CN111638104B - 一种生物芯片扫描仪的荧光校准片 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了一种生物芯片扫描仪的荧光校准片，包括生物芯片试剂盒底座、胶垫、固体基质和有机荧光混合液，所述有机荧光混合液以液滴点阵阵列结构分布在固体基质上，所述有机荧光混合液采用有机荧光染料和稀释液的混合液，其中，所述点阵阵列结构采用48或96个分点阵，且各分点阵的结构相同，通过生物芯片扫描仪对所述液滴点阵阵列结构进行扫描；本发明在有效确保生物芯片扫描仪的扫描精度基础上，操作方法简单，可批量生产，而且生产周期短、成本低。
Description
技术领域
本发明属于生物芯片检测技术领域，具体涉及一种生物芯片扫描仪的荧光校准片。
背景技术
在现有技术中，越精密的生物芯片扫描仪在进行扫描时对仪器精度的要求越高，然而对于近红外领域的生物芯片扫描仪至今缺乏专用的校准检验工具，因此，生物芯片扫描仪的扫描精度比较难检验评价。
在当前技术中，已有一些关于激光共聚焦生物芯片扫描仪的浓度梯度荧光校准片，被广泛应用于各类基因芯片扫描仪中，然而如果将这些浓度梯度荧光校准片应用作为生物芯片扫描仪会存在较大的误差。
基于以上，本申请人希望寻求针对生物芯片扫描仪的荧光校准片来校验生物芯片扫描仪的扫描性能，进而有效确保生物芯片扫描仪的扫描精度。
发明内容
有鉴于此，本发明的目的在于提供一种生物芯片扫描仪的荧光校准片，在有效确保生物芯片扫描仪的扫描精度基础上，操作方法简单，可批量生产，而且生产周期短、成本低。
本发明采用的技术方案如下：
一种生物芯片扫描仪的荧光校准片，包括生物芯片试剂盒底座、胶垫、固体基质和有机荧光混合液，所述有机荧光混合液以液滴点阵阵列结构分布在固体基质上，所述有机荧光混合液采用有机荧光染料和稀释液的混合液，其中，所述点阵阵列结构采用48或96个分点阵，且各分点阵的结构相同，通过生物芯片扫描仪对所述液滴点阵阵列结构进行扫描。
优选地，在单个分点阵中，将所述有机荧光混合液点样呈6行×n列或n行×6列状的液滴阵列结构，且n为正整数。
优选地，单个分点阵中相邻液滴之间的液滴间距均不小于800μm；所述n的范围为3-6。
优选地，所述生物芯片试剂盒底座为生物芯片扫描仪检测对象的下底板；所述固体基质采用硅胶膜片或玻璃片，所述胶垫采用硅胶或橡胶材质。
优选地，将液滴点阵阵列结构按逐行或逐列顺序对液滴进行正整数编号直至作为最后1点的第m点，从第1点到第m点的液滴荧光素浓度呈正数倍比例减少，同时各分点阵中相同编号的液滴荧光素浓度均相等，通过生物芯片扫描仪扫描所述点阵阵列结构中各液滴得到相应的的扫描灰度值,取各分点阵中相同编号液滴的扫描灰度值的中位值作为该编号的扫描灰度值；将各液滴荧光素浓度作为横坐标或纵坐标，将对应编号液滴的扫描灰度值作为纵坐标或横坐标进行线性拟合，其中,在满足相关系数R2不小于0.99的液滴荧光素浓度中，最高荧光素浓度和最低荧光素浓度的比值大于或等于103。
优选地，所述生物芯片试剂盒底座设有缺角，以靠近所述缺角的点样液滴作为第1点液滴。
优选地，所述生物芯片扫描仪的波长范围为760-850nm。
优选地，所述有机荧光染料采用Alexa Fluor 790荧光染料、Cy7.5荧光染料、NHS Ester荧光染料中的一种或几种的混合；所述稀释液采用点样抗体缓冲液和牛血清白蛋白的混合液。
优选地，第m点液滴采用作为空白对照的稀释液，从第1点到第m-1点的液滴荧光素浓度呈正数倍比例减少，通过生物芯片扫描仪扫描所述点阵阵列结构得到相应的扫描灰度值，所述第m点液滴的扫描灰度值作为本底灰度值；将各液滴荧光素浓度作为横坐标或纵坐标，将对应编号液滴的扫描灰度值与本底灰度值的灰度差值作为纵坐标或横坐标进行线性拟合。
优选地，基于各分点阵中满足线性拟合相关系数R2＞0.99的最高荧光素浓度对应的扫描灰度值并计算第一CV分值，基于各分点阵中满足线性拟合相关系数R2＞0.99的最低荧光素浓度对应的扫描灰度值并计算第二CV分值，取第一CV分值和第二CV分值的平均值作为单次扫描图像的CV值，所述CV值不大于5％；其中，第一CV分值＝各分点阵中满足线性拟合相关系数R2＞0.99的最高荧光素浓度对应的扫描灰度值的标准偏差值/取各分点阵中满足线性拟合相关系数R2＞0.99的最高荧光素浓度对应的扫描灰度值的平均值，第二CV分值＝各分点阵中满足线性拟合相关系数R2＞0.99的最低荧光素浓度对应的扫描灰度值的标准偏差值/取各分点阵中满足线性拟合相关系数R2＞0.99的最低荧光素浓度对应的扫描灰度值的平均值，用于检验校准扫描精度。
本发明将有机荧光混合液呈液滴点阵阵列结构分布在固体基质上，液滴点阵阵列结构完全根据生物芯片试剂盒来设计，具体体现为：本发明中点阵阵列结构采用48或96个分点阵，且各分点阵的结构相同，在对生物芯片扫描仪进行实际检验校准时，通过生物芯片扫描仪进行灰度值信号扫描并进行线性拟合得到荧光素浓度灰度曲线，根据该曲线可计算出扫描仪器检测的动态范围；通过信噪比(SNR)的计算，可检测出仪器的最低响应值；通过CV值的计算，可检验仪器本身的系统误差，并依据实际检测数据来对生物芯片扫描仪进行系统调节校正，最终可有效确保生物芯片扫描仪的扫描精确度；同时本发明提出的荧光校准片的校准操作方法简单，可批量生产，而且生产周期短、成本低。
本发明还进一步优选地设计了专用于波长范围为760-850nm的近红外生物芯片扫描仪的荧光校准片，具体通过Alexa Fluor 790荧光染料、Cy7.5荧光染料、NHS Ester荧光染料作为有机荧光染料的有机荧光混合液作为点样剂，通过大量试验验证后确认其校准结果灵敏且可靠稳定；当然地，本发明还可以根据实际需要通过改变荧光染料实现其他波谱范围的荧光校准。
附图说明
附图1是本发明具体实施方式下荧光校准片的结构示意图；
附图2是本发明具体实施方式下荧光校准片固体基质上的液滴点阵阵列结构示意图；
附图3是图2中48个分点阵中18个液滴扫描灰度值示意数据；
附图4是本发明具体实施方式下计算得到的荧光素浓度灰度曲线图。
具体实施方式
本发明实施例公开了一种生物芯片扫描仪的荧光校准片，包括生物芯片试剂盒底座、胶垫、固体基质和有机荧光混合液，有机荧光混合液以液滴点阵阵列结构分布在固体基质上，有机荧光混合液采用有机荧光染料和稀释液的混合液，其中，点阵阵列结构采用48或96个分点阵，且各分点阵的结构相同，通过生物芯片扫描仪对液滴点阵阵列结构进行扫描。
为了使本技术领域的人员更好地理解本发明中的技术方案，下面将结合本发明实施例中的附图，对本发明实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述，显然，所描述的实施例仅仅是本发明一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都应当属于本发明保护的范围。
请参见图1和图2所示，一种生物芯片扫描仪的荧光校准片，生物芯片扫描仪的波长范围为760-850nm，具体为：激发波长峰值范围为760-790nm，发射波长峰值范围为790-850nm，，包括生物芯片试剂盒底座10、胶垫20、固体基质30和有机荧光混合液，有机荧光混合液以液滴点阵阵列结构40分布在固体基质30上，有机荧光混合液采用有机荧光染料和稀释液的混合液，其中，有机荧光染料采用Alexa Fluor 790荧光染料、Cy7.5荧光染料、NHS Ester荧光染料中的一种或几种的混合，通过生物芯片扫描仪对液滴点阵阵列结构40进行扫描；稀释液采用常规通用的点样抗体缓冲液和牛血清白蛋白的混合液；也可以采用其他合适的公知稀释液；
为了提高生物芯片扫描仪对生物试剂盒扫描的精度以及操作便捷性，优选地，在本实施方式中，生物芯片试剂盒底座10为生物芯片扫描仪检测对象的下底板；固体基质30采用硅胶膜片或玻璃片，胶垫20采用硅胶或橡胶材质，用于粘附以及防护固体基质30；
为了确保生物芯片扫描仪的扫描精度，在本实施方式中，点阵阵列结构采用48或96个分点阵，且各分点阵的结构相同，在单个分点阵中，将有机荧光混合液点样呈6行×n列或n行×6列状的液滴阵列结构，且n为正整数，优选地，单个分点阵中相邻液滴之间的液滴间距均不小于800μm；n的范围为3-6；在实际实施时，将液滴点阵阵列结构按逐行或逐列顺序对液滴进行正整数编号直至作为最后1点的第m点，生物芯片试剂盒底座10设有缺角11，以靠近缺角11的点样液滴作为第1点液滴a1，第m点液滴am采用作为空白对照的稀释液，从第1点到第m-1点的液滴荧光素浓度呈正数倍比例减少，同时各分点阵中相同编号的液滴荧光素浓度均相等，通过生物芯片扫描仪扫描点阵阵列结构40中各液滴的扫描灰度值，将各分点阵中第m点液滴的扫描灰度值的中位值作为本底灰度值；将第1点液滴到第m点液滴荧光素浓度作为横坐标或纵坐标，取各分点阵中相同编号液滴的扫描灰度值的中位值与本底灰度值的灰度差值作为该编号的扫描灰度绝对值，将对应编号液滴的扫描灰度绝对值作为纵坐标或横坐标进行线性拟合，其中,在满足相关系数R2不小于0.99的液滴荧光素浓度中，最高荧光素浓度和最低荧光素浓度的比值大于或等于103；
进一步优选地，在本实施方式中，基于各分点阵中满足线性拟合相关系数R2＞0.99的最高荧光素浓度对应的扫描灰度值并计算第一CV分值，基于各分点阵中满足线性拟合相关系数R2＞0.99的最低荧光素浓度对应的扫描灰度值并计算第二CV分值，取第一CV分值和第二CV分值的平均值作为单次扫描图像的CV值，CV值不大于5％；其中，第一CV分值＝各分点阵中满足线性拟合相关系数R2＞0.99的最高荧光素浓度对应的扫描灰度值的标准偏差值/取各分点阵中满足线性拟合相关系数R2＞0.99的最高荧光素浓度对应的扫描灰度值的平均值，第二CV分值＝各分点阵中满足线性拟合相关系数R2＞0.99的最低荧光素浓度对应的扫描灰度值的标准偏差值/取各分点阵中满足线性拟合相关系数R2＞0.99的最低荧光素浓度对应的扫描灰度值的平均值，根据该标准来对扫描仪进行系统调节校正，用于确保扫描精度；需要说明的是，本申请涉及的标准偏差值是通过对各分点阵中的最高荧光素浓度对应的扫描灰度值进行STDEV公式计算后得到的；
优选地，在单次扫描图像中，将扫描仪系统可识别的最小扫描灰度值对应的浓度值作为最低响应值，且该最低响应值与达到扫描仪系统饱和灰度值对应的最小浓度值的比值大于103，也就是说最低响应值对应的点样液滴数量不大于13点，且等于13点时要求信号对噪声的比值SNR大于或等于2，根据该要求来对扫描仪最低响应值进行检测，可得到生物芯片扫描仪的最低响应值。
需要说明的是，本实施例以上涉及对于荧光校准片通过线性拟合得到的荧光素浓度灰度校准曲线的线性范围要求以及校准灵敏度要求均参照国标GB/T 33805-2017执行，这些要求仅作为本申请在校准实施时的技术内容，当不作为本申请的创新方案。
为了对本申请的实施例进行进一步展开说明，在如上实施方式的基础上，本申请进行了如下具体实施过程：请进一步参见图2所示，点阵阵列结构采用48个分点阵，在单个分点阵中，将有机荧光混合液点样呈6行×3列的液滴阵列结构(即m＝18)，单个分点阵中，液滴的外径为400μm，同行中相邻液滴之间的液滴间距为1800μm，同列中相邻液滴之间的液滴间距为900μm；以靠近缺角的点样液滴作为第1点液滴，其荧光素浓度为1mg/ml，第18点液滴采用作为空白对照的稀释液，各分点阵中相同编号的液滴荧光素浓度均相等；
请进一步参见图3所示，通过生物芯片扫描仪扫描点阵阵列结构40，得到48个分点阵中18个液滴扫描灰度值；取各分点阵中第18点液滴的扫描灰度值的中位值作为本底灰度值，并取各分点阵中相同编号液滴的扫描灰度值的中位值，并计算其与本底灰度值的灰度差值，计算情况请参见下表1：
表1：点阵阵列结构灰度差值数据(也就是18个液滴的扫描灰度绝对值)
| 第1点 | 第2点 | 第3点 | 第4点 | 第5点 | 第6点 | 第7点 | 第8点 | 第9点 | |
| 各分点阵扫描灰度值的中位值 | 65535 | 65535 | 49190.5 | 24615 | 12327 | 6182.5 | 3110.5 | 1574.5 | 806.5 |
| 本底灰度值 | 38.5 | 38.5 | 38.5 | 38.5 | 38.5 | 38.5 | 38.5 | 38.5 | 38.5 |
| 灰度差值(即扫描灰度绝对值) | 65535 | 65535 | 49152 | 24576 | 12288 | 6144 | 3072 | 1536 | 768 |
| 第10点 | 第11点 | 第12点 | 第13点 | 第14点 | 第15点 | 第16点 | 第17点 | 第18点 | |
| 各分点阵扫描灰度值的中位值 | 422.5 | 230.5 | 134.5 | 86.5 | 62.5 | 50.5 | 44.5 | 41.5 | 38.5 |
| 本底灰度值 | 38.5 | 38.5 | 38.5 | 38.5 | 38.5 | 38.5 | 38.5 | 38.5 | 38.5 |
| 灰度差值(即扫描灰度绝对值) | 384 | 192 | 96 | 48 | 24 | 12 | 6 | 3 | 0 |
由于第1点和第2点均为65535，达到灰度饱和值，已不符合线性相关系数要求(即R2不小于0.99)，因此去除第1点和第2点的数据；将第3点到第18点作为线性拟合对象，具体以其编号对应的液滴荧光素浓度作为纵坐标，将其对应的扫描灰度绝对值作为横坐标，第3点到第18点的液滴荧光素浓度及其扫描灰度绝对值数据请参见下表2：
表2第3点到第18点的液滴荧光素浓度-扫描灰度绝对值的对应关系
将表2的数据进行线性拟合，得到如图4所示的荧光素浓度灰度曲线，其相关系数R2＝0.99。同时本实施例还通过进一步计算证实，灵敏度符合要求，但CV值不满足要求，具体来说：第3点液滴作为最高荧光素浓度，第18点作为最低荧光素浓度，第一CV分值＝0.03％，第二CV分值＝36.36％，因此，单次扫描图像的CV值＝18.2％，不满足CV值不大于5％的要求，说明生物芯片扫描仪需要进行进一步调整，直至再次校准后确认其满足CV限值要求。
本实施例将有机荧光混合液呈液滴点阵阵列结构分布在固体基质上，液滴点阵阵列结构完全根据生物芯片试剂盒来设计，具体体现为：本实施例中点阵阵列结构采用48或96个分点阵，且各分点阵的结构相同，在对生物芯片扫描仪进行实际校准时，通过生物芯片扫描仪进行灰度值信号扫描并进行线性拟合得到荧光素浓度灰度曲线，根据该曲线可计算出生物扫描仪检测的动态范围；通过信噪比(SNR)的计算，可检测出仪器的最低响应值；通过CV值的计算，可检验仪器本身的系统误差，并依据实际检测数据来对生物芯片扫描仪进行系统调节校正，最终可有效确保生物芯片扫描仪的扫描精确度；同时本实施例提出的荧光校准片的校准操作方法简单，可批量生产，而且生产周期短、成本低；本实施例还进一步优选地设计了专用于波长范围为760-850nm的近红外生物芯片扫描仪的荧光校准片，具体通过Alexa Fluor 790荧光染料、Cy7.5荧光染料、NHS Ester荧光染料作为有机荧光染料的有机荧光混合液作为点样剂，通过大量试验验证后确认其校准结果灵敏且可靠稳定。
对于本领域技术人员而言，显然本发明不限于上述示范性实施例的细节，而且在不背离本发明的精神或基本特征的情况下，能够以其他的具体形式实现本发明。因此，无论从哪一点来看，均应将实施例看作是示范性的，而且是非限制性的，本发明的范围由所附权利要求而不是上述说明限定，因此旨在将落在权利要求的等同要件的含义和范围内的所有变化囊括在本发明内。不应将权利要求中的任何附图标记视为限制所涉及的权利要求。
此外，应当理解，虽然本说明书按照实施方式加以描述，但并非每个实施方式仅包含一个独立的技术方案，说明书的这种叙述方式仅仅是为清楚起见，本领域技术人员应当将说明书作为一个整体，各实施例中的技术方案也可以经适当组合，形成本领域技术人员可以理解的其他实施方式。
Claims (6)
1.一种生物芯片扫描仪的荧光校准片，其特征在于，包括生物芯片试剂盒底座、胶垫、固体基质和有机荧光混合液，所述生物芯片试剂盒底座具有48或96个孔，并且所述生物芯片试剂盒底座设有缺角，
所述固体基质采用硅胶膜片，
所述胶垫具有与生物芯片试剂盒底座一一对应的孔，
所述有机荧光混合液以液滴点阵阵列结构分布在固体基质上，所述有机荧光混合液采用有机荧光染料和稀释液的混合液，
其中，所述点阵阵列结构采用48或96个分点阵，每个分点阵一一对应所述生物芯片试剂盒底座和所述胶垫的48或96个孔，且各分点阵的结构相同，在单个分点阵中，将所述有机荧光混合液点样呈6行×n列或n行×6列状的液滴阵列结构，且n为正整数，其中n的范围为3-6；
单个分点阵中相邻液滴之间的液滴间距均不小于800μm；
所述生物芯片扫描仪为波长范围为760-850nm的近红外生物芯片扫描仪；
所述有机荧光染料采用Alexa Fluor 790荧光染料、Cy7.5荧光染料、800CWNHS Ester荧光染料中的一种或几种的混合；
所述稀释液采用点样抗体缓冲液和牛血清白蛋白的混合液；
所述荧光校准片用于进行如下所示的校准方法：将每个分点阵中的液滴阵列结构按逐行或逐列顺序对液滴进行正整数编号直至作为最后1点的第m点，以靠近所述生物芯片试剂盒底座的缺角的点样液滴作为第1点液滴a1，第m点液滴am采用作为空白对照的稀释液，从第1点到第m-1点的液滴荧光素浓度呈正数倍比例减少，同时各分点阵中相同编号的液滴荧光素浓度均相等，通过生物芯片扫描仪扫描点阵阵列结构中各液滴的扫描灰度值，将各分点阵中第m点液滴的扫描灰度值的中位值作为本底灰度值；将第1点液滴到第m点液滴荧光素浓度作为横坐标或纵坐标，取各分点阵中相同编号液滴的扫描灰度值的中位值与本底灰度值的灰度差值作为该编号的扫描灰度绝对值，将对应编号液滴的扫描灰度绝对值作为纵坐标或横坐标进行线性拟合，其中，在满足相关系数R2不小于0.99的液滴荧光素浓度中，最高荧光素浓度和最低荧光素浓度的比值大于或等于103。
2.根据权利要求1所述的生物芯片扫描仪的荧光校准片，其特征在于，所述n为3。
3.根据权利要求1所述的生物芯片扫描仪的荧光校准片，其特征在于，所述生物芯片试剂盒底座为生物芯片扫描仪检测对象的下底板，所述胶垫采用硅胶或橡胶材质。
4.根据权利要求1所述的生物芯片扫描仪的荧光校准片，其特征在于，基于各分点阵中满足线性拟合相关系数R2＞0.99的最高荧光素浓度对应的扫描灰度值并计算第一CV分值，基于各分点阵中满足线性拟合相关系数R2＞0.99的最低荧光素浓度对应的扫描灰度值并计算第二CV分值，取第一CV分值和第二CV分值的平均值作为单次扫描图像的CV值，所述CV值不大于5％；其中，第一CV分值＝各分点阵中满足线性拟合相关系数R2＞0.99的最高荧光素浓度对应的扫描灰度值的标准偏差值/取各分点阵中满足线性拟合相关系数R2＞0.99的最高荧光素浓度对应的扫描灰度值的平均值，第二CV分值＝各分点阵中满足线性拟合相关系数R2＞0.99的最低荧光素浓度对应的扫描灰度值的标准偏差值/取各分点阵中满足线性拟合相关系数R2＞0.99的最低荧光素浓度对应的扫描灰度值的平均值，用于检验校准扫描精度。
5.一种生物芯片扫描仪的荧光校准片的校准方法，其特征在于，所述校准方法为：
使用如权利要求1所述的生物芯片扫描仪的荧光校准片，将每个分点阵中的液滴阵列结构按逐行或逐列顺序对液滴进行正整数编号直至作为最后1点的第m点，以靠近所述生物芯片试剂盒底座的缺角的点样液滴作为第1点液滴a1，第m点液滴am采用作为空白对照的稀释液，从第1点到第m-1点的液滴荧光素浓度呈正数倍比例减少，同时各分点阵中相同编号的液滴荧光素浓度均相等，通过生物芯片扫描仪扫描点阵阵列结构中各液滴的扫描灰度值，将各分点阵中第m点液滴的扫描灰度值的中位值作为本底灰度值；
将第1点液滴到第m点液滴荧光素浓度作为横坐标或纵坐标，取各分点阵中相同编号液滴的扫描灰度值的中位值与本底灰度值的灰度差值作为该编号的扫描灰度绝对值，将对应编号液滴的扫描灰度绝对值作为纵坐标或横坐标进行线性拟合，其中，在满足相关系数R2不小于0.99的液滴荧光素浓度中，最高荧光素浓度和最低荧光素浓度的比值大于或等于103。
6.如权利要求5所述的校准方法，其特征在于，基于各分点阵中满足线性拟合相关系数R2＞0.99的最高荧光素浓度对应的扫描灰度值并计算第一CV分值，基于各分点阵中满足线性拟合相关系数R2＞0.99的最低荧光素浓度对应的扫描灰度值并计算第二CV分值，取第一CV分值和第二CV分值的平均值作为单次扫描图像的CV值，所述CV值不大于5％；其中，第一CV分值＝各分点阵中满足线性拟合相关系数R2＞0.99的最高荧光素浓度对应的扫描灰度值的标准偏差值/取各分点阵中满足线性拟合相关系数R2＞0.99的最高荧光素浓度对应的扫描灰度值的平均值，第二CV分值＝各分点阵中满足线性拟合相关系数R2＞0.99的最低荧光素浓度对应的扫描灰度值的标准偏差值/取各分点阵中满足线性拟合相关系数R2＞0.99的最低荧光素浓度对应的扫描灰度值的平均值，用于检验校准扫描精度。
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