을 유도하기 위한 명령; 글로벌 그리딩 모델을 상기 ROI에 적용하여 상기 ROI의 중심 위치의 정밀도를 향상시키기 위한 명령; 누락된 ROI를 복구하기 위한 명령; 상기 ROI의 반경을 조정하여 상기 광학 시스템의 신호 대 노이즈 비를 향상시키기 위한 명령을 포함하는, 실시예 23이 제공된다.
실시예 25에서, 상기 ROI 보정이 상기 복수의 반응 부위 내의 염료 포화, 격자 회전, 배율 계수의 변화, 및 광학 방사 왜곡으로 이루어진 그룹 중 적어도 하나를 최소화하여 반응 부위 결정 오류를 개선하는, 실시예 23이 제공된다.
실시예 26에서, 순수 염료 보정을 위한 상기 명령이 1개 초과의 채널에서 상기 장비 내로 로딩된 샘플 홀더를 이미징하기 위한 명령(상기 샘플 홀더는 복수의 반응 부위 및 1개 초과의 염료 타입을 포함하고, 각각의 염료는 1개 초과의 반응 부위를 점유함); 상기 샘플 홀더 상의 각각의 염료에 대한 피크 채널을 식별하기 위한 명령; 각각의 채널을 각각의 염료에 대한 상기 피크 채널로 정규화하기 위한 명령; 및 염료 기준 값의 세트를 포함하는 염료 행렬을 생성하기 위한 명령을 포함하는, 실시예 23이 제공된다.
실시예 27에서, 상기 샘플 홀더의 이미징은 서로 다른 네 개의 샘플 홀더를 이미징하기 위해 4회 수행되는, 실시예 26이 제공된다.
실시예 28에서, 상기 광학 시스템이, 복수의 여기 필터 및 복수의 방출 필터를 포함하고, 장비 정규화 보정을 위한 상기 명령은, 상기 여기 필터 및 상기 방출 필터 각각에 대한 제1 보정 계수를 결정하기 위한 명령; 한 쌍의 필터에 대한 제2 교정 계수를 계산하기 위한 명령(각각의 필터 쌍은 하나의 여기 필터 및 하나의 방출 필터를 포함함); 및 상기 제2 교정 계수를 필터 데이터에 적용하기 위한 명령을 포함하는, 실시예 23이 제공된다.
실시예 29에서, 상기 필터 정규화 계수에 의해 상기 장비로부터의 데이터가 제2 장비로부터의 데이터와 비교될 수 있는, 실시예 23이 제공된다.
실시예 30에서, RNase P 검증을 위한 상기 명령이, 검증 플레이트로부터 증폭 데이터를 수신하여 복수의 증폭 곡선을 생성하기 위한 명령(상기 검증 플레이트는 제1 수량 및 제2 수량의 샘플을 포함하고, 각각의 증폭 곡선은 지수 영역을 포함함); 상기 복수의 증폭 곡선의 지수 영역에 기초하여 형광 임계치의 세트를 결정하기 위한 명령; 상기 세트의 각 형광 임계치에 대해, 상기 제1 수량의 샘플로부터 생성된 증폭 곡선의 사이클 임계(Ct) 값의 제1 세트, 및 상기 제2 수량의 샘플로부터 생성된 증폭 곡선의 Ct 값의 제2 세트를 결정하기 위한 명령; 및 상기 복수의 형광 임계치 각각에서의 Ct 값에 기초하여 상기 제1 수량과 상기 제2 수량이 충분히 구별 가능한지 계산하기 위한 명령을 포함하는, 실시예 23이 제공된다.
실시예 31에서, 상기 RNase P 검증이 상기 장비에 연결된 프로세서에 의해 수행되는, 실시예 23이 제공된다.
실시예 32에서, RNase P 검증을 위한 상기 명령이 장비 검증 또는 실패의 표시를 디스플레이 화면 상에 표시하기 위한 명령을 더 포함하는, 실시예 30이 제공된다.
실시예 33에서, 다성분 데이터의 실시간 스펙트럼 보정에 대한 자동 염료 교정을 수행하기 위한 명령; 플레이트 검출을 수행하여 플레이트 로딩 오류가 있는지 판단하기 위한 명령; 자동 백그라운드 보정을 수행하여 백그라운드 변화를 보상하기 위한 명령; 및 형광 방출에서의 임의의 변화 또는 변동성을 검출하기 위해 반사 물질을 사용하는 장비 정규화를 수행하기 위한 명령을 더 포함하는, 실시예 23이 제공된다.
실시예 34에서, 복수의 반응 부위로부터 형광 방출을 이미징할 수 있는 광학 시스템을 포함하는 장비를 보정하는 시스템으로서, 이미지에서 반응 부위 위치를 결정하도록 구성된 관심 영역(ROI) 보정부; 형광 염료의 원시 스펙트럼을 상기 형광 염료의 순수 스펙트럼 보정 데이터와 비교하여 각각의 반응 부위에서 사용된 형광 염료의 기여도를 결정하도록 구성된 순수 염료 보정부; 필터 정규화 계수를 결정하도록 구성된 장비 정규화 보정부; 상기 장비가 샘플의 서로 다른 두 개의 수량을 구별할 수 있는지 검증하도록 구성된 RNase P 검증부; 및 보정 결과를 표시하도록 구성된 디스플레이 엔진을 포함하는, 시스템이 제공된다.
실시예 35에서, 상기 ROI 보정부가, 각 샘플 웰에서의 형광 임계치로부터 초기 관심 영역(ROI)을 추정하고; 각 ROI의 중심 위치를 추정하고; 각 ROI의 크기를 추정하고; 상기 복수의 반응 부위로부터 상기 ROI의 평균 크기를 결정하고; 글로벌 그리딩 모델을 유도하고; 글로벌 그리딩 모델을 상기 ROI에 적용하고, 상기 글로벌 그리딩 모델의 적용은 상기 ROI의 중심 위치의 정밀도를 향상시키고; 누락된 ROI를 복구하고; 상기 ROI의 반경을 조정하고, 상기 광학 시스템의 신호 대 노이즈 비를 향상시키도록 구성되는, 실시예 34가 제공된다.
실시예 36에서, 상기 ROI 보정부가 상기 복수의 반응 부위 내의 염료 포화, 격자 회전, 배율 계수의 변화, 및 광학 방사 왜곡으로 이루어진 그룹 중 적어도 하나를 최소화하여 반응 부위 결정 오류를 개선하는, 실시예 34가 제공된다.
실시예 37에서, 상기 순수 염료 보정부가, 1개 초과의 채널에서 상기 장비 내로 로딩된 샘플 홀더를 이미징하고(상기 샘플 홀더는 복수의 반응 부위 및 1개 초과의 염료 타입을 포함하고, 각각의 염료는 1개 초과의 반응 부위를 점유함); 상기 샘플 홀더 상의 각각의 염료에 대한 피크 채널을 식별하고; 각각의 채널을 각각의 염료에 대한 상기 피크 채널로 정규화하고; 염료 기준 값의 세트를 포함하는 염료 행렬을 생성하도록 구성된, 실시예 34가 제공된다.
실시예 38에서, 상기 보정부가 서로 다른 네 개의 샘플 홀더를 이미징하기 위해 상기 샘플 홀더를 4회 이미징하도록 구성된, 실시예 37이 제공된다.
실시예 39에서, 상기 광학 시스템이, 복수의 여기 필터 및 복수의 방출 필터를 포함하고, 상기 장비 정규화 보정부는, 상기 여기 필터 및 상기 방출 필터 각각에 대한 제1 보정 계수를 결정하고; 한 쌍의 필터에 대한 제2 교정 계수를 계산하고(각각의 필터 쌍은 하나의 여기 필터 및 하나의 방출 필터를 포함함); 상기 제2 교정 계수를 필터 데이터에 적용하도록 구성된, 실시예 34가 제공된다.
실시예 40에서, 상기 필터 정규화 계수에 의해 상기 장비로부터의 데이터가 제2 장비로부터의 데이터와 비교될 수 있는, 실시예 34가 제공된다.
실시예 41에서, RNase P 검증부가, 검증 플레이트로부터 증폭 데이터를 수신하여 복수의 증폭 곡선을 생성하고(상기 검증 플레이트는 제1 수량 및 제2 수량의 샘플을 포함하고, 각각의 증폭 곡선은 지수 영역을 포함함); 상기 복수의 증폭 곡선의 지수 영역에 기초하여 형광 임계치의 세트를 결정하고; 상기 세트의 각 형광 임계치에 대해, 상기 제1 수량의 샘플로부터 생성된 증폭 곡선의 사이클 임계(Ct) 값의 제1 세트, 및 상기 제2 수량의 샘플로부터 생성된 증폭 곡선의 Ct 값의 제2 세트를 결정하고; 상기 복수의 형광 임계치 각각에서의 Ct 값에 기초하여 상기 제1 수량과 상기 제2 수량이 충분히 구별 가능한지 계산하도록 구성된, 실시예 34가 제공된다.
실시예 42에서, 상기 RNase P 검증부가 장비 검증 또는 실패의 표시를 상기 디스플레이 엔진 상에 표시하도록 추가로 구성된, 실시예 41이 제공된다.
실시예 43에서, 다성분 데이터의 실시간 스펙트럼 보정을 수행하도록 구성된 자동 염료 교정부; 플레이트 로딩 오류가 있는지 판단하도록 구성된 플레이트 검출부; 백그라운드 변화를 보상하도록 구성된 자동 백그라운드 보정부; 및 형광 방출에서의 임의의 변화 또는 변동성을 검출하기 위해 반사 물질을 사용하도록 구성된 장비 정규화부를 더 포함하는, 실시예 34이 제공된다.
대안적인 실시예 44에서,복수의 반응 부위로부터 형광 방출을 이미징할 수 있는 광학 시스템을 포함하는 장비를 보정하는 방법으로서, 관심 영역(ROI) 보정을 수행하여 이미지에서 반응 부위 위치를 결정하는 단계; 순수 염료 보정을 수행하여 형광 염료의 원시 스펙트럼을 상기 형광 염료의 순수 스펙트럼 보정 데이터와 비교함으로써 각각의 반응 부위에서 사용된 형광 염료의 기여도를 결정하는 단계; 장비 정규화 보정을 수행하여 필터 정규화 계수를 결정하는 단계; 및 RNase P 검증을 수행하여 상기 장비가 샘플의 서로 다른 두 개의 수량을 구별할 수 있는지 검증하는 단계를 포함하는, 방법이 제공된다.
실시예 45에서, 복수의 반응 부위로부터 형광 방출을 이미징할 수 있는 광학 시스템을 포함하는 장비를 보정하는 시스템으로서, 프로세서; 및 프로세서-실행 가능한 명령으로 인코딩된 메모리를 포함하고, 상기 명령은, 관심 영역(ROI) 보정을 수행하여 이미지에서 반응 부위 위치를 결정하기 위한 명령; 순수 염료 보정을 수행하여 형광 염료의 원시 스펙트럼을 상기 형광 염료의 순수 스펙트럼 보정 데이터와 비교함으로써 각각의 반응 부위에서 사용된 형광 염료의 기여도를 결정하기 위한 명령; 장비 정규화 보정을 수행하여 필터 정규화 계수를 결정하기 위한 명령; 및 RNase P 검증을 수행하여 상기 장비가 샘플의 서로 다른 두 개의 수량을 구별할 수 있는지 검증하기 위한 명령을 포함하는, 시스템이 제공된다.
실시예 46에서, 복수의 반응 부위로부터 형광 방출을 이미징할 수 있는 광학 시스템을 포함하는 장비를 보정하기 위한 프로세서-실행 가능한 명령으로 인코딩된 컴퓨터 판독 가능한 저장 매체로서, 상기 명령은 관심 영역(ROI) 보정을 수행하여 이미지에서 반응 부위 위치를 결정하기 위한 명령; 순수 염료 보정을 수행하여 형광 염료의 원시 스펙트럼을 상기 형광 염료의 순수 스펙트럼 보정 데이터와 비교함으로써 각각의 반응 부위에서 사용된 형광 염료의 기여도를 결정하기 위한 명령; 장비 정규화 보정을 수행하여 필터 정규화 계수를 결정하기 위한 명령; 및 RNase P 검증을 수행하여 상기 장비가 샘플의 서로 다른 두 개의 수량을 구별할 수 있는지 검증하기 위한 명령을 포함하는, 컴퓨터 판독 가능한 저장 매체가 제공된다.
실시예 47에서, 복수의 반응 부위로부터 형광 방출을 이미징할 수 있는 광학 시스템을 포함하는 장비를 보정하는 시스템으로서, 이미지에서 반응 부위 위치를 결정하도록 구성된 관심 영역(ROI) 보정부; 형광 염료의 원시 스펙트럼을 상기 형광 염료의 순수 스펙트럼 보정 데이터와 비교하여 각각의 반응 부위에서 사용된 형광 염료의 기여도를 결정하도록 구성된 순수 염료 보정부; 필터 정규화 계수를 결정하도록 구성된 장비 정규화 보정부; 상기 장비가 샘플의 서로 다른 두 개의 수량 을 구별할 수 있는지 검증하도록 구성된 RNase P 검증부; 및 보정 결과를 표시하도록 구성된 디스플레이 엔진을 포함하는, 시스템이 제공된다.
대안적인 실시예 48에서, 상기 ROI 보정이, 각 샘플 웰에서의 형광 임계치로부터 초기 관심 영역(ROI)을 추정하는 단계; 각 ROI의 중심 위치를 추정하는 단계; 각 ROI의 크기를 추정하는 단계; 상기 복수의 반응 부위로부터 상기 ROI의 평균 크기를 결정하는 단계; 글로벌 그리딩 모델을 유도하는 단계; 글로벌 그리딩 모델을 상기 ROI에 적용하는 단계로서, 상기 글로벌 그리딩 모델의 적용은 상기 ROI의 중심 위치의 정밀도를 향상시키는 단계; 누락된 ROI를 복구하는 단계; 및 상기 ROI의 반경을 조정하는 단계로서, 상기 광학 시스템의 신호 대 노이즈 비를 향상시키는 단계를 포함하는, 실시예 44, 45, 46, 47, 또는 임의의 상기 실시예가 제공된다.
대안적인 실시예 49에서, 상기 ROI 보정이 상기 복수의 반응 부위 내의 염료 포화, 격자 회전, 배율 계수의 변화, 및 광학 방사 왜곡으로 이루어진 그룹 중 적어도 하나를 최소화하여 반응 부위 결정 오류를 개선하는, 실시예 44, 45, 46, 47, 또는 임의의 상기 실시예가 제공된다.
대안적인 실시예 50에서, 상기 순수 염료 보정이 1개 초과의 채널에서 상기 장비 내로 로딩된 샘플 홀더를 이미징하는 단계(상기 샘플 홀더는 복수의 반응 부위 및 1개 초과의 염료 타입을 포함하고, 각각의 염료는 1개 초과의 반응 부위를 점유함); 상기 샘플 홀더 상의 각각의 염료에 대한 피크 채널을 식별하는 단계; 각각의 채널을 각각의 염료에 대한 상기 피크 채널로 정규화하는 단계; 및 염료 기준 값의 세트를 포함하는 염료 행렬을 생성하는 단계를 포함하는, 실시예 44, 45, 46, 47, 또는 임의의 상기 실시예가 제공된다.
대안적인 실시예 51에서, 상기 샘플 홀더의 이미징은 서로 다른 네 개의 샘플 홀더를 이미징하기 위해 4회 수행되는, 실시예 44, 45, 46, 47, 50, 또는 임의의 상기 실시예가 제공된다.
대안적인 실시예 52에서, 상기 광학 시스템이 복수의 여기 필터 및 복수의 방출 필터를 포함하고, 상기 장비 정규화 보정은, 상기 여기 필터 및 상기 방출 필터 각각에 대한 제1 교정 계수를 결정하는 단계; 한 쌍의 필터에 대한 제2 교정 계수를 계산하는 단계(각각의 필터 쌍은 하나의 여기 필터 및 하나의 방출 필터를 포함함); 및 상기 제2 교정 계수를 필터 데이터에 적용하는 단계를 포함하는, 실시예 44, 45, 46, 47, 또는 임의의 상기 실시예가 제공된다.
대안적인 실시예 53에서, 상기 필터 정규화 계수에 의해 상기 장비로부터의 데이터가 제2 장비로부터의 데이터와 비교될 수 있는, 실시예 44, 45, 46, 47, 또는 임의의 상기 실시예가 제공된다.
대안적인 실시예 54에서, 상기 RNase P 검증이, 검증 플레이트로부터 증폭 데이터를 수신하여 복수의 증폭 곡선을 생성하는 단계(상기 검증 플레이트는 제1 수량 및 제2 수량의 샘플을 포함하고, 각각의 증폭 곡선은 지수 영역을 포함함); 상기 복수의 증폭 곡선의 지수 영역에 기초하여 형광 임계치의 세트를 결정하는 단계; 상기 세트의 각 형광 임계치에 대해, 상기 제1 수량의 샘플로부터 생성된 증폭 곡선의 사이클 임계(Ct) 값의 제1 세트, 및 상기 제2 수량의 샘플로부터 생성된 증폭 곡선의 Ct 값의 제2 세트를 결정하는 단계; 및 상기 복수의 형광 임계치 각각에서의 Ct 값에 기초하여 상기 제1 수량과 상기 제2 수량이 충분히 구별 가능한지 계산하는 단계를 포함하는, 실시예 44, 45, 46, 47, 또는 임의의 상기 실시예가 제공된다.
대안적인 실시예 55에서, 상기 RNase P 검증이 상기 장비에 연결된 프로세서에 의해 수행되는, 실시예 44, 45, 46, 47, 또는 임의의 상기 실시예가 제공된다.
대안적 실시예 56에서, 상기 RNase P 검증이 장비 검증 또는 실패의 표시를 디스플레이 화면 상에 표시하는 단계를 더 포함하는, 실시예 44, 45, 46, 47, 54, 또는 임의의 상기 실시예가 제공된다.
대안적인 실시예 57에서, 다성분 데이터의 실시간 스펙트럼 보정에 대한 자동 염료 교정을 수행하는 단계; 플레이트 검출을 수행하여 플레이트 로딩 오류가 있는지 판단하는 단계; 자동 백그라운드 보정을 수행하여 백그라운드 변화를 보상하는 단계; 및 형광 방출에서의 임의의 변화 또는 변동성을 검출하기 위해 반사 물질을 사용하는 장비 정규화를 수행하는 단계를 더 포함하는, 실시예 44, 45, 46, 47, 또는 임의의 상기 실시예가 제공된다.
본 문서에 설명된 다양한 구현예와 관련되는 방법을 위한 예시적인 시스템은 다음의 출원에서 설명되는 것들을 포함한다.
2015년 2월 6일 출원된, 미국 디자인 특허 출원 번호 29/516,847호,
2015년 2월 6일 출원된, 미국 디자인 특허 출원 번호 29/516,883호,
2015년 2월 6일 출원된, 미국 가출원 특허 출원 번호 62/112,910호,
2015년 2월 6일 출원된, 미국 가출원 특허 출원 번호 62/113,006호,
2015년 2월 6일 출원된, 미국 가출원 특허 출원 번호 62/113,077호,
2015년 2월 6일 출원된, 미국 가출원 특허 출원 번호 62/113,058호,
2015년 2월 6일 출원된, 미국 가출원 특허 출원 번호 62/112,964호,
2015년 2월 6일 출원된, 미국 가출원 특허 출원 번호 62/113,118호,
2015년 2월 6일 출원된, 미국 가출원 특허 출원 번호 62/113,212호,
2016년 2월 5일 출원된, 미국 특허 출원 번호 ___ (Life Technologies사의 관리 번호 LT01011)
2016년 2월 5일 출원된, 미국 특허 출원 번호 ___ (Life Technologies사의 관리 번호 LT01023)
2016년 2월 5일 출원된, 미국 특허 출원 번호 ___ (Life Technologies사의 관리 번호 LT01025)
2016년 2월 5일 출원된, 미국 특허 출원 번호 ___ (Life Technologies사의 관리 번호 LT01028)
2016년 2월 5일 출원된, 미국 특허 출원 번호 ___ (Life Technologies사의 관리 번호 LT01029)
2016년 2월 5일 출원된, 미국 특허 출원 번호 ___ (Life Technologies사의 관리 번호 LT01032)
2016년 2월 5일 출원된, 미국 특허 출원 번호 ___ (Life Technologies사의 관리 번호 LT01033)
이들 모두는 그 전체가 본원에 참조로 포함된다.
[00194] 다양한 구현예가 특정 예시적인 구현예, 실시예, 및 응용에 대하여 설명되었지만, 본 교시를 벗어나지 않고 다양한 변형 및 변경이 이루어질 수 있다는 것은 당업자에게는 명백할 것이다.

Claims (43)

  1. 복수의 반응 부위로부터 형광 방출을 이미징할 수 있는 광학 시스템을 포함하는 장비를 보정하는 방법으로서,
    관심 영역(ROI) 보정을 수행하여 이미지에서 반응 부위 위치를 결정하는 단계;
    순수 염료 보정을 수행하여 형광 염료의 원시 스펙트럼을 상기 형광 염료의 순수 스펙트럼 보정 데이터와 비교함으로써 각각의 반응 부위에서 사용된 형광 염료의 기여도를 결정하는 단계;
    장비 정규화 보정을 수행하여 필터 정규화 계수를 결정하는 단계; 및
    RNase P 검증을 수행하여 상기 장비가 샘플의 서로 다른 두 개의 수량을 구별할 수 있는지 검증하는 단계를 포함하는 방법.
  2. 제1항에 있어서, 상기 ROI 보정은,
    각 샘플 웰에서의 형광 임계치로부터 초기 관심 영역(ROI)을 추정하는 단계;
    각 ROI의 중심 위치를 추정하는 단계;
    각 ROI의 크기를 추정하는 단계;
    상기 복수의 반응 부위로부터 상기 ROI의 평균 크기를 결정하는 단계;
    글로벌 그리딩 모델(global gridding model)을 유도하는 단계;
    글로벌 그리딩 모델을 상기 ROI에 적용하는 단계로서, 상기 글로벌 그리딩 모델의 적용은 상기 ROI의 중심 위치의 정밀도를 향상시키는 단계;
    누락된 ROI를 복구하는 단계; 및
    상기 ROI의 반경을 조정하는 단계로서, 상기 광학 시스템의 신호 대 노이즈 비를 향상시키는 단계를 포함하는 방법.
  3. 제1항에 있어서, 상기 ROI 보정은 상기 복수의 반응 부위 내의 염료 포화, 격자 회전, 배율 계수의 변화, 및 광학 방사 왜곡으로 이루어진 그룹 중 적어도 하나를 최소화하여 반응 부위 결정 오류를 개선하는 방법.
  4. 제1항에 있어서, 상기 순수 염료 보정은
    1개 초과의 채널에서 상기 장비 내로 로딩된 샘플 홀더를 이미징하는 단계(상기 샘플 홀더는 복수의 반응 부위 및 1개 초과의 염료 타입을 포함하고, 각각의 염료는 1개 초과의 반응 부위를 점유함);
    상기 샘플 홀더 상의 각각의 염료에 대한 피크 채널을 식별하는 단계;
    각각의 채널을 각각의 염료에 대한 상기 피크 채널로 정규화하는 단계; 및
    염료 기준 값의 세트를 포함하는 염료 행렬을 생성하는 단계를 포함하는 방법.
  5. 제4항에 있어서, 상기 샘플 홀더의 이미징은 서로 다른 네 개의 샘플 홀더를 이미징하기 위해 4회 수행되는 방법.
  6. 제1항에 있어서, 상기 광학 시스템은 복수의 여기 필터 및 복수의 방출 필터를 포함하고, 상기 장비 정규화 보정은
    상기 여기 필터 및 상기 방출 필터 각각에 대한 제1 교정 계수를 결정하는 단계;
    한 쌍의 필터에 대한 제2 교정 계수를 계산하는 단계(각각의 필터 쌍은 하나의 여기 필터 및 하나의 방출 필터를 포함함); 및
    상기 제2 교정 계수를 필터 데이터에 적용하는 단계를 포함하는 방법.
  7. 제1항에 있어서, 상기 필터 정규화 계수에 의해 상기 장비로부터의 데이터가 제2 장비로부터의 데이터와 비교될 수 있는 방법.
  8. 제1항에 있어서, 상기 RNase P 검증은
    검증 플레이트로부터 증폭 데이터를 수신하여 복수의 증폭 곡선을 생성하는 단계(상기 검증 플레이트는 제1 수량 및 제2 수량의 샘플을 포함하고, 각각의 증폭 곡선은 지수 영역을 포함함);
    상기 복수의 증폭 곡선의 지수 영역에 기초하여 형광 임계치의 세트를 결정하는 단계;
    상기 세트의 각 형광 임계치에 대해, 상기 제1 수량의 샘플로부터 생성된 증폭 곡선의 사이클 임계(Ct) 값의 제1 세트, 및 상기 제2 수량의 샘플로부터 생성된 증폭 곡선의 Ct 값의 제2 세트를 결정하는 단계; 및
    상기 복수의 형광 임계치 각각에서의 Ct 값에 기초하여 상기 제1 수량과 상기 제2 수량이 충분히 구별 가능한지 계산하는 단계를 포함하는 방법.
  9. 제1항에 있어서, 상기 RNase P 검증은 상기 장비에 연결된 프로세서에 의해 수행되는 방법.
  10. 제8항에 있어서, 상기 RNase P 검증은
    장비 검증 또는 실패의 표시를 디스플레이 화면 상에 표시하는 단계를 더 포함하는 방법.
  11. 제1항에 있어서,
    다성분 데이터의 실시간 스펙트럼 보정에 대한 자동 염료 교정을 수행하는 단계;
    플레이트 검출을 수행하여 플레이트 로딩 오류가 있는지 판단하는 단계;
    자동 백그라운드 보정을 수행하여 백그라운드 변화를 보상하는 단계; 및
    형광 방출에서의 임의의 변화 또는 변동성을 검출하기 위해 반사 물질을 사용하는 장비 정규화를 수행하는 단계를 더 포함하는 방법.
  12. 장비를 보정하는 시스템으로서, 상기 장비는 복수의 반응 부위로부터 형광 방출을 이미징할 수 있는 광학 시스템을 포함하고, 상기 시스템은,
    프로세서; 및
    프로세서-실행 가능한 명령으로 인코딩된 메모리를 포함하고, 상기 명령은
    관심 영역(ROI) 보정을 수행하여 이미지에서 반응 부위 위치를 결정하기 위한 명령;
    순수 염료 보정을 수행하여 형광 염료의 원시 스펙트럼을 상기 형광 염료의 순수 스펙트럼 보정 데이터와 비교함으로써 각각의 반응 부위에서 사용된 형광 염료의 기여도를 결정하기 위한 명령;
    장비 정규화 보정을 수행하여 필터 정규화 계수를 결정하기 위한 명령; 및
    RNase P 검증을 수행하여 상기 장비가 샘플의 서로 다른 두 개의 수량을 구별할 수 있는지 검증하기 위한 명령을 포함하는 시스템.
  13. 제12항에 있어서, ROI 보정을 위한 상기 명령은
    각 샘플 웰에서의 형광 임계치로부터 초기 관심 영역(ROI)을 추정하기 위한 명령;
    각 ROI의 중심 위치를 추정하기 위한 명령;
    각 ROI의 크기를 추정하기 위한 명령;
    상기 복수의 반응 부위로부터 상기 ROI의 평균 크기를 결정하기 위한 명령;
    글로벌 그리딩 모델을 유도하기 위한 명령;
    글로벌 그리딩 모델을 상기 ROI에 적용하는 단계로서, 상기 글로벌 그리딩 모델의 적용은 상기 ROI의 중심 위치의 정밀도를 향상시키기 위한 명령;
    누락된 ROI를 복구하기 위한 명령; 및
    상기 ROI의 반경을 조정하는 단계로서, 상기 광학 시스템의 신호 대 노이즈 비를 향상시키기 위한 명령을 포함하는 시스템.
  14. 제12항에 있어서, 상기 ROI 보정은 상기 복수의 반응 부위 내의 염료 포화, 격자 회전, 배율 계수의 변화, 및 광학 방사 왜곡으로 이루어진 그룹 중 적어도 하나를 최소화하여 반응 부위 결정 오류를 개선하는 시스템.
  15. 제12항에 있어서, 순수 염료 보정을 위한 상기 명령은
    1개 초과의 채널에서 상기 장비 내로 로딩된 샘플 홀더를 이미징하기 위한 명령(상기 샘플 홀더는 복수의 반응 부위 및 1개 초과의 염료 타입을 포함하고, 각각의 염료는 1개 초과의 반응 부위를 점유함);
    상기 샘플 홀더 상의 각각의 염료에 대한 피크 채널을 식별하기 위한 명령;
    각각의 채널을 각각의 염료에 대한 상기 피크 채널로 정규화하기 위한 명령; 및
    염료 기준 값의 세트를 포함하는 염료 행렬을 생성하기 위한 명령을 포함하는 시스템.
  16. 제15항에 있어서, 상기 샘플 홀더의 이미징은 서로 다른 네 개의 샘플 홀더를 이미징하기 위해 4회 수행되는 시스템.
  17. 제12항에 있어서, 상기 광학 시스템은 복수의 여기 필터 및 복수의 방출 필터를 포함하고, 상기 장비 정규화 보정은
    상기 여기 필터 및 상기 방출 필터 각각에 대한 제1 교정 계수를 결정하는 것;
    한 쌍의 필터에 대한 제2 교정 계수를 계산하는 것(각각의 필터 쌍은 하나의 여기 필터 및 하나의 방출 필터를 포함함); 및
    상기 제2 교정 계수를 필터 데이터에 적용하는 것을 포함하는 시스템.
  18. 제12항에 있어서, 상기 필터 정규화 계수에 의해 상기 장비로부터의 데이터가 제2 장비로부터의 데이터와 비교될 수 있는 시스템.
  19. 제12항에 있어서, RNase P 검증을 위한 상기 명령은
    검증 플레이트로부터 증폭 데이터를 수신하여 복수의 증폭 곡선을 생성하기 위한 명령(상기 검증 플레이트는 제1 수량 및 제2 수량의 샘플을 포함하고, 각각의 증폭 곡선은 지수 영역을 포함함);
    상기 복수의 증폭 곡선의 지수 영역에 기초하여 형광 임계치의 세트를 결정하기 위한 명령;
    상기 세트의 각 형광 임계치에 대해, 상기 제1 수량의 샘플로부터 생성된 증폭 곡선의 사이클 임계(Ct) 값의 제1 세트, 및 상기 제2 수량의 샘플로부터 생성된 증폭 곡선의 Ct 값의 제2 세트를 결정하기 위한 명령; 및
    상기 복수의 형광 임계치 각각에서의 Ct 값에 기초하여 상기 제1 수량과 상기 제2 수량이 충분히 구별 가능한지 계산하기 위한 명령을 포함하는 시스템.
  20. 제12항에 있어서, 상기 RNase P 검증은 상기 장비에 연결된 프로세서에 의해 수행되는 시스템.
  21. 제19항에 있어서, RNase P 검증을 위한 상기 명령은 장비 검증 또는 실패의 표시를 디스플레이 화면 상에 표시하기 위한 명령을 더 포함하는 시스템.
  22. 제12항에 있어서,
    다성분 데이터의 실시간 스펙트럼 보정에 대한 자동 염료 교정을 수행하기 위한 명령;
    플레이트 검출을 수행하여 플레이트 로딩 오류가 있는지 판단하기 위한 명령;
    자동 백그라운드 보정을 수행하여 백그라운드 변화를 보상하기 위한 명령; 및
    형광 방출에서의 임의의 변화 또는 변동성을 검출하기 위해 반사 물질을 사용하는 장비 정규화를 수행하기 위한 명령을 더 포함하는 시스템.
  23. 장비를 보정하기 위한 프로세서-실행 가능한 명령으로 인코딩된 컴퓨터 판독 가능한 저장 매체로서, 상기 장비는 복수의 반응 부위로부터 형광 방출을 이미징할 수 있는 광학 시스템을 포함하며, 상기 명령은
    관심 영역(ROI) 보정을 수행하여 이미지에서 반응 부위 위치를 결정하기 위한 명령;
    순수 염료 보정을 수행하여 형광 염료의 원시 스펙트럼을 상기 형광 염료의 순수 스펙트럼 보정 데이터와 비교함으로써 각각의 반응 부위에서 사용된 형광 염료의 기여도를 결정하기 위한 명령;
    장비 정규화 보정을 수행하여 필터 정규화 계수를 결정하기 위한 명령; 및
    RNase P 검증을 수행하여 상기 장비가 샘플의 서로 다른 두 개의 수량을 구별할 수 있는지 검증하기 위한 명령을 포함하는 컴퓨터 판독 가능한 저장 매체.
  24. 제23항에 있어서, ROI 보정을 위한 상기 명령은
    각 샘플 웰에서의 형광 임계치로부터 초기 관심 영역(ROI)을 추정하기 위한 명령;
    각 ROI의 중심 위치를 추정하기 위한 명령;
    각 ROI의 크기를 추정하기 위한 명령;
    상기 복수의 반응 부위로부터 상기 ROI의 평균 크기를 결정하기 위한 명령;
    글로벌 그리딩 모델을 유도하기 위한 명령;
    글로벌 그리딩 모델을 상기 ROI에 적용하는 단계로서, 상기 글로벌 그리딩 모델의 적용은 상기 ROI의 중심 위치의 정밀도를 향상시키기 위한 명령;
    누락된 ROI를 복구하기 위한 명령; 및
    상기 ROI의 반경을 조정하는 단계로서, 상기 광학 시스템의 신호 대 노이즈 비를 향상시키기 위한 명령을 포함하는 컴퓨터 판독 가능한 저장 매체.
  25. 제23항에 있어서, 상기 ROI 보정은 상기 복수의 반응 부위 내의 염료 포화, 격자 회전, 배율 계수의 변화, 및 광학 방사 왜곡으로 이루어진 그룹 중 적어도 하나를 최소화하여 반응 부위 결정 오류를 개선하는 컴퓨터 판독 가능한 저장 매체.
  26. 제23항에 있어서, 순수 염료 보정을 위한 상기 명령은
    1개 초과의 채널에서 상기 장비 내로 로딩된 샘플 홀더를 이미징하기 위한 명령(상기 샘플 홀더는 복수의 반응 부위 및 1개 초과의 염료 타입을 포함하고, 각각의 염료는 1개 초과의 반응 부위를 점유함);
    상기 샘플 홀더 상의 각각의 염료에 대한 피크 채널을 식별하기 위한 명령;
    각각의 채널을 각각의 염료에 대한 상기 피크 채널로 정규화하기 위한 명령; 및
    염료 기준 값의 세트를 포함하는 염료 행렬을 생성하기 위한 명령을 포함하는 컴퓨터 판독 가능한 저장 매체.
  27. 제26항에 있어서, 상기 샘플 홀더의 이미징은 서로 다른 네 개의 샘플 홀더를 이미징하기 위해 4회 수행되는 컴퓨터 판독 가능한 저장 매체.
  28. 제23항에 있어서, 상기 광학 시스템은 복수의 여기 필터 및 복수의 방출 필터를 포함하고, 장비 정규화 보정을 위한 상기 명령은
    상기 여기 필터 및 상기 방출 필터 각각에 대한 제1 교정 계수를 결정하기 위한 명령;
    한 쌍의 필터에 대한 제2 교정 계수를 계산하기 위한 명령(각각의 필터 쌍은 하나의 여기 필터 및 하나의 방출 필터를 포함함); 및
    상기 제2 교정 계수를 필터 데이터에 적용하기 위한 명령을 포함하는 컴퓨터 판독 가능한 저장 매체.
  29. 제23항에 있어서, 상기 필터 정규화 계수에 의해 상기 장비로부터의 데이터가 제2 장비로부터의 데이터와 비교될 수 있는 컴퓨터 판독 가능한 저장 매체.
  30. 제23항에 있어서, RNase P 검증을 위한 상기 명령은
    검증 플레이트로부터 증폭 데이터를 수신하여 복수의 증폭 곡선을 생성하기 위한 명령(상기 검증 플레이트는 제1 수량 및 제2 수량의 샘플을 포함하고, 각각의 증폭 곡선은 지수 영역을 포함함);
    상기 복수의 증폭 곡선의 지수 영역에 기초하여 형광 임계치의 세트를 결정하기 위한 명령;
    상기 세트의 각 형광 임계치에 대해, 상기 제1 수량의 샘플로부터 생성된 증폭 곡선의 사이클 임계(Ct) 값의 제1 세트, 및 상기 제2 수량의 샘플로부터 생성된 증폭 곡선의 Ct 값의 제2 세트를 결정하기 위한 명령; 및
    상기 복수의 형광 임계치 각각에서의 Ct 값에 기초하여 상기 제1 수량과 상기 제2 수량이 충분히 구별 가능한지 계산하기 위한 명령을 포함하는 컴퓨터 판독 가능한 저장 매체.
  31. 제23항에 있어서, 상기 RNase P 검증은 상기 장비에 연결된 프로세서에 의해 수행되는 컴퓨터 판독 가능한 저장 매체.
  32. 제30항에 있어서, RNase P 검증을 위한 상기 명령은
    장비 검증 또는 실패의 표시를 디스플레이 화면 상에 표시하기 위한 명령을 더 포함하는 컴퓨터 판독 가능한 저장 매체.
  33. 제23항에 있어서,
    다성분 데이터의 실시간 스펙트럼 보정에 대한 자동 염료 교정을 수행하기 위한 명령;
    플레이트 검출을 수행하여 플레이트 로딩 오류가 있는지 판단하기 위한 명령;
    자동 백그라운드 보정을 수행하여 백그라운드 변화를 보상하기 위한 명령; 및
    형광 방출에서의 임의의 변화 또는 변동성을 검출하기 위해 반사 물질을 사용하는 장비 정규화를 수행하기 위한 명령을 더 포함하는 컴퓨터 판독 가능한 저장 매체.
  34. 장비를 보정하기 위한 시스템으로서, 상기 장비는 복수의 반응 부위로부터 형광 방출을 이미징할 수 있는 광학 시스템을 포함하며, 상기 시스템은,
    이미지에서 반응 부위 위치를 결정하도록 구성된 관심 영역(ROI) 보정부;
    형광 염료의 원시 스펙트럼을 상기 형광 염료의 순수 스펙트럼 보정 데이터와 비교하여 각각의 반응 부위에서 사용된 형광 염료의 기여도를 결정하도록 구성된 순수 염료 보정부;
    필터 정규화 계수를 결정하도록 구성된 장비 정규화 보정부;
    상기 장비가 샘플의 서로 다른 두 개의 수량을 구별할 수 있는지 검증하도록 구성된 RNase P 검증부; 및
    보정 결과를 표시하도록 구성된 디스플레이 엔진을 포함하는 시스템.
  35. 제34항에 있어서, 상기 ROI 보정부는
    각 샘플 웰에서의 형광 임계치로부터 초기 관심 영역(ROI)을 추정하고;
    각 ROI의 중심 위치를 추정하고;
    각 ROI의 크기를 추정하고;
    상기 복수의 반응 부위로부터 상기 ROI의 평균 크기를 결정하고;
    글로벌 그리딩 모델을 유도하고;
    글로벌 그리딩 모델을 상기 ROI에 적용하고, 상기 글로벌 그리딩 모델의 적용은 상기 ROI의 중심 위치의 정밀도를 향상시키고;
    누락된 ROI를 복구하고; 그리고
    상기 ROI의 반경을 조정하고, 상기 광학 시스템의 신호 대 노이즈 비를 향상시키도록 구성된 시스템.
  36. 제34항에 있어서, 상기 ROI 보정부는 상기 복수의 반응 부위 내의 염료 포화, 격자 회전, 배율 계수의 변화, 및 광학 방사 왜곡으로 이루어진 그룹 중 적어도 하나를 최소화하여 반응 부위 결정 오류를 개선하는 시스템.
  37. 제34항에 있어서, 상기 순수 염료 보정부는
    1개 초과의 채널에서 상기 장비 내로 로딩된 샘플 홀더를 이미징하고(상기 샘플 홀더는 복수의 반응 부위 및 1개 초과의 염료 타입을 포함하고, 각각의 염료는 1개 초과의 반응 부위를 점유함);
    상기 샘플 홀더 상의 각각의 염료에 대한 피크 채널을 식별하고;
    각각의 채널을 각각의 염료에 대한 상기 피크 채널로 정규화하고; 그리고
    염료 기준 값의 세트를 포함하는 염료 행렬을 생성하도록 구성된 시스템.
  38. 제37항에 있어서, 상기 보정부는 서로 다른 네 개의 샘플 홀더를 이미징하기 위해 상기 샘플 홀더를 4회 이미징하도록 구성된 시스템.
  39. 제34항에 있어서, 상기 광학 시스템은 복수의 여기 필터 및 복수의 방출 필터를 포함하고, 상기 장비 정규화 보정부는
    상기 여기 필터 및 상기 방출 필터 각각에 대한 제1 보정 계수를 결정하고;
    한 쌍의 필터에 대한 제2 교정 계수를 계산하고(각각의 필터 쌍은 하나의 여기 필터 및 하나의 방출 필터를 포함함); 그리고
    상기 제2 교정 계수를 필터 데이터에 적용하도록 구성된 시스템.
  40. 제34항에 있어서, 상기 필터 정규화 계수에 의해 상기 장비로부터의 데이터가 제2 장비로부터의 데이터와 비교될 수 있는 시스템.
  41. 제34항에 있어서, 상기 RNase P 검증부는 검증 플레이트로부터 증폭 데이터를 수신하여 복수의 증폭 곡선을 생성하고(상기 검증 플레이트는 제1 수량 및 제2 수량의 샘플을 포함하고, 각각의 증폭 곡선은 지수 영역을 포함함);
    상기 복수의 증폭 곡선의 지수 영역에 기초하여 형광 임계치의 세트를 결정하고;
    상기 세트의 각 형광 임계치에 대해, 상기 제1 수량의 샘플로부터 생성된 증폭 곡선의 사이클 임계(Ct) 값의 제1 세트, 및 상기 제2 수량의 샘플로부터 생성된 증폭 곡선의 Ct 값의 제2 세트를 결정하고; 그리고
    상기 복수의 형광 임계치 각각에서의 Ct 값에 기초하여 상기 제1 수량과 상기 제2 수량이 충분히 구별 가능한지 계산하도록 구성된 시스템.
  42. 제41항에 있어서, 상기 RNase P 검증부는 장비 검증 또는 실패의 표시를 상기 디스플레이 엔진 상에 표시하도록 추가로 구성된 시스템.
  43. 제34항에 있어서,
    다성분 데이터의 실시간 스펙트럼 보정을 수행하도록 구성된 자동 염료 교정부;
    플레이트 로딩 오류가 있는지 판단하도록 구성된 플레이트 검출부;
    백그라운드 변화를 보상하도록 구성된 자동 백그라운드 보정부; 및
    형광 방출에서의 임의의 변화 또는 변동성을 검출하기 위해 반사 물질을 사용하도록 구성된 장비 정규화부를 더 포함하는 시스템.
KR1020177025090A 2015-02-06 2016-02-05 생물학적 장비 보정을 위한 방법 및 시스템 KR102360726B1 (ko)

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US201562113118P 2015-02-06 2015-02-06
US201562113077P 2015-02-06 2015-02-06
US201562113183P 2015-02-06 2015-02-06
US201562112964P 2015-02-06 2015-02-06
US62/113,077 2015-02-06
US62/112,964 2015-02-06
US62/113,118 2015-02-06
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