JP3985454B2 - 電気泳動装置 - Google Patents
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Description
【発明の属する技術分野】
本発明は生体中の蛋白質、ペプチド、アミノ酸、神経伝達物質、ホルモン、核酸等や、環境、食品、薬品等に含まれる極微量物質の分析に用いられる電気泳動装置に関する。
【0002】
【従来の技術】
平板に流路を形成し、電気泳動分離を行う従来技術として、「Ultra-high-speed DNA fragment separations using microfabricated capillary array electrophoresis chips」(A. T. Woolley et.al,Proc. Natl.,1994,91,11348-11352)に記載のものがある。この装置では、2枚の薄いガラス平板の貼り合せからなり、一方のガラス平板上にはエッチングによって複数の分離用の微細溝が形成されており、貼り合わせることで流路を形成する。各流路は、試料を導入するための試料流路と、それに交差する試料を分離するための分離流路から成る。試料流路及び分離流路の端に溶液溜めとなる穴を設けられている。これらの溶液溜めには電極が差し込まれる。
【0003】
以上の構成で以下のように動作する。まず試料流路の両端の溶液溜めに差し込んだ電極に高電圧を印加して、試料流路から分離流路との流路交差部に試料を導入する。次に分離流路の両端の電極に電圧を印加し、流路交差部分に存在する試料のみを分離流路側に切り出して分離流路内を電気泳動させる。多成分で構成された混合溶液の試料では、成分毎に荷電状況や分離媒体溶液との相互作用が異なることによって生じる電気泳動速度の差を利用して分離が行われる。平板上方からレーザ光を流路に照射する。流路内の試料から励起された光は同軸で平板上方に設置した検知器で検知される。
【0004】
平板上には上記の流路が多数平行に配列されており、レーザ光を走査することで、一度に多数の検査を行うことができるとしている。
【0005】
【発明が解決しようとする課題】
ところで、上記従来技術においては、電気泳動基板に厚さ0.2〜0.3mm程度の非常に薄いガラス平板が用いられている。このため、検出部における光の入射、出射は平板と垂直の方向に限定されている。また、流路はフッ酸のエッチング加工により形成される場合が多い。このため、流路底面は平坦かつ平滑とは言えない状態であった。従って、通常は平板上方から同方向で励起光照射と蛍光検出をしている。このような光学系の制限から散乱光等の背景光や迷光によるSN比が悪化したり、検知精度が低下する問題があった。
さらに、上記従来技術では一度に多数の検査を行うために、同一平板上に流路を多数配列しているが、一つ一つの流路に対して順次レーザ光を走査して照射する必要がある。このため、照射時間が短くなり、試料を十分に励起できずに十分な検出感度が得られない場合がある。また、リアルタイムの蛍光時間変化を検出することができない等の問題がある。さらに、レーザを走査させるためには可動式ミラーの設置、光学系の煩雑化が必要となり、装置が高価、大型化するという課題も生じる。
そこで本発明の第1の目的は、背景光や迷光を少なくして検知精度の良い電気泳動装置を提供することにある。
また本発明の第2の目的は、多数の検体からの試料の容易な高速分析を可能にする電気泳動装置を提供することにある。
【0006】
【課題を解決するための手段】
上記目的を達成するため、本発明は、電気泳動分離用の流路が内部に形成された平板と、前記流路の一部に設けられた検出部位に対して励起光を照射する光照射手段と、前記励起光によって発生する試料からの蛍光を検出する蛍光検出手段とから成る電気泳動装置において、前記流路は矩形の断面を有し、平板面と略平行な上面および底面と左右の側壁面とから成り、前記流路の底面に平滑な第1の入射窓と、第1の入射窓に相対する位置の平板表面において励起光を平板内に導入するための平滑な第2の入射窓と、第1の入射窓と第2の入射窓の間に励起光伝送路を設け、前記流路の側面において試料からの蛍光を出射するための平滑な第1の出射窓と、前記第1の出射窓と相対する位置の平板の側面において蛍光を平板外に出射するための平滑な第2の出射窓と、前記第1の出射窓と前記第2の出射窓の間に蛍光伝送路を設け、前記励起光伝送路と蛍光伝送路中のいずれか、あるいは両方に集光手段を備えたものである。
【0008】
【発明の実施の形態】
図1に本発明の一実施例の、電気泳動装置の流路基板の斜視図を示す。図1において、平板10には、試料流路20と分離流路21及び、溶液溜30、試料溜34等が形成されている。分離流路21の途中には検出部が形成されている。検出部には励起光源900からの光が入射しやすい様に流路下部に入射窓を設けてある。流路側壁側には光が平板側方に出射しやすい様に第1の平滑な出射窓5aと蛍光が平板内、外に漏れることなく側方に伝送するための蛍光伝送路6bを形成する共に、平板の外周側の伝送路出口部にも平滑な第2の出射窓5bを設けてある。第2の出射窓の外側には蛍光検知器910が設置される。
【0009】
上記入射窓は流路を形成している基板下部及び上部側の厚さを他の部分よりも薄くなるように構成したものである。出射窓5aの部分は流路壁近くに空気層が形成されて窓になっており、出射窓5bは他の側壁部分より窪んだ形状としているものである。また、伝送路も両側に空気層が形成された構成としてしてある。なお、出射側に関しては分離流路等を形成する際に、ロッドファイバー等を埋め込む構成としても良い。
【0010】
各溶液溜30および、試料溜34には、試料導入用の第1、第2電極71、72、試料分離用の第3、第4電極73、74が挿入できるように構成されている。また、検出部の入射窓と分離流路21間には励起光集光レンズ41が設けられている。なお本図では流路を形成した平板上方は開放されているが、実際には透明平板からなる上蓋用の基板が設けてある。
【0011】
以上の構成で次のように動作する。溶液溜め30に分離媒体溶液を注入し、試料流路20と分離流路21の2つの流路を満たす。まず、試料溜め34に試料を滴下したのち試料流路20の両端の第1、第2の電極71、72に電圧を印加し、流路内に電界を形成させる。試料の先端が流路交差部21aを超える位置に到達するまで電界を印加して、試料を電気泳動させる。次に、分離流路21両端の第3、第4の電極73、74に電圧を印加して流路交差部21a内に存在する試料を分離流路21内に導入し、試料の分離を開始する。試料は各成分毎に異なる電気泳動速度によって分離しながら、検知部21bに到達する。検知部21bに対して、励起光源900から励起光90を照射する。励起光90によって試料は蛍光91を発光し、蛍光出射窓5a、蛍光伝送路6b、及び蛍光出射窓5bを通って検知器に入射する。励起光源としてはレーザあるは発光ダイオード、ハロゲンランプ等いずれも利用可能である。検知器としては、アレイ状に配置されたフォトセンサで一つ一つの流路からの信号を得る方法や、冷却CCDカメラのように画像素子全体で広い範囲の流路からの蛍光信号を取得する方法等、試料の種類や波長に合わせて選択すればよい。
【0012】
本実施例では、励起光は装置下部から照射し励起光を流路に入射するための入射窓を設けてある。このため、散乱や光発光強度の減衰が発生しにくくなり、流路壁面を通過しても励起光が散乱や光強度の減衰を発生せずに、試料から効率的に蛍光を励起できる。また、試料が発生した蛍光を側方に出射させるため、第1の出射窓と、光伝送路、及び第2の出射窓を設けてある。このため、流路側面での散乱や光発光強度の低下が発生しない。検知器の受光面は装置の側面に設置しているので、検知にノイズとなる励起光が検知器に入射することはなくなり、SN比は向上する。以上の効果により、検知精度は向上する。
【0013】
本実施例では、平板の一部に透明な光伝送路を設けたが、平板全体を透明部材で構成しても良い。透明部材で構成することで平板間の部材自体が光伝送路の役割を持つ。
【0014】
図2を用いて、図1の電気泳動基板の製造方法を説明する。図1の電気泳動基板は、図2に電気泳動基板を形成するための型を示したものである。図2のように型は、毛細流路用の矩形凸型200、蛍光集光レンズ、第1、第2の蛍光出射窓を形成するための凹型400を設けた第1のプレート110、および試料等の溶液溜め形成用の凸型300を備えた第2のプレート120から成る。これらのプレートの形成方法としては、金属を切削加工により形成する方法、また単結晶シリコン板をエッチング加工により形成してもよい。さらに放電加工により平板に凹凸を形成する方法も利用可能である。X線リソグラフィにより深溝形状のレジストを形成させ、それにニッケルをメッキした後、レジストを除去し、出来上がったニッケルの構造体を型として用いても良い。
【0015】
以上の型に熱硬化性の透明エポキシ樹脂あるいはシリコンエラストマ−Polydimethylsiloxaneを塗布し微細構造を転写する。転写した板材と、透明な平板を貼り合わせることで内部に毛細流路を備えた電気泳動用の平板ができる。
【0016】
図3には、ガラスのエッチング加工による流路形状を示す。以上、型を用いることで、流路断面の形状を、図3に示すように、ガラスのエッチング加工による毛細流路のような曲線状ではなく、矩形にすることができる。また光入射窓、蛍光出射窓等の光学部品を一体で形成することが可能となる。従って、励起光、蛍光の曲がり、散乱等による光強度の減衰がなく高精度な分析が達成される。
【0017】
次に、上記型として感光性の樹脂薄膜を利用する場合について説明する。露光とベーキング過程によるフォトリソグラフィ技術を適用して、感光性樹脂薄膜による型を形成し、シリコンエラストマ−Polydimethylsiloxaneを塗布し微細構造を転写して流路を形成する方法がある。しかしながら、一般的には流路側面及び底面の平滑度が良好ではなく光学検知には不十分である。
【0018】
これに対し、本発明者らは加工条件の最適化を図ることで、感光性樹脂による型の側面の平滑度を向上させる条件があることを見出した。
【0019】
図4には、ベーキング過程の時間と温度の条件を示したグラフを示す。露光過程においてはステッパのような縮小露光装置を用いる。本条件を適用することにより、側面は良好な平滑度を有するレジスト構造体を形成することができる。
【0020】
この平滑な側面を持つ感光性樹脂薄膜を型に用い、転写によって形成したシリコンエラストマ−Polydimethylsiloxaneを部材とした流路および平板壁面の光透過性を評価した。その結果、光の減衰や散乱がほとんど発生しないことがわかった。従って、高精度な検知が可能となる。
【0021】
図5に分離流路の検知部周辺を拡大した他の実施例を示す。励起光90に対して分離流路21の下面の平板内に励起光集光レンズ41を設置している。蛍光91に対して、蛍光集光レンズ51、空間フィルター52、グレーティング53を平板内に設置する。これらの光学部分はエポキシ樹脂やPolydimethylsiloxaneのような転写性の良好な高分子材料を透明部材として用いて平板に一体成形する。
【0022】
本実施例では、励起光と蛍光のための光学部品を平板内に形成しているため、光学的アライメントを不要とし、流路側面での散乱や光発光強度の低下が発生しない。以上の効果により、検知精度は向上する。
【0023】
図6に、本発明の他の実施例の、電気泳動の流路基板を示す。本実施例の本電気泳動基板で図1と異なる点は、分離流路の屈曲を利用し試料の分離状態を検出するようにしたものである。すなわち、基板の流れ方向の側方に励起光源を設置し、基板の横方向から励起光90を照射し、分離流路21側方から光を入射させ、分離流路下方(又は上方)に蛍光を出射させて、分離流路途中の複数個所で蛍光を検出するようにしたものである。前記平板10内の分離流路21側面近傍には励起光集光レンズ41、分離流路21下部には蛍光集光レンズ51が設けられている。
以上のような構成において、次のように動作する。励起光90を平板10の側面から照射したとき、分離流路21途中には照射点26a、26b、26c、26dのように、励起光が照射される複数の箇所が発生する。これらの照射点26からの蛍光発光91a、91b、91c、91dを蛍光検知器910上の検知部910a、910b、910c、910dで検知する。励起光源900、蛍光検知器910には先の実施例で示したものを用いればよい。
本実施例では、励起光90は蛍光検知器910には入射しないので迷光や背景光を少なくできるため、検知精度は向上する。また、試料によっては分離流路21の終端付近の照射点26d付近において分離が完了する場合だけではなく、流路交差部付近の照射点26aや照射点26bにおいて既に分離が完了している場合がある。このとき本実施例の構成によれば、各照射点の下の検知部910a等によって分離が終了していることを検知することができ、分析の高速化が可能である。
【0024】
図7に本発明のさらに他の実施例を示す。図7では、図1の電気泳動基板を多段に積層した構成としたものである。すなわち、それぞれの平板10には、試料流路20、分離流路21、溶液溜め30、試料溜め34、励起光集光レンズ41、蛍光集光レンズ51、空間フィルター52、グレーティング53が形成されている。本実施例では3層のみを示したが、3層以上でも良く、また2層でも良い。各平板10を積層して一体構成とした流路組み1000を得る。励起光90は同時に全ての平板内の分離流路21を照射する。3つの溶液溜め30は全ての平板を貫通しもうけられている。最上部溶液溜めから分離溶液を注入して、全ての平板内の試料流路20と分離流路21内に分離媒体溶液を満たすこうせいとしている。各電極線72、73、74を挿入するため穴である。各層の平板10は、分離流路21方向において長さy1からy3、試料流路20方向において長さxの分を残して切り取られている。切り取られている部分のxの長さは各層同じであり、長さxの分だけ蛍光91が平板内を進む長さが異なるので減衰及び散乱が少なくなる。長さy1からy3にかけては順番に長くなっており、各層の試料溜め34は貫通穴ではなく各平板で独立している。すなわち、試料溜めの位置をy方向に平板毎にずらして形成している。なお試料流路20の長さはどの平板と共同じ長さになるように形成してある。本構成とすることによって、試料溜め34には試料の注入および電極線71の差し込みが可能となっている。
【0025】
図8に本発明の電気泳動装置の全体構成を示す。図8において、図7で示した平板を多数積層した装置である平板組み1000を平板台1700上に設置する。多数検体からの試料が溜められたウェル82が多数配置されているタイタープレート81をオートサンプラー2300に設置し、オートサンプラー2300のサンプルノズル2400から各試料を平板組み1000の試料溜め34内に滴下する。電極組み1100から電極線を平板組み1000に挿入する。励起光源900から励起光をミラー1800によって平板組み1000に垂直方向に照射し、各平板内の分離流路からの蛍光を蛍光検知器910にて検知する。
【0026】
本実施例では、複数枚の平板を各平板内の分離流路が重なるように積層することで、1本の励起光が各平板の分離流路を同時に貫通させている。このため、励起光照射時間は長く、試料を十分に励起できる。平板内に励起光集光レンズと蛍光集光レンズを形成しているので、試料を効率的に励起でき、蛍光の減衰や散乱は発生しない。励起光照射と蛍光検知が同時なので、試料のリアルタイムの蛍光時間変化を検出することができる。従って、良好な検出感度が得られる。以上の効果により、多数の検体からの試料を容易かつ高速、高精度に分析することが可能となる。
【0027】
図9に本発明の他の実施例を示す。本実施例は、平板10内に複数の試料流路20と分離流路21をマトリックス状に配置したものである。平板10内の各々の分離流路21側面近傍には励起光集光レンズ41が設けられ、対応する試料からの蛍光を平板外部に導出するための蛍光集光レンズ51が設けられている。
【0028】
以上の構成で次のように動作する。平板10内の全ての試料流路20から全ての分離流路21への電界の切替を同時に行い、試料の分離を同時に開始する。励起光源900から励起光90はハーフミラー列8で光を分けられ、各励起光集光レンズ41を通過して平板10の側面から分離流路21を照射する。試料からの蛍光91は蛍光集光レンズ51を通過して蛍光検知器910上の検知部910eに入射する。
【0029】
本実施例において、1枚の平板内に分離流路を多数配置することで、1本の励起光が複数の流路を同時に貫通させているので、励起光照射時間は長く、試料を十分に励起できる。平板内に励起光集光レンズと蛍光集光レンズを形成しているので、試料を効率的に励起でき、蛍光の減衰や散乱は発生しない。励起光照射と蛍光検知が同時なので、試料のリアルタイムの蛍光時間変化を検出することができる。したがって、良好な検出感度が得られる。以上の効果により、多数の検体からの試料を容易かつ高速、高精度に分析することが可能となる。
【0030】
【発明の効果】
電気泳動分離用の毛細流路が内部に形成された平板と、前記毛細流路の一部に設けられた検出部位に対して励起光を照射する光照射手段と、前記励起光によって発生する試料からの蛍光を検出する蛍光検出手段とから成る電気泳動装置において、
前記毛細流路は矩形の断面を有し、平板面と平行な上面および底面と左右の側壁面とから成り、前記毛細流路の底面において励起光を流路内へ導入するための平滑な第1の入射窓と、第1の入射窓に相対する位置の平板表面において励起光を平板内に導入するための平滑な第2の入射窓と、第1の入射窓と第2の入射窓の間に励起光伝送路を設け、また前記毛細流路の側面において試料からの蛍光を出射するための平滑な第1の出射窓と、前記第1の出射窓と相対する位置の平板の側面において蛍光を平板外に出射するための平滑な第2の出射窓と、前記第1の出射窓と前記第2の出射窓の間に蛍光伝送路を設けることにより、背景光や迷光を少なくして検知精度の良い電気泳動装置を提供できる。
【0031】
また、上記構成からなる平板を、複数枚、各毛細流路が重なるように積層せしめ、1本の励起光が各平板の毛細流路を同時に貫通する位置に光照射手段を設け、各平板の側面の出射窓の延長位置に蛍光検出手段を設けることで、多数の検体からの試料の容易な高速分析を可能にする電気泳動装置を提供できる。
【図面の簡単な説明】
【図1】 本発明の一実施例を示す上方斜視図である。
【図2】 本発明の一実施例を示す上方斜視図である。
【図3】 従来例において分離流路に励起光を照射したときの分離流路の断面図である。
【図4】 本発明における加工方法の一実施例の条件を示す図である。
【図5】 本発明の一実施例を示す上方斜視図である。
【図6】 本発明の一実施例を示す上方斜視図である。
【図7】 本発明の一実施例を示す上方斜視図である。
【図8】 本発明の一実施例を示す上方斜視図である。
【図9】 本発明の一実施例を示す上方斜視図である。
【符号の説明】
10…平板、20…試料流路、21…分離流路、71、72、73、74…電極線、30…溶液溜め、34…試料溜め、4…励起光集光レンズ、5…蛍光集光レンズ、90…励起光、91…蛍光、900…励起光源、910…蛍光検知器
Claims (7)
- 電気泳動分離用の流路が内部に形成された平板と、前記流路の一部に設けられた検出部位に対して励起光を照射する光照射手段と、前記励起光によって発生する試料からの蛍光を検出する蛍光検出手段とから成る電気泳動装置において、
前記流路は矩形の断面を有し、平板面と略平行な上面および底面と左右の側壁面とから成り、前記流路の底面に平滑な第1の入射窓と、第1の入射窓に相対する位置の平板表面において励起光を平板内に導入するための平滑な第2の入射窓と、第1の入射窓と第2の入射窓の間に励起光伝送路を設け、前記流路の側面において試料からの蛍光を出射するための平滑な第1の出射窓と、前記第1の出射窓と相対する位置の平板の側面において蛍光を平板外に出射するための平滑な第2の出射窓と、前記第1の出射窓と前記第2の出射窓の間に蛍光伝送路を設け、前記励起光伝送路と蛍光伝送路中のいずれか、あるいは両方に集光手段を備えたことを特徴とする電気泳動装置。 - 電気泳動分離用の流路が内部に形成された平板と、前記流路の一部に設けられた検出部位に対して励起光を照射する光照射手段と、前記励起光によって発生する試料からの蛍光を検出する蛍光検出手段とから成る電気泳動装置において、
前記流路は矩形の断面を有し、平板面と略平行な上面および底面と左右の側壁面とから成り、前記流路の底面に平滑な第1の入射窓と、第1の入射窓に相対する位置の平板表面において励起光を平板内に導入するための平滑な第2の入射窓と、第1の入射窓と第2の入射窓の間に励起光伝送路を設け、前記流路の側面において試料からの蛍光を出射するための平滑な第1の出射窓と、前記第1の出射窓と相対する位置の平板の側面において蛍光を平板外に出射するための平滑な第2の出射窓と、前記第1の出射窓と前記第2の出射窓の間に蛍光伝送路を設け、前記蛍光伝送路中に分光手段を備えたことを特徴とする電気泳動装置。 - 電気泳動分離用の流路が内部に形成された平板と、前記流路の一部に設けられた検出部位に対して励起光を照射する光照射手段と、前記励起光によって発生する試料からの蛍光を検出する蛍光検出手段とから成る電気泳動装置において、
前記流路は矩形の断面を有し、平板面と略平行な上面および底面と左右の側壁面とから成り、前記流路の底面に平滑な第1の入射窓と、第1の入射窓に相対する位置の平板表面において励起光を平板内に導入するための平滑な第2の入射窓と、第1の入射窓と第2の入射窓の間に励起光伝送路を設け、前記流路の側面において試料からの蛍光を出射するための平滑な第1の出射窓と、前記第1の出射窓と相対する位置の平板の側面において蛍光を平板外に出射するための平滑な第2の出射窓と、前記第1の出射窓と前記第2の出射窓の間に蛍光伝送路を設け、前記蛍光伝送路中に空間フィルターを備えたことを特徴とする電気泳動装置。 - 電気泳動分離用の流路が内部に形成された平板と、前記流路の一部に設けられた検出部位に対して励起光を照射する光照射手段と、前記励起光によって発生する試料からの蛍光を検出する蛍光検出手段とから成る電気泳動装置において、
前記流路は矩形の断面を有し、平板面と略平行な上面および底面と左右の側壁面とから成り、前記流路の底面に平滑な第1の入射窓と、第1の入射窓に相対する位置の平板表面において励起光を平板内に導入するための平滑な第2の入射窓と、第1の入射窓と第2の入射窓の間に励起光伝送路を設け、前記流路の側面において試料からの蛍光を出射するための平滑な第1の出射窓と、前記第1の出射窓と相対する位置の平板の側面において蛍光を平板外に出射するための平滑な第2の出射窓と、前記第1の出射窓と前記第2の出射窓の間に蛍光伝送路を設け、前記平板が、所定の位置に流路形成用の凸型構造および光学手段形成用の凹型構造を備えた転写型板から一括転写成形された第1の平板と、透明な第2の平板とを張り合わせることで形成されることを特徴とする電気泳動装置。 - 請求項4記載の電気泳動装置において、前記転写型板上の凹凸構造体が、感光樹脂膜を光露光、現像することに形成される微細凹凸構造体であるところの電気泳動装置。
- 請求項4記載の電気泳動装置において、前記第1の平板の部材が熱硬化性のシリコン樹脂で形成されている電気泳動装置。
- 請求項1に記載の電気泳動装置において、前記平板内において、複数の流路を同一平面上に形成せしめ、1本の励起光が前記複数の流路を同時に貫通する位置に光照射手段を設け、平板の底面の出射窓の延長位置に蛍光検出手段を設けたことを特徴とする電気泳動装置。
Priority Applications (2)
Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
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