WO2005088280A1

WO2005088280A1 - 光測定装置及び光測定方法

Info

Publication number: WO2005088280A1
Application number: PCT/JP2005/004566
Authority: WO
Inventors: Yoshiyuki Mitani; Akihiro Namba; Yoshihiro Shimada
Original assignee: Olympus Corporation
Priority date: 2004-03-17
Filing date: 2005-03-15
Publication date: 2005-09-22
Also published as: EP1726940A1; US20070008536A1; JPWO2005088280A1

Abstract

　　光測定装置は、試料槽（８）を含む容器（７）と、前記試料槽に収容された試料からの光を集光するレンズ（５）と、前記レンズを通過した前記試料からの光を検出する光検出器（１３）と、前記光検出器の検知出力に基づいて前記試料槽の位置を検知する位置検知手段（１５）と、前記位置検知手段の検知出力に基づいて前記容器、または前記レンズを設置する位置調整手段（１８，１９）とを備えた。

Description

光測定装置及び光測定方法

技術分野

[0001] 本発明はマイクロプレートに収容した試料を蛍光物質で標識し、その試料に光を照射して、試料力発せられる螢光の強度ゆらぎの相関分光解析 (Fluorescence Correlation Spectroscopy: FCS)、あるいは担体粒子などの微細物質から発せられる蛍光の強度ゆらぎまたは散乱光強度ゆらぎの相関解析などを行なう光測定装置及び光測定方法に関する。

背景技術

[0002] 近年、生物の細胞やたんぱく質の構造、相互作用などを光を用いて調べることが行われている。例えば、たんぱく質などの試料を直接蛍光標識し、マイクロプレートの試料を収容する複数の円形の溝であるゥエル内にレーザ光などの光を照射して蛍光物質を励起し、試料の反応や形態変化などを、蛍光の強度のゆらぎを検出することによつて調べることが行なわれている。この光を用いる測定方法によれば、生きている細胞の内外などで起こるシグナル伝達のようなタンパク質の結合反応などを、高感度な蛍光検出によって精度良く測定することができる。

[0003] ところで、このような測定ではマイクロプレートが広く用いられて、る。これはマイクロプレートを用いれば、一度に多くの試料をほぼ同時に、しかも数十マイクロリットルレベルのわずかなサンプル量で測定を行なえるためである。通常使われて、るマイクロプレートは 127mm X 85mmの大きさで、ゥエル数は 96ある力最近の傾向として、サンプル量の節約やハイスループットを実現するために、ゥエル数が多、マイクロプレートが好んで用いられるようになってきている。し力し、マイクロプレートに多くのゥェルを配置すると 1ゥエル当たりの大きさが小さくなる。 384ゥエルのマイクロプレートでは 1ゥエルの直径は 4. 5mm程度であるのに対し、 1, 536穴のマイクロプレートでは直径 1. 5mm程度と極めて小さくなる。

[0004] このような極めて小さ!/、ゥエルを多数備えたマイクロプレートを試料ステージに保持し、目視などの通常の位置決め方法で光の照射位置の調整を行なう場合、集光レンズとして高倍率の対物レンズを用いると、測定ゥエルに光の照準を精度良く合わせることが難しくなり、位置ずれを起こしてしまう危険性がある。ゥエルごとの測定データを正確に管理するためには位置データと測定領域が一致して、ることが必要であるので、極めて高!、精度でマイクロプレートのゥエルを位置決めする必要がある。

[0005] マイクロプレートの位置決めを行なうための従来技術として、次の 2つの方法が提案されている。

[0006] 特開 2002— 14035号公報に記載された方法は、ゥエルの一部を"位置認識用ゥェル"とし、これらに蛍光物質を注入して、各ゥヱルの位置が目視でゎ力るようにしている。そして、マイクロプレートの全領域を光で照明し、各ゥエル内試料に含まれる蛍光物質カゝら発せられた蛍光を CCDカメラで一括して撮影し、各ゥエル内試料から発せられる蛍光の強度を全ゥエルにっ、て測定して、る。

[0007] また、米国特許第 6, 258, 326号明細書に記載された方法では、マイクロプレートそのものに直接加工を施し、複数の基準溝を配置して、基準溝の座標を光学的に計測して、マイクロプレートの位置決めを行なっている。特にゥエルの数が 1, 536のように多い場合、ゥエルの間に基準溝を複数配置し、位置決めの精度をさらに高めている。

発明の開示

[0008] しかしながら、特開 2002— 14035号公報に記載の方法では、マイクロプレートの位置認識はできる力蛍光標識のために使用されたゥエルは、測定に用いることができず、また測定用の蛍光色素とは別の位置認識のための蛍光色素を特別に準備しなければならないという問題点がある。また特開 2002— 14035号公報に記載の方法では、マイクロプレートを大きな領域で投影しているために、ゥエルの数が 1, 536のように多い場合、画像上、多くのゥエルが狭い領域に密集し、少しでもマイクロプレートが斜めに傾いたりすると、投影像がずれを生じたり、また複数のゥエルの投影像が重なり合ったりすることがある。従ってマイクロプレートの正確な位置決めを行なうことが困難になる。

[0009] 米国特許第 6, 258, 326号明細書に記載の方法では、精度の高いマイクロプレートの位置決めを行なうことができる力特殊に加工されたマイクロプレートを必要としている。また基準溝の構造そのものも複雑なため、加工工程が複雑になる。従って汎用性があるとは言えず、通常市販されて!、るマイクロプレートをそのまま用いることができないという問題がある。

[0010] 本発明は、力かる事情に鑑みてなされたものであって、通常用いられているマイクロプレートを使用し、特別な光学的な手段を新たに設けることなぐマイクロプレートのゥルの位置を簡便に計測することのできる光測定装置及び光測定方法を提供することを目的とする。

[0011] 本発明の 1局面に係る光測定装置は、試料槽を含む容器と、試料槽に収容された試料からの光を集光するレンズと、レンズを通過した試料力ゝらの光を検出する光検出器と、光検出器の検知出力に基づ!/、て試料槽の位置を検知する位置検知手段と、位置検知手段の検知出力に基づいて容器、またはレンズを設置する位置調整手段とを備えた。

[0012] また本発明の 1局面に係る光測定方法は、試料槽を含む容器を保持し、容器からの光をレンズにより集光するとともに、レンズを通過した容器力ゝらの光を光検出器で検出し、光検出器の検知出力に基づ、てレンズの光軸が試料槽を貫通するようにレンズの位置、または容器の位置を移動する。

図面の簡単な説明

[0013] [図 1]本発明の第 1の実施の形態に係る光測定装置の構成を示す図。

[図 2]マイクロプレートと対物レンズとを拡大して示す模式図。

[図 3]各ゥエルの中心点を求める動作を示す図。

[図 4]ゥルの中心点を求める動作を示す図。

[図 5A]検出信号の処理方法を示す図。

[図 5B]検出信号の処理方法を示す図。

[図 6A]ゥルの中心点を求める動作を示す図。

[図 6B]ゥルの中心点を求める動作を示す図。

[図 6C]ゥルの中心点を求める動作を示す図。

[図 6D]ゥルの中心点を求める動作を示す図。

[図 6E]ゥルの中心点を求める動作を示す図。 [図 7]中心位置の座標を求める方法を説明する図。

[図 8]本発明の第 3の実施の形態に係る光測定装置の構成を示す図。

[図 9]本発明の第 4の実施の形態に係る光測定装置の構成を示す図。

[図 10A]マイクロプレートとゥエルの構成を示す図。

[図 10B]マイクロプレートとゥエルの構成を示す図。

[図 11A]ゥルの中心点を求める動作を示す図。

[図 11B]ゥルの中心点を求める動作を示す図。

[図 11C]ゥルの中心点を求める動作を示す図。

[図 11D]ゥルの中心点を求める動作を示す図。

[図 11E]ゥルの中心点を求める動作を示す図。

発明を実施するための最良の形態

[0014] [第 1の実施の形態]

図 1は、本発明の第 1の実施の形態に係る光測定装置の構成を示す図である。本実施の形態に係る光測定装置の基本的な装置構成は共焦点光学顕微鏡をベースとして、る。図 1を参照しつつ光測定装置の構成と動作にっ、て説明する。

[0015] 本実施の形態の光測定装置は、 2種類の光源 la、 lbを備えている。光源 laには、ヘリウムネオン'レーザー（発振出力 2mW、波長： 633nm)を用い、光源 lbには、ァルゴン 'レーザー（発振出力 10mW、波長： 488nm)を用いる。光源 la、光源 lbから発せられたレーザ光は、ミラーによって進行方向が変えられた後、ダイクロイツクミラー 2で 2つのレーザ光の光路が 1つの光路に合成される。 1つにされた光ビームはレンズ 3でビーム直径が拡大した平行光ビームとなって進行し、ダイクロイツクミラー 4で反射されて対物レンズ 5に到達する。

[0016] 対物レンズ 5によって集光された光は試料ステージ 6上に載置され、固定されたマイクロプレート 7のゥエル 8内に照射される。ゥエル 8内の試料に、対物レンズ 5で集光した領域 (共焦点領域と言う）が照射されるように、マイクロプレート 7の水平位置は、試料ステージ χγ軸駆動機構 18が試料ステージ 6を駆動して調整し、マイクロプレート 7 の垂直位置は対物レンズ Z軸調整機構 17が対物レンズ 5を駆動して調整する。なお、試料ステージ 6によってマイクロプレート 7が駆動される平面を XY平面といい、対物レンズ Z軸調整機構 17によって対物レンズ 5が駆動される軸を Z軸という。 Z軸は、 XY 平面に垂直な軸である。

[0017] マイクロプレート 7は、一般的に用いられている種類の榭脂、及びガラスを材料として構成されている。マイクロプレート 7には、図 1に示すように、ゥエル 8が多数配設されている。なお、図示しないが、各ゥエル 8の底面はガラスなどの可視光を透過する素材で作成された窓となって、る。

[0018] 図 2は、マイクロプレート 7とその下方に配設された対物レンズ 5とを拡大して示す模式図である。対物レンズ 5はゥエル 8の底面と対畤するように構成されて、る。

[0019] 対物レンズ 5には、例えば X 40水浸対物レンズ（NAO. 9)を用い、マイクロプレート 7の底面と対物レンズ 5の先端部の間を液浸水で満たして、る。本実施の形態では、レーザ光の集光位置は水平方向（X— Y軸）についてはゥエル 8の中央部分、垂直方向（Z軸）につ!/、てはゥエル 8の底面の上壁位置から 100 μ m上方となって!/、る。そして、ゥエル 8内の共焦点領域の大きさと形状は、直径 0. 程度、長さ 2 m程度の略円筒状である。

[0020] 対物レンズ 5で集光されたレーザ光は試料内の蛍光分子を励起し、この蛍光分子力も蛍光が発生する。発生した蛍光は再び対物レンズ 5、続いてダイクロイツクミラー 4を通過して、ノリア ·フィルタ 9に入射する。

[0021] ダイクロイツクミラー 4はガラス製の平板の片面に多層膜コーティングを施して、透過、反射のスペクトル特性が最適になるように製作されている。なお、ダイクロイツクミラ一 4としては平板形状のみでなくプリズム形状のものを用いても良い。

[0022] バリアフィルタ 9は円板状で、蛍光の発光スペクトルに合わせた透過特性を有している。即ち、信号光となる蛍光の波長域の光のみを通過する。これにより、試料容器内で発生する散乱光ゃゥエル 8の壁など力反射して入射光路に戻ってくるノイズ光をカットすることができる。ノックグラウンド光であるノイズ光の波長は蛍光の波長と異なるため遮断されるからである。

[0023] ノリアフィルタ 9を通過した信号光はレンズ 10を通過し、集束光となってミラー 11で反射され、レンズ 10の後方に配置されたピンホール 12のピンホール面に集光される。すなわちレンズ 10の焦点面にピンホール 12の開口面が一致している。ピンホール 12の直径は可変である。ピンホール 12により、ゥエル 8内に形成された光の共焦点領域外からのバックグラウンド光が除去される。

[0024] ピンホール 12の後方近傍には光検出器 13が配置されている。光検出器 13で受光する信号光は微弱光であり、フオトン'パルスとなっている。そのため光検出器 13には、例えばアバランシェ 'フォトダイオード (APD)、あるいは光電子増倍管などの微弱光検出器を用いる。光検出器 13によって、信号光は電気信号である光電流パルスに変換される。変換された電気信号は、信号処理装置 14に入り、増幅され、波形整形されて、 ONZOFF電圧パルスとなって、コンピュータ 15に導かれる。

[0025] この電圧パルス信号はコンピュータ 15のメモリ（不図示）にデータとして記憶され、続いてこのデータに基づいて相関解析などの演算が行なわれる。そして、蛍光の強度はもとより、蛍光の寿命や、得られた蛍光の強度ゆらぎの自己相関関数、あるいは相互相関関数などの解析結果がコンピュータ 15の画面上に提示される。

[0026] さらに、コンピュータ 15は、光測定装置の各部を統括して制御して、マイクロプレート 7のゥエル 8の底面の中心座標を測定し、その測定値に基づ!/、て試料ステージ XY 軸駆動機構 18を作動させて光源力も発せられた光がゥエル 8の底面の中心位置に照射されるようにマイクロプレート 7を移動させる。

[0027] なお、本実施の形態では、蛍光物質としてローダミン.グリーン (Rhodamine Gree n： RhG)とサイファイヴ (Cy5)とを用いて、る。

[0028] ローダミン.グリーンは吸収のピーク波長が 490nm付近にあり、発光波長は 530nm 付近にピークを持っている。従ってアルゴンレーザーでローダミン'グリーンを励起する。またサイファイヴ (Cy5)は吸収のピーク波長が 640nm付近にあり、発光波長は 6 70nm付近にピークを持っている。従って、ヘリウムネオンレーザーでサイファイヴを励起する。

[0029] 次に第 1の実施の形態に係るマイクロプレート 7のゥエル 8の中心位置の位置決めを行なう方法について説明する。

[0030] 手順 1：マイクロプレート 7内で基準とするゥエル 8をあらかじめ決定する。例えば、図

3に示すマイクロプレート 7の最左上隅のゥエル 8を基準とするゥエル 8とし、そのゥェル 8の中心座標を (X , y )とする。 [0031] 手順 2：まず試料ステージ XY軸駆動機構 18を作動して保持された試料ステージ 6 を ΧΥ平面内で移動し、レーザ光のスポットを最左上隅の基準となるゥエル 8の外側である壁面上表面に配置させる。このときレーザ光のスポットは図 4に示すように、ゥェル 8の上端付近の位置 Ρとなる。

[0032] 手順 3 :次に、図 4に示すように試料ステージ^ y軸に沿う軌跡 R1上を移動させ、このときマイクロプレート 7のゥエル 8から生ずる光の強度であるカウントレートを読み込む。

[0033] 光検出器 13による検出信号は、図 5Aに示すように光の強度であるカウントレート信号にノイズが重畳した信号となっている。この検出信号に対して閾値を定め、波形整形して図 5Bに示す ONZOFFデジタル信号に変換する。

[0034] 手順 4：得られた ONZOFFデジタル信号の矩形形状の中心の y座標を計算により求める。

[0035] 手順 5 :続いて、図 4に示すように試料ステージを X軸に沿う軌跡 R2上を移動させ、このときマイクロプレート 7のゥエル 8力生ずる光の強度であるカウントレートを読み込む。そして、手順 3で説明した信号処理を行って ONZOFFデジタル信号を得る。

[0036] 手順 6 :得られた ONZOFFデジタル信号の矩形形状の中心の X座標を計算により求める。

[0037] 以上の手順によって、 1つのゥエル 8の中心点の座標がわかれば、試料ステージ 6 を移動させることで各ゥエル 8の中心点を求めることができる。

[0038] 例えば、図 3に示すように、中心点の y座標を一定にして、 X軸に沿って試料ステージ 6を移動して検出出力を時間と共に記録し、ゥエル 8の境界壁面の X座標を検出する。最初にゥエル 8壁面力得られた信号の X座標を X、次にゥヱル 8壁面力得られた信号の X座標を Xとする。以下、順次 X座標を決めていく。そして、以下の式（1)に

2

より n番目のゥエル 8の中心点の X座標（X )を求めることができる。

[0039] X =X + (X — X ) /2 …式（1)

n 2n-l 2n 2n— 1

X：第 1のゥエル 8の壁面左端の X座標

X：第 1のゥエル 8の壁面右端の X座標 X ：第 nのゥヱル 8の壁面左端の X座標

2n-l

X ：第 nのゥヱル 8の壁面右端の X座標

2n

同様にして、中心点の X座標を一定にして、 y軸に沿って試料ステージ 6を移動して、以下の式（2)により n番目のゥエル 8の中心点の y座標（y )を求めることができる。

[0040] y =Y + (Υ — Υ ) /2 …式（2)

η 2η— 1 2η 2η— 1

Υ：第 1のゥエル 8の壁面左端の Υ座標

Υ：第 1のゥエル 8の壁面右端の Υ座標

2

Υ ：第 ηのゥヱル 8の壁面左端の Υ座標

2η— 1

Υ ：第 ηのゥエル 8の壁面右端の Υ座標

2η

このように試料ステージ 6を移動させることでマイクロプレート 7の全ゥエル 8の底面の中心点を求めることができる。そして、各ゥエル 8を測定する際には、求めたゥエル 8 の中心位置情報に基づいて、当該ゥエル 8の底面の中心にレーザ光のスポットが位置するように、試料ステージ 6を移動させることで精度の良い位置決めを行うことができる。

[0041] [第 2の実施の形態]

本発明に係る第 2の実施の形態の光測定装置は、装置の構成は第 1の実施の形態と同一であるが、ゥエル 8の中心座標を求める手順のみが第 1の実施の形態と異なつている。従って、第 1の実施の形態と同一の部位には同一の符号を付して、その詳細の説明を省略する。

[0042] 次に第 2の実施の形態に係るマイクロプレート 7のゥエル 8の中心位置の位置決めを行なう方法について説明する。

[0043] 手順 1：マイクロプレート 7内で基準とするゥエル 8をあら力じめ決定する。例えば、第

3図に示すマイクロプレート 7の最左上隅のゥエル 8を基準とするゥエル 8とし、そのゥエル 8の中心座標を (X , y )とする。

[0044] 手順 2：まず試料ステージ XY軸駆動機構 18を作動して保持された試料ステージ 6 を XY平面内で移動し、レーザ光のスポットを最左上隅の基準とするゥエル 8の外側である壁面上表面に配置させる。このときレーザ光のスポットは図 6Aに示すように、ゥェル 8の上端付近の位置 Pとなる。

[0045] 手順 3 :次に、図 6Aに示すように試料ステージ 6を X軸に沿って移動する。このときマイクロプレート 7のゥヱル 8から生ずる光の強度であるカウントレートを読み込む。

[0046] 光検出器 13による検出信号は、図 5Aに示すように光の強度であるカウントレート信号にノイズが重畳した信号となっている。この検出信号に対して閾値を定め、波形整形して図 5Bに示す ONZOFFデジタル信号に変換して検出信号を得る。

[0047] 手順 4 :試料ステージ 6を y軸に沿って所定量だけ移動して y座標を変更し、手順 3 を実行して検出信号 1を得る。

[0048] 手順 5 :図 6B—図 6Eに示すように手順 3と手順 4を繰り返して実行して検出信号 2

— 5を得る ₀

[0049] 手順 6 :検出信号 1一 5を比較し、矩形形状の幅が最も大きい検出信号 3を出力する y軸の値がゥエル 8の中心位置を与える y座標 (y )となる。

[0050] 手順 7 :手順 2—手順 6を試料ステージ 6を y軸に沿って移動して繰り返す。そしてゥエル 8の中心位置を与える X座標（X )を求める。

[0051] このようにして、 1つのゥヱル 8の中心点の座標が求められた後は、第 1の実施の形態と同様にして、試料ステージ 6を移動させることでマイクロプレート 7の全ゥエル 8の中心点を求めることができる。

[0052] [第 2の実施の形態のバリエーション]

各ゥエル 8の境界壁面の最大幅位置での X, y座標の検出方法は図 6A—図 6Eに示す方法に限られない。例えば検出信号 1が得られた後、一定の移動量 Hだけ y軸に沿って試料ステージ 6を移動し、その位置力も X軸に沿って試料ステージ 6を移動して検出信号 5を得る。次に、図 7に示す幾何学的な関係に基づいて、中心位置 Oの座標を計算により求め、これをゥエル 8の境界壁面の最大幅位置での y座標としても良い。

[0053] なお、基本的に各ゥエル 8の直径は同じで、各ゥエル 8のマイクロプレート 7上での配置も等間隔になっているので、マイクロプレート 7上の全てのゥエル 8について中心点の座標を求めることをしなくても、代表する複数のゥエル 8、例えば四隅のゥエル 8についてはそれぞれ中心点の座標を求め、その他のゥエル 8について中心点の座標を計算により求めても良い。

[0054] あるいは一番端の横一列、縦一列のゥル 8の中心点の座標を求め、これからゥェル 8全部の中心点の座標を計算により求め、試料ステージ 6による位置決めを行なつても良い。もしマイクロプレート 7が斜めに傾いていたとしても、少なくとも 2つのゥエル 8の中心点の座標が分かれば、傾き具合を算出することができるので、それを考慮したゥエル 8位置の決定もできる。

[0055] なお、以上説明した各ゥエル 8の中心点の測定と、その測定値に基く試料ステージ 6の駆動制御はコンピュータ 15が光測定装置の各部を協働して制御することで実現することができる。

[0056] 即ち、コンピュータ 15は、光測定装置の各部を統括して制御して、マイクロプレート 7のゥエル 8の底面の中心座標を測定し、その測定値に基づ!/、て試料ステージ XY軸駆動機構 18を作動させて光源力も発せられた光がゥエル 8の底面の中心位置に照射されるようにマイクロプレート 7を移動させる。

[0057] [第 3の実施の形態]

図 8は、本発明の第 3の実施の形態に係る光測定装置の構成を示す図である。第 3 の実施の形態の基本的な構成としては、光源を必要としなヽ点以外は図 1に示す第 1の実施の形態の構成と同様であるので、同一の部位には同一の符号を付して、詳細な説明は省略する。

[0058] 対物レンズ 5には対物レンズ平面移動機構 19が接続されており、ステッピングモーターによる駆動をコンピューター（不図示）によりコントロールして、ゥエル 8の位置と対物レンズ 5の光軸を合わせる。対物レンズ平面移動機構 19の調整範囲は数 10 m 以下と微量であり、ゥエル位置の最終調整として実施する。ここで対物レンズ平面移動機構 19は、ステッピングモーターに限らず、超音波モーターを用いて駆動しても良い。

[0059] 本実施の形態ではマイクロプレート本体の榭脂から発せられる螢光を測定信号とする。図 10Aに示すようにマイクロプレート 7のゥエル 8の壁は榭脂でできており、底面はガラス板が接着された構造になって、る。マイクロプレート本体の榭脂部分はモールド成型されたモールド部材で構成されて、る。材料としては例えばポリカーボネイト、ポリスチレン、あるいはアクリルなどを用いることができる。少なくともマイクロプレート本体の壁部分にこれらの榭脂を用いると榭脂部分力螢光が発せられる。ただしこの場合、ゥエル部分は光学的に透明で、無螢光なガラス板を用い、マイクロプレート本体の榭脂部分に接着されている。なお、図 10Bに示すようにマイクロプレート 7を、マイク口プレート本体の榭脂部分と底面を構成する無螢光なガラス板とを嵌合によって製作しても良い。

[0060] 測定の手順を図 11 A—図 11Eを参照しつつ説明する。まず、試料をゥエル内に収容しな、状態でマイクロプレート 7を試料ステージ 6に設置する。試料ステージ 6を y 軸に沿って微小量移動する。このとき、レーザのスポットである点 Pは矢印で示す軌跡を描く。このとき、基本的にゥエル部分力も螢光は得られず、マイクロプレート本体の少なくとも壁部分から螢光が発せられる。この検出信号に基づいて、図 6A—図 6E に示す第 2の実施の形態と同様にゥエル 8の中心位置を決定する。 X軸方向についても、 y軸方向にっ、て行なったと同様に実施すればょ、。

[0061] 次に対物レンズ移動機構 19の電源を onし、壁部分力もの螢光信号を検知しながら、対物レンズの xy平面上での最適位置を決定し、対物レンズ 5を必要量移動させる。ゥエル 8の中心位置決定後、試料をゥエル 8に注入し、試料からの発光を検出する。本実施の形態ではマイクロプレート本体の榭脂から発せられる螢光を測定信号とするために、ゥエル内に試料が収容されていても、いなくても良い。

[0062] ゥエル内に試料が収容されてヽる場合で、試料からの発光の光強度が大き、場合は、ゥエル部分と対物レンズが向き合ったときに光検出器の出力信号力マイクロプレート本体の榭脂から発せられる螢光に比べて大きくなる。従って、光検出器の検知出力は、図 11A—図 11Eに示す信号と on— offの状態が逆転する。一方、ゥエル内に試料が収容されて、て、試料力発せられる螢光の光強度がマイクロプレート本体の榭脂から発せられる螢光に比べて小さい場合は、ゥエル部分と対物レンズが向き合ったときの光検出器の出力信号は図 11A—図 11Eと同様になる。

[0063] 化学発光、生物発光などの発光現象を測定するときも図 8の装置を用いる。ゥエルの位置決定法は、図 6A—図 6Eに示す第 2の実施の形態とほぼ同様で、ゥエル 8からの試料による発光を検出して決定する。 [0064] ここで例えば主要な癌マーカーであるアルファ'フエトプロテイン (AFP)の酵素免疫測定を図 8の装置を用いて行なう場合について説明する。まず、直径 1一 lO /z m程度のガラス微粒子に抗 AFP抗体を感作し、酵素アルカリフォスファターゼで標識し、緩衝液中に懸濁してゥエル内に収容する。これに血液などの検体を加え、室温で抗原抗体反応を起こさせる。そして反応に関与しなカゝつたガラス微粒子を洗浄により除去し、残りの溶液に化学発光基質 AMPPD (2—ジォキセタン 2ナトリウム塩)を加える。このとき AMPPDが酵素アルカリフォスファターゼと反応し、化学発光が生じる。この化学発光の発光強度を光検出器により測定し、検体中の AFP濃度を定量することができる。

[0065] [第 4の実施の形態]

図 9は、本発明の第 4の実施の形態に係る光測定装置の構成を示す図である。第 4 の実施の形態ではマイクロプレート本体の榭脂部分にレーザー光を照射し、この榭脂部分力発せられる螢光を測定してゥエルの位置検出を行なう。第 4の実施の形態の基本的な構成は光源が 1つである点を除いて第 1の実施の形態と同様であるので、同一の部位には同一の符号を付して、詳細な説明は省略する。

[0066] 光源として出力 50mW、波長 325nmのヘリウムカドミウム 'レーザーを用いる。光源としては第 1の実施の形態と同様に波長 488nmのアルゴンレーザー、あるいは波長 633nmのヘリウムネオン'レーザーを用いても良!、が、波長 325nmのヘリウムカドミゥム ·レーザーを用いれば、マイクロプレート本体を構成する榭脂の吸収波長に近!ヽので、さらに高い螢光強度を得ることができる。

[0067] 光源 lcから発した光をミラーで 2回反射させた後、レンズ 3に導いて、コリメート光とする。このコリメート光をダイクロイツクミラー 4で反射させて対物レンズ 5に導き、マイク口プレート 7に集光させる。

[0068] 測定の手順を図 11 A—図 11Eを参照しつつ説明する。まず、試料をゥエル 8に入れない状態でマイクロプレート 7を試料ステージ 6に設置する。光源 lcからの光を対物レンズ 5を通してマイクロプレート本体に照射する。試料ステージ 6を y軸に沿って微小量移動する。このとき、レーザのスポットである点 Pは矢印で示す軌跡を描く。このとき、基本的にゥル部分力も螢光は得られず、マイクロプレート本体の少なくとも壁部分から螢光が発せられる。この検出信号に基づいて、図 6A—図 6Eに示す第 2 の実施の形態と同様にゥエル 8の中心位置を決定する。 X軸方向についても、 y軸方向につ、て行なったと同様に実施すればょ、。

[0069] 次に対物レンズ移動機構 19の電源を onし、対物レンズ 5の xy平面上での最適位置を決定し、対物レンズ 5を必要量移動させる。ゥエル 8の最適位置決定後、試料をゥエル 8に注入し、試料からの発光を検出する。本実施の形態ではマイクロプレート本体の榭脂から発せられる螢光を測定信号とするために、ゥエル内に試料が収容されていても、いなくても良い。

[0070] なお、本実施の形態では丸い形状のゥエル 8を有するマイクロプレート 7について述ベたが、これ〖こ限ることなく、例えば矩形のゥエル 8を有するマイクロプレート 7についても同様な操作により、ゥエル 8の中心位置を決定することができる。また、ゥエルの数力 S96に限ることなぐ 384ゥエルのものなどを用いることができる。

[0071] また、化学発光や生物発光についても同様に測定を行なうことができる。

[0072] [本実施の形態の効果]

以上説明した実施の形態では通常市販されているマイクロプレート 7をそのまま用いて、光学的にマイクロプレート 7のゥエル 8の位置を計測し、その XY平面上の中心位置を求めて、試料の測定を行なうための光のスポット位置を正確に位置決めする。またこの際、マイクロプレート 7のゥエル 8の位置を計測するための光学的な手段を特別に配置するのではなぐ試料を測定するための光学系を位置測定にそのまま用いているので、簡便である。

[0073] また、ゥエル 8の位置を確実に把握するための基準点の算出にマイクロプレート 7を用いるが、試料が入っているゥエル 8でも、通常用いられる蛍光物質のみが入ったゥエル 8でも良い。従って、特別な試薬を必要とせず、かつマイクロプレート 7のゥエル 8 の無駄遣いも無い。

[0074] また、通常測定時では基準点を一点決めれば他のゥエル 8の中心点の座標も決定できるが、もし仮にマイクロプレート 7が斜め方向に傾いていても、上述の方法で基準点を少なくとも 2点決めれば、傾き具合を算出できるので、全ゥヱル 8の中心点の座標を求めることができる。 [0075] また、実際の試料の測定に用いる光学系の構成をそのまま用いているため、位置検出のための特別な機構や装置を設ける必要がない。

[0076] 更に、 1, 536ゥエルのマイクロプレート 7など、 1ゥエルあたりの大きさが極めて小さいマイクロプレート 7であっても、確実な位置決め、測定を行うことができるため、ゥェル 8ごとの測定データを正確に管理することができる。

[0077] なお、ゥエル 8の位置を確実に把握するための基準点の算出にマイクロプレート 7を用いるが、試料が入っていないゥエル 8にも、本実施の形態で述べた方法を適用することが可能である。この場合には、マイクロプレート 7からは蛍光ではなぐ反射光が返つて来る。従って、ダイクロイツクミラー 4に代えてビームスプリッタを用いれば良い。

[0078] なお、上述の各実施の形態で説明した機能は、ハードウェアを用いて構成するに留まらず、ソフトウェアを用いて各機能を記載したプログラムをコンピュータに読み込ませて実現することもできる。また、各機能は、適宜ソフトウェア、ハードウェアのいずれかを選択して構成するものであっても良い。

[0079] 更に、各機能は図示しない記憶媒体に格納したプログラムをコンピュータに読み込ませることで実現させることもできる。ここで本実施の形態における記憶媒体は、プログラムを記憶でき、かつコンピュータが読み取り可能な記憶媒体であれば、その記憶形式は何れの形態であってもよ、。

[0080] なお、この発明は、上記実施形態そのままに限定されるものではなぐ実施段階ではその要旨を逸脱しない範囲で構成要素を変形して具体ィ匕できる。また、上記実施形態に開示されている複数の構成要素の適宜な組み合せにより種々の発明を形成できる。例えば、実施形態に示される全構成要素から幾つかの構成要素を削除してもよい。更に、異なる実施形態に亘る構成要素を適宜組み合せてもよい。

産業上の利用可能性

[0081] 本発明はマイクロプレートのゥエルの位置を簡便に計測することのできる光測定装置、及びその光測定装置を備えた装置を製造、使用する産業に広く利用することができる。

Claims

請求の範囲

[1] 試料槽を含む容器と、

前記試料槽に収容された試料からの光を集光するレンズと、

前記レンズを通過した前記試料からの光を検出する光検出器と、

前記光検出器の検知出力に基づいて前記試料槽の位置を検知する位置検知手段と、

前記位置検知手段の検知出力に基づ!、て前記容器、または前記レンズを設置する位置調整手段と

を備えたことを特徴とする光測定装置。

[2] 光源と、

試料槽を含む容器と、

前記容器からの光を集光するレンズと、

前記レンズを通過した前記容器からの光を検出する光検出器と、

を備えたことを特徴とする光測定装置。

[3] 光源と、

試料槽を含む容器と、

前記レンズを通過した前記試料槽に収容された前記試料からの光を検出する光検出器と、

を備えたことを特徴とする光測定装置。

[4] 前記容器を移動させる移動手段を有し、

前記位置検知手段は、前記試料槽の底面の略中心位置を決定し、

前記位置調整手段は、前記移動手段を作動させて、前記試料槽の底面の略中心位置に前記光源力発せられた光を合致させることを特徴とする請求項 2乃至 3の内いずれか 1項に記載の光測定装置。

[5] 前記容器を移動させる移動手段を有し、

前記位置検知手段は、前記移動手段によって前記容器を移動しつつ前記光検出器で測定した検知出力に基づいて前記試料槽の位置を検知することを特徴とする請求項 1乃至 3の内いずれか 1項に記載の光測定装置。

[6] 前記容器を移動させる移動手段を有し、

前記移動手段は、前記容器を保持しつつ前記レンズの光軸に垂直な平面内を移動させることを特徴とする請求項 1乃至 3の内いずれ力 1項に記載の光測定装置。

[7] 前記容器は、マイクロプレートであることを特徴とする請求項 1乃至 5の内いずれか

1項に記載の光測定装置。

[8] 前記マイクロプレートは少なくとも壁が樹脂で、底面がガラスで構成されていることを特徴とする請求項 7に記載の光測定装置。

[9] 前記光検出器は、半導体光検出器、または光電子増倍管であることを特徴とする請求項 1乃至 5の内いずれか 1項に記載の光測定装置。

[10] 前記レンズは、対物レンズであることを特徴とする請求項 1乃至 5の内いずれか 1項に記載の光測定装置。

[11] 光源と、

蛍光物質を収容する試料槽を含む容器と、

前記容器を移動させる移動手段と、

前記光源からの光を前記蛍光物質に集光するレンズと、

前記蛍光物質からの蛍光を検出する光検出器と、

前記光検出器の検知出力に基づいて前記試料槽の底面の略中心位置を検知する位置検知手段と、

前記移動手段を作動させて前記試料槽の底面の略中心位置に前記光源から発せられた光を合致させる位置調整手段と

を備えたことを特徴とする光測定装置。

[12] 前記光源は前記試料を光測定する光源と共通であることを特徴とする請求項 2、 3

、 11の内いずれか 1項に記載の光測定装置。

[13] 試料槽を含む容器を保持し、

前記試料槽に収容された試料からの光をレンズにより集光するとともに、前記レンズを通過した前記試料からの光を光検出器で検出し、

前記光検出器の検知出力に基づいて前記レンズの光軸が前記試料槽を貫通するように前記レンズの位置、または前記試料槽の位置を移動することを特徴とする光測定方法。

[14] 試料槽を含む容器を保持し、前記容器からの光をレンズにより集光するとともに、前記レンズを通過した前記容器からの光を光検出器で検出し、

前記光検出器の検知出力に基づいて前記レンズの光軸が前記試料槽を貫通するように前記レンズの位置、または前記容器の位置を移動することを特徴とする光測定方法。