JPH04271800A - 電気泳動装置 - Google Patents
電気泳動装置Info
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- JPH04271800A JPH04271800A JP3034006A JP3400691A JPH04271800A JP H04271800 A JPH04271800 A JP H04271800A JP 3034006 A JP3034006 A JP 3034006A JP 3400691 A JP3400691 A JP 3400691A JP H04271800 A JPH04271800 A JP H04271800A
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Classifications
-
- G—PHYSICS
- G01—MEASURING; TESTING
- G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
- G01N27/00—Investigating or analysing materials by the use of electric, electrochemical, or magnetic means
- G01N27/26—Investigating or analysing materials by the use of electric, electrochemical, or magnetic means by investigating electrochemical variables; by using electrolysis or electrophoresis
- G01N27/416—Systems
- G01N27/447—Systems using electrophoresis
- G01N27/44756—Apparatus specially adapted therefor
- G01N27/44782—Apparatus specially adapted therefor of a plurality of samples
-
- G—PHYSICS
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- G01N27/416—Systems
- G01N27/447—Systems using electrophoresis
- G01N27/44704—Details; Accessories
- G01N27/44717—Arrangements for investigating the separated zones, e.g. localising zones
- G01N27/44721—Arrangements for investigating the separated zones, e.g. localising zones by optical means
-
- G—PHYSICS
- G01—MEASURING; TESTING
- G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
- G01N35/00—Automatic analysis not limited to methods or materials provided for in any single one of groups G01N1/00 - G01N33/00; Handling materials therefor
- G01N2035/00178—Special arrangements of analysers
- G01N2035/00237—Handling microquantities of analyte, e.g. microvalves, capillary networks
Abstract
(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。
め要約のデータは記録されません。
Description
【０００１】
【産業上の利用分野】本発明は遺伝子、タンパクの検出
およびＤＮＡ塩基配列決定装置に関するものである。
およびＤＮＡ塩基配列決定装置に関するものである。
【０００２】
【従来の技術】ＤＮＡの塩基配列決定にはラジオアイソ
トープ標識が用いられてきた。しかし、その不便さから
蛍光標識を用いる方法が普及してきている（バイオテク
ノロジー（Ｂｉｏ／Ｔｅｃｋｎｏｌｏｇｙ）６，８１６
（１９８８））。これらの方法では励起光源として２０
〜５０ｍｗの４８８ｎｍあるいは５１５ｎｍアルゴンレ
ーザを用いて、１０−１６モル／バンド〜２×１０−１
８モル／バンドのＤＮＡ断片を検出している。蛍光体に
はＦＩＴＣ（ｆｌｕｏｒｅｃｅｉｎｉｓｏｔｈｉｏｃｙ
ａｎａｔｅ，発光極大５１５ｎｍ）、ＳＦ（ｓｕｃｃｉ
ｎｙ／ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｉｎ，発光極大５１０ｎｍ〜
５４０ｎｍ）、ＴＲＩＴＣ（Ｔｅｔｒａｒｈｏｄａｍｉ
ｎｅ ｉｓｏｉｔｈｉｓ ｃｙａｎａｔｅ，発光極大５
８０ｎｍ）、Ｔｅｘａｓ Ｒｅｄ（発光極大６１５ｎｍ
）などが用いられていた。
トープ標識が用いられてきた。しかし、その不便さから
蛍光標識を用いる方法が普及してきている（バイオテク
ノロジー（Ｂｉｏ／Ｔｅｃｋｎｏｌｏｇｙ）６，８１６
（１９８８））。これらの方法では励起光源として２０
〜５０ｍｗの４８８ｎｍあるいは５１５ｎｍアルゴンレ
ーザを用いて、１０−１６モル／バンド〜２×１０−１
８モル／バンドのＤＮＡ断片を検出している。蛍光体に
はＦＩＴＣ（ｆｌｕｏｒｅｃｅｉｎｉｓｏｔｈｉｏｃｙ
ａｎａｔｅ，発光極大５１５ｎｍ）、ＳＦ（ｓｕｃｃｉ
ｎｙ／ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｉｎ，発光極大５１０ｎｍ〜
５４０ｎｍ）、ＴＲＩＴＣ（Ｔｅｔｒａｒｈｏｄａｍｉ
ｎｅ ｉｓｏｉｔｈｉｓ ｃｙａｎａｔｅ，発光極大５
８０ｎｍ）、Ｔｅｘａｓ Ｒｅｄ（発光極大６１５ｎｍ
）などが用いられていた。
【０００３】
【発明が解決しようとする課題】上記従来技術は感度の
点で不十分である上、Ｈｅ−Ｎｅレーザに比べると大き
なＡｒレーザを用いるため装置全体が大きくなる難点が
あった。
点で不十分である上、Ｈｅ−Ｎｅレーザに比べると大き
なＡｒレーザを用いるため装置全体が大きくなる難点が
あった。
【０００４】本発明の目的は上記難点を解消し、小型で
超高感度のＤＮＡ検出を可能とする装置を提供すること
にある。
超高感度のＤＮＡ検出を可能とする装置を提供すること
にある。
【０００５】
【課題を解決するための手段】上記目的を達成するため
に、光源として発光波長５９４ｍのＨｅ−Ｎｅレーザを
採用すると共に高効率受光光学系を採用したものである
。
に、光源として発光波長５９４ｍのＨｅ−Ｎｅレーザを
採用すると共に高効率受光光学系を採用したものである
。
【０００６】ゲル電気泳動中の蛍光標識ＤＮＡ断片の測
定限界は標識蛍光に対する背景光の大きさとそのゆらぎ
の大きさで決定される。ゲルからの背景光は発光波長が
長くなるにつれ漸減する。このため最適波長で励起した
時にゲルからの背景光で規格化した蛍光量はＴｅｘａｓ
Ｒｅｄが一番大きくなる。ＦＩＴＣの場合に比べてＴ
ｅｘａｓＲｅｄは５〜１０倍高感度である。そこで蛍光
標識としてＴｅｘａｓ Ｒｅｄを用い、これの最適励起
波長に近い５９４ｎｍ Ｈｅ−Ｎｅレーザを励起光源と
して用いた。励起光５９４ｎｍは発光極大６１５ｎｍと
近く散乱光除去が課題の１つであったが切れの鋭い蛍光
体フィルターの使用により散乱光を除去した。５９４ｎ
ｍＨｅ−Ｎｅレーザ出力は２．５ｍｗと小さく、大きな
発光量が得られないため、測定光量のゆらぎが検出感度
に大きな影響を与える。そこで、受光系を工夫し、励起
光スキャン方式よりも２桁以上多くの光を受光できる検
出系を用いた。すなわち、励起光をゲル平板の側面から
入射させ、すべての測定領域を同時に照射して全体の発
光量を上げると共に、シリンダーレンズを用いて受光立
体角を大きくした。
定限界は標識蛍光に対する背景光の大きさとそのゆらぎ
の大きさで決定される。ゲルからの背景光は発光波長が
長くなるにつれ漸減する。このため最適波長で励起した
時にゲルからの背景光で規格化した蛍光量はＴｅｘａｓ
Ｒｅｄが一番大きくなる。ＦＩＴＣの場合に比べてＴ
ｅｘａｓＲｅｄは５〜１０倍高感度である。そこで蛍光
標識としてＴｅｘａｓ Ｒｅｄを用い、これの最適励起
波長に近い５９４ｎｍ Ｈｅ−Ｎｅレーザを励起光源と
して用いた。励起光５９４ｎｍは発光極大６１５ｎｍと
近く散乱光除去が課題の１つであったが切れの鋭い蛍光
体フィルターの使用により散乱光を除去した。５９４ｎ
ｍＨｅ−Ｎｅレーザ出力は２．５ｍｗと小さく、大きな
発光量が得られないため、測定光量のゆらぎが検出感度
に大きな影響を与える。そこで、受光系を工夫し、励起
光スキャン方式よりも２桁以上多くの光を受光できる検
出系を用いた。すなわち、励起光をゲル平板の側面から
入射させ、すべての測定領域を同時に照射して全体の発
光量を上げると共に、シリンダーレンズを用いて受光立
体角を大きくした。
【０００７】
【作用】励起光を４８８ｎｍから５９４ｎｍにすること
により、同じ出力のレーザを使用した場合背景光を約１
／５とすることができた。また従来のＡｒレーザ（〜２
０ｍｗ）ではＦＩＴＣが光分解するため、発光量が少な
くなり感度低下の一因となっていたが、２．５ｍｗのＨ
ｅ−Ｎｅレーザ照射では測定中に色素分解はほとんどお
こらないため全体としてＦＩＴＣよりも１桁大きな背景
光比発光強度が得られる。
により、同じ出力のレーザを使用した場合背景光を約１
／５とすることができた。また従来のＡｒレーザ（〜２
０ｍｗ）ではＦＩＴＣが光分解するため、発光量が少な
くなり感度低下の一因となっていたが、２．５ｍｗのＨ
ｅ−Ｎｅレーザ照射では測定中に色素分解はほとんどお
こらないため全体としてＦＩＴＣよりも１桁大きな背景
光比発光強度が得られる。
【０００８】レーザスキャン方式では１００ｍｍの領域
を約０．３ｍｍ径のレーザビームで掃引する。従来の５
０ｍｗのレーザを使用しても各点が照射される平均レー
ザ強度は１７μｗと非常に小さい。２．５ｍｗのレーザ
では約０．９μｗとなりほとんど実用にならない。ここ
で用いた側面入射方式では各点の照射強度は２．５ｍｗ
で十分な発光量が得られる。しかしスキャン方式では受
光効率を２％程度とすることができるが同時照射方式で
は蛍光像を縮小受像するため受光率は０．１％以下に縮
小する。ここで採用したシリンダレンズは受光光量を６
〜９倍とし高効率受光、従って高感度検出を可能とする
。
を約０．３ｍｍ径のレーザビームで掃引する。従来の５
０ｍｗのレーザを使用しても各点が照射される平均レー
ザ強度は１７μｗと非常に小さい。２．５ｍｗのレーザ
では約０．９μｗとなりほとんど実用にならない。ここ
で用いた側面入射方式では各点の照射強度は２．５ｍｗ
で十分な発光量が得られる。しかしスキャン方式では受
光効率を２％程度とすることができるが同時照射方式で
は蛍光像を縮小受像するため受光率は０．１％以下に縮
小する。ここで採用したシリンダレンズは受光光量を６
〜９倍とし高効率受光、従って高感度検出を可能とする
。
【０００９】
【実施例】以下、本発明の一実施例を図１、図２により
説明する。図１は装置の模式図である。５９４ｎｍＨｅ
−Ｎｅレーザ１から出た光は側面から泳動分離ゲル４を
照射する。 線状照射部からでた蛍光はシリンドリカルレンズ７で集
光された後、フィルター６で選別され結像レンズ５によ
りラインセンーあるいは二次検出器上に結像する。アク
リルアミドゲル濃度は４〜６％（ｇ／ｃｃ）で、５９４
ｎｍのＨｅ−Ｎｅレーザで照射した時、ゲルから発する
背景蛍光は２×１０−１１ｍｏｌｅ／ｌのＴｅｘａｓ
Ｒｅｄと同等の強度である。レーザパワーは２．５ｍｗ
で、ビーム径は０．３ｍｍである。照射線上の位置分解
能として０．５ｍｍあれば良い。レーザ光が照射する０
．５ｍｍの長さの領域から出る蛍光の光子数Ｉは下記の
式で求められる。
説明する。図１は装置の模式図である。５９４ｎｍＨｅ
−Ｎｅレーザ１から出た光は側面から泳動分離ゲル４を
照射する。 線状照射部からでた蛍光はシリンドリカルレンズ７で集
光された後、フィルター６で選別され結像レンズ５によ
りラインセンーあるいは二次検出器上に結像する。アク
リルアミドゲル濃度は４〜６％（ｇ／ｃｃ）で、５９４
ｎｍのＨｅ−Ｎｅレーザで照射した時、ゲルから発する
背景蛍光は２×１０−１１ｍｏｌｅ／ｌのＴｅｘａｓ
Ｒｅｄと同等の強度である。レーザパワーは２．５ｍｗ
で、ビーム径は０．３ｍｍである。照射線上の位置分解
能として０．５ｍｍあれば良い。レーザ光が照射する０
．５ｍｍの長さの領域から出る蛍光の光子数Ｉは下記の
式で求められる。
【００１０】
【数１】
【００１１】ここでＩ０は入射光子数、Φは蛍光体の量
子収率、εはモル吸収係数、ｌは光路長、およびＭはモ
ル濃度である。２．５ｍｗのレーザから毎秒放出される
光子数は約１０１６個である。Φ〜０．７、５９４ｎｍ
の光を用いた場合ε〜５×１０４ｃｍ−１［Ｍ］−１，
ｌ〜０．０５ｃｍ、Ｍ〜２×１０−１１ｍｏｌｅ／ｌを
用いてゲルと同等量の蛍光を発するＴｅｘａｓ Ｒｅｄ
からの蛍光数を見積るとＩ〜３×１０７個／秒となる。 ｇｒｅｅｎ Ｈｅ−Ｎｅレーザ（１ｍｗ）を用いた場合
にはゲル背景光は１×１０−１０ｍｏｌｅ／ｌのＴｅｘ
ａｓ Ｒｅｄと同等の光を発し、この光量は１０７個／
秒である。蛍光体としてＦＩＴＣを用い、４８８ｎｍの
Ａｒレーザ（２０ｍｗ）で励起する場合背景光は〜３×
１０−１０ｍｏｌｅ／ｌのＦＩＴＣと同等の光を発する
。この光量は約２×１０８個秒である。
子収率、εはモル吸収係数、ｌは光路長、およびＭはモ
ル濃度である。２．５ｍｗのレーザから毎秒放出される
光子数は約１０１６個である。Φ〜０．７、５９４ｎｍ
の光を用いた場合ε〜５×１０４ｃｍ−１［Ｍ］−１，
ｌ〜０．０５ｃｍ、Ｍ〜２×１０−１１ｍｏｌｅ／ｌを
用いてゲルと同等量の蛍光を発するＴｅｘａｓ Ｒｅｄ
からの蛍光数を見積るとＩ〜３×１０７個／秒となる。 ｇｒｅｅｎ Ｈｅ−Ｎｅレーザ（１ｍｗ）を用いた場合
にはゲル背景光は１×１０−１０ｍｏｌｅ／ｌのＴｅｘ
ａｓ Ｒｅｄと同等の光を発し、この光量は１０７個／
秒である。蛍光体としてＦＩＴＣを用い、４８８ｎｍの
Ａｒレーザ（２０ｍｗ）で励起する場合背景光は〜３×
１０−１０ｍｏｌｅ／ｌのＦＩＴＣと同等の光を発する
。この光量は約２×１０８個秒である。
【００１２】レーザ光を１０ｃｍの領域をスキャンした
時にはデューティサイクルが１００分の０．５となるの
で、長さ０．５ｍｍの領域から放出される平均光子数は
１．５×１０４個／秒である。Ｆ値の大きなレンズを用
いて受光しても、フィルター透過率（〜５０％位）など
を考えると、受光効率は１〜２％、受光面での両子収率
を考えると受光される光子数は１００個／秒以下であり
、スキャニング方式では精度良い測定ができない。一方
本発明の側面入射方式ではデューティサイクルは１．０
であるが縮小画像を検出器上に結像するので受光率は小
さくなり０．０５％程度である。０．５ｍｍの領域から
出る光子数で検出器に入る量は受光面の量子効率および
種々原因による損失をも考慮すると３×１０３／秒程度
である。検出感度は背景光のゆらぎで決定される。統計
的なゆらぎとしては、約±１．７％のゆらぎがあり、高
感度検出をするには更に受光量を上げる必要がある。
時にはデューティサイクルが１００分の０．５となるの
で、長さ０．５ｍｍの領域から放出される平均光子数は
１．５×１０４個／秒である。Ｆ値の大きなレンズを用
いて受光しても、フィルター透過率（〜５０％位）など
を考えると、受光効率は１〜２％、受光面での両子収率
を考えると受光される光子数は１００個／秒以下であり
、スキャニング方式では精度良い測定ができない。一方
本発明の側面入射方式ではデューティサイクルは１．０
であるが縮小画像を検出器上に結像するので受光率は小
さくなり０．０５％程度である。０．５ｍｍの領域から
出る光子数で検出器に入る量は受光面の量子効率および
種々原因による損失をも考慮すると３×１０３／秒程度
である。検出感度は背景光のゆらぎで決定される。統計
的なゆらぎとしては、約±１．７％のゆらぎがあり、高
感度検出をするには更に受光量を上げる必要がある。
【００１３】本発明ではこれを実現するためにシリンド
リカル凸レンズ（ｆ＝２５ｍｍ Ｆ＝１．０）を照射部
から約２５ｍｍ離れた所に設置し、シリンドリカル凹レ
ンズ（ｆ＝−２００ｍｍ）を結像レンズの直前にいれタ
テ方向の像を拡大結像するようにして受光立体角を約６
〜７倍に向上させている。この結果、ゆらぎの大きさを
背景光量の±０．６％程度にすることができ、高感度を
得ることができた。すなわち、この検出系では２×１０
−１３ｍｏｌｅ／ｌのＴｅｘａｓ ＲｅｄがＳ／Ｎ〜１
で検出できる。
リカル凸レンズ（ｆ＝２５ｍｍ Ｆ＝１．０）を照射部
から約２５ｍｍ離れた所に設置し、シリンドリカル凹レ
ンズ（ｆ＝−２００ｍｍ）を結像レンズの直前にいれタ
テ方向の像を拡大結像するようにして受光立体角を約６
〜７倍に向上させている。この結果、ゆらぎの大きさを
背景光量の±０．６％程度にすることができ、高感度を
得ることができた。すなわち、この検出系では２×１０
−１３ｍｏｌｅ／ｌのＴｅｘａｓ ＲｅｄがＳ／Ｎ〜１
で検出できる。
【００１４】図２はλファージの末端をＴｅｘａｓ Ｒ
ｅｄで標識し、酵素切断した断片の電気泳動分離パター
ンである。ＤＮＡバンドの体積は１μｌと推定されるが
、２×１０−１９ｍｏｌｅ注入された試料からの信号を
読むことができる。
ｅｄで標識し、酵素切断した断片の電気泳動分離パター
ンである。ＤＮＡバンドの体積は１μｌと推定されるが
、２×１０−１９ｍｏｌｅ注入された試料からの信号を
読むことができる。
【００１５】
【発明の効果】以上説明したように本発明によれば、ゲ
ル発光の少ない長波長領域に発光帯を持つＴｅｘａｓ
Ｒｅｄあるいはその誘導体をＹｅｌｌｏｗ Ｈｅ−Ｎｅ
レーザで効率良く励起できるので高感度を得ることがで
きる。
ル発光の少ない長波長領域に発光帯を持つＴｅｘａｓ
Ｒｅｄあるいはその誘導体をＹｅｌｌｏｗ Ｈｅ−Ｎｅ
レーザで効率良く励起できるので高感度を得ることがで
きる。
【図１】図１は本発明の一実施例になる装置の概念図で
ある。
ある。
【図２】図２はλファージを制限酵素で切断し、切断部
に蛍光標識を入れて得たＤＮＡ断片スペクトルを示す図
である。
に蛍光標識を入れて得たＤＮＡ断片スペクトルを示す図
である。
１…Ｙｅｌｌｏｗ Ｈｅ−Ｎｅレーザ ６…バンド
パスフィルター ２…反射ミラー ７…シリ
ンドリカル凸レンズ ３…ガラス板 ８…高
感度ラインセンサーあるいは二次元検出器
パスフィルター ２…反射ミラー ７…シリ
ンドリカル凸レンズ ３…ガラス板 ８…高
感度ラインセンサーあるいは二次元検出器
Claims (3)
- 【請求項１】少なくとも電気泳動分離部、励起光源、お
よび光検出部を具備する遺伝子検出装置において、光源
として発光波長５９４ｎｍのＨｅ−Ｎｅレーザを用いる
事を特徴とする遺伝子検出装置。 - 【請求項２】受光部フィルターの透過極大が６１０〜６
４０ｎｍの範囲にあることを特徴とする請求項１記載の
遺伝子検出装置。 - 【請求項３】標識蛍光体としてＴｅｘａｓ Ｒｅｄおよ
びその誘導体を用いる事を特徴とする遺伝子検出方法。
Priority Applications (12)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP3034006A JPH04271800A (ja) | 1991-02-28 | 1991-02-28 | 電気泳動装置 |
| US07/843,232 US5268080A (en) | 1991-02-28 | 1992-02-28 | DNA detector and DNA detection method |
| US08/026,592 US5314602A (en) | 1991-02-28 | 1993-03-05 | DNA detector and DNA detection method |
| US08/372,136 US5516409A (en) | 1991-02-28 | 1995-01-13 | DNA detector and DNA detection method |
| US08/645,706 US5667656A (en) | 1991-02-28 | 1996-05-14 | DNA detector and DNA detection method |
| US08/669,915 US5759374A (en) | 1991-02-28 | 1996-06-25 | DNA detector and DNA detection method |
| US08/931,276 US5964998A (en) | 1991-02-28 | 1997-09-16 | DNA detector and DNA detection method |
| US09/088,849 US5954932A (en) | 1991-02-28 | 1998-06-02 | DNA detector and DNA detection method |
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