CN111870225A - 一种用于荧光标定的标准模板制作方法 - Google Patents

Abstract

本发明提出一种用于荧光标定的标准模板制作方法，包括如下步骤：步骤一、制作具有不同浓度梯度荧光试剂的标准模板纸片，以及制作不带荧光试剂的参考模板纸片；步骤二、用于仪器标定的数据采集，使用待标定的仪器对标准模板进行整体成像或者逐点进行数据采集，分别测得多个模板纸片处的荧光数据；步骤三、使用不同仪器，按照步骤二得出每个位置的荧光数据，得出仪器标定结果。本发明的方法可基本消除多数荧光成像设备中的激发光反射问题；加入同样形状的不沾染任何荧光剂的纸片作为参考点，可以消除大部分背景荧光噪声，提高标定的准确性；通过此方法制作的标定模板，可对不同荧光成像仪器的检测灵敏度做客观的横向比较，也可用于仪器开发过程中。

Description

一种用于荧光标定的标准模板制作方法

技术领域

本发明属于荧光检测和生物医疗交叉领域，涉及一种荧光成像设备和组织自发荧光的标定装置制作方法，可用于基于近红外的成像仪器的标定或作为自发荧光组织的仿体。

背景技术

荧光成像设备在医疗领域得到越来越广泛的应用，尤其是一些非侵入式荧光设备，例如可用于淋巴管和血管成像的近红外荧光系统，对病人的伤害较小，具有其独特优势。一些较为新型的荧光设备，例如FLUOPICS的FLUOBEAM系列成像设备，滨松的PDE II设备等，可用于甲状旁腺的确认，改善了传统的单纯依赖外科手术医生经验的状况，一些临床实验也证明了这些新的设备对于检测和确认甲状旁腺具有有效的辅助提升作用。

然而，尽管市面上涌现出诸多的荧光成像系统，但在实验室或者临床上仍然缺乏对这些仪器的荧光成像能力进行评估的标准品。而且由于曝光时间、成像器件灵敏度、图形处理算法等参数的不同，不同仪器得出的数值无法直接比较，也就很难对不同厂家的仪器检测能力做横向对比。另外，普通的荧光剂溶液样品，由于无法在常规环境下长时间保存，亦不适合作为仪器定标的标准样品。因此，一种相对客观的、标准的、可长时间保持稳定的、可用于不同荧光成像设备检测灵敏度评估的装置亟待解决。

另外，对于新的荧光检测设备的开发者而言，一些组织的自发荧光没有标准的对照体系，无法将仪器的荧光检测能力和生物组织的荧光特性分开，对于仪器的荧光检测能力难以评价。

发明内容

为了解决上述技术问题，本发明提出了一种荧光标准模板的制作方法，为这些问题的解决提供了可行的方案，本发明具体可应用于荧光成像设备，例如基于甲状旁腺自发荧光的检测设备，荧光导航内窥镜等对于荧光检测的灵敏度的横向比较。也可用作自发荧光组织的替代品，用于检验仪器对于组织荧光的检测能力。

本发明的技术方案如下：一种用于荧光标定的标准模板制作方法，包括如下步骤：

步骤一、制作具有不同浓度梯度荧光试剂的标准模板纸片，以及制作不带荧光试剂的参考模板纸片；

步骤二、采集用于仪器标定的数据，使用待标定的仪器对标准模板进行整体成像或者逐点进行数据采集，分别测得多个模板纸片处的荧光数据；

步骤三、使用不同仪器，按照步骤二得出每个位置的荧光数据，得出仪器标定结果。

进一步的，所述步骤一具体包括：

步骤1、准备荧光试剂和纯水，根据待标定仪器的检测范围，配备出不同浓度的溶液；

步骤2、采用滤纸剪裁出形状一致的纸片，将所述纸片浸泡到配备好的不同浓度的溶液中，经过预定时间后取出阴干；

步骤3、按照所浸泡溶液的浓度梯度将阴干后的纸片依次固定在黑色磨砂纸板上，同时固定若干未沾染荧光剂的纸片用于背景噪声的消除。

进一步的，所述步骤1～3；具体包括：

1-1、准备若干的荧光剂粉末，准备一片黑色磨砂纸板，准备纯水以及洁净容器；

1-2、用精密天平称取e mg的荧光粉末，放入一个洁净容器中；采用标准移液枪或者精密量筒取f ml纯水，并搅拌均匀，则该容器中荧光粉末的浓度为

取出0.5f ml溶液注射到1号容器中保存；

1-3、在剩下的溶液中继续加入0.5f ml的纯水后搅拌均匀，则容器中荧光粉末的浓度变为

继续取出0.5f ml溶液注射到2号容器中保存；

1-4、重复步骤1-2多次，则荧光粉末溶液浓度依次降低，根据待标定仪器的荧光检测范围，选择重复次数；当重复n-1次时，能够配备出n种不同溶液，并依次装在1至n号容器中，其浓度分别为：

其中，1≤i≤n；

1-5、准备一张滤纸，并剪裁出n+m张形状完全相同的纸片，其中m≥1；将其中n张纸片依次放入1至n号溶液中，并将此n个容器放置在4-8℃冰箱中静置1个小时以上；

1-6、取出容器中的n个纸片，并放置在阴凉处晾干，将晾干后的n张纸片和剩余的未浸泡溶液的m张纸片依次粘接固定在黑色磨砂指板上，得到制作好的标准模板，置于阴凉处保存。

进一步的，所述步骤二具体包括：

2-1、使用待标定的仪器对标准模板进行整体成像或者逐点进行数据采集，分别测得n+m个小纸片处的荧光数据，分别记为A₁、A₂……A_n、B₁、B₂……B_m；

2-2、当

时，

计算标定值

其中1≤i≤n，1≤j≤m；

当

时，

C_i＝无穷小，其中1≤i≤n，其物理意义为该点不可检测。

进一步的，本发明采用的荧光试剂，例如可以是吲哚菁绿ICG粉末和纯水，根据待标定仪器的检测范围，配备出不同浓度的溶液。

进一步的，所述步骤一中，该标准模板包括基底，为黑色磨砂纸板，以及荧光粉末载体，为滤纸片，基底作为标准模板的载体，具有固定荧光粉末载体的作用，两者之间采用双面胶粘接的方式固定。

有益效果：

本发明设计了一种标准荧光模板，可用于对不同荧光成像仪器的对比，也可用作自发荧光组织的仿体，用于检验仪器对于荧光的检测能力。该设计具有以下优点：

第一，制作中采用黑色的磨砂纸作为基底，采用干燥的浸润过荧光剂的纸片作为待检测点，可基本消除多数荧光成像设备中的激发光反射问题。

第二，加入同样形状的不沾染任何荧光剂的纸片作为参考点，可以消除大部分背景荧光噪声，提高标定的准确性。

第三，通过此方法制作的标定模板，可对不同荧光成像仪器的检测灵敏度做客观的横向比较，也可用于仪器开发过程中，作为自发荧光组织的替代品，用于评估仪器的检测性能。

第四，在干燥阴凉条件下，该模板易于长期保存。

附图说明

图1：本发明标准模板的制作流程；

图2：本发明标准模板示意图；

图3：数据对比图。

具体实施方式

下面结合本发明实施例中的附图，对本发明实施例中的技术方案进行清楚、完整的描述，显然，所描述的实施例仅为本发明的一部分实施例，而不是全部的实施例，基于本发明中的实施例，本领域的普通技术人员在不付出创造性劳动的前提下所获得的所有其他实施例，都属于本发明的保护范围。

根据本发明的一个实施例，提出一种用于荧光标定的标准模板制作方法，包括如下步骤：

步骤一、制作具有不同浓度梯度荧光试剂的标准模板纸片，以及制作不带荧光试剂的参考模板纸片；

步骤二、采集用于仪器标定的数据，使用待标定的仪器对标准模板进行整体成像或者逐点进行数据采集，分别测得多个模板纸片处的荧光数据；

步骤三、使用不同仪器，按照步骤二得出每个位置的荧光数据，得出仪器标定结果。

如图1所示为标准模板的制作流程，具体制作步骤。所述步骤一具体包括：

1-1准备若干的荧光剂粉末，例如ICG吲哚菁绿，准备一片黑色磨砂纸板，准备若干纯水以及洁净容器。

1-2用精密天平称取e mg的荧光粉末，放入一个洁净容器中。采用标准移液枪或者精密量筒取f ml纯水，并搅拌均匀，则该容器中荧光粉末的浓度为

取出0.5f ml溶液注射到1号容器中保存。

1-3在剩下的溶液中继续加入0.5f ml的纯水后搅拌均匀，则容器中荧光粉末的浓度变为

继续取出0.5f ml溶液注射到2号容器中保存。

1-4重复1-2步骤多次，则荧光粉末溶液浓度依次降低，根据待标定仪器的荧光检测范围，适当选择重复次数。当重复n-1次时，可配备出n种不同溶液，并依次装在1至n号容器中，其浓度分别为：

其中(1≤i≤n)

1-5准备一张滤纸，并剪裁出n+m张形状完全相同的纸片，其中m≥1。将其中n张纸片依次放入1至n号溶液中。并将此n个容器放置在4-8℃冰箱中静置1个小时以上。

1-6取出容器中的n个纸片，并放置在阴凉处晾干。将晾干后的n张纸片和剩余的未浸泡溶液的m张纸片依次粘接固定在黑色磨砂指板上。将制作好的标准模板置于阴凉处保存。

根据本发明的一个实施例，如图2所示为标准模板示意图，该标准模板包括以下组件：

1：基底，典型为黑色磨砂纸板；

2：荧光粉末载体，典型为滤纸片。

基底1作为标准模板的载体，具有固定荧光粉末载体2的作用，两者之间可采用双面胶粘接的方式固定。荧光粉末载体2采用前述步骤一制作而成，黑色磨砂纸板1上可固定多张荧光粉末载体2，每张荧光粉末载体2所浸润的荧光粉末溶液浓度不同。

使用不同仪器，按照步骤二得出每个位置的标定值，画出图3所示的数据对比图。根据数据图得出不同仪器的检测灵敏度高低，例如根据图3中所示，横轴是标定模板中的位置点，例如1号位置，2号位置等，没有单位，每个位置处的荧光粉末浓度不同。纵坐标是不同仪器测量的每个点的Ci值，该值是归一化到某一位置，例如n号位置的荧光信号强度，也没有单位。图3的数据，每条曲线最后的标定值越大，也就是越靠上，说明其对应的仪器检测灵敏度更高，仪器三优于仪器二，且均优于仪器一。

实施例一：ICG吲哚菁绿模板制作

制作ICG吲哚菁绿标定模板，可用作甲状旁腺的自发荧光仿体。其制作过程如下：准备2.56mg的ICG粉末，加入40ml纯水，搅拌均匀，得到浓度为64ng/ml的溶液，取20ml注入1号试剂瓶。在剩余的20ml溶液中继续加入20ml的纯水，并搅拌均匀，得到32ng/ml的溶液并取20ml注入到2号瓶，继续重复此操作6次，最终得到8瓶ICG溶液，其浓度依次为：1号瓶：64ng/ml，2号瓶：32ng/ml，3号瓶：16ng/ml，4号瓶：8ng/ml，5号瓶：4ng/ml，6号瓶：2ng/ml，7号瓶：1ng/ml，8号瓶：0.5ng/ml。

准备10枚直径10mm的圆形滤纸片作为荧光粉末载体2，取其中8枚，分别放进1至8号试剂瓶中浸润一小时以上，剩余2枚不做处理待用。之后取出8枚滤纸片，放在避光处阴干。准备一片尺寸为100mm*30mm的黑色磨砂纸板作为基底1，按照图2所示将10枚滤纸片通过双面胶固定在基底1上。至此，ICG模板制作完成。

通过小动物荧光成像仪对此模板和待检测甲状旁腺组织同时进行成像，可找到甲状旁腺的自发荧光与荧光粉末载体2中荧光强度相当的滤纸片，选择此滤纸片可替代甲状旁腺用于仪器的开发或评估。

尽管上面对本发明说明性的具体实施方式进行了描述，以便于本技术领域的技术人员理解本发明，且应该清楚，本发明不限于具体实施方式的范围，对本技术领域的普通技术人员来讲，只要各种变化在所附的权利要求限定和确定的本发明的精神和范围内，这些变化是显而易见的，一切利用本发明构思的发明创造均在保护之列。

Claims (6)

1.一种用于荧光标定的标准模板制作方法，其特征在于，包括如下步骤：

步骤一、制作具有不同浓度梯度荧光试剂的标准模板，以及制作不带荧光试剂的参考模板；

步骤二、采集用于仪器标定的数据，使用待标定的仪器对标准模板进行整体成像或者逐点进行数据采集，分别测得多个模板处的荧光数据；

步骤三、使用不同仪器，按照步骤二得出每个位置的荧光数据，得出仪器标定结果。

2.根据权利要求1所述的一种用于荧光标定的标准模板制作方法，其特征在于，所述步骤一具体包括：

步骤1、准备荧光试剂和纯水，根据待标定仪器的检测范围，配备出不同浓度的溶液；

步骤2、采用滤纸剪裁出形状一致的纸片，将所述纸片浸泡到配备好的不同浓度的溶液中，经过预定时间后取出阴干；

步骤3、按照所浸泡溶液的浓度梯度将阴干后的纸片依次固定在黑色磨砂纸板上，同时固定若干未沾染荧光剂的纸片用于背景噪声的消除。

3.根据权利要求2所述的一种用于荧光标定的标准模板制作方法，其特征在于，所述步骤1～3；具体包括：

1-1、准备若干的荧光剂粉末，准备一片黑色磨砂纸板，准备纯水以及洁净容器；

1-2、用精密天平称取e mg的荧光粉末，放入一个洁净容器中；采用标准移液枪或者精密量筒取f ml纯水，并搅拌均匀，则该容器中荧光粉末的浓度为

取出0.5f ml溶液注射到1号容器中保存；

1-3、在剩下的溶液中继续加入0.5f ml的纯水后搅拌均匀，则容器中荧光粉末的浓度变为

继续取出0.5f ml溶液注射到2号容器中保存；

1-4、重复步骤1-2多次，则荧光粉末溶液浓度依次降低，根据待标定仪器的荧光检测范围，选择重复次数；当重复n-1次时，能够配备出n种不同溶液，并依次装在1至n号容器中，其浓度分别为：

其中，1≤i≤n；

1-5、准备一张滤纸，并剪裁出n+m张形状完全相同的纸片，其中m≥1；将其中n张纸片依次放入1至n号溶液中，并将此n个容器放置在4-8℃冰箱中静置1个小时以上；

1-6、取出容器中的n个纸片，并放置在阴凉处晾干，将晾干后的n张纸片和剩余的未浸泡溶液的m张纸片依次粘接固定在黑色磨砂指板上，得到制作好的标准模板，置于阴凉处保存。

4.根据权利要求1所述的一种用于荧光标定的标准模板制作方法，其特征在于，所述步骤二具体包括：

2-1、使用待标定的仪器对标准模板进行整体成像或者逐点进行数据采集，分别测得n+m个小纸片处的荧光数据，分别记为A₁、A₂……A_n、B₁、B₂……B_m；

2-2、当

时，

计算标定值

其中1≤i≤n，1≤j≤m；

当

时，

C_i＝无穷小，其中1≤i≤n，其物理意义为该点不可检测。

5.根据权利要求1所述的一种用于荧光标定的标准模板制作方法，其特征在于，所述步骤一中，采用的荧光试剂，包括吲哚菁绿ICG粉末和纯水，根据待标定仪器的检测范围，配备出不同浓度的溶液。

6.根据权利要求1所述的一种用于荧光标定的标准模板制作方法，其特征在于，所述步骤一中，该标准模板包括基底，为黑色磨砂纸板，以及荧光粉末载体，为滤纸片，基底作为标准模板的载体，具有固定荧光粉末载体的作用，两者之间采用双面胶粘接的方式固定。

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