CN111751339B - 一种微阵列芯片激光共焦扫描仪的校准方法 - Google Patents

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Abstract

本发明提供了一种微阵列芯片激光共焦扫描仪的校准方法：步骤1、对标准机和被校仪器的荧光校准通道设置扫描参数，对同一校准芯片进行扫描，得到一组标准数据和待测数据；步骤2、计算该组数据的线性相关系数和斜率；步骤3、更改参数重复步骤1和步骤2共N次，得到N组的线性相关系数和斜率；步骤4、根据每组数据的线性相关系数，得到符合修正条件的组数M；步骤5；判断符合步骤4修正条件的组数的斜率，得到数据是否符合修正条件的组数L，符合则计算L组数据的斜率均值；步骤6、将斜率均值作为修正值，完成该通道的校准；步骤7、更换荧光通道重复步骤1～6，完成多通道的校准。本发明校准方法提高校准数据量，校准覆盖面更广。

Description

一种微阵列芯片激光共焦扫描仪的校准方法
技术领域
本发明涉及微阵列芯片扫描仪校准领域，特别涉及一种微阵列芯片激光共焦扫描仪的校准方法。
背景技术
微阵列检测仪器是革命性的生物技术。通过应用这些仪器，人们能够自动读取微阵列信息，在短短几分钟内获取大量的数据。大多数此类仪器中都应用荧光进行检测，这种方法能够在一个微阵列上同时检测多种生物样品，应用它研究人员能够生物样本的转录子进行检测。检测过程中要对整个微阵列的各个位置结合在靶标分子上的探针分子进行识别，然后把检测结果转换成微阵列图像，即微阵列的一张照片。微阵列图像提供了一个与微阵列上分子反应相对应的信息，这些信息直接反映了生物样品中该分子的类型和数量。随着共聚焦微阵列扫描技术的成熟，微阵列检测仪器临床诊断中逐渐普及。作为一款集成光源、光路及信号采集系的精密仪器，对检测的灵敏度要求极高。随着使用时间延长产生的光源衰减、光路漂移、使用过程中的PMT抖动等微小变化，都可能对结果的判读产生影响，因此采用合适的方法对微阵列芯片扫描仪进行校准是非常必要的。
发明内容
针对上述存在的问题，本发明提供了一种可对微阵列芯片扫描仪荧光信号范围进行校准，同时可以满足单通道微阵列芯片扫描仪和双通道微阵列芯片扫描仪，且操作简单，校准芯片更容易制备的校准方法更适合推广。
本发明采用的技术方案如下：一种微阵列芯片激光共焦扫描仪的校准方法，包括：
步骤1、分别对标准机和被校仪器的荧光校准通道设置相同的扫描参数，分别对同一校准芯片进行扫描，得到一组标准数据和待测数据；
步骤2、将标准数据与待测数据做截距为零的线性拟合，计算该组数据的线性相关系数和斜率；
步骤3、设置不同的扫描参数重复步骤1和步骤2共N次，得到N组数据的线性相关系数和斜率；
步骤4、判断线性相关系数符合标准的数据组数M，若符合标准的数据组数M不符合修正值条件，则表示被校准仪器与比标准机相比误差过大，需对被校准仪器重新进行性能调试，降低误差后再进入步骤1；
步骤5、判断符合步骤4的数据组的斜率符合标准的数据组数L，若斜率符合标准的数据组数L不符合修正条件，则表示被校准仪器与比标准机相比误差过大，需对被校准仪器重新进行性能调试，降低误差后进入步骤1；若斜率符合标准的数据组数L符合修正条件，则计算L组数据的斜率均值；
步骤6、将斜率均值作为被校准仪器在该荧光检测通道及设置参数范围内的修正值，对被校准仪器进行校准；
步骤7、更换荧光通道重复步骤1～6，完成被校准仪器其他荧光通道的校准。
进一步的，所述步骤3中，采用过原点的线性回归分析法进行拟合，计算得到每组数据的线性相关系数和斜率。
进一步的，所述步骤4中，数据组数N不少于6。
进一步的，所述步骤5中，所述判断线性相关系数符合标准的方法为：线性相关系数大于0.9的数据为符合标准，符合标准的数据组数M不少于5组。
进一步的，所述步骤5中，所述修正条件为：符合步骤4标准的数据组斜率值的变异系数CV值小于5％，且数据组数L不少于4组。
进一步的，所述性能调试包括：光路、焦距等调试，以降低被校准仪器与标准机的误差。
进一步的，所述校准芯片由具有浓度梯度的荧光纳米材料混合液点制在微流控芯片的反应池内或点制在玻片芯片表面制成，荧光纳米材料混合液浓度梯度不少于5个。
进一步的，所述每个点阵样品点数量不少于20个，即每个梯度浓度重复点制不少于4次。
进一步的，所述每个校准芯片点阵数量不少于3个。
进一步的，所述校准芯片的荧光信号值范围在0～65535之间。
进一步的，所述参数范围为N组扫描参数形成的参数集合。
与现有技术相比，采用上述技术方案的有益效果为：采用浓度梯度校准芯片的校准方法，不仅实现了对仪器的荧光信号范围进行校准，在数据提取方面，设置多组扫描参数组合，提高校准数据量，使得校准的覆盖面更广。校准结果在满足相关系数R2的情况下取斜率K值作为修正值，操作简单，校准结果的判读和仪器的参数的修正可用软件集成，极大的提高了效率。在校准片制备方面，采用荧光纳米材料点制校准芯片，荧光物质不易降解，提高了校准芯片的使用寿命。
附图说明
图1为本发明中的校准方法流程图。
图2为本发明中的微流控校准芯片示意图。
图3为本发明中的玻片校准芯片示意图。
图4为本发明实施例2中532nm通道的8组校准数据示意图。
图5为本发明实施例3中532nm通道的8组校准数据示意图。
图6为本发明实施例3中488nm通道的8组校准数据示意图。
具体实施方式
下面结合附图对本发明做进一步描述。
本发明要解决的技术问题是：
1.针对微阵列芯片扫描仪荧光信号范围进行校准，且该校准方法同时满足单通道微阵列芯片扫描仪和双通道微阵列芯片扫描仪的校准。
2.针对微阵列芯片扫描仪荧光信号范围进行校准的校准方法，提供浓度梯度校准芯片制备方法，降低校准芯片的制备成本
实施例1
采用如图1所示的本发明提供的校准方法，进行单通道扫描仪校准，具体过程如下：
将校准芯片在标准机532nm通道设置不同扫描参数扫描一组标准数据，得到标准数据。
本实施例中标准机设置的8组扫描参数为：Power60、PMT450；Power60、PMT550；Power60、PMT650；Power60、PMT750；Power70、PMT450；Power70、PMT550；Power70、PMT650；Power70、PMT750。
将同一校准芯片，同样的扫描参数在被校仪器扫描一组数据，得到待测数据。
本例中被校仪器设置的8组扫描参数为：Power60、PMT450；Power60、PMT550；Power60、PMT650；Power60、PMT750；Power70、PMT450；Power70、PMT550；Power70、PMT650；Power70、PMT750。
分别将8组532nm通道的标准数据与待测数据做截距为零的线性拟合，计算相同参数下两组数据的线性相关系数R2和斜率K值。计算线性相关系数R2和斜率K值、修正被校仪器荧光采集参数可手动完成也可由软件自动完成。
本实施例532nm单通道8组校准数据如图4所示，
本例中要求R2大于0.9的数据不少于7组。
本例中要求R2大于0.9的7组数据中，K值的CV值小于5％的数据组不少于6组(不满足时可去掉Power、PMT组合最大或最小的一组数据)，本例中7组数据K值的CV值为3.5％。
计算7组数据K值的均值Kavg，本例中Kavg＝1.0037作为被校准仪器在532nm通道，在Power60～Power70和PMT450～PMT750这个扫描参数空间范围内的修正值。
实施例2
采用发明提供的校准方法，进行双通道扫描仪校准，具体过程如下：
将校准芯片在标准机上532nm通道设置不同扫描参数扫描一组标准数据，得到标准数据。
本实施例中标准机532nm通道设置的8组扫描参数为：Power60、PMT450；Power60、PMT550；Power60、PMT650；Power60、PMT750；Power70、PMT450；Power70、PMT550；Power70、PMT650；Power70、PMT750。
将同一校准芯片，同样的扫描参数在被校仪器532nm通道扫描一组数据，得到待测数据。
本实施例中被校仪器532nm通道设置的8组扫描参数为：Power60、PMT450；Power60、PMT550；Power60、PMT650；Power60、PMT750；Power70、PMT450；Power70、PMT550；Power70、PMT650；Power70、PMT750。
分别将8组532nm通道的标准数据与待测数据做截距为零的线性拟合，计算相同参数下两组数据的线性相关系数R2和斜率K值。
本实施例532nm通道8组校准数据如图5所示；
本例中要求R2大于0.9的数据不少于7组。
本例中要求R2大于0.9的7组数据中，K值的CV值小于5％的数据组不少于6组(不满足时可去掉Power、PMT组合最大或最小的一组数据)，本例中7组数据K值的CV值为3.5％。
计算7组数据K值的均值Kavg，本例中Kavg＝1.0037作为被校准仪器在532nm通道，在Power60～Power70和PMT450～PMT750这个扫描参数空间范围内的修正值。
将校准芯片在标准机上488nm通道设置不同扫描参数扫描一组标准数据，得到标准数据。
本例中标准机488nm通道设置的8组扫描参数为：Power60、PMT450；Power60、PMT550；Power60、PMT650；Power60、PMT750；Power70、PMT450；Power70、PMT550；Power70、PMT650；Power70、PMT750。
将同一校准芯片，同样的扫描参数在被校仪器488nm通道扫描一组数据，得到待测数据。
本例中被校仪器488nm通道设置的8组扫描参数为：Power60、PMT450；Power60、PMT550；Power60、PMT650；Power60、PMT750；Power70、PMT450；Power70、PMT550；Power70、PMT650；Power70、PMT750。
分别将8组488nm通道的标准数据与待测数据做截距为零的线性拟合，计算相同参数下两组数据的线性相关系数R2和斜率K值。
本实施例488nm通道8组校准数据如图6所示，
本例中要求R2大于0.9的数据不少于7组。
本例中要求R2大于0.9的7组数据中，K值的CV值小于5％的数据组不少于6组(不满足时可去掉Power、PMT组合最大或最小的一组数据)，本例中7组数据K值的CV值为3.9％。
计算7组数据K值的均值Kavg，本例中Kavg＝1.2486作为被校准仪器在488nm通道，在Power60～Power70和PMT450～PMT750这个扫描参数空间范围内的修正值。
本发明采用浓度梯度的校准芯片，对仪器的信号采集范围进行校准，校准过程中同时要求相关系数R2和斜率K值，校准的准确性更高，采用浓度梯度的校准芯片，取消了信号点间的一致性要求，降低了制备成本。
实施例3
本发明还提供了一种制备实施例1-2中校准芯片的方法，包括以下过程：
步骤1、准备微流控芯片及采用荧光纳米材料配制的混合液；
步骤2、将荧光纳米材料配制的混合液按比例稀释成若干梯度浓度；
步骤3、将稀释后的混合液点制在微流控芯片的反应池内或点制在玻片芯片表面制，每个浓度梯度重复不少于4次，形成1个阵列；微流控芯片上阵列数不少于3个；
步骤4、将点制好的微流控芯片表面覆膜形成校准芯片。
采用上述方法，将用荧光纳米材料的混合液按比例稀释成7个梯度浓度。
将稀释后的荧光纳米材料混合液点制在用PVC塑料材质加工的微流控芯片的反应池内；本例反应池数量84个，共分3个阵列，每个整列由7乘4的反应池组成，以第一个阵列为例，从第1行反应池到第7行反应池荧光纳米材料混合液浓度递增，对应7个梯度浓度，对应的荧光信号值范围在0～65535之间，每个浓度梯度重复4次，将点制好的微流控芯片表面覆膜形成校准芯片，如附图2所示。
采用上述方法，将用荧光纳米材料的混合液按比例稀释成12个梯度浓度。
将稀释后的荧光纳米材料混合液点制在玻片芯片表面制；本实施例共分3个阵列，每个整列由12乘12的点组成，以第一个阵列为例，从第1行反应池到第12行反应池荧光纳米材料混合液浓度递增，对应12个梯度浓度，对应的荧光信号值范围在0～65535之间，每个浓度梯度重复12次，如附图3所示。
本发明并不局限于前述的具体实施方式。本发明扩展到任何在本说明书中披露的新特征或任何新的组合，以及披露的任一新的方法或过程的步骤或任何新的组合。如果本领域技术人员，在不脱离本发明的精神所做的非实质性改变或改进，都应该属于本发明权利要求保护的范围。
本说明书中公开的所有特征，或公开的所有方法或过程中的步骤，除了互相排斥的特征和/或步骤以外，均可以以任何方式组合。
本说明书中公开的任一特征，除非特别叙述，均可被其他等效或具有类似目的的替代特征加以替换。即，除非特别叙述，每个特征只是一系列等效或类似特征中的一个例子而已。

Claims (10)

1.一种微阵列芯片激光共焦扫描仪的校准方法，其特征在于，包括：
步骤1、分别对标准机和被校仪器的荧光校准通道设置相同的扫描参数，并分别对同一校准芯片进行扫描，得到一组标准数据和待测数据；
步骤2、将标准数据与待测数据做截距为零的线性拟合，计算该组数据的线性相关系数和斜率；
步骤3、设置不同的扫描参数重复步骤1和步骤2共N次，得到N组数据的线性相关系数和斜率；
步骤4、判断线性相关系数符合标准的数据组数M，若符合标准的数据组数M不符合修正值条件，则对被校准仪器重新进行性能调试，调试后进入步骤1；
步骤5、判断符合步骤4的数据组的斜率符合标准的数据组数L，若斜率符合标准的数据组数L不符合修正条件，则对被校准仪器重新进行性能调试，调试后进入步骤1；若斜率符合标准的数据组数L符合修正条件，则计算L组数据的斜率均值；
步骤6、将斜率均值作为被校准仪器在该荧光检测通道及设置参数范围内的修正值，对被校准仪器进行校准；
步骤7、更换荧光通道重复步骤1～6，完成被校准仪器其他荧光通道的校准。
2.根据权利要求1所述的微阵列芯片激光共焦扫描仪的校准方法，其特征在于，所述步骤2中，采用过原点的线性回归分析法进行拟合，计算得到每组数据的线性相关系数和斜率。
3.根据权利要求1所述的微阵列芯片激光共焦扫描仪的校准方法，其特征在于，所述步骤3中，数据组数N不少于6。
4.根据权利要求3所述的微阵列芯片激光共焦扫描仪的校准方法，其特征在于，所述步骤4中，所述判断线性相关系数符合标准的方法为：线性相关系数大于0.9，且数据组数M不少于5组。
5.根据权利要求4所述的微阵列芯片激光共焦扫描仪的校准方法，其特征在于，所述步骤5中，所述修正条件为：符合步骤4标准的数据组斜率值的变异系数CV值小于5％，且数据组数L不少于4组。
6.根据权利要求1所述的微阵列芯片激光共焦扫描仪的校准方法，其特征在于，所述校准芯片由具有浓度梯度的荧光纳米材料混合液点制在微流控芯片的反应池内或点制在玻片芯片表面制成，荧光纳米材料混合液浓度梯度不少于5个。
7.根据权利要求6所述的微阵列芯片激光共焦扫描仪的校准方法，其特征在于，每个梯度浓度重复点制不少于4次，形成一个阵列。
8.根据权利要求7所述的微阵列芯片激光共焦扫描仪的校准方法，其特征在于，每个校准芯片的阵列数量不少于3个。
9.根据权利要求8所述的微阵列芯片激光共焦扫描仪的校准方法，其特征在于，所述校准芯片的荧光信号值范围在0～65535之间。
10.根据权利要求1所述的微阵列芯片激光共焦扫描仪的校准方法，其特征在于，所述参数范围为N组扫描参数形成的参数集合。
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