JP4781827B2 - 分析方法および分析装置 - Google Patents

Description

本発明は試料溶液の光学分析を行うための分析装置に関する。

近年、ＤＮＡ、ＲＮＡおよびタンパク質などの生体試料の分析技術が著しく発展している。これら生体試料の検出法としては、蛍光法、吸収法、化学発光法およびラジオアイソトープ法などが挙げられる。このうちでは、検出感度の高さおよび取り扱い易さを兼ね備えた蛍光法が多くの研究者に使用されている。

しかしながら、蛍光法においては、試料が発する蛍光よりも数万倍強い励起光が試料からの蛍光に混入し、検出感度を低下させるという問題がある。したがって、蛍光法において試料からの蛍光を高感度に検出するためには、上記励起光を取り除くことが必要である。

このための手法として、例えば特許文献１には、平板状の基板に形成された流路に、基板面に垂直な方向から励起光を照射し、流路内の試料の蛍光を基板面と平行な方向から検出することにより、励起光の混入を防ぎ、検出感度を向上させたものが開示されている。図１５は、この手法による分析用のチップを用いた蛍光検出の様子を示す図である。

同図に示すように、基板２００には、断面形状が矩形の流路２０２、溶液溜２０３および試料溜２０４等が形成されている。流路２０２の途中には検出部２１０が設けられている。検出部２１０では、励起光源２０５からの励起光が流路２０２に入射しやすいように、流路２０２の下壁に入射窓（図示せず）が形成されている。さらに、検出部２１０における流路２０２の側壁には第１の出射窓２０６ａが形成され、この第１の出射窓２０６ａと基板２００の端面に形成された第２の出射窓２０６ｂとの間における基板２００の内部には、導波路２０７が形成されている。したがって、流路２０２内部の試料が発する蛍光は、第１の出射窓２０６ａ、導波路２０７および第２の出射窓２０６ｂを通り、第２の出射窓２０６ｂに対向して配置された蛍光検出器２０８に入射する。

上記の構成では、検出のための蛍光の取り出し方向は、基板２００への励起光の入射方向に対して垂直方向である。よって基板２００を透過した励起光は、蛍光検出器２０８の方向へ進行しにくくなる。これにより、励起光に起因するバックグラウンド光を減らすことができ、流路２０２中に保持された試料の蛍光の検出感度を向上できるようになっている。
特開２００２−２１４１９４（平成１４年７月３１日公開）

ここで、上記の従来技術に用いられる基板２００中の流路２０２は、矩形の断面形状を有し、基板２００の平面（表面）に平行な底面およびこれに垂直な左右の側面を有する。すなわち、流路２０２の両側面の上端部および下端部にはエッジ部が生じている。したがって、これらエッジ部に励起光が照射された場合、ここから回折光が発せられる。そして、この回折光の進行方向は、エッジの延伸方向すなわち流路の方向に対して垂直な方向となり、蛍光検出器２０８の配置方向と一致する。したがって、上記従来の構成では、観測すべき試料の蛍光と共に上記回折光を受光してしまう。このため、励起光の回折光による影響を充分に低減できず、試料からの発光を感度よく検出することができないという問題点を有している。

本発明は、上記問題点に鑑みなされたものであって、励起光が流路のエッジ部に照射されるような場合であっても、回折光の受光量を充分に低減して、試料からの発光を感度良く検出することができる分析装置の提供を目的としている。

上記課題を解決するために、本発明の分析装置は、試料を保持可能なセルが形成されたセル形成部材の前記セルに対して光を照射する光照射手段と、前記光照射手段からの光照射により前記試料からの発光を検出する光検出手段とを備えた分析装置において、前記光検出手段は前記セルの延伸方向に沿う方向に配置されていることを特徴とする。

また、本発明の分析方法は、試料を保持可能なセルが形成されたセル形成部材の前記セルに対して光を照射し、この光照射による前記試料からの発光を検出する分析方法において、前記試料からの発光の検出を、前記セルからの透過光の光路外であって、前記セルの延伸方向に沿う方向にて行うことを特徴とする。

上記の構成によれば、光検出手段がセルの延伸方向に沿う方向に配置されているので、回折光の受光量を充分に低減して、試料からの発光を感度良く検出することができる。すなわち、セル形成部材のセルがエッジ部を有し、このエッジ部において光照射により回折光が生じた場合、この回折光は前記エッジ部の延伸方向に対して直交する方向を中心に進行し、延伸方向に向かうにしたがって徐々に減衰する。したがって、前記エッジ部において光照射により回折光が生じ易い場合であっても、セルの延伸方向に沿う方向である光検出手段の配置方向には前記回折光が進行せず、光検出手段ではバックグラウンド光の少ない状態で試料からの発光の検出が可能となる。

上記の分析装置において、前記入射光が前記セルを通過する際の前記入射光の幅は、前記セルにおける前記延伸方向と直行する幅を含む幅に設定されている構成としてもよい。

上記の構成によれば、前記入射光は前記入射光が前記セルを通過する際の前記入射光の幅は、前記セルにおける前記延伸方向と直行する幅を含む幅に設定されているので、入射光は、セル内を局所的ではなく全体的に満遍なく照射することができる。したがって、セル内の試料からの発光を確実かつ安定に行わせることができる。

上記の分析装置において、前記入射光は前記セルの外部において焦点を結ぶ収束光であり、焦点を結ぶ前に前記セルを照射する場合は前記セルの出射側面を含む平面上での前記入射光の幅が前記セルの出射面側の幅の0.6倍以上かつ３倍以下であり、焦点を結んだ後に前記セルを照射する場合は前記セルの入射側面を含む平面上での前記入射光の幅が前記セルの入射面側の幅の0.6倍以上かつ３倍以下である構成としても良い。

上記の構成によれば、レンズなどにより収束した入射光をより効率よくセルに照射でき、セル内の試料からの発光をより確実かつ安定に行わせることができる。

上記の分析装置は、前記セル形成部材と前記光ピックアップを相対的に移動させる移動手段をさらに備え、前記セル形成部材には前記入射光の照射位置を案内するための案内溝が形成され、前記光照射手段は、前記セルに光を照射するとともに前記セル形成部材からの反射光を受光する光ピックアップと、前記反射光からの検出信号に基づき、前記案内溝に前記入射光が追従するように前記光ピックアップを制御するトラッキング手段とを備え、前記移動手段は、前記光ピックアップに対して前記セル形成部材を前記案内溝方向に相対的に移動させる構成としても良い。

上記の構成によれば、セル形成部材上の案内溝をピックアップが読み取ることで、セル形成部材のセル上の正確な位置に入射光の焦点を合わせることができるため、セル内の試料に的確に入射光（励起光）を照射することができる。

以上のように、本発明の分析装置は、前記光検出手段が、前記セルの延伸方向に沿う方向に配置されている構成である。

これにより、セル形成部材のセルがエッジ部を有し、このエッジ部において光照射により回折光が生じ易い場合であっても、セルの延伸方向に沿う方向である光検出手段の配置方向には前記回折光が進行しにくく、光検出手段ではバックグラウンド光の少ない状態で試料からの発光の検出が可能となる。したがって、回折光の受光量を充分に低減して、試料からの発光を感度良く検出することができる。

〔実施の形態１〕
本発明の実施の形態を図面に基づいて以下に説明する。なお、以下の説明では、分析装置が電気泳動やクロマトグラフィー等に使用する流路状セルを有する場合について説明する。

図１は、本発明の実施の形態における分析装置２１の要部を示すものであって、分析用基板（セル形成部材）１を流路（セル）２の延伸方向に平行な面で切った断面を含む分析装置２１の説明図である。この分析装置２１は、入射光照射装置（光照射手段）３１および光検出装置４１を備え、分析用基板１を使用して試料の分析を行うものである。なお、同図における分析用基板１は、分析用基板１に形成されている流路２の延伸方向と平行な面で切った縦断面を示している。

図１に示すように、分析用基板１には、断面（上記延伸方向に直行する面で切った断面）が長方形の流路２を有している。具体的には、分析用基板１は基板１４を有し、この基板１４に溝状の流路２が形成されている。基板１４における流路２の形成側の面は、流路の開口面を含め、カバー層１２より覆われている。

入射光照射装置３１は、光源（図示せず）とレンズ３２とを備え、光源が発した光（励起光）をレンズ３２により集光し、その光を分析用基板１に対する入射光３３として、基板平面（カバー層１２の表面）に対する垂直方向から流路２に入射させる。

光検出装置４１は、光学フィルター４２と発光検出器（光検出手段）４３と備える。光学フィルター４２は、入射光３３の波長の光の透過率が低く、試料からの発光３４の波長の光の透過率が高いものである。発光検出器４３は光電変換を行い、検出した入射光に応じた電気信号を出力する。光検出装置４１、すなわち光学フィルター４２および発光検出器４３は、入射光照射装置３１の光源とは反対側であって、入射光３３による基板１４の透過光３５の光路外かつ流路２の延伸方向に沿った位置に配置される例を示している。なお、光検出装置４１は、入射光照射装置３１の光源とは同じ側であって、入射光３３による基板１４の透過光３５の光路外かつ流路２の延伸方向に沿った位置に配置してもかまわない。

上記の構成において、流路２には光励起により蛍光や燐光などの発光３４を放出する試料が保持されている。したがって、この試料は入射光３３により励起されると発光３４を発する。発光３４の一部は、光学フィルター４２を通過後、その後ろに配置された発光検出器４３に到達しここで検出される。

上記のように、本実施の形態の分析装置２１では、光検出装置４１が透過光３５の光路外かつ流路２の延伸方向に沿った位置に配置されているので、感度の良い発光測定が可能である。これは次の理由による。

仮に光検出装置４１が透過光３５の光路内に配置されていた場合は、強い透過光３５の波長成分を光学フィルター４２により完全にカットしきれない場合が多く、試料からの発光３４の検出感度を低下させてしまうこともある。また、透過光３５が光学フィルター４２に入射することで、透過光３５が照射された光学フィルター４２の部位からは自家発光が発せられる恐れがある。自家発光の波長は一般に励起波長よりも長波長であるため、試料の発光３４と区別することは難しく、発光検出感度を下げる原因となる。よって光検出装置４１（発光検出器４３）は可能な限り透過光３５の光路外に配置するのが好ましい。

さて、本願の分析装置２１においては、光検出装置４１が流路２の延伸方向に沿った位置に配置されている点が大きな特徴である。この場合には、光検出装置４１が流路２の延伸方向に垂直な方向の位置に配置にされている場合と比べて、発光検出器４３への回折光や屈折光によるバックグラウンド光の入射量を少なくすることができる。これにより、本願の分析装置２１は、試料からの発光３４を高感度にて測定が可能となる。

次に、図１のように光検出装置４１（発光検出器４３）を配置した分析装置２１の優位性、すなわち分析装置２１における試料の発光の検出感度を向上する上での優位性について、図３（ａ）に示すように、図１とは異なる位置に光検出装置４１（発光検出器４３）を配置した分析装置２２１を用いて説明する。なお、図３（ａ）は図１に示した分析装置の比較例を示すものであって、分析用基板１を流路２の延伸方向に直交する面で切った断面を含む分析装置２２１の説明図、図３（ｂ）は、図３（ａ）における流路２付近の拡大図である。

分析装置２２１では光検出装置４１（発光検出器４３）が流路２の延伸方向に対して垂直な方向に配置されている。分析装置２２１は、この点が分析装置２１と異なり、それ以外のレンズ３２の配置、励起光の入射光３３の分析用基板１への入射法などは図１の構成と同様である。

図３（ｂ）に示すように、分析装置２２１の流路２は延伸方向に垂直な面で切った断面が例えば長方形であり、この断面において４個のエッジ部２ａを有している。これらエッジ部２ａでは、入射光３３が照射されると散乱光や回折光３６が発生しやすい。この散乱光や回折光３６（以後は説明の便宜上、散乱光や回折光３６を回折光３６と記す）はエッジ部２ａ（流路２）の延伸方向に対して垂直な方向を中心に進行する。この点は分析装置２１においても同様である。

分析装置２２１では、光検出装置４１が流路２の延伸方向に対して垂直な方向に配置されているので、エッジ部２ａにおける上記回折光３６の一部が直接光検出装置４１に入射してしまうことになる。したがって、分析装置２２１において、光検出装置４１の発光検出器４３は、試料が発する発光３４だけでなく、回折光３６も受光してしまうので、試料の発光３４の検出感度を充分に高めることができない。

さらに、分析装置２２１では、屈折光３７も試料の発光検出感度を低下させる原因となる。上記屈折光３７は以下のようにして生じる。

入射光３３が流路２に照射されるとき、入射光３３の一部である光３３ａは流路２の側面に照射される。この側面は流路２内の試料と基板材料の界面となっている。一般に、流路２内の試料は水などの溶媒が主成分である。これに対して分析用基板１の基板材料はガラスやプラスチック等から成り、屈折率はガラスやプラスチックの方が大きい。これにより、光３３ａは上記界面で屈折し、流路２の側面に対し垂直な方向に進行する成分を持つ屈折光３７となる。したがって、分析装置２２１のように流路２の延伸方向に対して垂直な方向に発光検出器４３が配置されている場合には、発光検出器４３が透過光３５の光路外に配置されている場合であっても、屈折光３７が発光検出器４３に入射しやすい。このため、屈折光３７によるバックグラウンド光が生じて試料の発光３４の検出感度が低下する。この屈折光３７は、入射光３３の波長、対物レンズ３２の開口数、基板１と流路内の溶媒の屈折率に依存するため、条件によっては発光検出器４３への入射が減る場合もあるが、通常は入射してバックグラウンド光になりやすい。

以上のように、光検出装置４１（発光検出器４３）を流路２の延伸方向に対して垂直な方向に配置した場合には、その位置が透過光３５の光路外であっても、試料からの発光３４の検出感度を充分に高めることができない。

これに対し、本実施の形態の分析装置２１では、光検出装置４１（発光検出器４３）は、流路２の延伸方向に配置されているので、流路２の延伸方向に対して垂直な方向に進む回折光３６や屈折光３７を直接に検出することがない。したがって、これら回折光３６や屈折光３７によるバックグラウンド光を抑制し、試料からの発光３４の検出感度を充分に高めることができる。

図４（ａ）は、分析装置２１の要部の構成を示すものであって、図１（正面図）に対する側面図である。同図において、分析用基板１は流路２の延伸方向に対して垂直な面で切った縦断面を示している。なお、図４（ｂ）は、図４（ａ）における流路２付近の拡大図である。

図４（ａ）に示すように、分析装置２１では、入射光照射装置３１のレンズ３２により集光された入射光３３は、流路２への入射前に焦点３８を作る。その後、入射光３３は、焦点３８から再び広がり、図４（ｂ）に示すように、光束幅３９が流路２の入射側の幅２ｂと等しくなる位置にて流路２に入射するようになっている。

上記の構成によれば、流路２の幅いっぱいに入射光３３が照射される。したがって、流路２内の試料は入射光（励起光）３３により効率よくかつ安定に励起され、信頼性の高い発光分析が可能となる。次に、このような、流路２への入射光３３の入射条件について図５（ａ）〜図５（ｃ）により詳細に説明する。

図５（ａ）には、流路２に対する入射光３３の入射側位置とは反対側位置（入射光３３の出射側位置）に入射光３３の焦点３８が存在する場合を示す。ここでは、焦点３８に向けて収束する入射光３３の光束幅が流路２における入射側とは反対側の幅と等しくなる状態にて入射光３３が流路２に入射している。この場合には、流路２の試料に対して入射光３３が満遍なく照射されるので、試料は入射光３３により効率よくかつ安定に励起される。

図５（ｂ）には、例えば図５（ａ）の状態よりレンズ３２を分析用基板１から遠ざけて行き、流路２内に焦点３８が移動した場合を示す。このように、入射光３３の焦点３８が流路２に近づいて行くと、流路２内の試料の一部に入射光３３が局所的に強く照射されるので、蛍光色素の劣化による蛍光強度の低下が生じる。特に、図５（ｂ）に示すように、焦点３８が流路２内に存在する状態では、焦点３８の付近で入射光３３のエネルギー密度が高くなり、蛍光強度が最も低下する。

図５（ｃ）には、例えば図５（ｂ）の状態よりレンズ３２をさらに分析用基板１から遠ざけて行き、流路２に対する入射光３３の入射側位置に焦点３８が移動した場合を示す。ここでは、入射光３３の光束幅が流路２における入射側の幅と等しくなる状態にて入射光３３が流路２に入射している。この場合には、図５（ａ）の場合と同様、流路２の試料に対して入射光３３が満遍なく照射されるので、試料は入射光３３により効率よくかつ安定に励起される。

図６は、レンズ３２−分析用基板１間の距離と試料からの発光３４の検出強度との関係を測定した結果を示すグラフである。レンズ３２と分析用基板１を近接させた状態から徐々に両者を離していくと、次第に流路２に入射光３３が集中的に照射され始め、Ａにおいて発光３４の検出強度の極大が現れる。さらに両者を遠ざけると、図５（ａ）の位置に達する。この位置を通過すると、流路２内で過度に入射光強度が高くなるために発光３４の検出強度が低下し、流路２の中心である図５（ｂ）の位置に焦点３８が移動し、この位置にて検出強度は極小値Ｂをとる。さらに両者を遠ざけると、図５（ｃ）の位置に達し、再び流路２に満遍なく入射光３３が照射されるようになる。この位置を通過すると、Ｃの位置に発光３４の検出強度の極大が現れる。その後、さらに両者を遠ざけると、流路２内の入射光３３の強度が下がるため、発光３４の検出強度が低下する。

図５（a）における流路２の幅Ｗが１００μｍ、深さＤが３０μｍ、分析用基板１の材料がポリメチルメタクリレート（屈折率１．４９）、レンズ３２の開口数が０．６５、入射側の分析用基板１の表面から流路２の入射側面までの距離Ｌが５０μｍという条件を用いて、図５（ａ）〜図５（ｃ）におけるレンズ３２−分析用基板１間の距離を計算すると、図６に示した（ａ）〜（ｃ）のとおりになる。なお、（ｂ）を０μｍとすると、（ａ）の位置は−７８μｍ、（ｃ）は＋７８μｍとなる。

さて、検出感度が高い範囲を図６に示されたデータから設定すると、以下のとおりとなる。検出感度が高い範囲は図中の（α）と（β）の範囲である。この（α）と（β）の範囲を、極小値を示す（ｂ）からの距離であらわすと、（α）と（β）は共に±５０μｍ〜±２００μｍと言える。まず（α）は、焦点を結ぶ前にセルを照射する場合であり、この（α）の範囲をセルの出射側面を含む平面上での入射光の幅に変換すると、６０μｍ〜３００μｍとなる（基板材料と溶媒間での屈折の効果を見込んだ計算結果である）。この入射光の幅を、セルの出射面側の幅との比で表すと、０．６倍〜３倍となる。次に、（β）は、焦点を結んだ後にセルを照射する場合であり、この（β）の範囲を前記セルの入射側面を含む平面上での入射光の幅に変換すると、同様に６０μｍ〜３００μｍとなり、セルの出射面側の幅との比で表すと、０．６倍〜３倍となる。したがって、入射光の幅と、セルの幅との比が０．６倍〜３倍の範囲となるように設定すれば、バックグラウンド光を抑えた高感度の検出が可能である。

さて、上述したように本実施例では、発光検出器４１は流路（セル）２の延伸方向に沿った位置に配置される。この延伸方向の具体的な範囲は、上記の（α）と（β）の範囲に依存することを以下に示す。図７は、基板１を上方から見た図であり、入射光の入射方向は紙面に直角となる。発光検出器４１は、図中の流路（セル）２の延伸方向に沿った位置に配置される。入射光の中心（焦点の延長上の位置）から、円１０６で示すように入射光は放射状に収束および発散し、流路（セル）２のエッジ１１２’で回折される。流路（セル）２のエッジ１１２’と入射光の外縁（円１０６）が交わる面における入射光の幅（径）が大きいほど、回折光の進行方向は広がる。したがって、回折光を避けて発光検出器４１を配置する範囲は狭くなる。上述の（α）と（β）の範囲で考えると、流路（セル）２のエッジ１１２’と入射光の外縁が交わる面における入射光の幅（径（円１０６））の最大値は３００μｍとなる。このとき、回折光が存在しない範囲を、入射光の中心位置（中心軸）と流路（セル）２の延伸方向とを結ぶ線からの角度で表すと、Sin^-1（±５０μｍ／１５０μｍ）＝±２０度となり、−２０度〜＋２０度の範囲であれば回折光を避けられる。したがって、この範囲に発光検出器４１を配置すれば、回折光の混入をさけてバックグラウンド光の少ない高感度な検出が可能である。つまり、発光検出器４１を配置する範囲は、流路（セル）２の延伸方向に沿った−２０度〜＋２０度の範囲となる。

上記の説明では、断面が長方形のセル（流路２）を分析用基板１が有する場合を例に挙げているが、本発明はセル（流路２）が上記以外の形状であってもよく、セル（流路２）がエッジ部を有するものであれば適用可能である。すなわち、上述のとおり、光検出装置４１を流路などのセルの延伸方向に沿った方向に配置することで、流路などのセルのエッジ部に励起光である入射光が照射されてもバックグラウンド光の少ない高感度の発光測定が可能となる。

また、上記の説明では、励起光である入射光３３を分析用基板１の表面に対し垂直方向から入射させる場合を例示しているが、これに限定されない。すなわち、上記の例では、分析用基板１の表面に対して垂直に入射する入射光３３を対物レンズ３２によって集光しているため、分析用基板１の表面に対して垂直な成分以外に焦点３８に向かって斜めに収束していく成分も含まれている。したがって、入射光３３は分析用基板１の表面に対して垂直なものに限られるわけではなく、それ以外の角度から入射した場合でも、流路の延伸方向に沿った方向に配置することにより、同様に回折光、屈折光によるバックグラウンド光の影響の少ない高感度の発光検出が可能である。

また、流路２は断面が長方形のものを例に挙げて説明したが、これ以外の形状としてもよい。例えば、流路の断面が円形の場合はエッジ部は存在しないが、入射光３３の入射時に、流路２と基板材料との界面において屈折光と反射光が流路の延伸方向に対して垂直方向に放出される。この場合でも、分析装置２１では、光検出装置４１が流路の延伸方向に配置されるため、屈折光や反射光が光検出装置４１に入射されることはなく、バックグラウンド光の少ない高感度な発光測定が可能である。

以上のように、本発明の構成によれば、試料や試薬からの光学的な変化を感度良く検出するための分析装置を提供することができる。

〔実施の形態２〕
本発明の実施の他の形態を図面に基づいて以下に説明する。以下の例では、分析用基板が試料溶液を保持するセルとして電気泳動における流路を備えている。また、分析用基板には、入射光照射装置３１からの入射光３３の照射を案内する案内手段（例えばトラック）が形成され、分析装置２１が上記案内手段を読み取り、分析用基板の流路に保持された試料に入射光３３を自動的かつ的確に照射できるようになっている。ここでは、入射光照射装置３１の光源を含む手段として、ＣＤやＤＶＤ等に使用される光ピックアップを用いる。

図２に示した分析用基板１は、基板１４、基板１４に形成された流路２およびカバー層１２に加えて、反射膜１１、保護層１３、案内手段としての案内溝１５、および微小開口１６を備えている。反射膜１１は、例えば金属膜からなり、基板１４における流路２の形成側の面を覆うように形成されている。保護層１３は例えば誘電体からなり、反射膜１１の上に形成されている。保護層１３は、反射膜１１が金属薄膜からなる場合に、大気から反射膜１１を保護し、反射膜１１の酸化を防止する。保護層１３の一例としては、反射膜１１上に窒化シリコン膜を２０ｎｍ形成したものである。案内溝１５は、入射光照射装置３１の光ピックアップによるトラッキングが可能なように、カバー層１２に形成されている。微小開口１６は、入射光照射装置３１からの入射光３３を流路２に入射できるように、流路２における入射光３３の入射側面の反射膜１１を一部除去することにより形成されている。

図８は、分析装置２１の入射光照射装置３１が備える入射光制御装置５０および光ピックアップ（光照射手段）５１の主要部の構成を示すブロック図である。光ピックアップ５１は、レンズ３２およびこのレンズ３２を駆動するアクチュエータ５１ａ以外に、半導体レーザーやフォトディテクタ、ビームスプリッタなどの光学部品により構成される光学系５１ｂを備えている。入射光制御装置５０は、番地再生回路５２、コントローラ５３（トラッキング手段）、およびサーボ回路５４（トラッキング手段）を備えている。

上記の制御装置５０において、光ピックアップ５１から出射された入射光３３は、レンズ３２によって集光され、分析用基板１へ入射される。この入射光３３は、分析用基板１の案内溝１５または番地情報記録部（図示せず）に照射される。案内溝１５または番地情報記録部からの反射光は再び光ピックアップ５１に戻り、光ピックアップ５１はフォーカス誤差信号・トラック誤差信号５５を出力する。

フォーカス誤差信号・トラック誤差信号５５はサーボ回路５４を介してアクチュエータ５１ａにフィードバックされる。これにより、サーボ回路５４は、案内溝１５または番地情報記録部に入射光が案内されるようにアクチュエータ５１ａを制御する。また、光量検出信号５６は番地再生回路５２に入力され、番地再生回路５２は光量検出信号５６から番地情報５７を検出し、この番地情報５７をコントローラ５３に送る。コントローラ５３では、番地情報５７を確認しながら制御信号５８をサーボ回路５４に出力し、入射光３３を所望の案内溝１５にアクセスさせる処理を行う。これにより、入射光３３を分析用基板１の所望の位置に移動させ、微小開口１６上の流路２に的確に入射させることができる。

なお、案内溝１５の微小開口１６の位置では、直前の案内溝１５でのトラッキング状態が保持される。このためには、微小開口１６を横切る時間がサーボの応答時間（サーボ帯域の逆数に比例）よりも十分に短ければよい。あるいは、微小開口１６を横断するときにサーボ動作を一時的に保持すればよい（ホールド動作）。こうすれば、入射光３３が流路２を横断してもトラッキングが乱されること無く、試料に的確に入射光３３を照射し、その後、再び案内溝１５に到達してトラッキング動作に復帰することができる。

上記の構成において、レンズ３２により集光された入射光３３は、分析用基板１の表面（流路２が形成されている側の面）に対して垂直の方向から微小開口１６を通じて流路２に入射される。流路２には入射光３３により励起され発光３４を放つ試料が保持されている。したがって、流路２の試料に入射光３３が照射されると、試料から発光３４が発散光として発せられる。この発光３４の一部は光検出装置４１に入射し、ここで検出される。光検出装置４１は、前述のように、入射光照射装置３１（光ピックアップ）とは反対側であって、入射光３３による基板１４の透過光３５の光路外かつ流路２の延伸方向に沿った位置に配置されている。

上記の構成によれば、光検出装置４１が入射光３３による基板１４の透過光３５の光路外かつ流路２の延伸方向に沿った位置に配置されているので、前述のように、入射光３３の回折光や屈折光の影響が少なく抑えられ、高感度の発光測定が可能となる。

また、図示はしないが、入射光３３の光束幅と流路２の幅との関係は、図６に示した（α）または（β）の範囲にあり、流路２が満遍なく照射されるため、試料を均一に励起することができ、安定した高感度の発光分析が可能である。

図９には、図２に示した分析用基板１の主要部の構成をディスク状基板すなわち分析用ディスク（セル形成部材）７０に適用し、電気泳動を用いて試料の分析を行う場合について示す。この分析用ディスク７０では電気泳動を使った分析を行うことができる。

分析用ディスク７０には、分析装置のターンテーブルの中心に分析用ディスク７０を固定するための中心穴７１、電気泳動による試料の分析を行う４つの分析用チップ７２、案内溝１５および番地情報記録部７３が形成されている。各分析用チップ７２は、液溜・注入口７４および泳動路（セル）７５を有する。また、塗りつぶし部分は反射膜１１が形成される部位であり、泳動路７５上の反射膜１１の一部には微小開口１６が形成されている。

分析用チップ７２の泳動路７５は、前記流路２に相当するものであり、長い第１泳動路７５ａと短い第２泳動路７５ｂとが十文字に形成されている。この分析用チップ７２の構造は、電気泳動による分析において一般に使われている構造であり、例えば特開２００３−６６００３公報（平成１５年３月５日公開）に分析例と共に開示されている。

第１泳動路７５ａは分析用ディスク７０の径方向に延び、第２泳動路７５ｂは第１泳動路７５ａに直交して延びている。液溜・注入口７４ａ〜７４ｄは、泳動路７５の４個の端部に泳動路７５と連通するように各１個が配置されている。即ち、第２泳動路７５ｂの一端部に液溜・注入口７４ａ、他端部に液溜・注入口７４ｃが配置され、第１泳動路７５ａの一端部に液溜・注入口７４ｂ、他端部に液溜・注入口７４ｄが配置されている。

上記の分析用ディスク７０での分析プロセス（電気泳動プロセス）では、バッファ/ゲル溶液を液溜・注入口７４ｄから注入し、泳動路７５ａと７５ｂに充填させる。次に７４ｂ、７４ｃにもバッファ/ゲル溶液を注入する。その後サンプル溶液を液溜・注入口７４ａに注入する。

サンプル溶液には例えばＤＮＡを使用する。このＤＮＡは末端への蛍光色素導入、またはインターカレーター型蛍光色素との混合等の方法で蛍光標識する必要がある。例えば前述のバッファ/ゲル溶液にインターカレーター型蛍光色素を添加することで、流路をＤＮＡが通過する際に蛍光染色をする方法をとってもよい。

次に、分析装置２１の電源から供給される電極を各液溜・注入口７４ａ〜７４ｄに配置し、それら電極を次のように接続する。まず、液溜・注入口７４ｃに配置した電極を＋電圧電源（数十〜数百ボルト）に接続し、液溜・注入口７４ａ、７４ｂ、７４ｄに配置された電極をグランドに接続する。これにより、液溜・注入口７４ｃに＋電圧（数十〜数百ボルト）が印加され、液溜・注入口７４ａにゼロボルトが印加され、泳動路７５に注入されたサンプル（ＤＮＡ断片：マイナスに帯電）は第２泳動路７５ｂの中を液溜・注入口７４ａ（−電極）から液溜・注入口７４ｃ（＋電極）に向かって泳動する。

次に、泳動させたサンプルが泳動路７５における十文字の交点に到達した後、液溜・注入口７４ｄに配置された電極を＋電圧電源（数十〜数キロボルト）に接続する一方、液溜・注入口７４ａ、７４ｃに配置された電極は液溜・注入口７４ｄに配置された電極の電圧よりも低い電圧を出力する＋電圧電源（数〜数キロボルト）に接続し、液溜・注入口７４ｂに配置された電極をグランドに接続する。これにより、液溜・注入口７４ｄの電極に＋電圧（数十〜数キロボルト）が印加され、液溜・注入口７４ｂの電極にゼロボルトが印加され、泳動路７５に注入されたサンプルは第１泳動路７５ａの中を十文字の交点から液溜・注入口７４ｄに向かって泳動する。このときサンプル（ＤＮＡ）の移動度は、充填されたゲルによる分子ふるい効果のために分子量により異なるので、各分子量断片のフラグメントに分けることができる。このようなマイクロキャピラリにおける電気泳動分析の原理は、上述の特開２００３−６６００３公報に開示されているように良く知られているため、詳細な説明は省略する。

ここで、電気泳動を行った実験例について図１１および図１２を用いて説明する。この場合の実験条件を以下に列記する。

ＤＮＡ試料：Fermentas LIFE SCIENCES社製 GeneRuler DNA Ladder, Low Range（DNA
濃度500 ng/μl）
蛍光試薬：インビトロジェン社 SYTO62
電気泳動用キット試薬：IC-1100形試薬（日立化成） 内部標準DNAおよび泳動ゲル
濃度：(1)ＤＮＡ溶液 10倍希釈したDNA Ladder１μlとキットの内部標準DNA９μｌを
混合
(2)ゲル・蛍光分子溶液 キットの泳動ゲル：SYTO62 20μM＝１００：１（容量
比）
測定基板：ＰＭＭＡ基板（日立化成 ｉ-チップ）
流路サイズ：１００μｍ（幅）×３０μｍ（深さ）
印加電圧：導入時０Ｖ−３００Ｖ、分離時０Ｖ−１３０Ｖ−７５０Ｖ
光源：波長（半導体レーザー）６５５ｎｍ、対物レンズＮＡ０．６、照射光量３ｍＷ
図１１は、測定基板を基板表面上方から見た図であり、説明の便宜上導入ウェルと泳動路のみを描いてある。

〔１〕試料導入時(図１１（ａ）)：試料溶液の導入時は上記(2)ゲル・蛍光分子溶液を導入ウェルＡ〜Ｃのいずれかから注入して、気泡が入らないように泳動路全体に充填する。次に、導入ウェルＤに上記(1)ＤＮＡ溶液を充填し、導入ウェルＡおよびＢをＧＮＤ（０Ｖ）に、ＢおよびＣを３００Ｖに接続する。すると、ＤＮＡは導入ウェルＤから泳動されて泳動路の交点に達する。

〔２〕分離時（図１１（ｂ））：十分に達したら、次は分離を行う。導入ウェルＡをＧＮＤ（０Ｖ）に、ＢとＤを１３０Ｖに、Ｃを７５０Ｖに接続する。すると、ＤＮＡ断片はおのおのの分子量に従って異なる速さで交点から導入ウェルＣへ向かって泳動を行う。その結果、ＤＮＡ断片は分子量毎に帯を作って泳動し、この帯に測定点にて光源からの光ビームを照射し、蛍光を検出する。

図１２は、この測定点において検出された蛍光強度の測定データである。横軸は、検出された時間であり、縦軸は検出強度を電圧で測定したものである。同図のように各ＤＮＡ断片の分子量毎にピークが観測され、たとえば３００ｂｐのＤＮＡ断片は０．７８ｎｇ／μｌの濃度で検出できており、７００ｂｐのＤＮＡ断片は０．２３ｎｇ／μｌの濃度で検出できている。このように、ＤＮＡを高感度で分離検出ができている。なお、図中のｂｐは塩基対の数を表す単位であり、ＤＮＡ断片の分子量に対応する。

図９において、分析用ディスク７０には、上記分析用チップ７２の他に、入射光３３を案内するための案内溝１５と番地情報を記録した番地情報記録部７３とが設けられている。分析用ディスク７０が回転すると、分析装置２１は、分析用ディスク７０の番地情報７３に含まれる半径位置を読み出しながら、分析用ディスク７０の所望の半径位置に入射光３３をアクセスする。したがって、分析装置２１では、一つの分析用チップ７２内の泳動路７５に沿った所望の位置にて試料からの発光３４を検出することができる。

さらに、分析用チップ７２は全部で４つ形成され、それぞれが９０度の角度をおいて配置されている。したがって、隣り合う分析用チップ７２の間には、案内溝１５と番地情報記録部７３とが周方向に並んで形成されることになる。入射光３３は、番地情報記録部７３の番地情報に含まれる分析用チップ７２の番号を読み出しながら、周方向に並ぶ分析用チップ７２にアクセスするため、４つの分析用チップ７２のうちの所望の分析用チップにて試料の分析（発光検出）を行うことができる。このとき、入射光３３が１つのトラック（案内溝１５）を周方向に走査すると、案内溝１５のトラッキング領域→番地情報記録部７３→案内溝１５のトラッキング領域→泳動路７５の順にこれらを繰り返し走査することになる。

分析用ディスク７０を使用する場合の分析装置２１では、光検出装置４１は、光ピックアップ５１からの入射光３３が分析用ディスク７０の微小開口１６から第１泳動路７５ａに入射される状態において、入射光３３による分析用ディスク７０の透過光３５の光路外であって、第１泳動路７５ａの延伸方向に沿った位置に配置される。

図１０は、分析用ディスク７０での入射光３３のトラッキングにおいて、入射光３３が微小開口１６を通り過ぎて、案内溝１５のトラッキング領域に移った状態を示す分析用ディスク７０の縦断面図である。

同図に示すように、入射光３３は光路８１を通って案内溝１５に集光される。この入射光３３は遮光層として機能する反射膜１１によって反射され、反射光８２となってレンズ３２へ戻る。この過程において、入射光３３は、案内溝１５において回折し、反射光８２には回折光の分布が反映されるので、光ピックアップ５１によって入射光３３を案内溝１５に追従させることができる。したがって、案内溝１５を流路２の所望の検出位置を横切るように（だだし、流路２自体には存在しないように）形成しておけば、入射光は案内溝１５の延長上にある流路２の所望の位置を横切り、その位置で試料の蛍光を検出（分析）できる。また、上記のように、入射光３３が流路２を通過する期間においてトラッキング制御は入射光３３が流路２を通過する直前の状態に保持されているので、流路２自体に案内溝１５が存在しなくても、流路２の通過前の案内溝１５ａからその延長上にある案内溝１５ｂへ連続して安定なトラッキングが行われる。なお、上述の例では、案内手段として案内溝１５を例に挙げて説明したが、これに限らずたとえばウォブルピットを案内手段としてもかまわない。

以上のように、本実施の形態においても、光検出装置４１は入射光照射装置３１（光ピックアップ５１）とは反対側であって、流路２（第１泳動路７５ａ）の延伸方向に沿った位置に配置されているので、バックグラウンド光の少ない高感度の発光測定が可能となる。また入射光３３の光束幅と流路２の幅との関係は、実施の形態１の場合と同様であるので、入射光３３により流路２が満遍なく照射される。したがって、入射光３３により流路２内の試料を均一に励起することができ、安定した高感度の発光分析が可能である。

また、分析装置２１は、反射膜１１上に形成された案内溝１５を読み取る光ピックアップ５１を備え、入射光３３を案内溝１５に追従させることができる。したがって、入射光３３は案内溝１５の延長上にある微小開口１６を通じて流路２を正確に照射することができる。これにより、分析装置２１では、試料や試薬からの光学的な変化を感度良く、さらに自動的かつ正確に検出することができる。また、入射光３３の焦点を反射膜１１上に合わせた状態にて入射光３３の光束幅と流路２の入射側面の幅とが等しくなるように分析用基板１を設計しておけば、分析用基板１に対して、複雑な制御を行うことなく、正確かつ効率のよい励起光の入射が可能となる。

上記の例においては、電気泳動における蛍光検出の場合について示したが、分析装置２１の構成は、これに限らずクロマトグラフィーなどの蛍光検出にも応用可能である。また、分析用基板１はディスク形状（分析用ディスク７０）に限らず他の形状であってもよい。また、以上の説明では、試料からの蛍光検出の例を示したが、燐光など、外部光源により励起されて発光を放つ試料を検出するための装置にも適用可能である。

次に、分析用ディスク７０を使用して電気泳動により分析を行う分析装置の電気配線や分析用ディスク７０を駆動する構成について説明する。

図１３は、ディスク分析装置における、分析用ディスク７０の回転機構１２０の一例を示す斜視図である。この例において、分析用ディスク７０には、図１４に示すように、液溜７４ａ〜７４ｄにそれぞれ接続された４本の電源接続配線１２２が分析用ディスク７０の内周部に引き出して形成されている。また、分析用ディスク７０には、分析装置のターンテーブルの中心に分析用ディスク７０を固定するための中心穴７１と、回転角度を固定するための切欠き部１３１が設けられている。

回転機構１３０は、分析用ディスク７０を載置して回転させるターンテーブル１３３とディスク押さえ１３４とを備えている。ターンテーブル１３３は、ディスク中心出し部１３５および回転角度固定具１３６を有し、スピンドルモータ１３７によって回転駆動される。ターンテーブル１３３に載置された分析用ディスク７０は、中心穴７１がディスク中心出し部１３５に嵌合され、ターンテーブル１３３に対する回転が回転角度固定具１３６によって阻止される。即ち、分析用ディスク７０の中心穴７１にディスク中心出し部１３５が入り、切欠き部１３１に回転角度固定具１３６が入ると、分析用ディスク７０は回転中心とターンテーブル１３３に対する回転方向の角度が固定される。これにより、後述するように、分析用ディスク７０の電源接続配線１２２とディスク押さえ１３４の接点１３８とがずれることなく接続される。ターンテーブル１３３の凸状に形成されたディスク中心出し部１３５の周囲には、ディスク押さえ１３４の接点１３８と接続される接点１３９が設けられている。これら接点１３９は分析装置２１の電源と接続されている。

分析用ディスク７０がターンテーブル１３３に載置されると、その分析用ディスク７０の上に固定用のディスク押さえ（スピンドルキャップ）１３４が配される。このディスク押さえ１３４は、一般に良く知られているように、分析用ディスク７０に対して上部から圧力を加えることによって、もしくは磁気力によって、分析用ディスク７０をターンテーブル１３３上に強固に固定するものである。

ディスク押さえ１３４には複数の接点１３８が設けられている。これら各接点１３８は、分析用ディスク７０の各電源接続配線１２２およびターンテーブル１３３の各接点１３９に対応しており、ディスク押さえ１３４の下面から中心穴１４０の内面に向かって延びている。接点１３８におけるディスク押さえ１３４の下面部分は、分析用ディスク７０の電源接続配線１２２と接触する第１接触部１３８ａであり、中心穴１４０の内面に延びた部分は、ターンテーブル１３３のディスク中心出し部１３５における接点１３９と接触する第２接触部１３８ｂである。

分析用ディスク７０上にディスク押さえ１３４が配された場合、分析用ディスク７０の電源接続配線１２２は、ディスク押さえ１３４の接点１３８における第１接触部１３８ａに接続され、ターンテーブル１３４の接点１３９はディスク押さえ１３４の接点１３８における第２接触部１３８ｂに接続される。これにより、分析用ディスク７０の各分析用チップ７２へは電気泳動のための電源を供給することができる。

本発明は上述した各実施形態に限定されるものではなく、請求項に示した範囲で種々の変更が可能であり、異なる実施形態にそれぞれ開示された技術的手段を適宜組み合わせて得られる実施形態についても本発明の技術的範囲に含まれる。

本発明の分析装置は、例えば一方向に延伸されたセルを有する分析用基板を使用し、前記セルに収容された種々の形態の試料からの発光の分析に利用可能である。

図１は、本発明の実施の形態における分析装置の要部を示すものでって、分析用基板を流路の延伸方向に平行な面で切った断面を含む分析装置の説明図である。 図１に示した分析装置の斜視図である。 図３（ａ）は図１に示した分析装置の比較例を示すものであって、分析用基板を流路の延伸方向に平行な面で切った断面を含む分析装置の説明図、図３（ｂ）は図３（ａ）に示した流路付近の拡大図である。 図４（ａ）は、図１に示した分析装置の要部を示すものであって、分析用基板を流路の延伸方向に垂直な面で切った断面を含む分析装置の説明図、図４（ｂ）は、図４（ａ）における流路付近の拡大図である。 図５（ａ）は、図１に示した分析装置において分析用基板の流路に対する入射光の入射側位置とは反対側位置に入射光の焦点が存在する場合を示す説明図、図５（ｂ）は、同分析装置において分析用基板の流路内に入射光の焦点が存在する場合を示す説明図、図５（ｃ）は、同分析装置において分析用基板の流路に対する入射光の入射側位置に入射光の焦点が存在する場合を示す説明図である。 図１に示した分析装置のレンズ−分析用基板間の距離と試料からの発光の検出強度との関係を測定した結果を示すグラフである。 図１に示した発光検出器を配置する領域の説明図である。 本発明の実施の形態における分析装置の入射光照射装置が備える入射光制御装置および光ピックアップの主要部の構成を示すブロック図である。 図２に示した分析用基板の構成を適用した分析用ディスクを示す正面図である。 図９に示した分析用ディスクを使用する分析装置において、入射光が流路を通り過ぎて案内溝のトラッキング領域に移った状態を分析用ディスクの縦断面を用いて示す説明図である。 図１１（ａ）は、本実施の形態の分析装置を使用して行った電気泳動の実験例を示すものであって、基板への試料導入時の状態を示す概略の平面図、図１１（ｂ）は同実験例において同基板における試料の分離時の状態を示す概略の平面図である。 図１１に示した実験において検出された蛍光強度の測定結果を示すグラフである。 図９に示した分析用ディスクを使用する分析装置における、分析用ディスクを装着した状態の回転機構の一例を示す斜視図である。 図１３に示した回転機構に適合する分析用ディスクを示す正面図である。 従来の分析装置を示す斜視図である。

符号の説明

１ 分析用基板（セル形成部材）
２ 流路（セル）
２ａ エッジ部
１１ 反射膜
１２ カバー層
１３ 保護層
１４ 基板
１５ 案内溝
１６ 微小開口
２１ 分析装置
３１ 入射光照射装置（光照射手段）
３２ レンズ
３３ 入射光
３４ 発光
３５ 透過光
３６ 回折光
３７ 屈折光
４１ 光検出装置
４２ 光学フィルター
４３ 発光検出器（光検出手段）
５０ 入射光制御装置
５１ 光ピックアップ（光照射手段）
５２ 番地再生回路
５３ 分析装置
５４ サーボ回路
７０ 分析用ディスク（セル形成部材）
７２ 分析用チップ
７３ 番地情報記録部
74a〜74d 液溜・注入口
７５ 泳動路（セル）
７５ａ 第１泳動路
７５ｂ 第２泳動路

Claims (5)

1. 試料を保持可能な流路を有し、エッジを有する流路セルが形成されたセル形成部材の前記流路セルに対して光を照射する光照射手段と、前記光照射手段からの光照射により前記試料からの発光を検出する光検出手段とを備えた分析装置において、
   前記光検出手段は、前記光照射手段から照射された光の前記セル形成部材からの透過光の光路外の位置に配置されており、
   前記透過光の光路外の位置は、前記流路セルへの前記光照射手段からの入射光の、前記セル形成部材の表面と垂直な光軸と直交する面において、前記入射光の光軸と前記流路セルの延伸方向とを結ぶ線に対する−２０度〜＋２０度の範囲の位置であって、前記エッジでの回折光が存在しない位置であることを特徴とする分析装置。
2. 前記光照射手段からの入射光が前記流路セルを通過する際の前記入射光の幅は、前記流路セルにおける前記流路の延伸方向と直行する幅を含む幅に設定されていることを特徴とする請求項１に記載の分析装置。
3. 前記光照射手段からの入射光は前記流路セルの外部において焦点を結ぶ収束光であり、焦点を結ぶ前に前記流路セルを照射する場合は前記流路セルの出射側面を含む平面上での前記入射光の幅が前記流路セルの前記出射側面の幅の0.6倍以上かつ３倍以下であり、焦点を結んだ後に前記流路セルを照射する場合は前記流路セルの入射側面を含む平面上での前記入射光の幅が前記流路セルの前記入射側面の幅の0.6倍以上かつ３倍以下であることを特徴とする請求項１に記載の分析装置。
4. 前記セル形成部材と光ピックアップとを相対的に移動させる移動手段をさらに備え、
   前記セル形成部材には前記光照射手段からの入射光の照射位置を案内するための案内溝が形成され、
   前記光照射手段は、前記流路セルに光を照射するとともに前記セル形成部材からの反射光を受光する光ピックアップと、前記反射光からの検出信号に基づき、前記案内溝に前記入射光が追従するように前記光ピックアップを制御するトラッキング手段とを備え、
   前記移動手段は、前記光ピックアップに対して前記セル形成部材を前記案内溝方向に相対的に移動させることを特徴とする請求項１に記載の分析装置。
5. 試料を保持可能な流路を有し、エッジを有する流路セルが形成されたセル形成部材の前記流路セルに対して光を照射し、この光照射による前記試料からの発光を検出する分析方法において、
   前記試料からの発光の検出を、前記セル形成部材からの透過光の光路外の位置にて行い、
   前記透過光の光路外の位置は、前記流路セルへの前記光照射による入射光の、前記セル形成部材の表面と垂直な光軸と直交する面において、前記入射光の光軸と前記流路セルの延伸方向とを結ぶ線に対する−２０度〜＋２０度の範囲の位置であって、前記エッジでの回折光が存在しない位置であることを特徴とする分析方法。

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