CN111295196A - 控制皮肤酶活性的分子细菌疗法 - Google Patents

Abstract

本发明提供了一种纯化的多肽，所述多肽抑制(i)角质细胞的蛋白酶产生和/或活性，(ii)抑制角质细胞的IL‑6产生和/或活性，(iii)抑制金黄色葡萄球菌产生酚可溶性调控蛋白α3，和/或(iv)抑制金黄色葡萄球菌的agr产生和/或活性。还提供了包含多肽的局部配制剂。提供了重组微生物，其包含编码所述多肽的载体或多核苷酸。还提供了包含重组微生物的益生菌组合物。本发明还提供了包含多肽和/或重组微生物的试剂盒和制品。

Description

控制皮肤酶活性的分子细菌疗法

关于联邦资助研究的声明

本发明是在美国国立卫生研究院(National Institutes of Health)授予的授权号为AI117673、AR067547、AR062496和AR064781的政府支持下完成的。政府在本发明中享有某些权利。

相关申请的交叉引用

根据美国法典第35篇第119条，本申请要求2017年8月31日提交的临时申请序列号62/553,025的优先权，该临时申请的公开内容通过引用并入本文。

技术领域

本公开涉及治疗皮肤病学疾病和病症的组合物和方法，以及涉及调节皮肤屏障渗透性的组合物。

微生物保藏

本公开的示例性微生物[表皮葡萄球菌(Staphylococcus epidermidis)A11、人葡萄球菌(Staphylococcus Hominis)C5、人葡萄球菌A9和沃氏葡萄球菌(Staphylococcuswarneri)G2]根据布达佩斯条约于2018年8月28日在弗吉尼亚州玛纳萨斯大学大道10801号Va.20110-2209的美国典型培养物保藏中心(American Type Culture Collection)保藏为ATCC编号_______(菌株名称表皮葡萄球菌A11 81618，于2018年8月28日保藏)、ATCC编号_______(菌株名称人葡萄球菌C5 81618，于2018年8月28日保藏)、ATCC编号_______(菌株名称人葡萄球菌A9 81618，于2018年8月28日保藏)以及ATCC编号_______(菌株名称沃氏葡萄球菌G2 81618，于2018年8月28日保藏)。自保藏处收到最近一次样品公开请求起至少五年的一段时间、自保藏日起至少三十年的一段时间或在相关专利有效期(enforceablelife)期间，以最长的期限为准，该保藏物将被保存在授权的保藏处，并且在发生突变、无活性或破坏的情况下将被替换。在该申请的专利发行后，对于公众获得这些细胞系的所有限制都不可逆的被消除。

背景技术

表皮是免疫防御的第一线，其保护和调节微生物与宿主生物体之间的相互作用。控制这种相互作用非常重要，因为细菌不仅驻留表面上(在此处它们影响浅表角质细胞)，而且还向下渗透到角质层并进入真皮(已经证明一些细菌种类在此处影响免疫功能)。例如，表皮葡萄球菌(S.epidermidis)与表皮角质细胞相互作用，以预防toll样受体3介导的炎症、募集肥大细胞和T细胞、并增加紧密连接(tight junction)和抗微生物肽的产生。与常见的皮肤共生细菌——表皮葡萄球菌不同，金黄色葡萄球菌(S.aureus)通常是致病性的，对皮肤功能有负面影响。这在诸如受到金黄色葡萄球菌促进的特应性皮炎(AD)的皮肤疾病中尤为明显。

已经证明居住在患有AD的受试者的皮肤中的微生物群系的总体微生物多样性降低且金黄色葡萄球菌丰度增加。已经将金黄色葡萄球菌定植的增加与AD患者的疾病严重程度的提高关联起来。从机制上讲，尚不清楚金黄色葡萄球菌如何使疾病恶化。已经证明来自金黄色葡萄球菌的几种产物会破坏屏障和/或引发炎症。这些产物包括a毒素、超抗原、毒性休克综合症毒素1、肠毒素、蛋白A、Panton-Valentine杀白细胞素、剥脱性毒素和V8丝氨酸蛋白酶。由于这些分子具有潜在的致病作用，因此在缺乏明确的临床感染迹象的情况下，了解皮肤对金黄色葡萄球菌定植的反应对于理解AD的发病机理和开发未来的疗法至关重要。

发明内容

本公开提供了纯化的多肽，其包含与SEQ ID NO:4、11、12、13、14、15、16或17具有至少98％同一性的序列，并且抑制(i)角质细胞的蛋白酶产生和/或活性，(ii)抑制角质细胞的IL-6产生和/或活性，(iii)抑制金黄色葡萄球菌(S.aureus)产生酚可溶性调控蛋白α3，和/或(iv)抑制金黄色葡萄球菌的agr产生和/或活性。在一个实施方案中，所述多肽与SEQ ID NO:2具有至少98％的同一性。在另外的实施方案中，所述多肽包含SEQ ID NO:4、11、12、13、14、15、16或17。在再另外的实施方案中，所述多肽由SEQ ID NO:4、11、12、13、14、15、16或17组成。在前述任一实施方案的另一个或进一步的实施方案中，所述多肽包含一种或多种D-氨基酸。在又一个或另外的实施方案中，所述多肽包含式I、IA或IB的化合物(参见下文)。

本公开还提供了局部配制剂，其包含本公开的多肽或式I、IA或IB的化合物。

本公开还提供了一种分离的多核苷酸，其编码本公开的多肽。在一个实施方案中，所述多核苷酸包含序列，所述序列在严格条件下与由SEQ ID NO:1或3组成的多核苷酸杂交并编码包含SEQ ID NO:4的多肽。在另外的实施方案中，所述多核苷酸包含SEQ ID NO:1或3。

本公开还提供了包含本公开的多核苷酸的载体。所述载体可以是用于在细胞或微生物宿主中表达的任何合适的载体。

本公开还提供了一种重组微生物，其包含本公开的载体或多核苷酸。在一些实施方案中，通过重组工程将不天然表达本公开的多肽的微生物改造成表达本公开的多核苷酸。在再另外的实施方案中，所述微生物是减毒的，因为其与相同物种的野生型生物体相比已成为非致病性的或致病性降低。在再另外的实施方案中，所述重组微生物是通常在哺乳动物(例如人)的皮肤上发现的微生物(例如共生微生物)。

本公开还提供了一种益生菌组合物，其包含本公开的重组微生物。

本公开还提供了一种益生菌组合物，其包含表达本公开的多肽(例如，SEQ ID NO:4、11、12、13、14、15、16和/或17)的微生物。在一个实施方案中，所述微生物是人葡萄球菌、表皮葡萄球菌、沃氏葡萄球菌或其任何组合。在进一步的实施方案中，所述微生物是人葡萄球菌C5、人葡萄球菌A9、表皮葡萄球菌A11和/或沃氏葡萄球菌G2。在再另外的或进一步的实施方案中，所述组合物包含选自以下微生物的组的微生物：所述微生物具有ATCC编号_______(菌株名称表皮葡萄球菌A11 81618，于2018年8月28日保藏)、ATCC编号_______(菌株名称人葡萄球菌C5 81618，于2018年8月28日保藏)、ATCC编号_______(菌株名称人葡萄球菌A981618，于2018年8月28日保藏)、ATCC编号_______(菌株名称沃氏葡萄球菌G281618，于2018年8月28日保藏)及任何前述菌株的组合。在另外的实施方案中，本公开的益生菌组合物是非天然的(例如，不包括皮肤上发现的全部微生物，或包括每单位体积一定量的、未在皮肤上发现的微生物，或微生物已被基因修饰，或该组合物含有通常未在皮肤上发现的成分或化合物)。

本公开还提供了一种治疗皮肤病学病症的方法，该方法包括施用足以抑制皮肤上的蛋白酶活性的、有效量的凝固酶阴性葡萄球菌属物种(Staphylococcus sp.)(CoNS)或有效量的CoNS的发酵提取物，其中CoNS产生多肽，所述多肽包含与SEQ ID NO:4、11、12、13、14、15、16或17具有至少98％同一性的序列并抑制蛋白酶产生。在一个实施方案中，所述皮肤病学病症选自由以下各项组成的组：内瑟顿综合征、特应性皮炎、接触性皮炎、湿疹、银屑病、痤疮、表皮角化过度、棘皮症、表皮炎症、皮肤炎症和搔痒症。在另外的实施方案中，所述施用是通过局部应用进行施用。在再另外的或进一步的实施方案中，所述CoNS选自由以下各项组成的组：表皮葡萄球菌、头状葡萄球菌(Staphylococcus capitis)、山羊葡萄球菌(Staphylococcus caprae)、解糖葡萄球菌(Staphylococcus saccharolyticus)、沃氏葡萄球菌、巴氏葡萄球菌(Staphylococcus pasteuri)、溶血葡萄球菌(Staphylococcushaemolyticus)、德氏葡萄球菌(Staphylococcus devriesei)、人葡萄球菌、Staphylococcus jettensis、Staphylococcus petrasii和路邓葡萄球菌(Staphylococcuslugdunensis)。在任意前述实施方案的再另外的或进一步的实施方案中，所述CoNS的发酵提取物包含SEQ ID NO:4的肽序列和/或式I、IA或IB的化合物。在另外的实施方案中，所述CoNS选自由以下各项组成的组：表皮葡萄球菌A11、人葡萄球菌C4、人葡萄球菌C5、人葡萄球菌A9、沃氏葡萄球菌G2及其任何组合。

本公开还提供了一种治疗皮肤疾病或病症的方法，其包括测量来自受试者皮肤的培养物的蛋白酶活性或受试者皮肤的蛋白酶活性；将蛋白酶活性与正常对照进行比较；施用共生皮肤细菌组合物和/或来自凝固酶阴性葡萄球菌的发酵提取物，其中所述共生皮肤细菌组合物或发酵提取物包含与SEQ ID NO:4、11、12、13、14、15、16或17具有至少98％同一性的多肽和/或包含式I、IA或IB的化合物，其中所述组合物被配制成维持共生皮肤细菌的生长和复制能力的乳膏、软膏或药物组合物。在一个实施方案中，所述凝固酶阴性葡萄球菌选自由以下各项组成的组：表皮葡萄球菌、头状葡萄球菌、山羊葡萄球菌、解糖葡萄球菌、沃氏葡萄球菌、巴氏葡萄球菌、溶血葡萄球菌、德氏葡萄球菌、人葡萄球菌、Staphylococcusjettensis、Staphylococcus petrasii和路邓葡萄球菌。

本公开还提供了一种治疗皮肤疾病或病症的方法，该方法包括施用本公开的纯化的多肽或益生菌组合物，所述益生菌组合物包含产生多肽的细菌，所述多肽与SEQ ID NO:4、11、12、13、14、15、16或17具有至少98％同一性且抑制激肽释放酶的产生或活性。

本公开还提供了一种治疗皮肤疾病或病症的方法，该方法包括施用抑制酚可溶性调控蛋白表达的组合物，其中该组合物包含本公开的纯化的多肽或式I、IA或IB的化合物。在一个实施方案中，所述施用是局部施用。在另外的实施方案中，该组合物是凝固酶阴性葡萄球菌的发酵提取物。

本公开还提供了一种局部益生菌组合物，其包含益生共生皮肤细菌，所述益生共生皮肤细菌选自由以下各项组成的组：表皮葡萄球菌A11、人葡萄球菌C4、人葡萄球菌C5、人葡萄球菌A9、沃氏葡萄球菌G2及其任何组合。在一个实施方案中，所述组合物被配制为洗剂、振荡剂、乳膏、软膏、凝胶、泡沫、粉剂、固体、糊剂或酊剂。

本公开还提供了一种药物组合物，其包含药物和含有酚可溶性调控蛋白α3的金黄色葡萄球菌发酵提取物或金黄色葡萄球菌益生菌。本公开还提供了所述组合物用于通过受试者的皮肤递送药物的用途。

本公开提供了共生细菌/好细菌和/或其产物，以防止皮肤中蛋白酶活性的增加。这在许多疾病状态中是重要的，所述疾病状态包括特应性皮炎、内瑟顿综合征和遭受异常高蛋白酶活性和屏障破坏的其它皮肤病状。

本公开还提供了因子和组合物以诱导蛋白酶活性，从而在与伤口修复、衰老、晒伤、色素异常和瘢痕有关的病症的治疗中帮助皮肤的蛋白水解重构。

本公开提供了一种治疗皮肤病学病症的方法，该方法包括施用足以抑制皮肤上的蛋白酶活性的、有效量的凝固酶阴性葡萄球菌属物种(CoNS)或有效量的CoNS的发酵提取物。在一个实施方案中，所述皮肤病学病症选自由以下各项组成的组：内瑟顿综合征、特应性皮炎、接触性皮炎、湿疹、银屑病、痤疮、表皮角化过度、棘皮症、表皮炎症、皮肤炎症和搔痒症。在另外的实施方案中，所述施用通过局部应用进行。在另外的实施方案中，所述CoNS选自由以下各项组成的组：表皮葡萄球菌、头状葡萄球菌、山羊葡萄球菌、解糖葡萄球菌、沃氏葡萄球菌、巴氏葡萄球菌、溶血葡萄球菌、德氏葡萄球菌、人葡萄球菌、Staphylococcusjettensis、Staphylococcus petrasii和路邓葡萄球菌。在具体的实施方案中，所述CoNS是表皮葡萄球菌。

本公开还提供了一种治疗皮肤疾病或病症的方法，其包括测量来自受试者皮肤的培养物的蛋白酶活性或来自受试者的皮肤的蛋白酶活性；将蛋白酶活性与正常对照进行比较；施用共生皮肤细菌组合物和/或来自凝固酶阴性葡萄球菌的发酵提取物，其中所述共生皮肤细菌组合物包含至少一种降低培养物或皮肤的丝氨酸蛋白酶活性的共生细菌，其中所述至少一种共生细菌被配制为维持所述共生皮肤细菌的生长和复制能力的乳膏、软膏或药物组合物。在一个实施方案中，所述凝固酶阴性葡萄球菌选自由以下各项组成的组：表皮葡萄球菌、头状葡萄球菌、山羊葡萄球菌、解糖葡萄球菌、沃氏葡萄球菌、巴氏葡萄球菌、溶血葡萄球菌、德氏葡萄球菌、人葡萄球菌、Staphylococcus jettensis、Staphylococcuspetrasii和路邓葡萄球菌。

本公开还提供了一种治疗皮肤疾病或病症的方法，该方法包括施用抑制激肽释放酶表达的药剂。本公开还提供了一种治疗皮肤疾病或病症的方法，该方法包括施用抑制酚可溶性调控蛋白表达的药剂。在前述任一实施方案的一个实施方案中，所述施用是局部施用。在另外的实施方案中，所述药剂是凝固酶阴性葡萄球菌的发酵提取物。在另外的实施方案中，所述凝固酶阴性葡萄球菌选自由以下各项组成的组：表皮葡萄球菌、头状葡萄球菌、山羊葡萄球菌、解糖葡萄球菌、沃氏葡萄球菌、巴氏葡萄球菌、溶血葡萄球菌、德氏葡萄球菌、人葡萄球菌、Staphylococcus jettensis、Staphylococcus petrasii和路邓葡萄球菌。

本公开还提供了包含多种皮肤细菌的局部组合物。在一个实施方案中，益生共生皮肤细菌是凝固酶阴性葡萄球菌属物种。在另一个不同的实施方案中，益生共生皮肤细菌包含金黄色葡萄球菌。在任意前述实施方案的一个实施方案中，细菌被配制为其中所述细菌保持存活的乳膏、洗剂、酊剂、凝胶或其它局部配方(formulary)。

本公开还提供了一种局部益生菌组合物，其包含益生共生皮肤细菌发酵提取物，所述益生共生皮肤细菌发酵提取物获自凝固酶阴性葡萄球菌属(CoNS)物种。在一个实施方案中，所述CoNS选自由以下各项组成的组：表皮葡萄球菌、头状葡萄球菌、山羊葡萄球菌、解糖葡萄球菌、沃氏葡萄球菌、巴氏葡萄球菌、溶血葡萄球菌、德氏葡萄球菌、人葡萄球菌、Staphylococcus jettensis、Staphylococcus petrasii和路邓葡萄球菌。

在所描述的任何实施方案中，局部益生菌组合物被配制为洗剂、振荡剂、乳膏、软膏、凝胶、泡沫、粉剂、固体、糊剂或酊剂。

本公开提供了一种药物组合物，其包含药物和金黄色葡萄球菌发酵提取物或金黄色葡萄球菌生物组合物。

本公开提供了一种用于通过皮肤进行药物递送的方法，该方法包括使皮肤与包含药物和金黄色葡萄球菌发酵提取物或金黄色葡萄球菌生物组合物的组合物接触。在一个实施方案中，所述药物是待通过皮肤吸收或吸附的局部药物。

本公开还提供了一种递送局部药物的方法，该方法包括在一定剂量和条件下，使受试者的皮肤与包含金黄色葡萄球菌或金黄色葡萄球菌的发酵提取物的组合物接触一段时间，以增加皮肤的渗透性，然后使皮肤与待递送的药物接触。

本公开提供了一种组合物，其包含来自金黄色葡萄球菌的发酵提取物或含有活的金黄色葡萄球菌的洗剂、振荡剂、乳膏、软膏、凝胶、泡沫、粉剂、固体、糊剂或酊剂。

在附图和以下描述中阐述了本发明的一个或多个实施方案的细节。通过说明书和附图以及权利要求书，本发明的其它特征、目的和优点将变得显而易见。

附图说明

图1A-D显示，(A-C)NHEK用金黄色葡萄球菌(SA；Newman、USA300、113、SANGER252)和表皮葡萄球菌(ATCC12228、ATCC1457)无菌过滤上清液处理24小时，并且NHEK条件培养基用特异性胰蛋白酶样、弹性蛋白酶样以及MMP蛋白酶底物进行分析。(D)分析金黄色葡萄球菌(Newman)分泌的蛋白酶对胰蛋白酶活性的影响。数据表示平均值±SEM(n＝4)并且代表至少三次独立的试验。使用单因素方差分析(ANOVA)(aec)和双因素方差分析(d)，并且通过*P<0.05、***P<0.001、****P<0.0001指示显著性。ANOVA，方差分析；MMP，基质金属蛋白酶；NHEK，正常人表皮角质细胞。

图2A-C显示，(A)在金黄色葡萄球菌(SA，Newman)上清液处理0-48小时后，在NHEK条件培养基中测量总蛋白酶活性(5μg ml BODIPY FL酪蛋白)；(B)然而，将丝氨酸蛋白酶抑制剂抑肽酶(800μg ml)应用于处理后24小时的条件培养基；(C)比较金黄色葡萄球菌(USA300 LAC)WT和无蛋白酶的(protease-null)菌株对NHEK条件培养基胰蛋白酶活性(Boc-Val-Pro-Arg-AMC，200mM)的影响。使用双因素方差分析(A、B)和单因素方差分析(C)，并且通过*P<0.05、**P<0.01、***P<0.001、****P<0.0001指示显著性。ANOVA，方差分析；NHEK，正常人表皮角质细胞；WT，野生型。

图3A-F显示金黄色葡萄球菌增加人角质细胞中KLK的表达。(A)在24小时金黄色葡萄球菌(SA，Newman)上清液处理后，NHEK中的KLK mRNA表达的相对丰度通过qPCR分析。(B-E)分析在用金黄色葡萄球菌上清液处理0-48小时的NHEK中KLK5、6、13和14的mRNA表达的倍数变化。通过看家基因——甘油醛-3-磷酸脱氢酶(GAPDH)将所有mRNA表达水平归一化。(F)使用公布的和预测的分子量二者，在用SA(Newman)上清液进行24小时处理后，通过免疫印迹法分析NHEK条件培养基和细胞裂解物的KLK5、6、13和14的蛋白质表达的变化。看家基因——a-微管蛋白用作细胞裂解物的加载对照。数据表示平均值±SEM(n＝3)并且代表至少三次独立的试验。使用双因素方差分析(bee)，并且通过**P<0.01、***P<0.001、****P<0.0001指示显著性。ANOVA，方差分析；KLK，激肽释放酶；NHEK，正常人表皮角质细胞；qPCR，实时定量PCR；SEM，平均值的标准误差。

图4A-D显示多个KLK造成人角质细胞中金黄色葡萄球菌诱导的丝氨酸蛋白酶活性。在CaCl₂分化和添加金黄色葡萄球菌(Newman)上清液之前，用KLK6、13或14siRNA(15nM)处理NHEK。siRNA加扰的(scrambled)(-)对照1和2分别以15nM和45nM使用。(A)分析条件培养基的胰蛋白酶活性(Boc-Val-Pro-Arg-AMC，200μM)的变化。(B-D)通过qPCR评估KLK6、KLK13和KLK14的转录水平，并将其归一化至看家基因GAPDH，以确认siRNA敲低效率。数据表示平均值±SEM(n＝4)并且代表至少三次独立的试验。使用单因素方差分析(a)，并且通过*P<0.05、**P<0.01、***P<0.001指示显著性。ANOVA，方差分析；GAPDH，甘油醛-3-磷酸脱氢酶；KLK，激肽释放酶；NHEK，正常人表皮角质细胞；qPCR，实时定量PCR；siRNA，小干扰RNA；SEM，平均值的标准误差。

图5A-C显示多个KLK调节人角质细胞中金黄色葡萄球菌诱导的DSG-1和FLG裂解。在siRNA敲低KLK6、13和14(15nM)后，通过免疫印迹法评估用金黄色葡萄球菌(Newman)上清液处理24小时的NHEK的下列项的变化：(A)桥粒芯蛋白-1(DSG-1)和(B)丝聚合蛋白原(profilaggrin，Pro-FLG)裂解。看家基因a-微管蛋白用作加载对照。DSG-1(全长)和Pro-FLG由黑色箭头指示。(C)DSG-1(全长)和Pro-FLG二者的光密度法分析由归一化至a-微管蛋白的平均像素数表示(n＝1)。免疫印迹代表至少三次独立的试验。KLK，激肽释放酶；NHEK，正常人表皮角质细胞；siRNA，小干扰RNA。

图6描绘了制备发酵提取物和进行活性测定的方法。

图7显示在agr群体感应系统(quorum sensing system)的控制下，金黄色葡萄球菌酚可溶性调控蛋白(PSM)是造成角质细胞丝氨酸蛋白酶活性增加的原因。

图8显示金黄色葡萄球菌PSM增加小鼠丝氨酸蛋白酶活性和皮肤屏障损害。

图9显示来自特应性皮炎(AD)损伤皮肤的金黄色葡萄球菌分离株可以以agr-型依赖性方式在角质细胞中诱导丝氨酸蛋白酶活性。

图10显示凝固酶阴性葡萄球菌(CoNS)菌株ATCC14490(表皮葡萄球菌)可以产生自诱导肽(AIP)，以关闭金黄色葡萄球菌的agr活性。

图11显示金黄色葡萄球菌和共生细菌在特应性皮炎中对丝氨酸蛋白酶活性的影响。

图12显示人葡萄球菌C5对金黄色葡萄球菌agr活性的影响。

图13显示各种CoNS菌株对金黄色葡萄球菌agr活性的影响。

图14A-J显示金黄色葡萄球菌PSMα导致上皮屏障内环境稳定的破坏。用来自野生型(WT)、PSMα(ΔPSMα)或PSMβ(ΔPSMβ)敲除菌株的金黄色葡萄球菌(SA)无菌过滤的上清液刺激人角质细胞(NHEK)，持续24h，并且分析(A)胰蛋白酶活性和(B)与看家基因GAPDH相比的KLK6 mRNA(n＝4)。(C)将PSM合成肽加入到NHEK中，持续高达24h，以分析胰蛋白酶活性的变化。(D、E)评估通过RNA-Seq对PSMα3处理后变化≥2倍的基因进行的转录分析，然后进行基因本体论(GO)分析。用SA WT、SAΔPSMα或SA 10分泌的蛋白酶敲除菌株(Δ蛋白酶)(1e⁷CFU)处理8周龄的雄性C57BL/6小鼠(n＝6)，持续72h。(F、G)鼠皮肤代表性图片(虚线表示处理区域)和处理后表皮厚度的变化(比例尺＝200μm)。(H-K)还评估了鼠背部皮肤(WT或突变SA菌株)的经皮水分流失(TEWL)和SA CFU/cm²的变化。所有误差线均以平均值的标准误差(SEM)表示，并且使用单因素方差分析来确定由以下指示的统计学显著性：p<0.05*、p<0.01**、p<0.001***、p<0.0001****。

图15A-G显示表皮葡萄球菌agr I型自诱导肽表征和在AD皮肤中的缺乏。(A、B)24h后表皮葡萄球菌agr I-III型上清液对金黄色葡萄球菌(SA)USA300 LAC agr I型活性的抑制(n＝4)，和表皮葡萄球菌agr I型自诱导肽(AIP)的已知结构的代表。(C)24h后表皮葡萄球菌(S.epi)agr I型菌株RP62A野生型(WT)或自诱导肽敲除型(ΔAIP)对SA agr活性的影响。(D)将在表皮葡萄球菌WT存在或不存在的情况下生长的SA无菌过滤的上清液或ΔAIP上清液应用到NHEK，持续另外24h，然后测量NHEK胰蛋白酶活性(n＝4)。(E)AD皮肤上发现的表皮葡萄球菌agr I-III型基因组的共有区。(F、G)根据基于客观SCORAD的‘最不严重’到‘最严重’AD评分和基于AD严重程度的所有受试者的综合数据，8名单独的AD受试者的发红区上的表皮葡萄球菌agr I型与SA相对丰度的比率。所有误差线均以平均值的标准误差(SEM)表示，并使用单因素方差分析(A、C、D)和(非参数)未配对Mann-Whitney检验(F)以确定由以下指示的统计学显著性：p<0.05*、p<0.01**、p<0.001***、p<0.0001****。

图16A-F显示多株临床上分离的凝固酶阴性葡萄球菌抑制金黄色葡萄球菌agr活性。(A)将临床上分离的凝固酶阴性葡萄球菌(CoNS)的无菌过滤的上清液添加到金黄色葡萄球菌(SA)USA300 LAC agr I型P3-YFP报告菌株(reporter strain)，持续24h，然后分析SA agr活性(n＝3)。(B、C)对人葡萄球菌C5菌株基因组进一步测序，并分析agrD基因的自诱导肽(AIP)序列。人葡萄球菌C5上清液的生物化学分析还测试了<3kDa尺寸排阻离心过滤、80％硫酸铵沉淀和pH 11 1h处理的上清液影响SA agr活性的能力。(D-F)在存在人葡萄球菌C5上清液的情况下生长24h的SA被无菌过滤，并添加到人角质细胞(NHEK)，持续24h，然后分析胰蛋白酶活性、与看家基因GAPDH相比的KLK6 mRNA表达和IL-6蛋白质水平。所有误差线均以平均值的标准误差(SEM)表示，并使用单因素方差分析以确定由以下指示的统计学显著性：p<0.05*、p<0.01**、p<0.001***、p<0.0001****。

图17A-H显示AD临床CoNS分离株抑制SA诱导的鼠皮肤屏障损伤。在存在或不存在活性人葡萄球菌C5(1e⁸ CFU)的情况下，将金黄色葡萄球菌(SA)USA300 LAC agr I型pAmiP3-Lux报告菌株(1e⁷ CFU)应用到8周龄雌性C57BL/6小鼠，持续48h(n＝5)。(A、B)通过发光变化评估鼠背部皮肤上的SA agr活性。(C)48h SA处理后鼠皮肤的代表性图像(虚线框表示处理区域)。(D-H)测定SA CFU/cm²，并且通过分析Il6 mRNA表达、经皮水分流失(TEWL)、胰蛋白酶活性和归一化至看家基因Gapdh的Klk6mRNA表达的变化评估鼠皮肤屏障损伤和炎症。所有误差线均以平均值的标准误差(SEM)表示，并使用单因素方差分析以确定由以下指示的统计学显著性：p<0.05*、p<0.01**、p<0.001***、p<0.0001****。

图18A-H显示金黄色葡萄球菌PSMα改变人角质细胞中的主要屏障基因和细胞因子表达。(A-D)以剂量和时间依赖性方式二者评估用合成PSMα3处理的人角质细胞的胰蛋白酶活性和归一化至看家基因GAPDH的KLK6转录表达的变化。(E)在用PSMα3处理24h的人角质细胞中相对于对照下调≥2倍的基因的GO-term分析。(F-H)用SA WT、SAΔpsmα或SAΔpsmβ上清液处理24h的IL-6、TNF-α或IL-1α的人角质细胞细胞因子蛋白质表达的变化。所有误差线均以平均值的标准误差(SEM)表示，并使用单因素方差分析以确定由以下指示的统计学显著性：p<0.05*、p<0.01**、p<0.001***、p<0.0001****。

图19A-H显示金黄色葡萄球菌PSMα和蛋白酶是造成鼠皮肤上的屏障损伤和炎症诱发的原因。将金黄色葡萄球菌(SA)(1e⁷ CFU)野生型(WT)、PSMα敲除型(Δpsmα)和不含蛋白酶型(Δ蛋白酶)菌株应用到雄性鼠背部皮肤，持续72h(n＝6)，并测量(A、E)胰蛋白酶活性、(B、F)Klk6、(C、G)Il6和(D、H)归一化至看家基因Gapdh的IL17a/f mRNA表达的变化。所有误差线均以平均值的标准误差(SEM)表示，并使用单因素方差分析以确定由以下指示的统计学显著性：p<0.05*、p<0.01**、p<0.001***、p<0.0001****。

图20A-C显示CoNS菌株不影响SA生长。凝固酶阴性葡萄球菌(CoNS)上清液影响SAagr I型P3-YFP报告菌株生长，如通过OD600nm(n＝3-4)评估的，包括添加到SA agr I型报告菌株持续24h的(A)CoNS临床分离株、(B)表皮葡萄球菌agr type I-III和(C)表皮葡萄球菌野生型(WT)或自诱导肽敲除型(ΔAIP)上清液。所有误差线均以平均值的标准误差(SEM)表示。

图21A-B显示人葡萄球菌C5抑制SA agr I-III型，但不抑制IV型。将人葡萄球菌C5上清液添加到SA agr I-IV型P3-YFP报告菌株持续24h(n＝3)。(A)SA报告菌株agr I-IV型活性和(B)在存在人葡萄球菌C5上清液的情况下培养时OD600nm的生长测量结果。所有误差线均以平均值的标准误差(SEM)表示，并使用单因素方差分析以确定由以下指示的统计学显著性：p<0.05*、p<0.01**、p<0.001***、p<0.0001****。

图22A-F显示人葡萄球菌C5上清液抑制SA诱导的皮肤屏障损伤。在存在或不存在10x浓缩的<3kDa人葡萄球菌C5上清液的情况下，将金黄色葡萄球菌(SA)(1e⁷ CFU)应用到雌性鼠背部皮肤，持续48h(n＝3)。(A-B)鼠背部的代表性图像(虚线表示处理区域)和SA处理后从鼠皮肤回收的SA CFU/cm²。(C-F)SA诱导的皮肤屏障损伤标记物，包括Il6、经皮水分流失(TEWL)、胰蛋白酶活性和与看家基因Gapdh相比的Klk6 mRNA表达。所有误差线均以平均值的标准误差(SEM)表示，并使用单因素方差分析以确定由以下指示的统计学显著性：p<0.05*、p<0.01**、p<0.001***、p<0.0001****。

具体实施方式

如本文和所附权利要求书中所使用的，单数形式“一(a、an)”和“该(the)”包括复数指代，除非上下文另外明确指出。因此，例如，对“一种药剂”的引用包括多种这类药剂，而对“该微生物”的引用包括引用一种或多种微生物及本领域技术人员已知的其等同物，等等。

另外，除非另有说明，否则“或”的使用表示“和/或”。类似地，“包含(comprise、comprises、comprising)”和“包括(include、includes、including)”是可互换的，而不意图是限制性的。

将进一步理解的是，在各个实施方案的描述使用术语“包含”的情况下，本领域技术人员将理解，在一些特定情况下，可以可替代地使用语言“基本上由…组成”或“由…组成”来描述实施方案。

除非另有定义，否则本文中使用的所有技术和科学术语具有与本公开所属领域的普通技术人员通常理解含义的相同含义。与本文描述的方法和药剂相似或等同的任何方法和药剂都可以用于所公开的方法和组合物的实践中。

特应性皮炎(AD)是最常见的免疫疾病之一，会给患者的生活质量和财务状况带来沉重负担，并带来严重的合并症风险。皮肤屏障功能的缺陷是AD的重要特征。AD患者的湿疹性皮肤病变的Th2细胞因子(如IL4和IL13)水平升高。Th2细胞因子通过抑制丝聚蛋白的表达来促进皮肤屏障功能的降低。这些细胞因子还抑制人抗微生物肽[如抗菌肽(cathelicidin)和b-防御素-2]的表达，这是AD中的缺陷，可导致皮肤细菌群落生态失调和金黄色葡萄球菌定植增强。靶向IL4受体α的疗法导致疾病的显著改善。Th2细胞因子活性、屏障功能、抗微生物活性和疾病结果之间的强相关性支持确定这些基本表皮功能之间的因果关系的努力。

蛋白水解活性增加可损害AD患者的皮肤屏障，因为已经发现它们表现出增加的激肽释放酶(KLK)表达。KLK是具有15种丝氨酸蛋白酶的家族，其中几种丝氨酸蛋白酶主要存在于表皮的上部颗粒层和角膜层中。在内瑟顿综合征中，由于丝氨酸蛋白酶抑制剂Kazal-5型的活性降低，观察到丝氨酸蛋白酶活性增加。所引起的酶活性的增加导致增加的脱皮、改变的抗微生物肽和丝聚蛋白(FLG)加工、以及蛋白酶激活受体2激活和炎症。增加的蛋白酶活性还可在微生物群系与皮肤免疫系统的交流中起重要作用，并且最近已证明其通过增强细菌通过表皮的渗透而直接影响表皮细胞因子的产生和炎症。

皮肤微生物群系的生态失调和金黄色葡萄球菌在皮肤上的定植与特应性皮炎(AD)的恶化有关。本公开证明金黄色葡萄球菌具有诱导来自角质细胞的特定KLK的表达并增加皮肤中总体蛋白水解活性的能力。这阐释了皮肤上的细菌与宿主进行交流的系统，并针对金黄色葡萄球菌定植如何会增加AD患者的疾病严重程度提出了以前未知但可能重要的机制。

金黄色葡萄球菌可以向皮肤上分泌多种蛋白酶，这改变皮肤屏障的完整性。已证明丝氨酸蛋白酶V8和丝氨酸样蛋白酶表皮剥脱毒素裂解角质桥粒(corneodesmosome)粘附蛋白(包括DSG-1)，导致脱皮增加。已知短梗霉溶素(Aureolysin)，一种MMP，裂解并失活LL-37(皮肤上一种重要的抗微生物肽)。但是，金黄色葡萄球菌产物的这些直接蛋白水解作用需要高水平的酶和细菌，因此与该生物体感染过程中发生的事件更加一致。

金黄色葡萄球菌激活角质细胞后，观察到屏障蛋白的消化增加。已知FLG由较大的Pro-FLG(400kDa)裂解成单体形式(37kDa)，该单体形式在形成角质层与角蛋白的物理屏障中起重要作用。已经证明，Pro-FLG的加速裂解可与皮肤脱皮增加有关(Hewett等，2005)。有趣的是，在用金黄色葡萄球菌上清液处理的人角质细胞中观察到Pro-FLG的裂解增加。当KLK6或KLK13沉默时，Pro-FLG的裂解被部分阻断，这表明金黄色葡萄球菌可通过裂解Pro-FLG以KLK依赖性方式降低皮肤屏障的完整性。

DSG-1是一种重要的角质桥粒粘附蛋白，其在裂解时导致增加的脱皮。通过金黄色葡萄球菌刺激的KLK活性容易裂解角质细胞中的全长DSG-1(160kDa)。据报道，KLK5、6、7和14可以裂解DSG-1，而KLK13则不能。这表明上调的KLK6和KLK14可导致全长DSG-1的裂解增强，同时提供与KLK13不参与DSG-1裂解的观点相反的证据。因此，金黄色葡萄球菌可使KLK改变FLG裂解，但也增加DSG-1裂解，作为降低表皮皮肤屏障完整性的另一种途径。特定的siRNA敲低表明，KLK表达的增加至少部分是造成由金黄色葡萄球菌刺激的丝氨酸蛋白酶活性增加的原因。图2C表明，来自金黄色葡萄球菌的分泌的蛋白酶有助于诱导角质细胞中胰蛋白酶活性的增加。因为包括金黄色葡萄球菌在内的细菌可以穿透皮肤表面并引起强烈的皮肤免疫反应(Nakatsuji等，2013、2016；Zhang等，2015)，所以这些细菌也可能影响皮肤细胞的蛋白酶活性。这些观察结果也与酒渣鼻或内瑟顿综合征有关。

本公开证明，由金黄色葡萄球菌产生的可溶性因子具有改变角质细胞产生的内源蛋白酶活性的有效的、先前未曾想到的能力。这发生在金黄色葡萄球菌产物的稀释液中，从该稀释液中无法检测到细菌蛋白酶的活性。因此，金黄色葡萄球菌可以促进表皮提高内源蛋白水解活性的表达，从而显著地改变总表皮蛋白水解活性的平衡。

金黄色葡萄球菌的不同菌株(Newman、USA300、113和SANGER252)和表皮葡萄球菌的不同菌株(ATCC12228和ATCC1457)对于人角质细胞蛋白酶活性具有不同的作用。金黄色葡萄球菌菌株(包括Newman和USA300)增加胰蛋白酶活性，而金黄色葡萄球菌的其它菌株和表皮葡萄球菌增加弹性蛋白酶或MMP活性。因此，细菌可改变表皮蛋白酶活性，这取决于细菌的种类和菌株。其它细菌种类和金黄色葡萄球菌的菌株可能会另外独特地影响人皮肤的酶平衡。有趣的是，初步数据发现，纯化的toll样受体配体不会在角质细胞中诱导胰蛋白酶活性或KLK表达。

蛋白酶活性在多种皮肤疾病中高度上调，导致皮肤屏障受损。在几乎所有情况下，这都与疾病状况恶化有关。一方面，本公开证明共生微生物及其细菌产物可用于预防皮肤中蛋白酶活性的增加。特别地，本公开证明，凝固酶阴性葡萄球菌可通过抑制agr群体感应系统来预防金黄色葡萄球菌诱导的皮肤中的丝氨酸蛋白酶活性。金黄色葡萄球菌是一种致病细菌菌株，可在皮肤中诱导丝氨酸蛋白酶活性。增加的蛋白酶活性破坏皮肤屏障，并导致恶化的疾病状态，包括内瑟顿综合征和特应性皮炎。本公开证明，可以通过使用共生的或好的皮肤细菌和由其衍生的因子来防止丝氨酸蛋白酶活性的这种增加。

本公开提出了角质细胞对金黄色葡萄球菌的意外响应。由于增加的DSG-1和FLG裂解，金黄色葡萄球菌产生一种或多种因子，所述因子以KLK依赖性方式降低皮肤屏障的完整性。

本公开证明金黄色葡萄球菌不仅分泌蛋白酶，而且可以特异性地活化角质细胞以提高内源蛋白酶的表达。本公开表明，金黄色葡萄球菌分泌酚可溶性调控蛋白α(PSMα)，其触发表皮的自身消化。例如，KLK家族的三个成员似乎在这种增加的酶活性中起作用。

本公开还鉴定了共生细菌、基因和多肽，它们抑制金黄色葡萄球菌的附属基因调节子(agr)群体感应系统并关闭PSMα，从而抑制蛋白酶活性。因此，本公开提供了调节特应性皮炎的靶标以及调节特应性皮炎和皮肤上的蛋白酶活性的药剂和益生菌制剂。

本公开证明，通常驻留在皮肤上的凝固酶阴性葡萄球菌(CoNS)物种，例如表皮葡萄球菌和人葡萄球菌，通过产生自诱导肽(AIP)来保护免受金黄色葡萄球菌的这种生物活性，所述自诱导肽(AIP)抑制金黄色葡萄球菌的附属基因调节(agr)群体感应系统并关闭PSMα分泌。

几乎所有金黄色葡萄球菌毒素都在毒力附属基因调节子(agr)的控制之下。agr系统通过称为群体感应的过程在特定细胞密度下触发基因表达的变化。除毒素外，已知agr还上调多种毒力决定因子，例如胞外酶(蛋白酶、脂肪酶、核酸酶)，并下调表面结合蛋白的表达。认为在需要时(例如，在开始时细胞密度低且对宿主组织的粘附重要时，结合蛋白)这种适应控制感染的某些毒力决定因子的产生；以及在建立感染且需要从宿主组织获取营养时，控制毒素和降解性胞外酶的产生。

不同CoNS物种的多种临床分离株在不改变金黄色葡萄球菌丰度的情况下在体外和体内均抑制蛋白酶活化并防止上皮损伤(例如，在不改变金黄色葡萄球菌密度的情况下抑制蛋白酶的生物活性/agr活性)。此外，本公开证明，具有活性AD的患者显示出这些有益微生物(例如CoNS)与金黄色葡萄球菌相比的相对丰度的降低，因此克服了对群体感应的抑制并使得金黄色葡萄球菌能够破坏屏障。总之，本公开显示了正常人皮肤微生物群系的成员如何通过作为群落帮助控制金黄色葡萄球菌毒素产生来维持免疫内环境稳定。

本公开还鉴定了提供抑制agr群体感应活性的产物的多核苷酸序列、多肽序列及其片段。这些多核苷酸和多肽可用于提供治疗剂和重组的非致病性皮肤细菌或减毒皮肤细菌，用于局部配制剂中，以治疗金黄色葡萄球菌感染和/或特应性皮炎。

例如，本公开提供了下调agr活性的自诱导肽(AIP)。本文还提供了编码AIP的多核苷酸。

本公开提供了AD皮肤中金黄色葡萄球菌定植增加与丝氨酸蛋白酶活性增加之间的联系，并提供了新的靶标和疗法，包括但不限于：上调皮肤中的蛋白酶活性的发酵提取物(例如，来自金黄色葡萄球菌的发酵提取物)；或下调皮肤中的蛋白酶活性的、来自共生细菌的发酵提取物(例如，含有一种或多种本公开的AIP)。此外，本公开提供(i)包含此类提取物或纯化的AIP肽的局部配制剂；(ii)包含共生益生菌(例如，已经用AIP编码序列转化的非致病性细菌或减毒细菌，或局部配制剂中的纯化的共生细菌制剂)的局部配制剂。另外的治疗靶标可以是针对KLK和/或DSG-1和/或FLG疗法(例如，增加这些因子的表达或向AD受试者的递送)的抗体。

在一个实施方案中，本公开的AIP多肽具有X₁X₂X₃X₄CX₅X₆X₇X₈(SEQ ID NO:10)的共有序列(SEQ ID NO:10)，其中X₁是S、K、V、G或T；X₂是Y、Q、A或I；X₃是N、S、T或D；X₄是V、P、M或T；X₅是G、S、A、N或T；X₆是G、N、T或L；X₇是Y或F；且X₈是F、L或Y，其中SEQ ID NO:10的氨基酸5-9形成硫代内酯环。落入SEQ ID NO:10的共有序列内的示例性肽序列包括：SYNVCGGYF(SEQID NO:4)、KYNPCSNYL(SEQ ID NO:11)、SYSPCATYF(SEQ ID NO:12)、SQTVCSGYF(SEQ ID NO:13)、GANPCALYY(SEQ ID NO:14)、TINTCGGYF(SEQ ID NO:15)、VQDMCNGYF(SEQ ID NO:16)和GYSPCTNFF(SEQ ID NO:17)。在进一步的实施方案中，多肽产生式I或IA的结构。在另一个实施方案中，多肽可以包含D-氨基酸或L-氨基酸的组合。在任何前述实施方案中，所述多肽抑制金黄色葡萄球菌蛋白酶活性、agr活性或角质细胞蛋白酶活性。

本公开提供了式I的化合物：

其中X₁来自1-6氨基酸；X₂是选自以下的氨基酸：缬氨酸(V)、脯氨酸(P)、甲硫氨酸(M)和苏氨酸(T)；其中R⁵选自由以下各项组成的组：

其中R⁶选自由以下各项组成的组：

其中R⁷选自由以下各项组成的组：

且其中R⁸选自由以下各项组成的组：

在一个实施方案中，本公开提供了式IA的化合物：

其中X₁来自1-6氨基酸；X₂是选自以下的氨基酸：缬氨酸(V)、脯氨酸(P)、甲硫氨酸(M)和苏氨酸(T)；

其中R¹选自由以下各项组成的组：

其中R²选自由以下各项组成的组：

其中R³选自由以下各项组成的组：

其中R⁵选自由以下各项组成的组：

其中R⁶选自由以下各项组成的组：

其中R⁷选自由以下各项组成的组：

且其中R⁸选自由以下各项组成的组：

本公开提供了纯化的多肽(例如，AIP肽)，其包含与SEQ ID NO:4具有至少98％同一性的序列，并且其抑制(i)角质细胞的蛋白酶产生和/或蛋白酶活性；(ii)抑制角质细胞的IL-6产生和/或活性；(iii)抑制金黄色葡萄球菌(S.aureus)产生酚可溶性调控蛋白α3；和/或(iv)抑制金黄色葡萄球菌的agr产生和/或活性。在另外的实施方案中，本公开提供了式IB的化合物：

在再另外的实施方案中，本公开提供了纯化的多肽，其包含SEQ ID NO:4、11、12、13、14、15、16或17或由SEQ ID NO:4、11、12、13、14、15、16或17组成。在进一步的实施方案中，所述多肽形成式I、IA或IB的结构。

在一个实施方案中，本公开的AIP肽可包含一种或多种D-氨基酸。

本公开提供了局部配制剂，其包含具有SEQ ID NO:10的共有序列的AIP肽，或SEQID NO:4、11、12、13、14、15、16或17的肽，或式I、IA或IB的化合物。

“基本上一致的”是指氨基酸序列在很大程度上(但不是完全)相同，但是保留了与之相关的序列的功能活性。与多肽序列或多核苷酸序列共有的同一性百分比是基于序列的比对。使用各种程序来执行比对并确定同一性在本领域中是常见的。通常，如果两个多肽或结构域的序列具有至少85％、90％、95％、98％或99％的同一性，或者如果在序列中存在保守变异，则它们是“基本上一致的”。可以使用计算机程序，例如BLAST程序(Altschul等，1990)来比较序列同一性。

本公开还提供了编码本公开的AIP多肽的多核苷酸(即“AIP多核苷酸”)。例如，本公开提供了编码SEQ ID NO:2或4的多核苷酸。在一个实施方案中，该多核苷酸在严格条件下与由SEQ ID NO:3组成的多核苷酸杂交并编码SEQ ID NO:4的多肽。杂交反应的“严格性”是本领域普通技术人员容易确定的，其通常是取决于探针长度、洗涤温度和盐浓度的经验计算。通常，较长的探针需要较高的温度，以进行适当的退火，而较短的探针则需要较低的温度。杂交通常取决于在互补链存在于低于其解链温度的环境中时变性DNA再退火的能力。探针和可杂交序列之间期望的同源性程度越高，可以使用的相对温度则越高。因此，结果是，较高的相对温度倾向于使反应条件更严格，而较低的温度则不太这样。关于杂交反应的严格性的更多细节和解释，参见Ausubel等,Current Protocols in Molecular Biology,Wiley Interscience Publishers,(1995)。如本文所定义，“严格条件”或“高度严格条件”通常：(1)采用低离子强度和高温进行洗涤，例如在50℃，0.015M氯化钠/0.0015M柠檬酸钠/0.1％十二烷基硫酸钠；(2)在杂交过程中使用变性剂，例如甲酰胺，例如在42℃，50％(v/v)甲酰胺与0.1％牛血清白蛋白/0.1％菲可(Ficoll)/0.1％聚乙烯吡咯烷酮/pH 6.5的50mM磷酸钠缓冲液以及750mM氯化钠、75mM柠檬酸钠；或(3)在42℃，使用50％甲酰胺、5x SSC(0.75M NaCl、0.075M柠檬酸钠)、50mM磷酸钠(pH 6.8)、0.1％焦磷酸钠、5x Denhardt溶液、超声处理的鲑鱼精子DNA(50μg/ml)、0.1％SDS和10％葡聚糖硫酸酯，其中在42℃在0.2xSSC(氯化钠/柠檬酸钠)中进行洗涤和在55℃在50％甲酰胺中进行洗涤，然后在55℃进行高严格度洗涤(由含有EDTA的0.1x SSC组成)。可以使用密码子表推导编码SEQ ID NO:11、12、13、14、15、16和17的多核苷酸序列。

可以将AIP多核苷酸克隆到用于本公开的各种载体中。例如，可以将AIP多核苷酸克隆到表达载体或质粒中，以用于在重组宿主细胞中转化和/或表达。用于细菌转化的载体是已知的。四种主要的载体类型是质粒、病毒载体、粘粒和人工染色体。所有工程载体的共同点是复制起点、多克隆位点和选择标记。这些中的任何一个都适用于本文。AIP多核苷酸可以插入到克隆、载体、梭子(shuttle)、质粒、BAC中，或者也可以被整合到细菌基因组中。如果使用质粒，则质粒的拷贝数可以在每个细胞5-500个拷贝数之间。示例性质粒和表达载体包括但不限于：p252、p256、p353-2(Leer等，1992)、p8014-2、pA1、pACYC、pAJ01、pAl-衍生物(Vujcic&Topisirovic 1993)、pall、pAM-β-1,2,3,5,8(simon和chopin 1988)、pAR1411、pBG10、pBK、pBM02、pBR322、pBR328、pBS-slpGFP、pC194(McKenzie等，1986、1987；Horinouchi&Weisblum 1982b)、PC194/PUB110、pC30il、pC30il(Skaugen 1989)、pCD034-1、pCD034-2、pCD256、pC12000、pC1305、pC1528、pCIS3、pCL2.1、pCT1138、pD125、pE194、pE194/PLS1、pEGFP-C1、pEH、pF8801、pFG2、pFK-系列、pGK-系列、pGK12、pGK13、pIA、pIAV1、5、6、7、9、pIL.CatT、pIL252/3、pIL253、pIL7、pISA[对于大肠杆菌(E.coli)而言较低]、pJW563、pKRV3、pLAB1000(Josson等，1990)、pLB4(Bates&Gilbert 1989)、pLBS、pLE16、pLEB124、pLEB590、pLEB591、pLEB600、pLEB604、pLEP24Mcop、pLJ1(Takiguchi等，1989)、pLKS、pLTK2、pWCFS101和pMD5057(Bates&Gilbert，1989；Skaugen，1989；Leer等，1992；Vujcic&Topisirovic，1993；Eguchi等，2000；Kaneko等，2000；Danielsen，2002；Daming等，2003；delas Rivas等，2004；van Kranenburg等，2005)、pLP1/18/30、pLP18、pLP317、pLP317cop、pLP3537、pLP3537xyl、pLP402、pLP825、pLP825和pLPE323、pLP82H、pLPC37、pLPE23M、pLPE323、pLPE350、pLPI(Bouia等，1989)、pLS1、pLS1和pE194(Lacks等，1986；Horinouchi&Weisblum 1982a)、plul631、来自携带红霉素抗性基因的罗伊氏乳杆菌(L.reuteri)的pLUL631、pM3、pM4、pMD5057、pMG36e、pND324、pNZ-系列、pPSC系列、pSH71(de vos，1987)、pSIP-系列、pSK11L、pSL2、PSN2、pSN2(Khan&Novick 1982)、pT181(Koepsel等，1987)、(Khan&Novick 1983)、pT181、pC194和pE194[在枯草芽孢杆菌(B.subtilis)中没有功能(Gruss等，1987)]、pT181、pE194/pLS1、pC194/pUB110和pSN2(Khan，2005)、pTL、pTRK家族、pTRT家族、pTUAT35、pUBII0和pC194(McKenzie等，1986、1987；Horinouchi&Weisblum1982b)、pUCL22、pULP8/9、pVS40、pWC1、pWCFS101、pWV02、pWV04、pWV05、RepA、系统BetL。

在一个实施方案中，本公开提供了包含本公开的AIP多肽或肽的局部组合物。例如，在一个实施方案中，所述局部组合物包含纯化的多肽(例如，AIP肽)，其包含SEQ ID NO:10的共有序列或与SEQ ID NO:4、11、12、13、14、15、16或17中的任何序列具有至少98％同一性的序列，并且抑制(i)角质细胞的蛋白酶产生和/或蛋白酶活性；(ii)抑制角质细胞的IL-6产生和/或活性；(iii)抑制从金黄色葡萄球菌(S.aureus)产生酚可溶性调控蛋白α3；和/或(iv)抑制金黄色葡萄球菌的agr产生和/或活性。在另外的实施方案中，所述局部组合物包含式I、IA或IB的化合物(如上所定义)。

在另外的实施方案中，所述局部组合物可包含非致病性微生物(包括已被工程化以减少或消除致病活性的减毒微生物)，其中所述微生物已被工程化以表达AIP多肽。微生物可以被工程化以包含载体和/或AIP多核苷酸。在一个实施方案中，微生物产生式I、IA和/或IB的化合物。

在一个实施方案中，本文的组合物和方法使用非致病性细菌，所述非致病性细菌已通过用本公开的AIP多核苷酸转化细菌而被工程化，从而产生式I、IA和/或IB的化合物。在一个实施方案中，群体中的细菌是非致病性、非侵入性微生物，并且在某些实施方案中可以是革兰氏阳性食品级细菌菌株。在另外的实施方案中，转化的细菌群体由皮肤微生物群系中天然存在的细菌制备。

在某些实施方案中，在组合物中形成细菌群体并被转化以表达式I、IA和/或IB的化合物的细菌可以是相同细菌的集合或处于不同系统发育水平的不同细菌的混合物。驻留在健康人皮肤上的细菌包括通常驻留在人面部上的细菌物种，例如放线菌纲(Actinobacteria)，包括棒杆菌属(corynebacterium)和丙酸杆菌属(propionibacterium)中的细菌。在其它实施方案中，驻留在健康人受试者的皮肤上的细菌包括通常存在于面部以外的皮肤上的细菌物种，包括例如拟杆菌门(bacteroidetes)和变形菌门(proteobacteria)的属中的细菌。皮肤微生物群系中的其它细菌包括本文下面所列细菌。

在一个实施方案中，细菌来自丙酸杆菌属，包括但不限于：产酸丙酸杆菌(Propionibacterium acidifaciens)、产丙酸丙酸杆菌(Propionibacteriumacidipropionici)、产丙酸丙酸杆菌菌株4900、痤疮丙酸杆菌(Propionibacteriumacnes)、澳樟丙酸杆菌(Propionibacterium australiense)、贪婪丙酸杆菌(Propionibacterium avidum)、环乙烷丙酸杆菌(Propionibacterium cyclohexanicum)、费氏丙酸杆菌费氏亚种(Propionibacterium freudenreichii subsp.Freudenreichii)、费氏丙酸杆菌费氏亚种菌株20271、费氏丙酸杆菌谢氏亚种(Propionibacteriumfreudenreichii subsp.Shermanii)、费氏丙酸杆菌谢氏亚种菌株4902、费氏丙酸杆菌谢氏亚种菌株4902、颗粒丙酸杆菌(Propionibacterium granulosum)、无害丙酸杆菌(Propionibacterium innocuum)、詹氏丙酸杆菌(P.jensenii)菌株20278、嗜淋巴丙酸杆菌(Propionibacterium lymphophilum)、微嗜氧丙酸杆菌(Propionibacteriummicroaerophilum)、丙酸丙酸杆菌(Propionibacterium propionicum)、特氏丙酸杆菌(Propionibacterium thoenii)和特氏丙酸杆菌菌株20277。在一个实施方案中，细菌不是痤疮丙酸杆菌。在一个实施方案中，细菌来自棒杆菌属，包括但不限于：拥挤棒杆菌(C.accolens)、非发酵棒杆菌(C.afermentan)、无枝菌酸棒杆菌(C.amycolatum)、银色棒杆菌(C.argentoratense)、水生棒杆菌(C.aquaticum)、耳棒杆菌(C.auris)、牛棒杆菌(C.bovis)、白喉棒杆菌(C.diphtheria)、马棒杆菌(C.equi)[现为马红球菌(Rhodococcusequi)]、微黄棒杆菌(C.flavescens)、解葡萄糖苷棒杆菌(C.glucuronolyticum)、谷氨酸棒状杆菌(C.glutamicum)、肉芽肿棒杆菌(C.granulosum)、溶血棒杆菌(C.haemolyticum)、C.halofytica、杰氏棒杆菌(C.jeikeium)(组JK)、麦氏棒杆菌(C.macginleyi)、马氏棒杆菌(C.matruchotii)、极小棒杆菌(C.minutissimum)、短棒状杆菌(C.parvum)(痤疮丙酸杆菌)、丙酸棒杆菌(C.propinquum)、假白喉棒杆菌(C.pseudodiphtheriticum)[霍夫曼氏棒杆菌(C.hofmannii)]、假结核棒杆菌(C.pseudotuberculosis)、[绵羊棒杆菌(C.ovis)]、化脓棒杆菌(C.pyogenes)、解脲棒杆菌(C.urealyticum)(组D2)、牛肾盂炎棒杆菌(C.renale)、棒杆菌属物种(C.spec)、纹带棒杆菌(C.striatum)、纤细棒杆菌(C.tenuis)、溃疡棒杆菌(C.ulcerans)、解脲棒杆菌和干燥棒杆菌(C.xerosis)。考虑具有亲脂性基团和非亲脂性基团的细菌，并且非亲脂性细菌可以包括发酵棒状杆菌和非发酵棒状杆菌。在一个实施方案中，细菌不是白喉棒杆菌、C.amicolatum、纹带棒杆菌、杰氏棒杆菌、解脲棒杆菌、干燥棒杆菌、假结核棒杆菌、纤细棒杆菌、纹带棒杆菌或极小棒杆菌，因为这些细菌可能是致病的。在一个实施方案中，细菌来自微球菌亚目(Micrococcineae)，包括但不限于：GRAS细菌物种阿氏节杆菌(Arthrobacter arilaitensis)、贝氏节杆菌(Arthrobacterbergerei)、球形节杆菌(Arthrobacter globiformis)、烟草节杆菌(Arthrobacternicotianae)、嗜根考克氏菌(Kocuria rhizophila)、变异库克菌(Kocuria varians)、滕黄微球菌(Micrococcus luteus)、里拉微球菌(Micrococcus lylae)、Microbacteriumgubbeenense、金橙黄短杆菌(Brevibacterium aurantiacum)、乳酪短杆菌(Brevibacterium casei)、亚麻短杆菌(Brevibacterium linens)、食物小短杆菌(Brachybacterium alimentarium)和奶酪发酵小短杆菌(Brachybacteriumtyrofermentans)。在另外的实施方案中，细菌来自葡萄球菌属(Staphylococcus)，包括但不限于：艾格尼丝葡萄球菌(Staphylococcus agnetis)、阿尔莱特葡萄球菌(S.arlettae)、耳葡萄球菌(S.auricularis)、头状葡萄球菌、山羊葡萄球菌、肉葡萄球菌(S.carnosus)、溶酪葡萄球菌(Staphylococcus caseolyticus)、产色葡萄球菌(S.chromogenes)、科氏葡萄球菌(S.cohnii)、S.condiment、海豚葡萄球菌(S.delphini)、德氏葡萄球菌、马胃葡萄球菌(S.equorum)、猫葡萄球菌(S.felis)、福氏葡萄球菌(S.fleurettii)、鸡葡萄球菌(S.gallinarum)、溶血葡萄球菌、人葡萄球菌、猪葡萄球菌(S.hyicus)、中间型葡萄球菌(S.intermedius)、克氏葡萄球菌(S.kloosii)、李氏葡萄球菌(S.leei)、缓慢葡萄球菌(S.lentus)、路邓葡萄球菌、水獭葡萄球菌(S.lutrae)、S.massiliensis、S.microti、蝇葡萄球菌(S.muscae)、尼泊尔葡萄球菌(S.nepalensis)、巴氏葡萄球菌、佩藤科费尔葡萄球菌(S.pettenkoferi)、鱼发酵葡萄球菌(S.piscifermentans)、假中间型葡萄球菌(S.pseudintermedius)、假路邓葡萄球菌(S.pseudolugdunensis)、小牛肉葡萄球菌(S.pulvereri)、S.rostra、解糖葡萄球菌、腐生葡萄球菌(S.saprophyticus)、施氏葡萄球菌(S.schleiferi)、松鼠葡萄球菌(S.sciuri)、金猿葡萄球菌(S.simiae)、模仿葡萄球菌(S.simulans)、斯氏葡萄球菌(S.stepanovicii)、琥珀葡萄球菌(S.succinus)、小牛葡萄球菌(S.vitulinus)、沃氏葡萄球菌和木糖葡萄球菌(S.xylosus)。在一个实施方案中，细菌不是金黄色葡萄球菌或表皮葡萄球菌。在另外的实施方案中，细菌来自链球菌属(Streptococcus)，包括但不限于：少酸链球菌(Streptococcus acidominimus)、毗邻链球菌(Streptococcus adjacens)、无乳链球菌(Streptococcus agalactiae)、非解乳糖链球菌(Streptococcus alactolyticus)、咽峡炎链球菌(Streptococcus anginosus)、澳大利亚链球菌(Streptococcus australis)、牛链球菌(Streptococcus bovis)、卡氏链球菌(Streptococcus caballi)、犬链球菌(Streptococcus canis)、山羊链球菌(Streptococcus caprinus)、Streptococcus castoreus、盲肠链球菌(Streptococcuscecorum)、星座链球菌(Streptococcus constellatus)、星座链球菌星座亚种(Streptococcus constellatus subsp.Constellatus)、星座链球菌咽炎亚种(Streptococcus constellatus subsp.Pharyngis)、乳脂链球菌(Streptococcuscremoris)、仓鼠链球菌(Streptococcus criceti)、嵴链球菌(Streptococcuscristatus)、丹尼尔链球菌(Streptococcus danieliae)、缺陷链球菌(Streptococcusdefectives)、Streptococcus dentapri、Streptococcus dentirousetti、负鼠链球菌(Streptococcus didelphis)、无乳链球菌(Streptococcus difficilis)、耐性链球菌(Streptococcus durans)、停乳链球菌(Streptococcus dysgalactiae)、停乳链球菌停乳亚种(Streptococcus dysgalactiae subsp.Dysgalactiae)、停乳链球菌似马亚种(Streptococcus dysgalactiae subsp.Equisimilis)、消化道链球菌(Streptococcusentericus)、马链球菌(Streptococcus equi)、马链球菌马亚种(Streptococcus equisubsp.Equi)、马链球菌类马亚种(Streptococcus equi subsp.Ruminatorum)、马链球菌兽疫亚种(Streptococcus equi subsp.Zooepidemicus)、Streptococcus equines、粪链球菌(Streptococcus faecalis)、屎链球菌(Streptococcus faecium)、野鼠链球菌(Streptococcus ferus)、鹑鸡链球菌(Streptococcus gallinaceus)、解没食子酸链球菌(Streptococcus gallolyticus)、解没食子酸链球菌解没食子酸亚种(Streptococcusgallolyticus subsp.Gallolyticus)、解没食子酸链球菌马其顿亚种(Streptococcusgallolyticus subsp.Macedonicus)、解没食子酸链球菌巴氏亚种(Streptococcusgallolyticus subsp.Pasteurianus)、Streptococcus garvieae、格氏链球菌(Streptococcus gordonii)、Streptococcus halichoeri、汉森链球菌(Streptococcushansenii)、Streptococcus henryi、猪肠链球菌(Streptococcus hyointestinalis)、猪阴道链球菌(Streptococcus hyovaginalis)、Streptococcus ictaluri、婴儿链球菌(Streptococcus infantarius)、婴儿链球菌结肠亚种(Streptococcus infantariussubsp.Coli)、婴儿链球菌婴儿亚种(Streptococcus infantarius subsp.Infantarius)、婴儿链球菌(Streptococcus infantis)、海豚链球菌(Streptococcus iniae)、中间链球菌(Streptococcus intermedius)、肠道链球菌(Streptococcus intestinalis)、Streptococcus lactarius、乳酸链球菌(Streptococcus lactis)、乳酸链球菌乳脂亚种(Streptococcus lactis subsp.Cremoris)、乳酸链球菌丁二酮乳酸亚种(Streptococcuslactis subsp.Diacetilactis)、乳酸链球菌乳酸亚种(Streptococcus lactissubsp.Lactis)、Streptococcus lutetiensis、猕猴链球菌(Streptococcus macacae)、马其顿链球菌(Streptococcus macedonicus)、Streptococcus marimammalium、玛斯里链球菌(Streptococcus massiliensis)、Streptococcus merionis、Streptococcus minor、缓症链球菌(Streptococcus mitis)、麻疹链球菌(Streptococcus morbillorum)、变形链球菌(Streptococcus mutans)、寡发酵链球菌(Streptococcus oligofermentans)、口腔链球菌(Streptococcus oralis)、鼠口腔链球菌(Streptococcus orisratti)、羊链球菌(Streptococcus ovis)、副血链球菌(Streptococcus parasanguinis)、副乳房链球菌(Streptococcus parauberis)、短小链球菌(Streptococcus parvulus)、巴氏链球菌(Streptococcus pasteurianus)、Streptococcus peroris、海豹链球菌(Streptococcusphocae)、植物链球菌(Streptococcus plantarum)、多形链球菌(Streptococcuspleomorphus)、多动物链球菌(Streptococcus pluranimalium)、Streptococcusplurextorum、肺炎链球菌(Streptococcus pneumonia)、Streptococcus porci、豕链球菌(Streptococcus porcinus)、Streptococcus porcorum、假肺炎链球菌(Streptococcuspseudopneumoniae)、假豕链球菌(Streptococcus pseudoporcinus)、酿脓链球菌(Streptococcus pyogenes)、棉籽糖乳链球菌(Streptococcus raffinolactis)、鼠链球菌(Streptococcus ratti)、Streptococcus rupicaprae、解糖链球菌(Streptococcussaccharolyticus)、唾液链球菌(Streptococcus salivarius)、唾液链球菌唾液亚种(Streptococcus salivarius subsp.Salivarius)、唾液链球菌嗜热亚种(Streptococcussalivarius subsp.Thermophilus)、血液链球菌(Streptococcus sanguinis)、Streptococcus shiloi、中国链球菌(Streptococcus sinensis)、茸毛链球菌(Streptococcus sobrinus)、猪链球菌(Streptococcus suis)、嗜热链球菌(Streptococcus thermophilus)、托尔豪特链球菌(Streptococcus thoraltensis)、苏黎世链球菌(Streptococcus tigurinus)、Streptococcus troglodytae、Streptococcustroglodytidis、乳房链球菌(Streptococcus uberis)、Streptococcus urinalis、前庭链球菌(Streptococcus vestibularis)和Streptococcus waius。在另外的实施方案中，细菌来自乳杆菌属(Lactobacillus)，包括但不限于：格氏乳球菌(Lactococcus garvieae)、乳酸乳球菌(Lactococcus lactis)、乳酸乳球菌乳脂亚种(Lactococcus lactissubsp.cremoris)、乳酸乳球菌霍氏亚种(Lactococcus lactis subsp.hordniae)、乳酸乳球菌、乳酸乳球菌乳酸亚种(Lactococcus lactis subsp.Lactis)、鱼类乳球菌(Lactococcus piscium)、植物乳球菌(Lactococcus plantarum)、棉籽糖乳球菌(Lactococcus raffinolactis)、耐酸乳杆菌(Lactobacillus acetotolerans)、嗜酸乳杆菌(Lactobacillus acidophilus)、敏感乳杆菌(Lactobacillus agilis)、双叉乳杆菌(Lactobacillus algidus)、食品乳杆菌(Lactobacillus alimentarius)、解淀粉乳酸杆菌(Lactobacillus amylolyticus)、嗜淀粉乳杆菌(Lactobacillus amylophilus)、淀粉乳杆菌(Lactobacillus amylovorus)、动物乳杆菌(Lactobacillus animalis)、鸟乳杆菌(Lactobacillus aviarius)、鸟乳杆菌不解棉子糖亚种(Lactobacillus aviariussubsp.araffinosus)、鸟乳杆菌鸟亚种(Lactobacillus aviarius subsp.aviarius)、巴伐利亚乳杆菌(Lactobacillus bavaricus)、双发酵乳杆菌(Lactobacillus bifermentans)、短乳杆菌(Lactobacillus brevis)、布氏乳杆菌(Lactobacillus buchneri)、保加利亚乳杆菌(Lactobacillus bulgaricus)、卡尼乳杆菌(Lactobacillus carnis)、干酪乳杆菌(Lactobacillus casei)、干酪乳杆菌不发酵乳糖亚种(Lactobacillus caseisubsp.alactosus)、干酪乳杆菌干酪亚种(Lactobacillus casei subsp.casei)、干酪乳杆菌假植物亚种(Lactobacillus casei subsp.pseudoplantarum)、干酪乳杆菌鼠李糖亚种(Lactobacillus casei subsp.rhamnosus)、干酪乳杆菌坚韧亚种(Lactobacillus caseisubsp.tolerans)、乳酪乳杆菌(Lactobacillus catenaformis)、纤维二糖乳杆菌(Lactobacillus cellobiosus)、丘状乳杆菌(Lactobacillus collinoides)、融合魏斯菌(Lactobacillus confusus)、棒状乳杆菌(Lactobacillus coryniformis)、棒状乳杆菌棒状亚种(Lactobacillus coryniformis subsp.coryniformis)、棒状乳杆菌扭曲亚种(Lactobacillus coryniformis subsp.torquens)、卷曲乳杆菌(Lactobacilluscrispatus)、弯曲乳杆菌(Lactobacillus curvatus)、弯曲乳杆菌弯曲亚种(Lactobacillus curvatus subsp.curvatus)、弯曲乳杆菌蜜二糖亚种(Lactobacilluscurvatus subsp.melibiosus)、德氏乳杆菌(Lactobacillus delbrueckii)、德氏乳杆菌保加利亚亚种(Lactobacillus delbrueckii subsp.bulgaricus)、德氏乳杆菌德氏亚种(Lactobacillus delbrueckii subsp.delbrueckii)、德氏乳杆菌乳酸亚种(Lactobacillus delbrueckii subsp.lactis)、广布乳杆菌(Lactobacillus divergens)、香肠乳杆菌(Lactobacillus farciminis)、发酵乳杆菌(Lactobacillus fermentum)、穹隆乳杆菌(Lactobacillus formicalis)、食果糖乳杆菌(Lactobacillus fructivorans)、果糖乳杆菌(Lactobacillus fructosus)、鹑鸡乳杆菌(Lactobacillus gallinarum)、加氏乳杆菌(Lactobacillus gasseri)、禾谷乳杆菌(Lactobacillus graminis)、耐盐乳杆菌(Lactobacillus halotolerans)、哈氏乳杆菌(Lactobacillus hamsteri)、瑞士乳杆菌(Lactobacillus helveticus)、异型腐酒乳杆菌(Lactobacillus heterohiochii)、希氏乳杆菌(Lactobacillus hilgardii)、麦芽香乳杆菌(Lactobacillus homohiochii)、惰性乳杆菌(Lactobacillus iners)、肠乳杆菌(Lactobacillus intestinalis)、詹氏乳杆菌(Lactobacillus jensenii)、约氏乳杆菌(Lactobacillus johnsonii)、坎氏乳杆菌(Lactobacillus kandleri)、开菲尔乳杆菌(Lactobacillus kefiri)、马乳酒样乳杆菌(Lactobacillus kefuranofaciens)、偏性异发酵乳杆菌(Lactobacillus kefirgranum)、昆氏乳杆菌(Lactobacillus kunkeei)、乳酸乳杆菌(Lactobacillus lactis)、莱士曼氏乳酸杆菌(Lactobacillus leichmannii)、林氏乳杆菌(Lactobacillus lindneri)、坏发酵乳杆菌(Lactobacillus malefermentans)、马里乳杆菌(Lactobacillus mali)、马耳他乳杆菌(Lactobacillus maltaromicus)、马尼厚乳杆菌(Lactobacillus manihotivorans)、稍小乳杆菌(Lactobacillus minor)、小小乳杆菌(Lactobacillus minutus)、粘膜乳杆菌(Lactobacillus mucosae)、鼠乳杆菌(Lactobacillus murinus)、纳氏乳杆菌(Lactobacillus nagelii)、口乳杆菌(Lactobacillus oris)、面包乳杆菌(Lactobacilluspanis)、类布氏乳杆菌(Lactobacillus parabuchneri)、副干酪乳杆菌(Lactobacillusparacasei)、副干酪乳杆菌副干酪亚种(Lactobacillus paracasei subsp.paracasei)、副干酪乳杆菌坚韧亚种(Lactobacillus paracasei subsp.tolerans)、类高加索乳杆菌(Lactobacillus parakefiri)、类消化乳杆菌(Lactobacillus paralimentarius)、类植物乳杆菌(Lactobacillus paraplantarum)、戊糖乳杆菌(Lactobacillus pentosus)、类食品乳杆菌(Lactobacillus perolens)、栖鱼乳杆菌(Lactobacillus piscicola)、胚牙乳杆菌(Lactobacillus plantarum)、脑桥乳杆菌(Lactobacillus pontis)、罗伊乳杆菌(Lactobacillus reuteri)、鼠李糖乳杆菌(Lactobacillus rhamnosus)、鼠李糖乳杆菌菌株5/E5a、龈沟乳杆菌(Lactobacillus rimae)、罗氏乳杆菌(Lactobacillus rogosae)、瘤胃乳杆菌(Lactobacillus ruminis)、米酒乳杆菌(Lactobacillus sakei)、米酒乳杆菌肉花亚种(Lactobacillus sakei subsp.camosus)、米酒乳杆菌米酒亚种(Lactobacillussakei subsp.sakei)、唾液乳杆菌(Lactobacillus salivarius)、唾液乳杆菌水杨素亚种(Lactobacillus salivarius subsp.salicinius)、唾液乳杆菌唾液亚种(Lactobacillussalivarius subsp.salivarius)、旧金山乳杆菌(Lactobacillus sanfranciscensis)、沙氏乳杆菌(Lactobacillus sharpeae)、苏氏乳杆菌(Lactobacillus suebicus)、发状乳杆菌(Lactobacillus trichodes)、龈乳杆菌(Lactobacillus uli)、牛痘乳杆菌(Lactobacillus vaccinostercus)、阴道乳杆菌(Lactobacillus vaginalis)、绿色乳杆菌(Lactobacillus viridescens)、小牛乳杆菌(Lactobacillus vitulinus)、木糖乳杆菌(Lactobacillus xylosus)、山梨氏乳杆菌(Lactobacillus yamanashiensis)、山梨氏乳杆菌马里亚种(Lactobacillus yamanashiensis subsp.mali)、山梨氏乳杆菌山梨亚种(Lactobacillus yamanashiensis subsp.Yamanashiensis)和玉米乳杆菌(Lactobacilluszeae)。在另外的实施方案中，细菌来自乳球菌属(Lactococcus)，包括但不限于：Lactococcus Schleifer、春氏乳球菌(Lactococcus chungangensis)、弗氏乳球菌(Lactococcus fujiensis)、格氏乳球菌、乳酸乳球菌、乳酸乳球菌乳脂亚种、乳酸乳球菌霍氏亚种、乳酸乳球菌乳酸亚种、乳酸乳球菌Tructae亚种、鱼类乳球菌、植物乳球菌(Lactococcus plantarum)和棉籽糖乳球菌(Lactococcus raffinolacti)。

在再另一个实施方案中，本公开提供了用于局部递送的益生菌组合物，其包含本公开的CoNS共生皮肤细菌。在一个实施方案中，CoNS细菌包含产生AIP多肽和/或式I化合物的细菌。在进一步的实施方案中，局部组合物仅包含产生AIP多肽或式I化合物的单一微生物物种。在再另外的实施方案中，本公开的共生皮肤细菌包括选自由以下各项组成的组的微生物：表皮葡萄球菌A11、人葡萄球菌A9、人葡萄球菌C4、人葡萄球菌C5和沃氏葡萄球菌G2。在再另外的实施方案中，本公开的局部益生菌组合物可以包含选自以下的共生皮肤细菌或由选自以下的共生皮肤细菌组成：表皮葡萄球菌A11、人葡萄球菌A9、人葡萄球菌C4、人葡萄球菌C5、沃氏葡萄球菌G2及其任意组合。

可以从人皮肤中分离出本公开的共生细菌，并使用本文所述的方法进行鉴定。例如，本公开提供了一种通过使用例如泡沫头拭子擦拭人皮肤表面来获得、鉴定和培养本文所述的共生细菌的方法。将拭子放入胰蛋白大豆肉汤中。将肉汤稀释到补充有3％蛋黄的甘露醇盐琼脂平板(MSA)上。收集没有晕轮的、代表凝固酶阴性葡萄球菌(CoNS)菌株的粉色菌落，并使其在胰蛋白大豆肉汤(TSB)中生长，然后将25％体积的无菌过滤的上清液添加到生长在新鲜的TSB中的金黄色葡萄球菌agr I型YFP报告菌株中(用于测量24h孵育后金黄色葡萄球菌agr活性的抑制)。使用荧光计测量金黄色葡萄球菌报告菌株的agr活性。通过gDNA分离和测序进一步表征对金黄色葡萄球菌agr活性具有强抑制作用的菌株。使用任意数目的市售试剂盒(例如DNeasy UltraClean Microbial Kit,Qiagen)分离gDNA。可以使用各种序列平台(例如MiSeq；Illumin Inc.,San Diego,CA)对gDNA进行两个循环的测序，这可以产生2x 250bp的配对末端读段。使用cutadapt(参见例如，world-wide-web(万维网)，cutadapt.readthedocs.io/en/stable/)去除接头。可以使用Trim Galore(参见例如，world-wide-web，bioinformatics.babraham.ac.uk/projects/trim_galore/)以默认参数去除低质量的序列。使用Bowtie2程序(版本2.28)(I)，以参数(-D20–R3–N1–L20–非常-灵敏-局部的)和人参考基因组hg19，从去掉接头的(quality-trimmed)数据集中去除定位到人基因组的序列。使用SPAdes(3.8.0版)从头开始组装过滤后的读段，其中k-mer长度范围为33-127。使用子系统技术(RASY)，通过微生物基因组的快速注释，以默认参数对基因组进行注释。将来自带注释的CDS的氨基酸序列(编码DNA序列)与从Uniprot数据库获得的细菌agr蛋白进行比对。根据以下三个标准鉴定来自组装的基因组的agr基因：(i)序列同一性>60％；(ii)e值<e100；和(iii)agr基因座结构，四个基因的操纵子，agrBDCA。含有与SEQ IDNO:1或3的序列具有至少60％、70％、80％、90％、95％、98％、99％或100％同一性的序列的微生物可用于本公开的方法和组合物中。

如本文所用，术语“益生菌组合物”或“局部益生菌组合物”或“益生菌皮肤组合物(probiotic skin composition)”包括这样的组合物：所述组合物包括益生共生皮肤细菌、益生共生皮肤细菌发酵提取物、表达AIP多肽的减毒微生物或工程化微生物、和(i)抑制蛋白酶活性或(ii)促进蛋白酶活性的药剂、以及维持共生皮肤细菌的活力的药物载体。

如本文所用，术语“局部的”可包括从外部以及浅层注射(例如，皮内和病灶内)向皮肤给药，以便局部益生菌组合物与皮肤直接接触。

如本文所用，术语“发酵提取物”是指在合适的发酵条件下在培养物中将益生共生皮肤细菌发酵的产物。例如，培养金黄色葡萄球菌可以产生用于增加皮肤屏障渗透性的PSMα3。金黄色葡萄球菌的提取物含有PSMα3，其可应用于皮肤以改善渗透性、诱导皮肤重建或促进皮肤屏障渗透性，以进行药物递送。类似地，可以培养产生本公开的AIP的CoNS细菌的发酵提取物，并且将来自这类培养物的提取物用于抑制金黄色葡萄球菌相关的病理学(例如，蛋白酶活性、皮炎等)。

如本文所用，术语“益生共生皮肤细菌”包括皮肤微生物群系的微生物。益生共生皮肤细菌可包括促进蛋白酶活性的细菌的组合物(“促进蛋白酶的益生共生皮肤细菌”)。促进蛋白酶的益生共生皮肤细菌通常是产生酚可溶性组件α3(PSMα3)的皮肤细菌。促进蛋白酶的益生共生皮肤细菌组合物(或其发酵提取物)可用于例如促进皮肤重建、伤口修复、衰老、晒伤、色素异常和瘢痕。在一个实施方案中，促进蛋白酶的益生共生皮肤细菌包括一种或多种细菌，所述细菌具有丝氨酸蛋白酶活性和/或诱导皮肤的丝氨酸蛋白酶活性。例如，促进蛋白酶的益生共生皮肤细菌可包括产生酚可溶性组件α3(PSMα3)的金黄色葡萄球菌菌株。

在另外的实施方案中，益生共生皮肤细菌可包括抑制蛋白酶活性的细菌的组合物(“抑制蛋白酶的益生共生皮肤细菌”)。抑制蛋白酶的益生共生皮肤细菌组合物可用于治疗疾病，如酒渣鼻、特应性皮炎和内瑟顿综合征。在一个实施方案中，抑制蛋白酶的益生共生皮肤细菌包括一种或多种细菌，所述细菌抑制其它皮肤细菌的丝氨酸蛋白酶活性和/或抑制皮肤的丝氨酸蛋白酶活性。例如，抑制蛋白酶的益生共生皮肤细菌可包括凝固酶阴性葡萄球菌物种。在一个实施方案中，凝固酶阴性菌株选自由以下各项组成的组：表皮葡萄球菌、头状葡萄球菌、山羊葡萄球菌、解糖葡萄球菌、沃氏葡萄球菌、巴氏葡萄球菌、溶血葡萄球菌、德氏葡萄球菌、人葡萄球菌、Staphylococcus jettensis、Staphylococcus petrasii和路邓葡萄球菌。在一个实施方案中，抑制蛋白酶的共生皮肤细菌选自表皮葡萄球菌菌株、人葡萄球菌菌株、沃氏葡萄球菌菌株及其任何组合。在特定的实施方案中，表皮葡萄球菌菌株是表皮葡萄球菌14990和/或表皮葡萄球菌A11。在另外的实施方案中，人葡萄球菌菌株是人葡萄球菌C4、人葡萄球菌C5和/或人葡萄球菌A9。在另一个具体的实施方案中，沃氏葡萄球菌菌株是沃氏葡萄球菌G2。在一个实施方案中，CoNS细菌包括产生AIP多肽和/或式I的化合物的细菌。在进一步的实施方案中，局部组合物仅包含单一种类的微生物，其产生AIP多肽或式I的化合物。在再另外的实施方案中，本公开的共生皮肤细菌包含选自由以下各项组成的组的微生物：表皮葡萄球菌A11、人葡萄球菌A9、人葡萄球菌C4、人葡萄球菌C5和沃氏葡萄球菌G2。在再另外的实施方案中，本公开的局部益生菌组合物可以包含选自以下的共生皮肤细菌或由选自以下的共生皮肤细菌组成：表皮葡萄球菌A11、人葡萄球菌A9、人葡萄球菌C4、人葡萄球菌C5、沃氏葡萄球菌G2及前述的任意组合。

术语“接触”是指使皮肤暴露于局部益生菌组合物，以使益生菌皮肤组合物可以调节皮肤上的蛋白酶活性(例如丝氨酸蛋白酶活性)。

术语“抑制”或“抑制有效量(inhibiting effective amount)”是指足以使例如皮肤上或皮肤培养物中的蛋白酶活性(例如丝氨酸蛋白酶活性)受到抑制的益生菌皮肤组合物的量，所述益生菌皮肤组合物由一种或多种益生微生物和/或发酵培养基或提取物和/或发酵副产物和/或合成分子组成。术语“抑制”还包括预防或改善病症(例如皮疹、疼痛等)的病征或症状。

如本文所用，对于治疗患有疾病或病症的受试者，术语“治疗有效量”是指足以改善疾病或病症的病征或症状的益生菌皮肤组合物或其提取物的量。例如，通过测量皮肤疼痛的严重程度的频率，可以将治疗有效量测量为足以减轻受试者的皮炎或皮疹症状的量。通常，以使疾病或病症的症状减少至少50％、90％或100％的量治疗受试者。通常，最佳剂量将取决于病症和各种因素(例如受试者的体重、细菌的类型、受试者的性别和症状的程度)。但是，本领域技术人员可以容易地确定合适的剂量。

如本文所用，术语“纯化的”和“基本上纯化的”是指微生物或生物剂的培养物或共培养物(例如发酵培养基和提取物、分级发酵培养基、发酵副产物、AIP肽、多肽、基因、多核苷酸、式I的化合物等)，其基本上不含与体内产生的药剂自然相关的其它细胞或自然环境中存在的成分。在一些实施方案中，共培养益生菌可包含多种共生皮肤细菌。

本公开提供了全细胞制剂，其包含表皮葡萄球菌、人葡萄球菌和/或沃氏葡萄球菌的基本上均质的制剂。这样的制剂可以用于制备用于治疗炎症和微生物感染的组合物。全细胞制剂可包含表皮葡萄球菌、人葡萄球菌和/或沃氏葡萄球菌，或可包含如下所述的非致病性(例如，减毒微生物)载体。本公开还提供了衍生自这类全细胞的部分(fraction)，其包含药剂，所述药剂降低由于金黄色葡萄球菌活性而导致的皮肤中的蛋白酶活性。

第一细菌组合物抑制第二细菌组合物的蛋白酶活性的能力可以通过在使第二组合物与第一组合物接触之前和之后接触测量第二细菌组合物的蛋白酶活性来确定。生物体与本公开的局部益生菌组合物的接触可以在体外发生，例如，通过将局部益生菌组合物添加至细菌培养物中以测试细菌的蛋白酶抑制活性。可选地，接触可以在体内发生，例如通过使局部益生菌组合物与患有皮肤疾病或病症的受试者接触。

益生共生皮肤细菌制剂可以以多种方式制备。本领域已知的多种方法中的任何一种均可用于向受试者施用局部益生菌组合物。例如，可以配制本公开的益生菌皮肤组合物或提取物或合成制剂，用于局部施用(例如，作为洗剂、乳膏、喷雾剂、凝胶剂或软膏)。这样的局部配制剂可用于治疗或抑制皮肤上的微生物、真菌、病毒存在或感染或炎症。配制剂的例子包括局部洗剂、乳膏、肥皂、擦拭片等。

在另一个实施方案中，提供了局部益生菌组合物，其包含多种益生共生皮肤细菌。当用于治疗皮炎或与增加的蛋白酶(例如丝氨酸蛋白酶)活性有关的其它皮肤疾病或病症时，该组合物包含一种或多种抑制皮肤上的蛋白酶活性的细菌。在这种情况下，益生共生皮肤细菌是凝固酶阴性葡萄球菌物种。在一个实施方案中，益生共生皮肤细菌选自由以下各项组成的组：表皮葡萄球菌菌株、人葡萄球菌菌株、沃氏葡萄球菌菌株及其任何组合。当需要增加蛋白酶活性时(例如，用于治疗伤口、皮肤重建等)，益生共生细菌组合物包含增加蛋白酶活性或刺激皮肤蛋白酶活性(例如，丝氨酸蛋白酶活性)的细菌。在该实施方案中，示例性共生细菌组合物包含产生PSMα3的金黄色葡萄球菌细菌或毒力减弱的金黄色葡萄球菌。

在另外的实施方案中，局部益生菌组合物包含促进皮肤上的蛋白酶活性的益生共生皮肤细菌发酵提取物。在各个方面，产生提取物的细菌包括金黄色葡萄球菌。

在再另外的实施方案中，提供了局部益生菌组合物，其基本上由金黄色葡萄球菌发酵提取物(单独地，或与金黄色葡萄球菌组合)组成。根据另一方面，可以将上述局部益生菌组合物配制成洗剂、振荡剂、乳膏、软膏、凝胶、泡沫、粉剂、固体、糊剂或酊剂。

在另外的实施方案中，局部益生菌组合物包含益生共生皮肤细菌发酵提取物。在各个方面，产生提取物的细菌包含凝固酶阴性葡萄球菌属物种。在一个实施方案中，葡萄球菌属物种选自由以下各项组成的组：表皮葡萄球菌菌株、人葡萄球菌菌株、沃氏葡萄球菌菌株及其任何组合，其产生抑制agr群体感应系统和/或皮肤中或皮肤的微生物群系中的蛋白酶产生的AIP。在一个实施方案中，AIP包含SEQ ID NO:10的共有序列、或与具有agr群体调节活性的SEQ ID NO:4、11、12、13、14、15、16或17具有至少98％同一性的序列、和/或式I、IA或IB的化合物。

在再另外的实施方案中，提供了局部益生菌组合物，其基本上由凝固酶阴性葡萄球菌属物种发酵提取物或表皮葡萄球菌发酵提取物(单独地，或与凝固酶阴性葡萄球菌属物种或表皮葡萄球菌组合)组成。在另外的实施方案中，该组合物包含一种或多种本文所述的保藏的微生物菌株(例如表皮葡萄球菌A11、人葡萄球菌A9、人葡萄球菌C5和/或沃氏葡萄球菌G2)。

根据另一个实施方案，可以将上述局部益生菌组合物配制成洗剂、振荡剂、乳膏、软膏、凝胶、泡沫、粉剂、固体、糊剂或酊剂。

在另外的实施方案中，提供了一种发酵提取物，其可以通过在发酵条件下使选自由以下各项组成的组的细菌发酵而获得：表皮葡萄球菌菌株、人葡萄球菌菌株、沃氏葡萄球菌菌株及其任何组合。在各个方面，这类发酵提取物可用于抑制皮肤上的丝氨酸蛋白酶活性。在另外的实施方案中，所述发酵提取物获自本文所述的任何一种或多种保藏的微生物菌株(例如，表皮葡萄球菌A11、人葡萄球菌A9、人葡萄球菌C5和/或沃氏葡萄球菌G2)。根据另一个实施方案，发酵提取物可以配制成洗剂、振荡剂、乳膏、软膏、凝胶、泡沫、粉剂、固体、糊剂或酊剂。

在另外的实施方案中，提供了绷带或敷料，其包含上述局部益生菌组合物、上述益生共生皮肤细菌发酵提取物、上述益生共生皮肤细菌及其任意组合。在各个方面，提供了绷带或敷料，其主要成分包括基质和抑制皮肤上的蛋白酶活性的益生共生皮肤细菌。在各个方面，提供了绷带或敷料，其主要成分包括基质和抑制皮肤上的蛋白酶活性的益生共生皮肤细菌发酵提取物。

在另外的实施方案中，提供了绷带或敷料，其包含上述局部益生菌组合物、上述益生共生皮肤细菌发酵提取物、上述益生共生皮肤细菌及其任意组合。在各个方面，提供了绷带或敷料，其主要成分包括基质和促进皮肤上的蛋白酶活性的益生共生皮肤细菌。在各个方面，提供了绷带或敷料，其主要成分包括基质和促进皮肤上的蛋白酶活性的益生共生皮肤细菌发酵提取物。

本公开还提供了一种用于治疗与蛋白酶(例如丝氨酸蛋白酶活性)相关的皮肤疾病或病症的方法。这类疾病或病症的例子包括内瑟顿综合征、特应性皮炎、接触性皮炎、湿疹、银屑病、痤疮、表皮角化过度、棘皮症、表皮炎症、皮肤炎症和搔痒症。在一个实施方案中，首先通过测量来自怀疑患有疾病或病症的受试者的样品(例如皮肤的样品或来自皮肤的细菌培养物)的蛋白酶活性来确定疾病或病症的存在。如果样品显示出高于正常的蛋白酶活性(例如丝氨酸蛋白酶活性)，则通过使受试者的皮肤与蛋白酶抑制性共生细菌制剂接触，用该制剂对该受试者进行治疗。在另外的实施方案中，使来自具有高蛋白酶活性的受试者并包含细菌的培养物与制剂体外接触，以确定培养物对制剂的敏感性及其对蛋白酶抑制的作用。

蛋白酶抑制性共生细菌制剂或发酵提取物可以与一种或多种已知的丝氨酸蛋白酶抑制剂组合。有许多可用于本公开的方法和组合物中的商业和临床相关的丝氨酸蛋白酶抑制剂。例如，丝氨酸蛋白酶抑制剂，诸如在例如美国专利号5,786,328、美国专利号5,770,568或美国专利号5,464,820中公开的那些，以上专利的公开内容通过引用并入本文。示例性的丝氨酸蛋白酶抑制剂包括结合并抑制丝氨酸蛋白酶多肽或其功能片段的抗体、将丝氨酸蛋白酶多肽降解为无活性肽的酶、底物类似物等。丝氨酸蛋白酶表达抑制剂包括例如减少丝氨酸蛋白酶多核苷酸(例如DNA或RNA)的转录或翻译的反义分子、核酶和小分子试剂(例如维生素D拮抗剂)。本公开的一个实施方案涉及组织激肽释放酶的底物类似物。这些底物类似物包含具有对应于组织激肽释放酶的388至390位的氨基酸序列的肽。肽可以通过重组工程技术基因合成制备，例如通过克隆和表达核酸序列，或者从天然来源例如细菌、真菌或细胞提取物中纯化。氨基酸的结构、化学、物理化学、命名和分析方面在《氨基酸化学》(Chemistry of the Amino Acids)(J.P.Greenstein和M.Winitz编辑,John Wiley&Sons,New York,N.Y.,1961,1984年再版)中有所描述，其通过引用明确地并入本文。肽包括修饰的和/或未修饰的氨基酸，其包括天然存在的氨基酸、非天然存在的(非编码)氨基酸、合成制备的氨基酸及其组合。天然存在的氨基酸包括甘氨酸(Gly)、具有烷基侧链的氨基酸如丙氨酸(Ala)、缬氨酸(Val)、亮氨酸(Leu)、异亮氨酸(Ile)和脯氨酸(Pro)、芳香族氨基酸苯丙氨酸(Phe)、酪氨酸(Tyr)和色氨酸(Trp)、氨基酸醇丝氨酸(Ser)和苏氨酸(Thr)、酸性氨基酸天冬氨酸(Asp)和谷氨酸(Glu)、Asp和Glu的酰胺、天冬酰胺(Asn)和谷氨酰胺(Gln)、含硫氨基酸半胱氨酸(Cys)和甲硫氨酸(Met)以及碱性氨基酸组氨酸(His)、赖氨酸(Lys)和精氨酸(Arg)。非天然存在的氨基酸包括例如，鸟氨酸(Orn)、正亮氨酸(Nle)、瓜氨酸(citralline)(Cit)、高瓜氨酸(hCit)、锁链素(Des)和异锁链素(Ide)。修饰的氨基酸包括天然和非天然存在的氨基酸以及合成产生的氨基酸的衍生物和类似物。这类氨基酸形式已经被化学修饰，例如通过用氯(Cl)、溴(Br)、氟(F)或碘(I)卤化一个或多个活性位点；用含碳基团例如甲基(Me)、乙基(Et)、丁基(Bu)、氨基(NH₂或NH₃)、脒基(Am)、乙酰氨基甲基(Acm)或苯基(Ph)基团烷化；或通过添加含有磷(P)、氮(N)、氧(O)或硫(S)的基团。还可以通过例如另外的氨基酸或肽或前体化学制剂的水合、氧化、氢化、酯化或环化来进行修饰。实例包括氨基酸异羟肟酸酯和脱羧酶、丹酰氨基酸、聚氨基酸和氨基酸衍生物。具体实例包括γ氨基丁酸(GABA)、羟脯氨酸(Hyp)、可在2或3位被修饰的氨基己二酸(Aad)、邻-氨基丁酸(Aab或Abu)、硒代半胱氨酸(SeCys2)、叔丁基甘氨酸(Bug或ter-BuGly)、N-氨基甲酰基氨基酸、氨基酸甲酯、氨基丙酸(或β-丙氨酸；13-Ala)、金刚烷基甘氨酸(Adg)、氨基己酸(Acp)、N-乙基天冬酰胺(Et-Asn)、别-羟基赖氨酸(aHyl)、别-异亮氨酸(aIle)、苯基甘氨酸(Phg)、吡啶基丙氨酸(Pal)、噻吩基丙氨酸(Thi)、α-Δ-氨基丁酸(Kbu)、α-β-二氨基丙酸(Kpr)、1-或2-萘基丙氨酸(1Nal或2Nal)、邻氟苯丙氨酸(Phe(o-F))、N-甲基甘氨酸(MeGly)、N-甲基-异亮氨酸(Melle)、N-甲基-缬氨酸(MeVal)、2-氨基庚酸(Ahe)、2-或3-氨基异丁酸(Aib)、2-氨基-庚二酸(2-amino-pimellic acid)(Dbu)、2-2′-二氨基庚二酸(Dpm)、2,3-二氨基丙酸(Dpr)和N-乙基甘氨酸(EtGly)。化学产生的非编码氨基酸包括例如，苯基甘氨酸(Ph-Gly)、环己基丙氨酸(Cha)、环己基甘氨酸(Chg)和4-氨基苯丙氨酸[Phe(4NH₂)或Aph]。修饰的氨基酸也可以是这样的化学结构：所述化学结构根本不是氨基酸，而是实际上被分类为另外的化学形式，例如烷基胺、糖、核酸、脂质、脂肪酸或其它酸。构成肽的任何修饰的或未修饰的氨基酸均可以处于D-构象或L-构象，或包含一个、两个或多个互变异构体或共振体。

一种包含本文公开的益生菌皮肤组合物的药物组合物，其包含共生细菌(例如表皮葡萄球菌A11、人葡萄球菌A9、人葡萄球菌C4、人葡萄球菌C5和/或沃氏葡萄球菌G2)、其工程化形式(例如减毒或遗传修饰的形式)或含有AIP肽编码序列的减毒微生物，所述药物组合物可以被配制成适合局部施用以产生局部或全身作用的任何剂型、包括乳剂、溶液剂、悬浮剂、乳膏、凝胶、水凝胶、软膏、撒布剂、敷料、酏剂、洗剂、悬浮剂、酊剂、糊剂、泡沫、薄膜、气雾剂、冲洗剂、喷雾剂、栓剂、绷带、皮肤贴剂。包含本文公开的益生菌的局部配制剂还可以包含脂质体、胶束、微球、纳米系统及其混合物。

在一个实施方案中，提供了包含本文公开的益生菌皮肤组合物的绷带或敷料，所述益生菌皮肤组合物包含共生细菌(例如表皮葡萄球菌A11、人葡萄球菌A9、人葡萄球菌C4、人葡萄球菌C5和/或沃氏葡萄球菌G2)、其工程化形式(例如减毒或遗传修饰的形式)或含有本文所述的AIP肽编码序列的减毒微生物。在各个方面，提供了绷带或敷料，其主要成分包括基质和益生菌皮肤组合物，所述益生菌皮肤组合物包含共生细菌(例如，表皮葡萄球菌A11、人葡萄球菌A9、人葡萄球菌C4、人葡萄球菌C5和/或沃氏葡萄球菌G2)、其工程化形式(例如减毒或遗传修饰的形式)或含有上述AIP肽编码序列的减毒微生物。在各种实施方案中，提供了绷带或敷料，其主要成分包括基质和益生共生皮肤细菌或提取物。在各个方面，提供了绷带或敷料，其主要成分包括基质和益生共生皮肤细菌发酵提取物。在各个方面，提供了绷带或敷料，其主要成分包括基质和甘油。在一个实施方案中，绷带或敷料被应用于皮肤损害或损伤的部位。在另外的实施方案中，绷带或敷料被应用于感染部位。

“药学上可接受的载体”旨在包括溶剂、分散介质、包衣、抗微生物剂和抗真菌剂(在需要时，只要它们对益生共生细菌无害)、等渗剂和吸收延迟剂等。此类介质和试剂用于药物活性物质的用途是本领域众所周知的。除任何常规介质或试剂与药物组合物不相容的情况外，考虑将其用于治疗组合物和治疗方法中。也可以将补充性活性化合物掺入组合物中。

适用于本文公开的局部配制剂的药学上可接受的载体和赋形剂包括但不限于水性媒介物、与水混溶的媒介物、非水性媒介物、稳定剂、溶解度增强剂、等渗剂、缓冲剂、抗氧化剂、局部麻醉药、助悬剂和分散剂、润湿剂或乳化剂、络合剂、掩蔽(sequestering)剂或螯合剂、渗透促进剂、低温保护剂、冻干保护剂、增稠剂和惰性气体。

包含益生菌的药物组合物可以配制成软膏、乳膏、喷雾剂和凝胶的形式。合适的软膏媒介物包括油质或烃媒介物，包括例如猪油、加苯甲酸的猪油、橄榄油、棉籽油和其它油、白凡士林；乳化或吸收媒介物，例如亲水凡士林、硫酸羟基甘油三硬脂酸酯(hydroxystearin sulfate)、甘油和无水羊毛脂；水可去除性媒介物，例如亲水性软膏；水可溶性软膏媒介物，包括分子量不同的聚乙二醇；乳剂媒介物，油包水(W/O)乳剂或水包油(O/W)乳剂，包括鲸蜡醇、单硬脂酸甘油酯、羊毛脂和硬脂酸[参见《雷明顿：药学技术与实践》(Remington:The Science and Practice of Pharmacy)]。这些赋形剂是润肤的，但通常需要添加抗氧化剂和防腐剂。

合适的乳膏基质可以是水包油或油包水的。乳膏媒介物可以是可水洗的，并且包含油相、乳化剂和水相。油相也称为“内部”相，其通常包含凡士林和脂肪醇，例如鲸蜡醇或硬脂醇。尽管不是必须的，但是水相通常在体积上超过油相，并且通常包含湿润剂。乳膏配制剂中的乳化剂可以是非离子、阴离子、阳离子或两性表面活性剂。

凝胶是半固体悬浮型系统。单相凝胶包含在整个液体载体中基本上均质的材料。合适的胶凝剂包括交联的丙烯酸聚合物，例如卡波姆、羧基聚亚烷基(carboxypolyalkylene)、Carbopol^RTM；亲水性聚合物，例如聚环氧乙烷、聚氧乙烯-聚氧丙烯共聚物和聚乙烯醇；纤维素聚合物，例如羟丙基纤维素、羟乙基纤维素、羟丙基甲基纤维素、羟丙基甲基纤维素酞酸酯和甲基纤维素；树胶，例如黄芪胶和黄原胶；海藻酸钠；和明胶。为了制备均匀的凝胶，可以添加分散剂例如醇或丙三醇，或可以通过研磨、机械混合和/或搅拌来分散胶凝剂。

在另外的实施方案中，包含本文公开的式I的化合物和/或共生益生菌、其衍生物或类似物的药物组合物可以被单独配制或与一种或多种额外的治疗剂联合被配制，所述额外的治疗剂包括但不限于化学治疗剂、抗生素(只要它们不破坏益生菌的益处)、抗真菌剂、止痒剂、止痛剂、蛋白酶抑制剂和/或抗病毒剂。

如本文所用，局部施用包括皮肤(皮内)、结膜、角膜内、眼内、眼睛、耳、经皮、鼻、阴道、尿道、呼吸道和直肠施用。这类局部配制剂可用于治疗或抑制眼、皮肤和粘膜(例如、口腔、阴道、直肠)的癌症。市场上的配制剂的例子包括局部洗剂、乳膏、肥皂、擦拭片等。

用于加压容器、泵、喷雾、雾化器或喷雾器中的溶液或悬浮液可被配制成包含乙醇、稀酒精或用于分散、增溶本文所公开的活性成分或延长其释放的合适的替代剂、作为溶剂的推进剂；和/或表面活性剂，例如脱水山梨糖醇三油酸酯、油酸或低聚乳酸。

可用于形成可蚀基质的材料包括但不限于几丁质、壳聚糖、葡聚糖和支链淀粉；琼脂胶(guar gum)、阿拉伯胶、刺梧桐胶、槐豆胶、黄蓍胶、角叉菜胶、印度树胶(gum ghatti)、瓜尔豆胶、黄原胶和硬葡聚糖；淀粉，如糊精和麦芽糊精；亲水性胶体，例如果胶；磷脂，例如卵磷脂；海藻酸；海藻酸丙二醇酯；明胶；胶原；和纤维素塑料，例如乙基纤维素(EC)、甲基乙基纤维素(MEC)、羧甲基纤维素(CMC)、CMEC、羟乙基纤维素(HEC)、羟丙基纤维素(HPC)、醋酸纤维素(CA)、丙酸纤维素(CP)、丁酸纤维素(CB)、乙酸丁酸纤维素(CAB)、CAP、CAT、羟丙基甲基纤维素(HPMC)、HPMCP、HPMCAS、乙酸偏苯三酸羟丙基甲基纤维素(hydroxypropyl methylcellulose acetate trimellitate,HPMCAT)和乙基羟乙基纤维素(EHEC)；聚乙烯吡咯烷酮；聚乙烯醇；聚乙酸乙烯酯；甘油脂肪酸酯；聚丙烯酰胺；聚丙烯酸；乙基丙烯酸(ethacrylic acid)或甲基丙烯酸的共聚物(EUDRAGIT,Rohm America,Inc.,Piscataway,N.J.)；聚(甲基丙烯酸2-羟乙酯)；聚交酯；L-谷氨酸和L-谷氨酸乙酯的共聚物；可降解的乳酸-乙醇酸共聚物；聚-D-(-)-3-羟基丁酸；以及其它丙烯酸衍生物，例如甲基丙烯酸丁酯、甲基丙烯酸甲酯、甲基丙烯酸乙酯、丙烯酸乙酯、(2-二甲基氨基乙基)甲基丙烯酸酯和(三甲基氨基乙基)甲基丙烯酸氯化物的均聚物和共聚物。

在又一个实施方案中，本文提供的组合物(例如益生菌组合物或包含肽或式I的化合物的组合物)可以与本领域已知的一种或多种甾体类药物组合，所述甾体类药物包括但不限于醛固酮、倍氯米松、倍他米松、醋酸脱氧皮质酮、醋酸氟氢可的松、氢化可的松(皮质醇)、泼尼松龙、强的松、甲基泼尼松龙、地塞米松和去炎松。

在另一个实施方案中，本文提供的组合物(例如益生菌组合物或包含肽或式I的化合物的组合物)可以与一种或多种抗真菌剂组合，所述抗真菌剂包括但不限于阿莫罗芬、两性霉素B、阿尼芬净、联苯苄唑、布替萘芬、布康唑、卡泊芬净、环吡酮、克霉唑、益康唑、芬替康唑、非律平菌素、氟康唑、异康唑、伊曲康唑、酮康唑、米卡芬净、咪康唑、萘替芳、游霉素、制霉菌素、奥昔康唑(oxyconazole)、拉夫康唑(ravuconazole)、泊沙康唑、龟裂霉素、舍他康唑、硫康唑、特比萘芬、特康唑、噻康唑和伏立康唑。

为了用于本文所述的治疗应用，本文还描述了试剂盒和制品。这样的试剂盒可以包括载体、包装或容器，其被分隔开以容纳一个或多个容器，例如小瓶、管等，每个容器包括用于本文所述方法的单独元件之一。合适的容器包括例如瓶、小瓶、注射器和试管。容器可以由多种材料(例如玻璃或塑料)形成。

例如，容器可以包含一种或多种本文提供的组合物(例如益生菌组合物或包含肽或式I的化合物的组合物)，所述组合物任选地与本文公开的其它药剂组合。这样的试剂盒任选地包含本文公开的组合物，以及与该组合物在本文所述方法中的使用有关的识别性描述或标签或说明书。

提供以下实施例以进一步阐释本发明，但不限制本发明。

实施例

实施例1

原代人角质细胞的培养。在37℃，5％CO₂下，在EpiLife培养基(ThermoFisherScientific)中培养新生NHEK(ThermoFisher Scientific,Waltham,MA)，该培养基中补充有1x EpiLife确定的生长补充剂(ThermoFisher Scientific)、60μM CaCl₂和1x抗生素-抗真菌剂(PSA；100U/ml青霉素、100U/ml链霉素、250ng/ml两性霉素B；ThermoFisherScientific)。对于实验，使NHEK生长至70％汇合，然后在高钙EpiLife培养基(2mM CaCl₂)中分化48小时，然后用细菌无菌过滤的上清液处理。使用这些人类衍生的商业细胞产物不需要知情同意。对于细菌上清液处理，用添加到EpiLife培养基的无菌过滤的细菌上清液(按体积计5％)处理分化的NHEK。NHEK仅用于第3和第5代之间的实验。

细菌培养。所有细菌均在37℃，在3％胰蛋白大豆肉汤(TSB；Sigma,St.Louis,MO)中培养，同时以300r.p.m.振荡。使金黄色葡萄球菌菌株Newman、USA300、113、SANGER252以及表皮葡萄球菌菌株ATCC12228和ATCC1457生长24小时，达到稳定期(stationary phase)，然后离心(4,000r.p.m.，室温[RT]，10分钟)并无菌过滤(0.22μm)上清液，然后将其添加到NHEK。简而言之，在含有25μg/ml林可霉素和5μg/ml红霉素的3％TSB中培养无蛋白酶的菌株，持续24小时，然后在仅仅3％TSB中次培养另外的24小时。对于鼠类活性金黄色葡萄球菌定植测定，将2x10⁶菌落形成单位的细菌应用于8-mm TSB琼脂盘，使其在室温下干燥30分钟，然后添加到鼠背部皮肤中。

鼠细菌盘(bacteria disk)模型。将雌性C57BJ/6L小鼠(8周龄)用于细菌皮肤定植的鼠模型。简而言之，为了去除背部皮肤的毛发，将小鼠剃毛并施加nair，持续2e3分钟，然后用酒精擦拭片去除毛发。恢复24小时后，将3x8mm TSB琼脂盘应用于鼠背部皮肤，持续12小时，其中每个盘仅含有TSB(媒介物对照)或每个盘含有2e⁶菌落形成单位的金黄色葡萄球菌(USA300)。将Tegaderm应用在琼脂盘的顶部上，以使其固定。对小鼠实施安乐死，然后收集8-mm全皮肤穿刺活检，用于分析。

原位酶谱法。将鼠皮肤切片(厚度为10μm)用1％tween-20在水中冲洗1次，持续5分钟。在加湿室中，在37℃，用2μg ml的BODIPY FL酪蛋白总蛋白酶活性底物(Thermo-FisherScientific)处理切片，持续4小时，以测量总蛋白酶活性。在添加BODIPY FL酪蛋白之前30分钟，还将丝氨酸蛋白酶抑制剂AEBSF(50mM；Sigma)应用于切片。将载玻片在磷酸盐缓冲盐水中冲洗1次，然后应用不含DAPI的ProLong金抗荧光淬灭封片剂(gold antifademounting medium)(ThermoFisher Scientific)和盖玻片。使用Olympus BX51(Tokyo,Japan)荧光显微镜测量荧光信号。

蛋白酶活性测定。以50ml将NHEK条件培养基添加到96孔黑色底板(Corning,Corning,NY)中，然后根据制造商的说明添加150ml的5μg ml BODIPY FL酪蛋白底物、2μgml的弹性蛋白(弹性蛋白酶样底物；ThermoFisher Scientific)或4μg ml的明胶(MMP底物；ThermoFisher Scientific)。另外，以150μl在1x消化缓冲液(ThermoFisher Scientific)中，将200μM的肽Boc-Val-Pro-Arg-AMC(胰蛋白酶样底物；BACHEM,Bubendorf,Switzerland)添加到NHEK条件培养基中。在室温下，通过SpectraMAX Gemini EM荧光计(ThermoFisher Scientific)分析相对荧光强度，每2小时读取一次，持续24小时。在ex:485nm和em:530nm读取BODIPY FL酪蛋白板。在ex:485nm和em:515nm读取弹性蛋白样和MMP底物板。在ex:354nm和em:435nm读取胰蛋白酶样底物板。

实时定量PCR。根据制造商的说明，使用Purelink RNA分离柱(ThermoFisherScientific)从NHEK中分离RNA。使用Nanodrop分光光度计(ThermoFisher Scientific)对RNA进行定量，并使用iScript cDNA合成试剂盒(Bio-Rad,Irvine,CA)对500ng的RNA进行反转录。使用基因特异性引物和TaqMan探针(ThermoFisher Scientific)在CFX96实时检测系统(Bio-Rad)上进行实时定量PCR反应。

免疫印迹法。对于细胞裂解，将含有1x蛋白酶抑制剂混合物(Cell SignalingTechnology,Danvers,MA)的、冷的1x放射免疫沉淀测定(RIPA)缓冲液(Sigma)应用于NHEK，然后进行刮取(scraping)。将细胞裂解物在冰上孵育30分钟，然后离心(13,000r.p.m.，15分钟，4℃)，以除去细胞碎片。样品如下制备：使用二喹啉甲酸(BCA)测定法(Pierce,Rockford,IL)测定蛋白质浓度，然后将40mg样品添加到含1％b-巯基乙醇的、4x Laemmli样品缓冲液(Bio-Rad)中，并在95℃加热7分钟。样品在4-20％的Tris-甘氨酸预制TGX凝胶(Bio-Rad)上电泳，使用trans-blot turbo转印系统(Bio-Rad)将其转移到0.22-μm聚偏氟乙烯(PVDF)膜(Bio-Rad)上，在含0.1％tween-20的1x odyssey封闭溶液(LI-COR,Lincoln,NE)中在室温封闭1小时，并在4℃用一抗染色过夜。在3x PBST(含0.1％tween-20的磷酸盐缓冲盐水)洗涤后，在室温下，在定轨振荡器上将Odyssey(LI-COR)荧光二抗应用于膜，持续1小时。在红外成像仪(LI-COR)上进行分析之前，进行另外的3x PBST洗涤。以1:100的稀释度使用来自Santa Cruz Biotechnologies(Santa Cruz,CA)的一抗KLK5(H-55)、KLK6(H-60)、DSG-1(H-290)、FLG(H-300)和a-微管蛋白(TU-02)。以1:1,000的稀释度使用来自Abcam(Cambridge,UK)的KLK13(ab28569)和KLK14(ab128957)抗体。

KLK基因沉默。使用RNAiMAX(ThermoFisher Scientific)和OptiMEM培养基(ThermoFisher Scientific)，用15nM或45nM的特定KLK沉默子，选择siRNA或siRNA加扰(-)的对照(ThermoFisher Scientific)，处理NHEK，持续24小时。使NHEK在高钙培养基(2mMCaCl₂)中分化48小时，然后在分析NHEK裂解物和条件培养基之前，用无菌过滤的金黄色葡萄球菌(Newman)上清液进行24小时处理。

统计分析。单因素方差分析和双因素方差分析均用于统计分析，其中P值<0.05为显着。使用GraphPad prism 6.0版(GraphPad,La Jolla,CA)进行结果的统计分析。

葡萄球菌影响人角质细胞的蛋白酶活性。为了评估在人皮肤上发现的不同细菌菌株是否可以诱导角质细胞的蛋白酶活性，将正常人表皮角质细胞(NHEK)的原代培养物用来自金黄色葡萄球菌的四种不同实验室分离株的无菌过滤的培养上清液进行处理，所述实验室分离株包括两种耐甲氧西林金黄色葡萄球菌菌株(USA300和SANGER252)和两种甲氧西林敏感性金黄色葡萄球菌菌株。还测试了两种表皮葡萄球菌分离株(ATCC12228和ATCC1457)。暴露于无菌细菌培养上清液后二十四小时，分析角质细胞培养基的蛋白酶活性，以及对胰蛋白酶样、弹性蛋白酶样或基质金属蛋白酶(MMP)活性的底物选择。在用金黄色葡萄球菌菌株Newman和USA300处理后，NHEK条件培养基含有明显更多的胰蛋白酶活性(图1a)。表皮葡萄球菌菌株ATCC12228增加了MMP和弹性蛋白酶的活性，而金黄色葡萄球菌菌株USA300和SANGER 252以及表皮葡萄球菌菌株ATCC1457以较小的程度增加NHEK条件培养基中的弹性蛋白酶活性(图1b和c)。为了确认在NHEK条件培养基中观察到的增加的蛋白酶活性源自NHEK，而不是由细菌本身产生的，在NHEK存在和不存在的情况下，在向培养孔中添加金黄色葡萄球菌(Newman)上清液后，分析胰蛋白酶活性。当将相同浓度的、来自金黄色葡萄球菌的稀释上清液独自添加到NHEK培养基中时，在不存在NHEK的情况下，未检测到酶活性(图1d)。

金黄色葡萄球菌增加表皮丝氨酸蛋白酶活性。由于某些金黄色葡萄球菌菌株(Newman和USA300)诱导的胰蛋白酶活性的大幅增加，以及该活性在由金黄色葡萄球菌介导的疾病中的潜在作用，因此，针对该生物体进行实验，以更好地理解细菌如何诱导NHEK中的蛋白酶活性。为了评估蛋白酶对金黄色葡萄球菌的反应的动力学，用来自金黄色葡萄球菌(Newman)的、无菌过滤的培养上清液处理角质细胞，持续0、8、24和48小时，然后收集NHEK条件培养基进行蛋白酶分析。NHEK条件培养基中总蛋白酶活性的测量结果显示，在暴露于金黄色葡萄球菌上清液后，总蛋白水解活性随时间增加(图2a)。丝氨酸蛋白酶抑制剂抑肽酶的添加证实了该活性是由于丝氨酸蛋白酶引起的(图2b)，这与图1a中所示的胰蛋白酶样活性增加的观察结果一致。金黄色葡萄球菌USA300 LAC野生型和无蛋白酶的菌株的比较表明，野生型和无蛋白酶的菌株均使NHEK条件培养基中的胰蛋白酶活性增加，但无蛋白酶的菌株诱导胰蛋白酶活性的能力与野生型菌株相比明显下降(图2c)。总之，这些数据证实，金黄色葡萄球菌可以增加内源性NHEK丝氨酸蛋白酶活性，并且金黄色葡萄球菌蛋白酶和其它金黄色葡萄球菌产物有助于该细菌激活角质细胞的能力。

为了进一步验证金黄色葡萄球菌对表皮蛋白酶活性的作用，将活性金黄色葡萄球菌(USA300)应用于小鼠的背部皮肤。然后对应用部位的皮肤进行活检并切片，用于在存在或不存在丝氨酸蛋白酶抑制剂4-苯磺酰氟(AEBSF)的情况下通过原位酶谱法分析总蛋白水解活性。与仅用琼脂盘处理的皮肤相比，用金黄色葡萄球菌处理后表皮中的总表皮蛋白酶活性在质量上得到提高，并且通过荧光增强检测到的增加的活性通过用AEBSF抑制丝氨酸蛋白酶活性而在很大程度上被消除了。在包括无底物对照的所有切片中均观察到毛囊处的背景自发荧光。这些观察结果进一步证明，金黄色葡萄球菌的存在可以增加表皮中的蛋白酶活性。

金黄色葡萄球菌提高角质细胞中的KLK表达。KLK是表皮中丰富的丝氨酸蛋白酶家族，具有胰蛋白酶样或胰凝乳蛋白酶样活性。为了确定金黄色葡萄球菌是否可以改变角质细胞中KLK mRNA的表达，用金黄色葡萄球菌(Newman)上清液处理NHEK，持续24小时，并通过实时定量PCR测量KLK1-15的表达。KLK5的相对mRNA丰度最高，而KLK6、13和14在暴露于金黄色葡萄球菌后一致地表现出最大的倍数增加(图3a-e)。除KLK1显示表达降低外，所有其它分析过的KLK在暴露于金黄色葡萄球菌后均显示出mRNA表达的细微增加。未检测到KLK2、3和15的mRNA。

然后，在金黄色葡萄球菌(Newman)上清液处理后，分析细胞裂解物和NHEK条件培养基的KLK蛋白表达的变化。在细胞裂解物和条件培养基中，在金黄色葡萄球菌上清液处理后，KLK6和14的免疫印迹显示这些KLK蛋白的表达增加，而KLK13仅在条件培养基中增加。在金黄色葡萄球菌上清液处理后，KLK5的表达没有变化(图3f)。

KLK6、13和14有助于提高角质细胞丝氨酸蛋白酶活性。因为在金黄色葡萄球菌暴露后KLK6、13和14显示在NHEK中的表达增加最大，所以进行实验以检查这些KLK是否与观察到的丝氨酸蛋白酶活性增加有关。小干扰RNA(siRNA)用于选择性沉默其表达。KLK6和KLK13的siRNA显着降低了金黄色葡萄球菌诱导的胰蛋白酶活性，而KLK14以较小的程度降低胰蛋白酶活性。KLK6、13和14的三重(triple)敲低也显示胰蛋白酶活性相对于对照siRNA显着降低，尽管未观察到累加效应(图4a)。有趣的是，KLK6、13和14的三重敲低导致KLK13和KLK14的敲低效率降低，这可解释缺乏针对胰蛋白酶活性的累加效应的原因(图4b-d)。

金黄色葡萄球菌通过诱导KLK促进桥粒芯蛋白-1和FLG的降解。桥粒芯蛋白-1(DSG-1)和FLG对调节表皮皮肤屏障的完整性都很重要。免疫印迹表明，使NHEK暴露于金黄色葡萄球菌(Newman)上清液促进了全长DSG-1(160kDa)的裂解，而KLK6、13或14的siRNA沉默阻断DSG-1的裂解(图5a)。KLK6和KLK13的siRNA沉默也部分阻断了金黄色葡萄球菌介导的NHEK中丝聚合蛋白原(Pro-FLG)的裂解(由免疫印迹上>250kDa的条带所指示)(图5b)。光密度分析进一步阐释了KLK6、13和14敲低防止DSG-1或Pro-FLG裂解的能力(图5c)。总体而言，这些观察结果表明，金黄色葡萄球菌通过诱导KLK6、13和14增加角质细胞蛋白水解活性的能力可导致对于维持正常表皮屏障所必需的分子的消化。

实施例2

细菌制备。本研究中使用的所有细菌均列在表A中。所有葡萄球菌菌株(金黄色葡萄球菌、表皮葡萄球菌、人葡萄球菌、沃氏葡萄球菌、头状葡萄球菌和路邓葡萄球菌)均以250RPM，在37℃培养箱中，以4mL或400μL体积(取决于测定)，在3％胰蛋白大豆肉汤(TSB)中生长到稳定期，持续24h。在抗生素筛选(表S1所示)下使具体菌株在以下浓度下生长：5μg/mL Erm、25μg/mL Lcm和10μg/mL Cm。对于人角质细胞或鼠皮肤的细菌上清液的处理，使24h培养的细菌团粒化(pelleted)(15min,4,000RPM,RT)，然后将上清液过滤灭菌(0.22μm)。对于用人葡萄球菌C5和表皮葡萄球菌RP62A菌株进行的鼠和人角质细胞试验，用3kDa尺寸排阻柱(Amicon Ultra-15离心过滤器,Millipore)过滤细菌无菌过滤的上清液，以收集<3kDa的部分，并使用冻干机进一步浓缩10x，然后在处理前重新悬浮在分子级H₂O中。用几种技术进一步对人葡萄球菌C5上清液进行生化测试。在室温下进行硫酸铵沉淀(80％)，持续1h，然后离心(30min,4,000RPM,RT)，然后将沉淀物(团粒)在H₂O中重新悬浮，以分离小肽。此外，使用pH 1-14试纸条，用2M NaOH使人葡萄球菌C5上清液提高到pH 11，持续1h，然后使用2MHCl，以使上清液pH返回到大约6.5的起始pH，然后加入至金黄色葡萄球菌agr报告菌株中。

表A

正常人角质细胞培养。在37℃，5％CO₂下，在含有60μM CaCl₂的Epilife培养基(Thermo Fisher Scientific)中培养正常新生人表皮角质细胞(NHEK；Thermo FisherScientific)，该培养基中补充有1x EpiLife确定的生长补充剂(EDGS；Thermo FisherScientific)和1x抗生素-抗真菌剂(PSA；100U/ml青霉素、100U/ml链霉素、250ng/ml两性霉素B；Thermo Fisher Scientific)。NHEK仅用于第3-5代之间的实验。对于实验，使NHEK生长至70％汇合，然后在高钙EpiLife培养基(2mM CaCl₂)中分化48小时，以模拟表皮的上层。对于细菌上清液处理，将分化的NHEK用加入到Epilife培养基的无菌过滤的细菌上清液(按体积计5％)处理24h。类似于合成PSM处理，将5-50μg-mL的肽添加到DMSO中的NHEK中，持续24h。

金黄色葡萄球菌表皮小鼠模型。如图例所说明的，将8周龄的性别和年龄相匹配的雄性或雌性C57BL/6(Jackson)小鼠用于所有实验(n＝3-6)。所有动物实验均获得机构动物护理和使用委员会(Institutional Animal Care and Use Committee)的批准。通过剃毛除去小鼠毛发并应用Nair 2-3min，然后立即用酒精擦拭片除去。在应用细菌之前，使皮肤屏障从毛发去除中恢复48h。在1.5cm²消毒纱布片上以100μL体积将3％TSB中的金黄色葡萄球菌(1e7 CFU)应用于鼠皮肤，持续48-72h。将Tegaderm施加在纱布顶上以使其在治疗期间固定。对于金黄色葡萄球菌agr抑制实验，将活性人葡萄球菌C5(10:1)或10x浓缩的<3kDa无菌过滤的共生细菌上清液(1:1)与金黄色葡萄球菌在3％TSB中混合，然后立即将其应用到纱布上。

合成的酚可溶性调控蛋白制备。所有合成的酚可溶性调控蛋白(PSM)均由LifeTein(Hillsborough,NJ)生产。以95％纯度产生具有N-末端甲酰化(f)的肽。PSM序列如下：

PSMα1:f-MGIIAGIIKVIKSLIEQFTGK(SEQ ID NO:5)、

PSMα2:f-MGIIAGIIKFIKGLIEKFTGK(SEQ ID NO:6)、

PSMα3:f-MEFVAKLFKFFKDLLGKFLGNN(SEQ ID NO:7)、

PSMα4:f-MAIVGTIIKIIKAIIDIFAK(SEQ ID NO:8)、

PSMβ2:

f-MTGLAEAIANTVQAAQQHDSVKLGTSIVDIVANGVGLLGKLFGF(SEQ ID NO:9)。

将肽重悬于DMSO中，并通过真空离心蒸发浓缩器(speedvac)浓缩成储存在-80℃的500mg粉末状原料，然后在DMSO中重构用于实验。

RNA分离和实时定量PCR。根据制造商的说明，使用Purelink RNA分离试剂盒(Thermo Fisher Scientific)分离所有RNA。对于NHEK，将350μL RNA裂解缓冲液(含1％β-巯基乙醇)直接添加到细胞中。对于小鼠组织，在750μL的RNA裂解缓冲液中，将0.5cm²的全层皮肤珠磨(2x 30sec,2.0mm氧化锆珠)，中间在冰上5分钟。然后将组织离心(10min，13,000RPM，4℃)，然后将350μL的澄清的裂解物添加到70％EtOH中，并进行基于柱的RNA分离。对于金黄色葡萄球菌RNA分离，将1x10⁹CFU细菌用2:1比例的RNAprotect(Qiagen)孵育10分钟，然后离心(10min，13,000RPM，RT)，重新悬浮于750μL的RNA裂解缓冲液中，并使用裂解基质B管和Fastprep-24(MP Biomedicals)进行珠磨(2x1min，6.5速度)。然后再次离心样品，并如上所述将350μL澄清的裂解物加入到70％的EtOH中。RNA分离后，用Nanodrop(ThermoFisher Scientific)定量样品，并使用iScript cDNA合成试剂盒(Bio-Rad)反转录500ng RNA。qPCR反应在CFX96实时检测系统(Bio-Rad)上进行。对于哺乳动物细胞，使用基因特异性引物和TaqMan探针(Thermo Fisher Scientific)，其中GAPDH用作看家基因。

RP62A感受态细胞的产生和转化。制备电转化感受态RP62A细胞。简而言之，将表皮葡萄球菌RP62A的过夜培养物在预热的脑心浸液(BHI)肉汤中稀释至OD₆₀₀nm为0.5，在37℃，在摇动下再孵育30min，转移到离心管中，然后在冰上冷冻10min。通过离心(10min，4000RPM，4℃)收获细胞，依次用1体积、1/10体积、然后是1/25体积的冷高压灭菌水洗涤，然后在每次洗涤后在4℃使其再团粒化。在最后一次洗涤后，将细胞重悬于1/200体积的冷的10％无菌甘油中，并以50μL等分到试管中，以在-80℃储存。进行了表皮葡萄球菌RP62A的转化。简而言之，将冷冻的感受态细胞在冰上融化5min，然后在室温下融化5min。将解冻的细胞短暂离心(1min，5000g，RT)，并将团粒重悬于50μL的、补充有500mM蔗糖的10％甘油中。加入DNA后，将细胞转移至1mm的杯中，并以1.1msec的时间常数，以2.1kV，在Micropulser(Bio-Rad)上进行脉冲。电穿孔后，立即将细胞重悬于1mL补充有500mM蔗糖的BHI肉汤中，在30℃摇动1小时，然后，在30℃将其涂布在具有10μg/mL氯霉素(Cm)的BHI琼脂上。

表皮葡萄球菌RP62A AIP的等位基因替换。等位基因替换质粒pMAD(50)用于选择性地产生表皮葡萄球菌RP62A中agrD的AIP编码序列的框内缺失。简而言之，通过PCR扩增RP62A的AIP序列上游和下游大约1000bp的片段，然后通过重叠延伸或“SOEing”进行基因剪接而将其连接在一起。用BamHI和SalI消化缝合的片段和pMAD载体，通过T4 DNA连接酶(NewEngland Biolabs)连接在一起，随后将其用于化学转化表皮葡萄球菌克隆复合体10质粒人工修饰大肠杆菌菌株DC10B-CC10。在37℃，将转化株涂布在具有100μg/mL Amp和30μg/mLCm的LB上。通过限制性消化和测序验证正确的转化株。经验证的构建体注释为pMAD::ΔAIP。然后用来自DC10B-CC10的～5μg的pMAD::ΔAIP转化电转化感受态RP62A，然后在30℃，将其涂布在具有10μg/mL Cm和50μL的40mg/mL5-溴-4-氯-3-吲哚基-β-D-半乳糖苷(X-Gal)的BHI琼脂上。选择单个蓝色菌落，并且，在30℃使其在具有10μg/mL Cm的BHI中生长过夜。然后，将过夜培养物以1:100(最终体积为100mL)稀释至不含抗生素的新鲜、预热的BHI中，并在43℃孵育24小时。通过选择在43℃在补充有10μg/mL Cm和50uL的40mg/mL X-Gal的BHI琼脂上生长的浅蓝色菌落，另外重复进行稀释和在43℃生长，以促进单交换事件。选择浅蓝色菌落，并在不含抗生素的BHI中于30℃孵育过夜，以促进双交换事件。将该过夜的稀释物涂布在补充有50μL的40mg/mL X-Gal的BHI琼脂上，并在37℃孵育过夜。选择白色菌落并贴(patched)在补充有10μg/mL Cm或50μL的40mg/mL X-Gal的BHI琼脂上。选择在Cm存在下不能生长且在X-Gal存在下仍为白色的菌落，并通过测序筛选AIP编码序列的缺失。经过验证的突变菌株被注释为表皮葡萄球菌RP62A ΔAIP。

RNA测序。将RNA提交至加州大学圣地亚哥分校(UCSD)基因组核心设施进行文库制备和测序。使用TruSeq mRNA Library Prep Kit(TruSeq mRNA库制备试剂盒)(Illumina)进行文库制备，然后在HiSeq 2500测序仪(Illumina)上进行高通量测序。使用Partek Flow和Partek Genomics Suite软件分析数据，并使用PANTHER分类系统(http[://]pantherdb.org)进行基因本体论分析。

组织学。收集全厚鼠皮(0.5cm²)，将其固定在多聚甲醛(4％)中，并在PBS中洗涤，然后与30％和10％的蔗糖一起孵育过夜，然后用干冰将组织冷冻在OCT封片剂中。将低温恒温器切割的切片(10mm)固定到Superfrost Plus载玻片(Fisher Scientific)上，并用苏木精和曙红(H&E)染色。在二甲苯孵育和用paramount和载玻片固定之前，将切片以75％-100％的EtOH梯度温育5min间隔。在Olympus BX51(Tokyo,Japan)荧光显微镜上以200x的放大倍率拍摄照片。

细胞因子水平测定。来自NHEK的条件培养基(25μL)用于定量各种细胞因子的蛋白质浓度。根据制造商关于Magpix 200(Luminex)系统的说明，使用针对3种人细胞因子(IL-6、IL-8、TNFα)的、基于磁珠的milliplex测定试剂盒(Millipore)。通过ELISA(R&DSystems)定量人IL-1α和IL-36α。

细菌CFU的定量。如下定量金黄色葡萄球菌菌落形成单位(CFU)：在37℃培养箱中，在含3％蛋黄乳液和亚碲酸盐的Baird-parker琼脂(BD)平板上涂布10^-1至10^-5的系列稀释物(10μL)，持续24h，然后对CFU计数。通过使用分光光度计以及还测量在PBS中以1:20稀释的细胞的OD600nm，估计所有葡萄球菌菌株的细菌CFU。

经皮失水测量。为了确定对表皮皮肤屏障的损害，使用TEWAMETER TM300(C&K)测量用金黄色葡萄球菌处理48-72h的鼠皮肤的经皮水分流失(TEWL)。

胰蛋白酶活性分析。将NHEK条件培养基以50μL添加到黑色96孔黑底板(Corning)中，然后以在1x消化缓冲液(10mM Tris-HCl pH 7.8)中的终浓度为200μM添加150μL的肽Boc-Val-Pro-Arg-AMC(胰蛋白酶样底物；BACHEM)，并在37℃孵育24h。用SpectraMAXGemini EM荧光计(Thermo Fisher Scientific)分析相对荧光强度(ex:354nm，em:435nm)。对于鼠皮肤胰蛋白酶活性分析，在1mL的1M乙酸中将0.5cm²的全层皮肤珠磨(2.0mm氧化锆珠，2x 30sec，每一次后5min)，然后在4℃旋转过夜。将样品离心(10min，13,000RPM，4℃)，添加到新的微量离心管中，然后使用Speedvac进行蛋白质浓缩以去除所有剩余的乙酸。将蛋白质重新悬浮在分子级水(500μL)中，并在4℃旋转过夜，然后再次离心。将澄清的蛋白质裂解物添加到新管中，并使用BCA(Bio-rad)分析来确定蛋白质浓度。最后，将10μg总蛋白添加至96孔板，然后如上所述用胰蛋白酶底物进行分析。

金黄色葡萄球菌agr活性。使用金黄色葡萄球菌USA300 LAC agr I型P3-YFP(AH1677)或金黄色葡萄球菌USA300 LAC agr I型pAmi P3-Lux(AH2759)报告菌株来检测金黄色葡萄球菌agr活性。对于体外实验，将1e6CFU的金黄色葡萄球菌USA300 LAC agr I型P3-YFP与100μL的无菌过滤的共生上清液(按体积计25％)一起添加到300μL的3％TSB中，并在37℃摇动(250RPM)24h。然后将细菌在PBS中按1:20稀释(终浓度200μL)，并使用荧光计如上所述检测YFP(ex:495nm，em:530nm)，然后使用分光光度计上的OD₆₀₀nm读数(readout)确定细菌密度。对于鼠实验，使用IVIS仪器确定金黄色葡萄球菌USA300 LAC agr I型pAmiP3-Lux活性，并通过使用LiveImaging软件(PerkinElmer)测量发射的光子(p/sec/cm2/sr)来评估暴露2分钟后的发光强度。

基因组测序和组装。使用DNeasy UltraClean Microbial Kit(Qiagen)分离人葡萄球菌C5基因组DNA。使用MiSeq平台(Illumina Inc.,San Diego,CA)对文库进行两个循环测序，生成2x250bp的配对末端读段。使用cutadapt(1.9.1版)(http[://]cutadapt.readthedocs.io/en/stable/)去除接头。使用Trim Galore(版本1.9.1)(https[://][www.]bioinformatics.babraham.ac.uk/projects/trim_galore/)以默认参数去除低质量序列(质量得分<30)。以下列参数(-D20-R3-N1-L20--非常-灵敏-局部的)使用Bowtie2(版本2.2.8)(51)和人参考基因组hg19(UCSC Genome Browser)从去掉接头的数据集中去除定位到人基因组的序列。使用SPAdes(3.8.0版)(52)从头开始组装过滤后的读段，其中k-mer长度范围为33-127。使用子系统技术(RAST)，通过微生物基因组的快速注释，以默认参数对基因组进行注释。将来自注释的CDS(编码DNA序列)的氨基酸序列与从Uniprot数据库获得的细菌agr蛋白(2017年10月下载)进行比对。根据以下三个标准鉴定来自组装的基因组的agr基因：i)序列同一性>60％；ii)e值<e100；和iii)agr基因座结构，四个基因的操纵子，agrBDCA。

微生物群系数据和基因组比较分析。分析了针对特应性皮炎皮肤的公众可得的鸟枪法宏基因组数据。金黄色葡萄球菌和表皮葡萄球菌菌株的相对丰度直接从已公布的补充材料中获得([www.]sciencetranslationalmedicine.org/cgi/content/full/9/397/eaal4651/DC1)。agrD特征分析限于八名患者(AD01、AD02、AD03、AD04、AD05、AD08、AD09和AD11)，用发红的AD皮肤上的7个不同身体部位的信息和基于客观SCORAD的AD严重程度的差异进行。通过与agrD基因区域内已知的agr I-III型序列进行氨基酸序列比较，将评估的61种表皮葡萄球菌菌株分类为agr I、II或III型。

定量和统计分析。非参数Mann-Whitney检验用于AD患者宏基因组学数据的统计学显着性分析。用于统计分析的单因素方差分析或双因素方差分析在各个图描述中指示。所有统计分析均使用GraphPad Prism 6.0版(GraphPad,La Jolla,CA)进行。所有数据均以平均值±平均值的标准误差(SEM)表示，并且认为P值≤0.05是显著的。

金黄色葡萄球菌产生的PSMα和蛋白酶诱导表皮屏障损伤。人皮肤的主要功能是建立抵抗外部环境的物理屏障。由金黄色葡萄球菌产生的特定毒素，如酚可溶性调控蛋白(PSM)可以促进上皮炎症，因此被提议是驱动AD疾病的关键(19-22)。因此，为了理解皮肤表面上的金黄色葡萄球菌如何影响表皮屏障中的炎症活性，评估了正常人表皮角质细胞(NHEK)在暴露于在PSMα或PSMb操纵子中具有靶向缺失的金黄色葡萄球菌USA300LAC菌株时表达蛋白水解活性的能力。PSMα的产生是诱导胰蛋白酶样丝氨酸蛋白酶活性和激肽释放酶6(KLK6)的mRNA水平升高所必需的(图14A-B)。金黄色葡萄球菌中的PSMα和PSMβ操纵子含有不同的肽，包括PSMα1-4和PSMβ1-2。因此，在NHEK上测试了合成的PSMα1-4和PSMβ2肽，发现(图14C)所有PSMα肽均可以刺激胰蛋白酶活性，而PSMβ2则不能。选择PSMα3，它是NHEK中最强的PSMα胰蛋白酶活性诱导剂，以进一步证明它可以以剂量和时间依赖性方式刺激NHEK中的胰蛋白酶活性和KLK6 mRNA表达(图18)。此外，暴露于PSMα3的NHEK的RNA-Seq转录谱分析表明，该毒素对与皮肤屏障相关的基因[包括多种蛋白酶(KLK、MMP)]的表达、物理屏障的成分(丝聚蛋白、桥粒芯蛋白-1、兜甲蛋白、内皮蛋白、角蛋白)、抗微生物肽和细胞因子有广泛的影响(图14D-E、图18)。

为了验证在体内PSMα操纵子对表皮屏障的作用，用相同数量的金黄色葡萄球菌USA300 LAC野生型或PSMα突变株在小鼠皮肤表面上定植72h。野生型金黄色葡萄球菌诱导红斑、脱屑(scaling)和表皮增厚，而在没有PSMα的情况下未观察到细菌丰度的变化(图14F)。尽管表皮厚度增加，在暴露于野生型金黄色葡萄球菌后观察到经皮水分流失(TEWL)的增加，这是一种评估皮肤屏障损伤的成熟方法，但在没有PSMα时却观察不到这种现象(图14G)。然而，体内完全分化的表皮的皮肤屏障破坏也取决于金黄色葡萄球菌蛋白酶的表达。使用缺少10种分泌的主要蛋白酶(包括短梗霉溶素、V8、staphopain A/B和SplA-F)的金黄色葡萄球菌USA300 LAC突变菌株，尽管存在十分完整的PSMα表达，但可见的损伤证据和TEWL升高仍以金黄色葡萄球菌蛋白酶缺陷的方式减少(图14F、H)。与观察到的与PSMα或细菌蛋白酶的表达相关的大体(gross)和组织学的变化一致的是，仅在暴露于野生型金黄色葡萄球菌的小鼠中测量到角质细胞胰蛋白酶活性、Klk6转录表达和细胞因子Il6、Il17a和Il17f的增加，但在PSMα或蛋白酶缺陷型菌株中没有测量到这些(图19)。此外，尽管皮肤屏障和皮肤的炎症环境发生了变化，但在这些条件下，皮肤表面上的金黄色葡萄球菌丰度没有变化(图14I-J)。综上所述，这些数据表明，由金黄色葡萄球菌产生的PSMα和蛋白酶活性导致对表皮屏障的损害，并且该屏障损害对于金黄色葡萄球菌促进炎症是必需的。

表皮葡萄球菌自诱导肽抑制金黄色葡萄球菌agr活性。有趣的是，金黄色葡萄球菌PSMα肽和分泌的蛋白酶均受agr群体感应系统的调节。此外，已经发现金黄色葡萄球菌临床分离株具有四种不同的agr类型，其中agr I型在AD受试者中最为突出。尽管在AD中金黄色葡萄球菌皮肤定植增加，但也存在其它细菌种类，诸如凝固酶阴性葡萄球菌(CoNS)菌株，包括丰富的人皮肤共生微生物表皮葡萄球菌，因此理解这些细菌如何交流至关重要。已经证明表皮葡萄球菌agr I型实验室分离株产生自诱导肽(AIP)，该肽通过agr串扰(crosstalk)机制抑制金黄色葡萄球菌agr I-III型系统，但不抑制IV型，而关于其它表皮葡萄球菌agrII和III型对金黄色葡萄球菌agr活性的影响却知之甚少。将来自具有agr I、II或III型的表皮葡萄球菌菌株的条件培养上清液添加到金黄色葡萄球菌USA300 LAC agr I型报告菌株中，以探索表皮葡萄球菌agr活性是否会影响金黄色葡萄球菌agr系统。该实验证实，表皮葡萄球菌agr I是金黄色葡萄球菌agr活性的唯一有效抑制剂，而表皮葡萄球菌agr II和III型几乎没有作用(图15A)。agrD基因区域内表皮葡萄球菌agr I型AIP的靶向缺失消除了表皮葡萄球菌抑制金黄色葡萄球菌agr活性的能力(图15B-C)。由于金黄色葡萄球菌PSMα诱导的NHEK胰蛋白酶活性是表皮屏障损害的组成部分，因此测试表皮葡萄球菌agr I型野生型或AIP敲除菌株，以确定它们是否可以影响此结果。观察到，当在野生型表皮葡萄球菌agrI型上清液存在的情况下培养金黄色葡萄球菌时，金黄色葡萄球菌诱导的NHEK胰蛋白酶活性受到抑制，而该活性不受缺乏该AIP的表皮葡萄球菌的抑制(图15D)。总体而言，这些实验确定了金黄色葡萄球菌诱导NHEK屏障损害的能力可受表皮葡萄球菌agr I型AIP表达的影响。

AD皮肤上表皮葡萄球菌agr I型相对丰度的不足。确定了表皮葡萄球菌的实验室菌株影响金黄色葡萄球菌对人角质细胞功能的作用的潜力后，进行实验以确定这些细菌在临床环境中的丰度。针对基于agr类型的表皮葡萄球菌相对丰度，分析了从患有不同严重程度(基于客观SCORAD)的AD的8名受试者的7处身体部位收集的皮肤微生物群系获得的宏基因组学数据。序列比对基于AD患者上的agr IIII型鉴定了表皮葡萄球菌基因组，并确定AD皮肤上最常见的表皮葡萄球菌agr类型是agr I型(图15E)。表皮葡萄球菌agr I与金黄色葡萄球菌的比较显示，在疾病严重程度增加的AD受试者中，表皮葡萄球菌agr I型的丰度变得相对较小(图15F-G)。这些观察结果证实了表皮葡萄球菌agr I型在AD皮肤微生物群系中的存在，并提示了与临床疾病相关的可能性。

不同的葡萄球菌种类和菌株抑制金黄色葡萄球菌agr活性。为了进一步确立金黄色葡萄球菌与皮肤微生物群系的其它成员之间的群体感应相互作用的生理学意义，测试了CoNS的不同AD临床分离株的培养上清液抑制金黄色葡萄球菌USA300 LAC agr I型群体感应活性的能力。不同物种(包括表皮葡萄球菌、人葡萄球菌、沃氏葡萄球菌和头状葡萄球菌)显示出对金黄色葡萄球菌的agr活性的有效抑制活性(图16A)。与表皮葡萄球菌的实验室分离株相似，CoNS菌株抑制金黄色葡萄球菌的agr活性，而不抑制其生长速率(图316S)。此外，对人葡萄球菌菌株C5的agrD AIP编码区进行的基因组序列分析显示，在AIP编码区中存在新的AIP序列，该序列类似于表皮葡萄球菌agr I型编码区的序列，并且具有预测的人葡萄球菌C5的八聚体(octomer)AIP序列(图16B；SEQ ID NO:4)。活性人葡萄球菌C5上清液的生化技术表明，对金黄色葡萄球菌agr活性的抑制取决于<3kDa(小尺寸)的pH 11的敏感(硫代内酯环)因子，其可以用80％硫酸铵沉淀(肽)。(图16C)。

接下来，在人葡萄球菌C5无菌过滤的上清液存在的情况下培养金黄色葡萄球菌，并将随后的培养上清液施加到NHEK，如图14所示。类似于表皮葡萄球菌agr I型，人葡萄球菌C5在NHEK中抑制金黄色葡萄球菌诱导的胰蛋白酶活性、KLK6转录物产生和IL-6蛋白表达(图16D-F)。此外，除了最常见的agr I型的临床分离株之外，人葡萄球菌C5还可抑制多种金黄色葡萄球菌agr系统，包括agr II型和III型，但不包括IV型(图17S)。这一发现与通过表皮葡萄球菌agr I型系统所观察到的相吻合。总体而言，这些观察结果表明，除了表皮葡萄球菌外，CoNS种类的临床分离株也可以使用群体感应来抑制金黄色葡萄球菌对角质细胞的损害。

临床CoNS分离株抑制金黄色葡萄球菌agr活性、其促进AD的能力。为了建立体内CoNS和金黄色葡萄球菌之间的群体感应相互作用的生理关联，使用金黄色葡萄球菌USA300LAC agr I型P3-Lux启动子(发光)菌株通过IVIS对金黄色葡萄球菌agr活性进行评估。背部皮肤上的金黄色葡萄球菌显示出丰富的agr活性，但是当存在活性人葡萄球菌C5时，金黄色葡萄球菌的agr活性被抑制(图17A-B)。此外，人葡萄球菌C5还保护免受金黄色葡萄球菌引起的皮肤红斑和脱屑(图17C)，而不会改变金黄色葡萄球菌的丰度(图17D)。该表型与炎症、屏障破坏、以及表皮蛋白酶活性和Klk6表达的改善的迹象有关(图17E-H)。此外，当在＜3kDa的浓缩人葡萄球菌C5上清液的存在下将金黄色葡萄球菌应用于鼠背部皮肤时，观察到屏障损伤和炎症的类似减少，而金黄色葡萄球菌的丰度没有变化。(图22)。这些数据表明，皮肤CoNS微生物群落可能包含通过种间群体感应活性促进上皮屏障内环境稳定的新型AIP。

已经描述了本公开的多个实施方式。然而，应当理解，在不脱离本公开的精神和范围的情况下可以进行各种修改。因此，其它实施方案在所附权利要求书的范围内。

序列表

<110> 加利福尼亚大学董事会

<120> 控制皮肤酶活性的分子细菌疗法

<130> 00015-332WO1

<140> 尚未指定

<141> 2018-08-31

<150> US 62/553,025

<151> 2017-08-31

<160> 17

<170> PatentIn版本3.5

<210> 1

<211> 141

<212> DNA

<213> 人葡萄球菌

<220>

<221> CDS

<222> (1)..(141)

<400> 1

atg aca ttt att aca gat tta ttc att aaa cta ttc tca tta atc tta 48

Met Thr Phe Ile Thr Asp Leu Phe Ile Lys Leu Phe Ser Leu Ile Leu

1 5 10 15

gaa act gtt ggt aca ctt gct tca tat aat gta tgt ggt ggt tat ttc 96

Glu Thr Val Gly Thr Leu Ala Ser Tyr Asn Val Cys Gly Gly Tyr Phe

20 25 30

gat gaa cct gaa gtt cct aaa gaa tta act gat ctt aat aga taa 141

Asp Glu Pro Glu Val Pro Lys Glu Leu Thr Asp Leu Asn Arg

35 40 45

<210> 2

<211> 46

<212> PRT

<213> 人葡萄球菌

<400> 2

Met Thr Phe Ile Thr Asp Leu Phe Ile Lys Leu Phe Ser Leu Ile Leu

1 5 10 15

Glu Thr Val Gly Thr Leu Ala Ser Tyr Asn Val Cys Gly Gly Tyr Phe

20 25 30

Asp Glu Pro Glu Val Pro Lys Glu Leu Thr Asp Leu Asn Arg

35 40 45

<210> 3

<211> 27

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 来自人葡萄球菌的编码片段

<220>

<221> CDS

<222> (1)..(27)

<400> 3

tca tat aat gta tgt ggt ggt tat ttc 27

Ser Tyr Asn Val Cys Gly Gly Tyr Phe

1 5

<210> 4

<211> 9

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 合成结构

<400> 4

Ser Tyr Asn Val Cys Gly Gly Tyr Phe

1 5

<210> 5

<211> 21

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 酚可溶性调控蛋白α-1

<400> 5

Met Gly Ile Ile Ala Gly Ile Ile Lys Val Ile Lys Ser Leu Ile Glu

1 5 10 15

Gln Phe Thr Gly Lys

20

<210> 6

<211> 21

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 酚可溶性调控蛋白α-2

<400> 6

Met Gly Ile Ile Ala Gly Ile Ile Lys Phe Ile Lys Gly Leu Ile Glu

1 5 10 15

Lys Phe Thr Gly Lys

20

<210> 7

<211> 22

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 酚可溶性调控蛋白α-3

<400> 7

Met Glu Phe Val Ala Lys Leu Phe Lys Phe Phe Lys Asp Leu Leu Gly

1 5 10 15

Lys Phe Leu Gly Asn Asn

20

<210> 8

<211> 20

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 酚可溶性调控蛋白α-4

<400> 8

Met Ala Ile Val Gly Thr Ile Ile Lys Ile Ile Lys Ala Ile Ile Asp

1 5 10 15

Ile Phe Ala Lys

20

<210> 9

<211> 44

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 酚可溶性调控蛋白β-2

<400> 9

Met Thr Gly Leu Ala Glu Ala Ile Ala Asn Thr Val Gln Ala Ala Gln

1 5 10 15

Gln His Asp Ser Val Lys Leu Gly Thr Ser Ile Val Asp Ile Val Ala

20 25 30

Asn Gly Val Gly Leu Leu Gly Lys Leu Phe Gly Phe

35 40

<210> 10

<211> 9

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> AIP共有序列

<220>

<221> MISC_FEATURE

<222> (1)..(1)

<223> Xaa是S、K、V、G或T

<220>

<221> MISC_FEATURE

<222> (2)..(2)

<223> Xaa是Y、Q、A或I

<220>

<221> MISC_FEATURE

<222> (3)..(3)

<223> Xaa是N、S、T或D

<220>

<221> MISC_FEATURE

<222> (4)..(4)

<223> Xaa是V、P、M或T

<220>

<221> MISC_FEATURE

<222> (6)..(6)

<223> Xaa是G、S、A、N或T

<220>

<221> MISC_FEATURE

<222> (7)..(7)

<223> Xaa是G、N、T或L

<220>

<221> MISC_FEATURE

<222> (8)..(8)

<223> Xaa是Y或F

<220>

<221> MISC_FEATURE

<222> (9)..(9)

<223> Xaa是Y、F或L

<400> 10

Xaa Xaa Xaa Xaa Cys Xaa Xaa Xaa Xaa

1 5

<210> 11

<211> 9

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 来自表皮葡萄球菌菌株A11的AIP肽

<400> 11

Lys Tyr Asn Pro Cys Ser Asn Tyr Leu

1 5

<210> 12

<211> 9

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 来自人葡萄球菌菌株A9和C4的AIP肽

<400> 12

Ser Tyr Ser Pro Cys Ala Thr Tyr Phe

1 5

<210> 13

<211> 9

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 来自人葡萄球菌的AIP肽

<400> 13

Ser Gln Thr Val Cys Ser Gly Tyr Phe

1 5

<210> 14

<211> 9

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 来自人葡萄球菌和头状葡萄球菌的AIP肽

<400> 14

Gly Ala Asn Pro Cys Ala Leu Tyr Tyr

1 5

<210> 15

<211> 9

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 来自人葡萄球菌的AIP肽

<400> 15

Thr Ile Asn Thr Cys Gly Gly Tyr Phe

1 5

<210> 16

<211> 9

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 来自路邓葡萄球菌的AIP肽

<400> 16

Val Gln Asp Met Cys Asn Gly Tyr Phe

1 5

<210> 17

<211> 9

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 来自沃氏葡萄球菌菌株G2的AIP肽

<400> 17

Gly Tyr Ser Pro Cys Thr Asn Phe Phe

1 5

PCT/RO/134表

Claims (37)

1.一种纯化的多肽，所述多肽包含与SEQ ID NO:4、11、12、13、14、15、16或17具有至少98％同一性的序列，并且所述多肽抑制(i)角质细胞的蛋白酶产生和/或活性，(ii)抑制角质细胞的IL-6产生和/或活性，(iii)抑制金黄色葡萄球菌(S.aureus)产生酚可溶性调控蛋白α3，和/或(iv)抑制金黄色葡萄球菌的agr产生和/或活性。

2.根据权利要求1所述的纯化的多肽，其中所述多肽与SEQ ID NO:2具有至少98％的同一性。

3.根据权利要求1所述的纯化的多肽，其中所述多肽包含SEQ ID NO:4、11、12、13、14、15、16或17。

4.根据权利要求1所述的纯化的多肽，其中所述多肽由SEQ ID NO:4、11、12、13、14、15、16或17组成。

5.根据权利要求1-4中任一项所述的纯化的多肽，其中所述多肽包含一种或多种D-氨基酸。

6.根据权利要求1-4中任一项所述的纯化的多肽，其中所述多肽包含式I、式IA或式IB的化合物。

7.一种局部配制剂，其包含权利要求1-4中任一项所述的多肽。

8.一种分离的多核苷酸，其编码权利要求1-4中任一项所述的多肽。

9.根据权利要求8所述的分离的多核苷酸，其中所述多核苷酸包含在严格条件下与由SEQ ID NO:1组成的多核苷酸杂交并编码包含SEQ ID NO:4的多肽的序列。

10.根据权利要求8所述的分离的多核苷酸，其中所述多核苷酸包含SEQ ID NO:1或3。

11.一种载体，其包含权利要求8所述的多核苷酸。

12.一种载体，其包含权利要求9或10所述的多核苷酸。

13.一种重组微生物，其包含权利要求8所述的多核苷酸。

14.一种重组微生物，其包含权利要求9或10所述的多核苷酸。

15.根据权利要求13所述的重组微生物，其中所述微生物是减毒微生物。

16.根据权利要求13所述的重组微生物，其中所述微生物是共生微生物。

17.一种局部益生菌组合物，其包含权利要求15或16所述的重组微生物。

18.一种局部益生菌组合物，其由表达权利要求1所述的多肽的微生物组成。

19.根据权利要求18所述的局部益生菌组合物，其中所述微生物是人葡萄球菌(S.hominis)、表皮葡萄球菌(S.epidermidis)、沃氏葡萄球菌(S.warneri)或其任何组合。

20.根据权利要求19所述的局部益生菌组合物，其中所述微生物是人葡萄球菌C5、人葡萄球菌A9、表皮葡萄球菌A11和/或沃氏葡萄球菌G2。

21.根据权利要求18所述的局部益生菌组合物，其中所述组合物包含选自以下微生物的组的微生物：所述微生物具有ATCC编号_______(菌株名称表皮葡萄球菌A11 81618，于2018年8月28日保藏)、ATCC编号_______(菌株名称人葡萄球菌C5 81618，于2018年8月28日保藏)、ATCC编号_______(菌株名称人葡萄球菌A9 81618，于2018年8月28日保藏)、ATCC编号_______(菌株名称沃氏葡萄球菌G2 81618，于2018年8月28日保藏)及任何前述菌株的组合。

22.一种治疗皮肤病学病症的方法，所述方法包括施用足以抑制皮肤上的蛋白酶活性的、有效量的凝固酶阴性葡萄球菌属物种(Staphylococcus sp.)(CoNS)或有效量的CoNS的发酵提取物，其中所述CoNS产生多肽，所述多肽包含与SEQ ID NO:4具有至少98％同一性的序列且抑制蛋白酶产生。

23.根据权利要求22所述的方法，其中所述皮肤病学病症选自由以下各项组成的组：内瑟顿综合征、特应性皮炎、接触性皮炎、湿疹、银屑病、痤疮、表皮角化过度、棘皮症、表皮炎症、皮肤炎症和搔痒症。

24.根据权利要求22所述的方法，其中所述施用是通过局部应用进行施用。

25.根据权利要求22所述的方法，其中所述CoNS选自由以下各项组成的组：表皮葡萄球菌(Staphylococcus epidermidis)、头状葡萄球菌(Staphylococcus capitis)、山羊葡萄球菌(Staphylococcus caprae)、解糖葡萄球菌(Staphylococcus saccharolyticus)、沃氏葡萄球菌(Staphylococcus warneri)、巴氏葡萄球菌(Staphylococcus pasteuri)、溶血葡萄球菌(Staphylococcus haemolyticus)、德氏葡萄球菌(Staphylococcus devriesei)、人葡萄球菌(Staphylococcus Hominis)、Staphylococcus jettensis、Staphylococcuspetrasii和路邓葡萄球菌(Staphylococcus lugdunensis)。

26.根据权利要求22所述的方法，其中所述CoNS的发酵提取物包含SEQ ID NO:4的多肽序列和/或式I的化合物。

27.根据权利要求22所述的方法，其中所述CoNS选自由以下各项组成的组：表皮葡萄球菌A11、人葡萄球菌C4、人葡萄球菌C5、人葡萄球菌A9、沃氏葡萄球菌G2及其任何组合。

28.一种治疗皮肤疾病或病症的方法，所述方法包括：

测量来自受试者皮肤的培养物的蛋白酶活性或来自受试者的皮肤的蛋白酶活性；

将所述蛋白酶活性与正常对照进行比较；

施用共生皮肤细菌组合物和/或来自凝固酶阴性葡萄球菌的发酵提取物，其中所述共生皮肤细菌组合物或发酵提取物包含与SEQ ID NO:4具有至少98％同一性的多肽和/或包含式I的化合物，其中所述组合物被配制成维持所述共生皮肤细菌的生长和复制能力的乳膏、软膏或药物组合物。

29.根据权利要求28所述的方法，其中所述凝固酶阴性葡萄球菌选自由以下各项组成的组：表皮葡萄球菌、头状葡萄球菌、山羊葡萄球菌、解糖葡萄球菌、沃氏葡萄球菌、巴氏葡萄球菌、溶血葡萄球菌、德氏葡萄球菌、人葡萄球菌、Staphylococcus jettensis、Staphylococcus petrasii和路邓葡萄球菌。

30.一种治疗皮肤疾病或病症的方法，所述方法包括施用权利要求1所述的纯化的多肽或包含细菌的益生菌组合物，所述细菌产生抑制激肽释放酶表达的、与SEQ ID NO:4具有至少95％同一性的多肽。

31.一种治疗皮肤疾病或病症的方法，所述方法包括施用抑制酚可溶性调控蛋白表达的组合物，其中所述组合物包含权利要求1所述的纯化的多肽或式I的化合物。

32.根据权利要求30或31所述的方法，其中所述施用是局部施用。

33.根据权利要求30或31所述的方法，其中所述组合物是凝固酶阴性葡萄球菌的发酵提取物。

34.一种局部益生菌组合物，其包含多种选自由以下各项组成的组的益生共生皮肤细菌：表皮葡萄球菌A11、人葡萄球菌C4、人葡萄球菌C5、人葡萄球菌A9、沃氏葡萄球菌G2及其任何组合。

35.根据权利要求34所述的局部益生菌组合物，其被配制成洗剂、振荡剂、乳膏、软膏、凝胶、泡沫、粉剂、固体、糊剂或酊剂。

36.一种药物组合物，其包含药物和金黄色葡萄球菌发酵提取物或金黄色葡萄球菌生物，所述发酵提取物或金黄色葡萄球菌生物包含酚可溶性调控蛋白α3。

37.一种通过皮肤进行药物递送的方法，所述方法包括使皮肤与权利要求36所述的组合物接触。

Images