JPWO2014020967A1 - 共焦点顕微鏡又は多光子顕微鏡の光学系を用いた光分析装置、光分析方法及び光分析用コンピュータプログラム - Google Patents

Abstract

走査分子計数法、ＦＣＳ、ＦＩＤＡ、ＰＣＨ等の光分析技術のための共焦点顕微鏡又は多光子顕微鏡の光学系を用いた光分析技術に於いて、光強度の計測前に光学系に於いて予定される状態が実現されているか否かの判定を可能にする技術が提供される。本発明による試料溶液中に配置された光検出領域からの光強度を計測し光強度の分析を行う光分析技術に於いては、試料容器に対する光検出領域の位置を移動させながら光検出器により出力された信号強度の大きさに基づいて、光検出領域が試料溶液中に配置され且つ光検出領域からの光強度の計測が実行可能であるか否か及び／又は光強度の計測が実行可能である試料容器に対する前記光検出領域の位置又はその範囲を判定する判定処理が実行される。

Description

本発明は、共焦点顕微鏡又は多光子顕微鏡の光学系などの溶液中の微小領域からの光が検出可能な光学系を用いて、溶液中に分散又は溶解した原子、分子又はこれらの凝集体（以下、これらを「粒子」と称する。）、例えば、タンパク質、ペプチド、核酸、脂質、糖鎖、アミノ酸若しくはこれらの凝集体などの生体分子、ウイルス、細胞などの粒子状の対象物、或いは、非生物学的な粒子からの光を検出して、それらの状態（相互作用、結合・解離状態など）の分析又は解析に於いて有用な情報を取得することが可能な光分析技術に係る。なお、本明細書に於いて、検出される光は、蛍光、りん光、化学発光、生物発光、散乱光等であってよい。光を発する粒子（以下、「発光粒子」と称する。）は、それ自身が光を発する粒子、又は、任意の発光標識若しくは発光プローブが付加された粒子のいずれであってもよい。

近年の光計測技術の発展により、共焦点顕微鏡の光学系とフォトンカウンティング（１光子検出）も可能な超高感度の光検出技術とを用いて、一光子又は蛍光一分子レベルの微弱光の検出・測定が可能となっている。そこで、そのような微弱光の計測技術を用いて、生体分子等の特性、分子間相互作用又は結合・解離反応の検出を行う光分析技術が種々提案されている。そのような光分析技術としては、例えば、蛍光相関分光分析（Fluorescence Correlation Spectroscopy：ＦＣＳ。例えば、特許文献１−３参照）、蛍光強度分布分析(Fluorescence-Intensity Distribution Analysis：ＦＩＤＡ。例えば、特許文献４)やフォトンカウンティングヒストグラム（Photon Counting Histogram：ＰＣＨ。例えば、特許文献５）などが知られている。また、特許文献６〜８には、共焦点顕微鏡の光学系を用いて計測される試料溶液の蛍光信号の時間経過に基づいて蛍光性物質を検出する方法が提案されている。

更に、本願出願人は、特許文献９〜１１に於いて、共焦点顕微鏡又は多光子顕微鏡の光学系などの溶液中の微小領域からの光が検出可能な光学系を用いた光分析技術であって、ＦＣＳ、ＦＩＤＡ等の光分析技術とは異なる原理による新規な光分析技術を提案した。かかる新規な光分析技術（以下、「走査分子計数法」と称する。）では、試料溶液内に於いて光の検出領域である微小領域（以下、「光検出領域」と称する。励起光が使用される場合には、励起光の集光領域に概ね一致する。）の位置を移動させながら、即ち、光検出領域により試料溶液内を走査しながら、光検出領域が試料溶液中に分散してランダムに運動する発光粒子を包含したときに、その発光粒子から発せられる光を個別に検出し、これにより、試料溶液中の発光粒子を一つずつ検出して、発光粒子のカウンティングや試料溶液中の発光粒子の濃度又は数密度に関する情報の取得が可能となる。

特開２００５−０９８８７６ 特開２００８−２９２３７１ 特開２００９−２８１８３１ 特許第４０２３５２３号 国際公開２００８−０８０４１７ 特開２００７−２０５６５ 特開２００８−１１６４４０ 特開平４−３３７４４６号公報 国際公開第２０１１／１０８３６９ 国際公開第２０１１／１０８３７０ 国際公開第２０１１／１０８３７１

上記の如き走査分子計数法、ＦＣＳ、ＦＩＤＡ、ＰＣＨ等の光分析技術の如く、共焦点顕微鏡又は多光子顕微鏡の光学系を用いて光強度の計測を成功裡に実行するためには、試料溶液から光検出器までの光学系が予定された状態となっている必要がある。例えば、試料容器中に試料溶液が確実に存在し、光学系の対物レンズの焦点領域、即ち、微小領域（光検出領域）は、かかる試料溶液中に確実に存在していなければならない。また、液浸式の対物レンズの場合には、対物レンズと試料容器との間に所定の液体（水、オイルなど）が介在していなければならない。更に、検出される光が励起光を必要とする場合には、励起光が予定された強度にて且つ予定された領域にて試料溶液内で集光されて微小領域を形成していなければならず、微小領域からの光を検出する光検出器は、正常に受光した光を電気信号に変換できる状態となっている必要がある。更にまた、特に、走査分子計数法の場合、試料溶液内で対物レンズの光検出領域の位置を移動しながら光強度の計測が実行されるところ、光検出領域の移動経路上に試料溶液内からの逸脱する部分や光強度の計測に影響を与える異物等が存在すると、その部分の光強度の計測値を除外する処理など、分析処理に労力を要することと成り得るので、そのような試料溶液内から逸脱する部分や異物等が予め無い状態となっていることが好ましい。

上記の如き、試料溶液から光検出器までの光学系に於いて予定される状態が達成されているか否かの確認は、対物レンズの先端の小さな空間領域の状況を把握する必要があるため、従前に於いては、一般に、使用者の経験に基づいて為されることが多い。特に、光強度の計測時に対物レンズの視野又は焦点領域近傍の状況を使用者が直接的に確認することが困難である場合には、しばしば、光強度の計測の終了後にその結果を参照して、かかる計測が、光学系が予定された状態の下で為されたか否かが判断されていた。しかしながら、使用者の経験や計測後の結果の状態によって、光学系に於いて予定された状態が達成できていたか否かを判断することは、非効率的であり（実験条件によって、一回の光強度の計測は、数十分〜１時間程度を要する場合もある。）、また、費用を要する場合もあり得る。従って、使用者の経験に頼らずに、計測前に光学系に於いて予定される状態が実現されているか否かを判定できるようになっている方が有利である。

かくして、本発明の一つの目的は、上記の如き走査分子計数法、ＦＣＳ、ＦＩＤＡ、ＰＣＨ等の光分析技術のための共焦点顕微鏡又は多光子顕微鏡の光学系を用いた光分析技術に於いて、使用者の経験や光強度の計測後の結果の状態の観察に依らなくとも、光強度の計測前に光学系に於いて予定される状態が実現されているか否かを判定することを可能にする新規な構成を提供することである。

この点に関し、一般に共焦点顕微鏡又は多光子顕微鏡の光学系を用いた光分析装置の場合、一般に、試料溶液から光検出器までの光学系の状態によって、光検出器により出力された信号強度に於けるバックグラウンド（背景強度）の大きさが変化する。即ち、光学系に於いて予定される状態、即ち、光検出領域が試料溶液中に配置され且つ光検出領域からの光強度の計測が実行可能である状態が達成されているか否かは、光検出器により出力された信号強度の大きさを参照すれば、判定できることとなる。本発明に於いては、かかる知見が利用される。

本発明によれば、上記の課題は、共焦点顕微鏡又は多光子顕微鏡の光学系を用いて試料溶液中に配置された光検出領域からの光強度を計測し、かかる光強度の分析を行う光分析装置であって、試料容器に対する光検出領域の位置を移動する光検出領域位置移動器と、光検出領域からの光を検出するための光検出器と、試料容器に対する光検出領域の位置を移動させながら光検出器により出力された信号強度の大きさに基づいて、光検出領域が試料溶液中に配置され且つ光検出領域からの光強度の計測が実行可能であるか否か及び光強度の計測が実行可能である試料容器に対する光検出領域の位置又はその範囲のうちの少なくとも一つを判定する判定器とを含むことを特徴とする装置によって達成される。かかる構成に於いて、共焦点顕微鏡又は多光子顕微鏡の光学系の「光検出領域」とは、コンフォーカル・ボリューム、即ち、顕微鏡に於いて光が検出される微小領域であり、対物レンズから励起光が与えられる場合には、その励起光が集光された領域に相当する。また、本装置で実行される光強度の計測・分析は、走査分子計数法、ＦＣＳ、ＦＩＤＡ、ＰＣＨ等の共焦点顕微鏡又は多光子顕微鏡の光学系を用いて光強度の計測・分析を行う光分析技術であれば、任意のものであってよい。試料容器に対する光検出領域の位置は、試料容器若しくは試料容器を担持するステージを移動させることにより、或いは、光学系の光路内の光学要素の向きを変更させることによって焦点位置を移動させることにより達成されてよい。

上記の本発明の装置は、基本的には、上記の特許文献等に記載されている共焦点顕微鏡又は多光子顕微鏡の光学系を用いて試料溶液中に配置された光検出領域からの光強度の計測・分析を行う光分析装置に適用される。既に触れた如く、光学系に於いて、光検出領域が試料溶液中に配置され且つ光検出領域からの光強度の計測が実行可能である状態が達成されているか否かは、光検出器により出力された信号強度の大きさを参照すれば判定可能である。そこで、本発明では、顕微鏡に於いて、試料容器に対する光検出領域の位置を移動させながら、光検出器から出力される信号強度の大きさを参照し、かかる信号強度の大きさに基づいて、光検出領域が試料溶液中に配置され且つ光検出領域からの光強度の計測が実行可能である状態が達成されているか否か、或いは、かかる状態が達成されている試料容器に対する光検出領域の位置若しくはその範囲が判定される。かかる構成によれば、光検出器から出力される信号強度の大きさ自体は、使用者の経験や光強度の計測後の結果の状態の観察に依らずに参照できるので、光検出領域が試料溶液中に配置され且つ光検出領域からの光強度の計測が実行可能である状態が達成されていることを確認した後、光強度の計測を実行できるようになり、有利である。なお、上記の判定を行う判定器は、典型的には、光分析装置のコンピュータのプログラムに従った作動によって実現されてよい。

上記の構成に於いて、判定器は、上記の判定を行うために、光検出領域が試料溶液中に配置され且つ光検出領域からの光強度の計測が実行可能であるときに得られる光検出器から出力される信号強度の大きさの範囲（第一の信号強度参照値範囲）を記憶していてよい。そして、試料容器に対する光検出領域の位置を移動させながら実行される判定時には、光検出器により出力された信号強度の大きさを参照し、かかる信号強度の大きさが第一の光強度参照値範囲に在るとき、そのときの試料容器に対する光検出領域の位置に於いて光検出領域からの光強度の計測が実行可能であると判定するようになっていてよい。かかる構成によれば、対物レンズの視野又は焦点領域近傍の状況を使用者が直接的に目視することが困難である場合であっても、光検出領域が試料溶液中に配置され且つ光検出領域からの光強度の計測が実行可能であるか否かを容易に確認できることとなる。

一方、光検出器により出力された信号強度の大きさが第一の光強度参照値範囲から逸脱しているときは、光検出領域からの光強度の計測が実行可能でないこととなる。その際、光検出領域からの光強度の計測が実行可能でない理由によって、光検出器により出力された信号強度の大きさが異なることが分かっている。そこで、上記の構成に於いて、判定器は、光検出器により検出された光強度の大きさが第一の光強度参照値範囲から逸脱しているときには、光検出器により出力された信号強度の大きさに基づいて、光検出領域からの光強度の計測が実行可能でない理由を判定するよう構成されていてよい。かかる構成によれば、光検出領域からの光強度の計測が実行可能でないときに、その理由が把握されるので、光検出領域からの光強度の計測が実行可能となるように適宜処置することが可能となる。

上記の光検出領域からの光強度の計測が実行可能でない理由の判定を行うための構成としては、具体的には、（ｉ）試料容器内に試料溶液がない場合、（ii）対物レンズが液浸式である場合に対物レンズと試料容器との間に満たされるべき液体がない場合、（iii）光検出領域が試料容器の壁に位置している場合、（iv）光検出器が故障している場合、及び（v）光強度の計測に於いて励起光の照射が必要な場合に励起光が予定された状態にて光検出領域に集光されていない場合のうちの少なくとも一つの場合のそれぞれに於いて、光検出器により出力される信号強度の大きさの範囲が予め記憶され、光検出器により出力される信号強度の大きさが前記の予め記憶された範囲のうちの一つに在るとき、光検出領域からの光強度の計測が実行可能でない理由が、前記（i）〜（v）の場合のうちの光検出器により出力される信号強度の大きさの属する予め記憶された範囲に対応する場合であることが判定されるようになっていてよい。予め記憶される信号強度の大きさの範囲のデータは、光検出領域の近傍の状況が確認できる状態で行われる予備実験等により取得するようになっていてよい。なお、例えば、励起光の照射の不具合や光検出器の故障といった事象は、試料容器内に試料溶液を準備しなくても検出される。従って、上記の構成に於いて、判定器が、光検出領域が試料溶液内に配置されていないときに光検出器により出力された信号強度の大きさに基づいて光検出領域からの光強度の計測が実行できない原因があるか否かを判定するよう構成されていてもよい。

ところで、先に列記されている如き種々の光分析技術のうち、走査分子計数法などでは、光検出領域からの光の強度の計測が試料溶液内で光検出領域の位置を移動しながら実行される。その場合、既に触れた如く、光検出領域の移動経路上に於いては、試料溶液内からの逸脱する部分や光強度の計測に影響を与える異物等が存在していない状態となっていることが好ましい。この点に関し、光検出領域が試料溶液内からの逸脱する部分や異物等の存在領域を通過したときには、やはり、光検出器から出力される信号強度のバッググラウンドに変化が現れ、その際の信号強度は、典型的には、増大する。また、移動経路が循環経路である場合には、光検出領域が試料溶液内からの逸脱する部分や異物等の存在によって周期的な信号強度の増大が観測される。

そこで、上記の本発明の装置が、走査分子計数法の如く、試料溶液内に於ける光検出領域の位置を移動しながら光検出領域からの光強度の計測を行う装置である場合には、光検出領域からの光強度の計測の実行の前に光検出領域の位置を移動しながら光検出器により出力された信号強度の大きさに於いて第一の所定値を超える位置があったとき又は光検出領域の位置の移動周期と略同じ周期にて第二の所定値を超える位置があったときには、その移動経路は、好適ではないので、光検出領域の位置の移動経路が変更されるように構成されていてよい。第一の所定値及び第二の所定値は、適宜、実験的に設定されてよく、同一の値であっても異なる値であってもよい。

上記の本発明の一連の構成に於ける実施形態一つの例として、判定器による上記の判定は、光検出領域からの光強度の計測の実行前に自動的に為されてよい。具体的には、例えば、光分析装置に試料溶液が分注された試料容器が載置された後に、まず、光検出領域が試料容器の外側に位置するように配置され、光検出器により出力された信号強度の大きさが参照される。ここに於いては、信号強度の大きさに基づいて、励起光又は光検出器の異常の有無、液浸式対物レンズの場合のレンズ先端の液体の有無が確認可能である。しかる後、試料容器を横断するように光検出領域の位置が移動され、その際の光検出器により出力された信号強度の大きさが逐次参照され、信号強度の大きさに基づいて、容器の壁の存在範囲、容器内の範囲及び／又は試料溶液の有無が確認されてよい。かくして、上記の一連の信号強度の大きさに基づく判定に於いて、光検出領域が試料溶液中に配置され且つ光検出領域からの光強度の計測が実行可能であるか否か或いは光強度の計測の実行可能な位置又はその範囲が確認され、光検出領域からの光強度の計測が実行可能でないことが判明した場合には、使用者に警告が発せられるようになっていてよい。更に、試料溶液内に於ける光検出領域の位置を移動しながら光検出領域からの光強度の計測を行う形式の光分析技術を実行する場合には、光検出領域の位置を試料溶液内にて予定された経路上にて移動され、光検出器により出力された信号強度の大きさが参照されて、信号強度の大きさが第一又は第二の所定値と比較されて、移動経路上に於ける試料溶液内からの逸脱する部分や光強度の計測に影響を与える異物等の有無が確認されてよい。そして、移動経路上に試料溶液内からの逸脱する部分や光強度の計測に影響を与える異物等の存在が推定される場合には、移動経路が変更されてよい。

上記の本発明の装置に於ける試料容器に対する光検出領域の位置を移動させながら光検出器により出力された信号強度の大きさに基づいて、光検出領域が試料溶液中に配置され且つ光検出領域からの光強度の計測が実行可能であるか否か或いは光強度の計測が実行可能である試料容器に対する光検出領域の位置又はその範囲を判定する判定処理は、汎用のコンピュータによっても実現可能である。従って、本発明のもう一つの態様によれば、共焦点顕微鏡又は多光子顕微鏡の光学系を用いて試料溶液中に配置された光検出領域からの光強度を計測しかかる光強度の分析を行うための光分析用コンピュータプログラムであって、試料容器に対する光検出領域の位置を移動する手順と、試料容器に対する光検出領域の位置を移動させながら光検出器により出力された信号強度を検出する手順と、かかる信号強度の大きさに基づいて、光検出領域が試料溶液中に配置され且つ光検出領域からの光強度の計測が実行可能であるか否か及び光強度の計測が実行可能である試料容器に対する光検出領域の位置又はその範囲のうちの少なくとも一つを判定する判定手順をコンピュータに実行させることを特徴とするコンピュータプログラムが提供される。なお、コンピュータプログラムは、コンピュータ読み取り可能な記憶媒体に記憶されて提供される。コンピュータは、記憶媒体に記憶されているプログラムを読み出して、情報の加工・演算処理を実行することにより、上記の手順を実現する。ここで、コンピュータ読み取り可能な記録媒体とは、磁気ディスク、光磁気ディスク、ＣＤ−ＲＯＭ、ＤＶＤ−ＲＯＭ、半導体メモリ等であってよい。更に、上述のプログラムは、通信回線によってコンピュータへ配信され、この配信を受けたコンピュータがプログラムを実行するようにしても良い。

かかる構成に於いても、判定手順に於いて、光検出器により出力された信号強度の大きさが、予め記憶された光検出領域が試料溶液中に配置され且つ光検出領域からの光強度の計測が実行可能であるときの第一の信号強度参照値範囲に在るとき、そのときの試料容器に対する光検出領域の位置に於いて光検出領域からの光強度の計測が実行可能であると判定されるようになっていてよい。そして、光検出器により検出された光強度の大きさが第一の光強度参照値範囲から逸脱しているとき、光検出器により出力された信号強度の大きさに基づいて、光検出領域からの光強度の計測が実行可能でない理由が判定されてよい。かかる態様の一つとして、判定手順に於いて、光検出器により出力される信号強度の大きさが、予め記憶された（ｉ）試料容器内に試料溶液がない場合、（ii）対物レンズが液浸式である場合に対物レンズと試料容器との間に満たされるべき液体がない場合、（iii）光検出領域が前記試料容器の壁に位置している場合、（iv）光検出器が故障している場合、又は（v）光強度の計測に於いて励起光の照射が必要な場合に励起光が予定された状態にて光検出領域に集光されていない場合の光検出器により出力される信号強度の大きさの範囲のうちの一つに在るとき、光検出領域からの光強度の計測が実行可能でない理由が、（i）〜（v）の場合のうちの光検出器により出力される信号強度の大きさの属する予め記憶された範囲に対応する場合であることが判定されてよい。また、判定手順に於いて、光検出領域が試料溶液内に配置されていないときに光検出器により出力された信号強度の大きさに基づいて光検出領域からの光強度の計測が実行できない原因があるか否かが判定されるようになっていてもよい。

更に、上記のコンピュータプログラムに於いても、同コンピュータプログラムが試料溶液内に於ける光検出領域の位置を移動しながら光検出領域からの光強度の計測を行うための光分析用コンピュータプログラムである場合には、光検出領域からの光強度の計測の実行の前に光検出領域の位置を移動しながら光検出器により出力された信号強度の大きさに於いて第一の所定値を超える位置があったとき又は光検出領域の位置の移動周期と略同じ周期にて第二の所定値を超える位置があったときには、光検出領域の位置の移動経路を変更する手順をコンピュータに実行させるようになっていてよい。

また、上記のコンピュータプログラムに於いても、好適には、光検出領域からの光強度の計測の実行前に判定手順が自動的にコンピュータに実行させるようになっていてよい。

上記の本発明の装置又はコンピュータプログラムによれば、試料容器に対する光検出領域の位置を移動させながら光検出器により出力された信号強度の大きさに基づいて、光検出領域が試料溶液中に配置され且つ光検出領域からの光強度の計測が実行可能であるか否か或いは光強度の計測が実行可能である試料容器に対する光検出領域の位置又はその範囲を判定する過程を含む新規な方法が提供される。かくして、本発明によれば、更に、共焦点顕微鏡又は多光子顕微鏡の光学系を用いて試料溶液中に配置された光検出領域からの光強度を計測し光強度の分析を行う光分析方法であって、試料容器に対する光検出領域の位置を移動させる移動過程と、試料容器に対する光検出領域の位置を移動させながら光検出器により出力された信号強度を検出する信号検出過程と、かかる信号強度の大きさに基づいて、光検出領域が試料溶液中に配置され且つ光検出領域からの光強度の計測が実行可能であるか否か及び光強度の計測が実行可能である試料容器に対する光検出領域の位置又はその範囲のうちの少なくとも一つを判定する判定過程を含むことを特徴とする方法が提供される。

かかる構成に於いても、判定過程に於いて、光検出器により出力された信号強度の大きさが、予め記憶された光検出領域が試料溶液中に配置され且つ光検出領域からの光強度の計測が実行可能であるときの第一の信号強度参照値範囲に在るとき、そのときの試料容器に対する光検出領域の位置に於いて光検出領域からの光強度の計測が実行可能であると判定されるようになっていてよい。そして、光検出器により検出された光強度の大きさが第一の光強度参照値範囲から逸脱しているとき、光検出器により出力された信号強度の大きさに基づいて、光検出領域からの光強度の計測が実行可能でない理由が判定されてよい。かかる態様の一つとして、判定手順に於いて、光検出器により出力される信号強度の大きさが、予め記憶された（ｉ）試料容器内に試料溶液がない場合、（ii）対物レンズが液浸式である場合に対物レンズと試料容器との間に満たされるべき液体がない場合、（iii）光検出領域が前記試料容器の壁に位置している場合、（iv）光検出器が故障している場合又は（v）光強度の計測に於いて励起光の照射が必要な場合に励起光が予定された状態にて光検出領域に集光されていない場合の光検出器により出力される信号強度の大きさの範囲のうちの一つに在るとき、光検出領域からの光強度の計測が実行可能でない理由が、（i）〜（v）の場合のうちの光検出器により出力される信号強度の大きさの属する予め記憶された範囲に対応する場合であることが判定されてよい。また、判定過程に於いて、光検出領域が試料溶液内に配置されていないときに光検出器により出力された信号強度の大きさに基づいて光検出領域からの光強度の計測が実行できない原因があるか否かが判定されるようになっていてもよい。

更に、上記の方法に於いても、試料溶液内に於ける前記光検出領域の位置を移動しながら前記光検出領域からの光強度の計測を行う光分析技術に適用される場合には、光検出領域からの光強度の計測の実行の前に光検出領域の位置を移動しながら光検出器により出力された信号強度の大きさに於いて第一の所定値を超える位置があったとき又は光検出領域の位置の移動周期と略同じ周期にて第二の所定値を超える位置があったときには、光検出領域の位置の移動経路が変更されるようになっていてよい。

また、上記の方法に於いても、判定過程は、光検出領域からの光強度の計測の実行前に自動的に実行されてよい。

本発明は、走査分子計数法（特許文献６−８）、ＦＩＤＡ（特許文献４）、ＦＣＳ（特許文献１−３）等の処理に従って、典型的には、タンパク質、ペプチド、核酸、脂質、糖鎖、アミノ酸若しくはこれらの凝集体などの生体分子、ウイルス、細胞などの粒子状の生物学的な対象物の溶液中の状態の分析又は解析の用途に用いられる光分析技術に適用されるが、非生物学的な粒子（例えば、原子、分子、ミセル、金属コロイドなど）の溶液中の状態の分析又は解析に用いられてもよく、そのような場合も本発明の範囲に属することは理解されるべきである。

かくして、上記の本発明の構成によれば、共焦点顕微鏡又は多光子顕微鏡の光学系を用いた光分析技術に於いて、光検出器から出力される信号強度の大きさを参照して、光学系の状態が、光強度の計測が実行可能である状態であるか否かを判定できるので、使用者の経験や光強度の計測後の結果の状態の観察に依らなくとも、実際の検査などの計測を行う前に、計測が正しく行えるか否かを確認することができることとなる。従って、光学系に種々の不具合が発生し、光強度の計測が実行可能である状態でないにもかかわらず、或いは、光検出領域が光強度の計測が実行可能ではない位置又は範囲内に在り若しくは通過するにもかかわらず、これらのことに使用者が気付かずに、比較的時間を要する光強度の計測を実行してしまうといったことが予防可能となる。そして、かかる構成により、所謂、計測の失敗の頻度が低減され、計測の効率の改善が期待される。

本発明のその他の目的及び利点は、以下の本発明の好ましい実施形態の説明により明らかになるであろう。

図１（Ａ）は、本発明を実現する光分析装置の内部構造の模式図である。図１（Ｂ）は、コンフォーカル・ボリューム（共焦点顕微鏡の観察領域）の模式図である。図１（Ｃ）は、ミラー７の向きを変更して光検出領域の位置を移動する機構の模式図である。図１（Ｄ）は、マイクロプレートの水平方向位置を移動して光検出領域の位置を移動する機構の模式図である。 図２（Ａ）は、光分析装置に於いて使用されるマイクロプレートの斜視図である。図２（Ｂ）は、マイクロプレートの下方にて該マイクロプレートに対して相対的に対物レンズの位置を移動する様子を模式的な表した図である。 図３（Ａ）は、底面が平坦に成型されたマイクロチューブ型の容器の模式図である。図３（Ｂ）は、光分析装置に於いてマイクロチューブ型容器を用いて光強度の計測を行う場合の模式的な側方図である。図３（Ｃ）は、図３（Ｂ）の状態で、マイクロチューブ型容器に対して、コンフォーカル・ボリュームを水平方向に、０．０５ｍｍのピッチで移動した際の光検出器の出力した信号強度を示したグラフ図である。左は、容器内に試料溶液が在る場合であり、右は、容器内に試料溶液がない場合である。 図４（Ａ）は、試料溶液内にてコンフォーカル・ボリュームの位置を移動する際の移動経路を模式的に示した図である。左は、円形の移動経路であり、右は、直線的な移動経路である。図４（Ｂ）は、コンフォーカル・ボリュームの移動経路上に異物Ｘが存在していた場合に経路変更を行う様子を模式的に示した図である。図４（Ｃ）は、走査分子計数法による計測に於いて経路上に異物が存在していた場合の計測例を示している。 図５は、本発明による光強度の計測の前に実行される判定処理の一つの例をフローチャートの形式にて示した図である。

１…光分析装置（共焦点顕微鏡）
２…光源
３…シングルモードオプティカルファイバー
３ａ…ファイバー出射端
４…コリメータレンズ
４ａ…ピンホール
５…ダイクロイックミラー
６、７、１１…反射ミラー
７ａ…ミラー偏向器
８…対物レンズ
８ａ…液浸用液体
９…マイクロプレート
９ａ…マイクロチューブ型容器
１０…ウェル（試料溶液容器）
１０ａ…ウェルの壁部
１０ｂ…マイクロプレートの底部
１２…コンデンサーレンズ
１３…ピンホール
１４…バリアフィルター
１５…マルチモードオプティカルファイバー
１６…光検出器
１７…ミラー偏向器モーター
１７ａ…ステージ位置変更装置
１８…コンピュータ
ＣＶ…コンフォーカル・ボリューム（光検出領域）

以下、本発明の好ましい実施形態について詳細に説明する。

光分析装置の構成
本発明は、図１（Ａ）に模式的に例示されている如き、走査分子計数法、ＦＣＳ、ＦＩＤＡ、ＰＣＨ等が実行可能な共焦点顕微鏡の光学系と光検出器とを組み合わせてなる光分析装置に適用される。図１（Ａ）を参照して、光分析装置１は、光学系２〜１７と、光学系の各部の作動を制御すると共にデータを取得し解析するためのコンピュータ１８とから構成される。光分析装置１の光学系は、通常の共焦点顕微鏡の光学系と同様であってよく、そこに於いて、光源２から放射されシングルモードファイバー３内を伝播したレーザー光（Ｅｘ）が、ファイバーの出射端に於いて固有のＮＡにて決まった角度にて発散する光となって放射され、コリメーター４によって平行光となり、ダイクロイックミラー５、反射ミラー６、７にて反射され、対物レンズ８へ入射される。対物レンズ８の上方には、典型的には、１〜数十μＬの試料溶液が分注される試料容器又はウェル１０が配列されたマイクロプレート９が配置されており、対物レンズ８から出射したレーザー光は、試料容器又はウェル１０内の試料溶液中で焦点を結び、光強度の強い領域（励起領域）が形成される。試料溶液中には、観測対象物である単一粒子、典型的には、蛍光性発光粒子又は蛍光色素等の発光標識が付加された発光粒子が分散又は溶解されており、かかる発光粒子が励起領域に進入すると、その間、発光粒子が励起され光が放出される。放出された光（Ｅｍ）は、対物レンズ８、ダイクロイックミラー５を通過し、ミラー１１にて反射してコンデンサーレンズ１２にて集光され、ピンホール１３を通過し、バリアフィルター１４を透過して（ここで、特定の波長帯域の光成分のみが選択される。）、マルチモードファイバー１５に導入されて、光検出器１６に到達し、時系列の電気信号に変換された後、コンピュータ１８へ入力され、光分析のための処理が為される。なお、当業者に於いて知られている如く、上記の構成に於いて、ピンホール１３は、対物レンズ８の焦点位置と共役の位置に配置されており、これにより、図１（Ｂ）に模式的に示されている如きレーザー光の焦点領域、即ち、励起領域内から発せられた光のみがピンホール１３を通過し、励起領域以外からの光は遮断される。図１（Ｂ）に例示されたレーザー光の焦点領域は、通常、１〜１０ｆＬ程度の実効体積を有する本光分析装置に於ける光検出領域であり（典型的には、光強度が領域の中心を頂点とするガウス様分布となる。実効体積は、光強度が１／ｅ^２となる面を境界とする略楕円球体の体積である。）、コンフォーカル・ボリュームと称される。また、本発明では、１つの発光粒子からの光、例えば、一つの蛍光色素分子からの微弱光が検出されるので、光検出器１６としては、好適には、フォトンカウンティングに使用可能な超高感度の光検出器が用いられる。光の検出がフォトンカウンティングによる場合、光強度の測定は、所定時間に亘って、逐次的に、所定の単位時間毎（ＢＩＮ ＴＩＭＥ）に、光検出器に到来するフォトンの数を計測する態様にて実行される。従って、この場合、時系列の光強度のデータは、時系列のフォトンカウントデータである。また、顕微鏡のステージ（図示せず）には、観察するべきウェル１０を変更するべく、マイクロプレート９の水平方向位置を移動するためのステージ位置変更装置１７ａが設けられていてよい。ステージ位置変更装置１７ａの作動は、コンピュータ１８により制御されてよい。かかる構成により、検体が複数在る場合にも、迅速な計測が達成可能となる。

更に、上記の光分析装置の光学系に於いては、また、上記の光分析装置の光学系に於いて、走査分子計数法の実行の際、或いは、ＦＣＳ、ＦＩＤＡ、ＰＣＨ等の実行の態様によって、試料溶液内を光検出領域により走査する、即ち、試料溶液内に於いて焦点領域、即ち、光検出領域の位置を移動するための機構（光検出領域位置移動器）が設けられてよい。かかる光検出領域の位置を移動するための機構としては、図１（Ｃ）に模式的に例示されている如く、反射ミラー７の向きを変更するミラー偏向器１７が採用されてよい（光路を変更して光検出領域の絶対的な位置を移動する方式）。かかるミラー偏向器１７は、通常のレーザー走査型顕微鏡に装備されているガルバノミラー装置と同様であってよい。また、更に、図１（Ｄ）に例示されている如く、試料溶液が注入されている容器１０（マイクロプレート９）の水平方向の位置を移動し、試料溶液内に於ける光検出領域の相対的な位置を移動するべくステージ位置変更装置１７ａが作動される（試料溶液の位置を移動する方式）。いずれの方式による場合も、所望の光検出領域の位置の移動パターンを達成するべく、ミラー偏向器１７又はステージ位置変更装置１７ａは、コンピュータ１８の制御の下、光検出器１６による光検出と協調して駆動される。光検出領域の位置の移動軌跡は、円形、楕円形、矩形、直線、曲線又はこれらの組み合わせから任意に選択されてよい（コンピュータ１８に於けるプログラムに於いて、種々の移動パターンが選択できるようになっていてよい。）。なお、図示していないが、対物レンズ８又はステージを上下に移動することにより、光検出領域の位置が上下方向に移動されるようになっていてもよい。

観測対象物となる発光粒子が多光子吸収により発光する場合には、上記の光学系は、多光子顕微鏡として使用される。その場合には、励起光の焦点領域（光検出領域）のみで光の放出があるので、ピンホール１３は、除去されてよい。また、観測対象物となる発光粒子が化学発光や生物発光現象により励起光によらず発光する場合には、励起光を生成するための光学系２〜５が省略されてよい。発光粒子がりん光又は散乱により発光する場合には、上記の共焦点顕微鏡の光学系がそのまま用いられる。更に、光分析装置１に於いては、図示の如く、複数の励起光源２が設けられていてよく、発光粒子の励起波長によって適宜、励起光の波長が選択できるようになっていてよい。同様に、検出光光路にダイクロイックミラー１４ａを挿入して、検出光を複数の波長帯域に分割して別々に複数個の光検出器１６により検出するようになっていてよい。

更にまた、本発明は、有意な背景光の存在下にて光検出領域に観測対象粒子が進入することによる光強度値の低下を検出する形式の光分析技術に適用されてもよい。その場合、光学系は上記と同様であるが、試料溶液中には、背景光を発する発光物質と、発光強度が相対的に低い観測対象粒子が分散される。

コンピュータ１８は、ＣＰＵおよびメモリを備え、ＣＰＵが各種演算処理を実行することにより、本発明の手順を実行する。なお、各手順は、ハードウェアにより構成するようにしてもよい。本実施形態で説明される処理の全て或いは一部は、それらの処理を実現するプログラムを記憶したコンピュータ読み取り可能な記憶媒体を用いて、コンピュータ１８により実行されてよい。即ち、コンピュータ１８は、記憶媒体に記憶されているプログラムを読み出して、情報の加工・演算処理を実行することにより、本発明の処理手順を実現するようになっていてよい。ここで、コンピュータ読み取り可能な記録媒体とは、磁気ディスク、光磁気ディスク、ＣＤ−ＲＯＭ、ＤＶＤ−ＲＯＭ、半導体メモリ等であってよく、或いは、上記のプログラムを通信回線によってコンピュータに配信し、この配信を受けたコンピュータがプログラムを実行するようにしても良い。

光強度の計測が実行可能であるか否かの判定機構
「発明の概要」にて触れたように、上記の光分析装置に於いて、光検出領域が試料溶液内に存在していないこと（光検出領域の位置が試料溶液からずれている、或いは、試料容器内に試料溶液が入っていないなど。）、励起光が必要な場合に励起光の集光状態に異常があること、或いは、光検出器の出力に異常があることなどに気付かずに、光検出領域からの光強度の計測を実行してしまった場合、かかる光強度の計測は無駄となってしまう。従って、光強度の計測の際には、試料溶液から光検出器までの光学系が光検出領域からの光強度の計測のために予定された状態に成っており、光強度の計測が実行可能であることを確認しておくことが望ましい。しかしながら、上記の光分析装置に於いて、対物レンズの先端領域、試料容器等の寸法は、比較的小さく、使用者が目視で確認することが困難であり得る。また、共焦点顕微鏡又は多光子顕微鏡がイメージングを目的とせず、光強度の計測を主要な目的としている場合、対物レンズの視野を観察するための機構、例えば、接眼レンズや顕微鏡像撮影用カメラ等、が設けられていないことがあり、その場合には、対物レンズの光軸方向前方の光検出領域の近傍の状態を確認することは一層困難である。

そこで、本発明では、試料容器（９，１０）の装着後に、試料容器に対する光検出領域の位置を移動させながら、光検出器から出力される信号強度の大きさを参照し、かかる信号強度の大きさに基づいて、光検出領域が試料溶液中に配置され且つ光検出領域からの光強度の計測が実行可能である状態が達成されているか否か、或いは、かかる状態が達成されている試料容器に対する光検出領域の位置若しくはその範囲が判定される。既に述べた如く、共焦点顕微鏡又は多光子顕微鏡の光学系を用いた光分析装置の場合、試料溶液から光検出器までの光学系の状態によって、励起光の散乱・反射、迷光、盲蛍光の状態や光検出器自体のノイズが変化し、光検出器により出力された信号強度に於けるバックグラウンド（背景強度）の大きさが変化する。そして、かかる変化は、通常、光検出領域内に観測対象となる粒子の存否による光強度の変化よりも大きい。従って、光検出器により出力された信号強度を参照することにより、光検出領域が試料溶液中に配置され且つ光検出領域からの光強度の計測が実行可能である状態が達成されているか否か、或いは、かかる状態が達成されている試料容器に対する光検出領域の位置若しくはその範囲の判定が、光強度の計測の前に、可能となる。

図２は、本発明に於ける上記の如き判定処理の様子を模式的に示している。同図を参照して、試料容器が図２（Ａ）に模式的に描かれている如く、複数のウェル１０が整列してなるマイクロプレート９であり、対物レンズ８が液浸式対物レンズであるとき、光強度の計測が実行可能である状態に於いては、図２（Ｂ）に模式的に示されている如く、対物レンズ８とマイクロプレート９の底面１０ｂとの間には、液体８ａが与えられ、光検出領域ＣＶは、試料溶液Ｓ内に存在する。しかしながら、図中、破線にて示されている如く、ウェル１０と対物レンズ８との位置がずれており、光検出領域ＣＶがウェル１０の壁１０ａ内に在る場合（左図）や液体８ａが無い場合、ウェル１０内に試料溶液が無い場合（右図）には、励起光の散乱光又は反射光等の強さが、光検出領域ＣＶが試料溶液Ｓ内に存在し光強度の計測が実行可能である状態とは異なり、かかる差が、光検出器により出力された信号強度に現れる。また、励起光Ｅｘが予定された態様にて照射されていない場合（励起光が照射されていない場合や集光領域が対物レンズ・ピンホールの共役の位置に無い場合など）にも、このことが光検出器により出力された信号強度に反映される。

そこで、本実施形態に於いては、好適には、図２（Ｂ）の矢印の如く、試料容器に対する対物レンズ８の位置を相対的に移動して試料容器に対する光検出領域の位置を変位させ、これと共に、光検出器により出力される信号強度が検出される。そして、コンピュータ１８には、光強度の計測が実行可能である状態に於ける光検出器により出力された信号強度を、予め記憶装置に記憶しておき、試料容器に対する対物レンズ８の位置の移動の際に検出された光検出器の出力信号強度が、上記の予め記憶された信号強度と比較され、これにより、光検出領域が任意の位置に在るときに光強度の計測が実行可能であるか否か、或いは、光強度の計測が実行可能な位置の範囲が検出できることとなる。また、更に好適には、上記に列記した種々の要因により光強度の計測が実行可能でない状態に於ける光検出器により出力された信号強度の各々を記憶装置に予め記憶しておくことにより、光検出領域が任意の位置に在るときに光強度の計測が実行可能でない場合、そのときの信号強度が、種々の要因に対応する前記の予め記憶された信号強度のいずれと略一致しているかを判定することによって、光強度の計測が実行可能でない要因が判定することが可能となる。なお、予め記憶される上記の一連の状態の信号強度は、同一の光分析装置を光強度の計測を行う場合と同一の条件下で事前計測しておくことが可能であることは理解されるべきである。即ち、各計測条件について、一度、一連の状態の信号強度を試料容器から光検出器までの光学系の状態を確認できる態様にて計測し記憶しておけば、以後、その記憶された信号強度の値が利用できることとなる。

光強度の計測が実行可能でない場合は、例えば、下記の如くであってよい。
（ｉ）励起光が照射されていない場合
（ii）光検出器が故障している場合
（iii）液浸式対物レンズの場合に対応する液体（水、シリコンオイル等）が対物レンズ先端に載置されていない場合［ドライ式対物レンズの場合、対物レンズ先端に異物が存在する場合］
（iv）光検出領域が容器の壁部に位置している場合
（ｖ）ウェル内に試料溶液が注入されていない場合
（vi）その他の場合

図３は、試料容器として、図３（Ａ）に模式的に示されている如きマイクロチューブ型の容器９ａを使用した場合の例を示している。かかるマイクロチューブ９ａは、この分野に於いて、例えば、ＰＣＲなどにて、しばしば使用されるプラスチック製のマイクロチューブの底部を平坦状に成型したものである。このマイクロチューブ９ａを使用する場合には、図３（Ｂ）に模式的に示されている如く、開口部を有する板状のアダプタに複数のマイクロチューブ９ａが装着され、マイクロチューブ９ａの底面にて対物レンズ８が液浸用の液体を介して接近される。かかる構成に於いて、本発明による判定処理を実行する際には、図示の如く、図２（Ｂ）の場合と同様に、試料容器に対する対物レンズ８の位置を相対的に移動し、これと共に、光検出器により出力される信号強度が検出される。図３（Ｃ）は、図３（Ｂ）に例示の如く、試料容器に対する対物レンズ８（水浸式対物レンズ）の相対位置を０．０５ｍｍずつ、光検出領域の位置の状態を確認しながら、移動した際の光検出器の出力の例を示したものである。なお、同図に於いて、縦軸は、光検出器の出力信号強度であり、計測単位時間（ＢＩＮ ＴＩＭＥ）当たりに検出された光子数の単位［ｋＨｚ］にて表されている（励起光が照射されていない場合には、光子は、光検出器に到達しないので、信号強度は、光検出器自体のノイズを光子数単位に換算した値である。）。また、同図に於いて、左側のプロットは、試料溶液が注入された容器に於いて得られた結果であり、右側のプロットは、空の容器に於いて得られた結果である。

図３（Ｃ）を参照して、光検出器の出力信号強度は、光検出領域が、容器の外側、容器の壁、試料溶液が存在する容器内、空の容器内のそれぞれにある場合に於いて、容器の構造に対応して変化することが理解される。より詳細には、図示の実験条件に於いて、光検出器の出力信号強度は、以下の通りであった。
（ａ）光検出領域が容器の外側に在る状態
（ａ−１）対物レンズの先端に液浸用水が無い状態 … ０．３ｋＨｚ
（ａ−２）対物レンズの先端に液浸用水が在る状態 … ０．５ｋＨｚ
（ｂ）光検出領域が容器の壁部に在る状態 … ３．０ｋＨｚ以上
（ｃ）光検出領域が容器の内側に在る状態
（ｃ−１）容器内に溶液が存在する場合 … ０．７ｋＨｚ
（ｃ−２）容器内が空の場合 … ０．２ｋＨｚ
また、励起光が照射されていない場合は、０．２ｋＨｚであり、光検出器をＯＦＦにしている場合は、０ｋＨｚであった。なお、上記の信号強度の値は、励起光強度に依存するところ、励起光強度が変化しても各々の大小関係は保存されることは確認された。上記の結果は、光検出器の出力信号強度を参照することにより、光検出領域が如何なる状態にあり、光強度の計測が実行可能であるか否かを判定でき、更に、光強度の計測が実行可能でない場合には、その原因を特定可能であることを示している。

かくして、本発明の実施形態に於いては、光強度の計測の際には、計測の実行に先立って、試料容器に対する対物レンズ８の位置を相対的に移動し、これと共に、光検出器により出力される信号強度が検出される。そして、検出された信号強度が、予め記憶された光強度の計測の実行可能である場合の値［（ｃ−１）光検出領域が試料溶液の注入された容器の内側に在る場合の値］と実質的に一致するか否かを判定することにより、光検出領域が任意の位置に在る場合に、光強度の計測が実行可能であるか否かを判定できることとなる。また、光検出器により出力される信号強度が予め記憶された光強度の計測が実行可能である場合の値と実質的に（許容される誤差の範囲で（以下同様））一致する光検出領域の位置の範囲を特定することにより、光強度の計測が実行可能な位置の範囲が決定できることとなる。更にまた、上記の如き種々の状態に於ける（光検出領域の状態が確認できる態様にて計測された）信号強度をコンピュータ１８に予め記憶しておくことにより、光強度の計測が実行可能でないと判定された場合に、光検出器により出力される信号強度が予め記憶された値のうちのいずれに実質的に一致するか若しくは近接しているかを判定して、光強度の計測が実行可能でない原因が特定できることとなる。かかる構成によれば、試料容器の載置忘れ、試料容器の位置ずれ、試料溶液の入れ忘れ、液浸用液体の載置忘れ若しくは蒸発等による喪失、誤った液浸用液体の載置、励起光の照射ミス、光検出器の異常などを気付かずに光強度の計測を実行してしまうなどの計測の失敗を予防できることが期待される。なお、上記の如く判定された光強度の計測が実行可能な位置又はその範囲は、コンピュータ１８の記憶装置に於いて、光分析装置の構成、試料容器の寸法と関連付けて記憶され、以後実行される光強度の計測の際に利用されてよい。

光検出領域を移動しながら光強度の計測を行う場合の移動経路の確認
ところで、既に触れた如く、走査分子計数法、或いは、ＦＣＳ、ＦＩＤＡ、ＰＣＨ等の幾つかの態様に於いては、図４（Ａ）に例示されている如く試料溶液内を光検出領域ＣＶにより走査しながら、光検出領域ＣＶからの光強度の計測が実行される。その場合、光検出領域の移動経路上に於いて、試料溶液から逸脱する部分や異物（図４（Ｂ）中のＸ）が存在すると、計測データに於いてそれらの部分を除外する手間・労力が必要となる。従って、試料溶液内を光検出領域により走査しながら光強度の計測を行う態様に於いては、計測前に、光検出領域の移動経路上に試料溶液から逸脱する部分や異物が存在していないことを確認しておくことが好ましい。

この点に関し、光検出領域の移動経路上に試料溶液から逸脱する部分や異物が存在する場合、それらの部分を光検出領域が通過する際には、散乱・反射の状態が変化し、背景光の変動が生ずる（通常、信号強度が極端に増大する。）。従って、前記の光強度の計測が実行可能であるか否かの判定の場合と同様に、光検出領域の移動経路上の移動中の光検出器の出力信号強度を参照することにより、試料溶液から逸脱する部分や異物の存否が判定できることとなる。

図４（Ｃ）は、光検出領域の位置を移動しながら、光強度の計測を行った場合であって、光検出領域の移動経路上に異物が存在していた場合の光強度（フォトンカウント）の計測データの例である。同図の例に於いては、励起光として、波長６４０ｎｍのレーザー光を用い、対物レンズの出射強度を１ｍＷに調整し、光検出領域を９０００ｒｐｍ（周期〜６６６７μｓｅｃ）に回転移動させた。なお、ビンタイムは１０μｓｅｃとした。同図の例の場合、光検出領域の移動周期６６６７μｓｅｃに略一致する間隔で、フォトンカウントが５０カウントを越えるピークが出現した。通常、観測対象粒子となる発光粒子（ATTO647N、ATTO633など）の発する光強度は、１０カウント程度であるので、図中の光検出領域の移動周期に同期して発生したフォトンカウントのピークは、移動経路上に固定的に存在する異物であると考えられる。また、光検出領域の移動経路が、例えば、容器の壁を横切る場合も、図３（Ｃ）の結果から理解される如く同様に観測対象粒子からは想定されないほど、大きな信号強度が出力される。

かくして、本実施形態に於いて、光検出領域の位置を移動しながら光強度の計測を行う場合には、上記の結果に例示されている如き知見に基づき、光強度の計測の実行前に、光検出領域の位置をその移動経路に沿って移動され、光検出器の出力信号強度が検出される。そして、検出された出力信号強度に於いて、適宜設定された閾値を越える値が在った場合には、移動経路上に試料溶液から逸脱する部分や異物等が存在すると判定されてよい。また、移動経路が循環経路である場合には、光検出領域の位置を複数回移動経路に沿って移動して得られた光検出器の出力信号強度に於いて、光検出領域の移動周期に同期して適宜設定された閾値を越える値が出現した場合に、移動経路上に固定的に存在する異物等が存在すると判定されてよい。そして、移動経路上に試料溶液から逸脱する部分や異物等が存在していることが判明した際には、図４（Ｂ）右図の如く、移動経路が適宜変更されてよい。

判定処理の流れ
本発明に於ける上記の判定処理は、試料容器の設置後に、光強度の計測実行に先立って、コンピュータ１８の記憶装置（図示せず）に記憶されたプログラム（試料容器に対する光検出領域の位置を移動させながら光検出器により出力された信号強度の大きさに基づいて、光検出領域が試料溶液中に配置され且つ光検出領域からの光強度の計測が実行可能であるか否か又は光強度の計測が実行可能である試料容器に対する光検出領域の位置又はその範囲を判定する判定手順、光検出領域の位置の移動経路を変更する手順）に従って実行されてよい（即ち、判定処理を実行する判定器は、光分析装置のコンピュータに於けるプログラムに従った作動により実現される。）。図５は、複数のウェルを有するマイクロプレートを用いた場合又は図３の如きアダプタに担持された複数のマイクロチューブを試料容器として用いた場合の判定処理の過程の一つの例を示している。（以下、光検出領域からの光強度の計測を「本計測」と称する。）

図５を参照して、判定処理に於いては、試料容器の設置後、使用者がコンピュータ１８に対して判定処理実行の指示入力を行うと、対物レンズ８の焦点領域（光検出領域）が試料容器の外側に位置するよう試料容器の載置されたステージが移動される（ステップ１００）。なお、可能であれば、対物レンズ８の下方のミラー偏向器７ａを作動して光検出領域を試料容器の外側へ移動してもよい。ここに於いて、光検出器の出力信号強度を検出し（ステップ１１０）、検出された出力信号強度が予め記憶された閾値Ｉｏ±Δｏの範囲内にあるか否かが判定される（ステップ１２０）。ここで予定される状態は、対物レンズ８が液浸用液体８ａを介して試料容器９の底面１０ｂへ近接した状態であるので、閾値Ｉｏは、かかる状態にて得られるべき信号強度に設定される。（例えば、閾値Ｉｏ＝０．５ｋＨｚ）Δｏは、適宜、設定されてよい誤差範囲である。

ステップ１２０の判定処理に於いて、検出された出力信号強度が閾値Ｉｏ±Δｏの範囲から逸脱しているときには、何等かの異常が存在することとなるので、検出された出力信号強度と予め記憶された異常時の信号強度値とが比較され、異常の原因が特定されてよい（ステップ１２５）。具体的には、例えば、出力信号強度の値に応じて下記の如く処置が為されてよい。
（ｉ）出力信号強度＝［液浸用液体が無い場合の値］のとき（例：０．３ｋＨｚ）
液浸水が無い可能性有り、の趣旨のメッセージを表示して、処理を終了させる。装置に自動給水機構がある場合は、自動給水を実施して再度判定処理を実行する。
（ii）出力信号強度＝［光検出器のバックグラウンド値］のとき（例：０．２ｋＨｚ）
レーザーが故障している可能性有り、の趣旨のメッセージを表示して、処理を終了させる。
（iii）出力信号強度＜［光検出器のバックグラウンド値］のとき
光検出器が故障している可能性有り、の趣旨のメッセージを表示して、処理を終了させる。

ステップ１２０の判定処理に於いて、検出された出力信号強度が閾値Ｉｏ±Δｏの範囲内にあるときには、試料容器の寸法情報に従って、対物レンズ８の焦点領域が試料容器の壁部内に位置するよう試料容器の載置されたステージが移動され（ステップ１３０）、光検出器の出力信号強度を検出し（ステップ１４０）、検出された出力信号強度が予め記憶された閾値Ｉｗ以上であるか否かが判定される（ステップ１５０）。ここに於いて予定される状態は、対物レンズ８の焦点領域が試料容器の壁部内に在る状態であるので、閾値Ｉｗは、かかる状態にて得られるべき信号強度値（例えば、閾値Ｉｗ＝３ｋＨｚ）に設定される。ここで、検出された出力信号強度が閾値Ｉｗ以上とならない場合には、ウェル又はチューブが存在しないか或いはウェル又はチューブの位置が予定された位置とずれていることが推定されるので、その旨を表示して、そのウェル又はチューブをスキップして、次のウェル又はチューブに進むか、若しくは、処理を一旦、終了させるかを使用者に選択させるようになっていてよい（ステップ１５５）。

ステップ１５０の判定処理に於いて、検出された出力信号強度が閾値Ｉｗ以上であるときには、試料容器の寸法情報に従って、対物レンズ８の焦点領域が試料容器（ウェル又はチューブ）の内側に位置するよう試料容器の載置されたステージが移動され（ステップ１６０）、光検出器の出力信号強度を検出し（ステップ１７０）、検出された出力信号強度が予め記憶された閾値Ｉｉ±Δｉの範囲内であるか否かが判定される（ステップ１８０）。ここに於いて予定される状態は、対物レンズ８の焦点領域が試料容器のウェル又はチューブ内の試料溶液中に在る状態であるので、閾値Ｉｉは、かかる状態にて得られるべき信号強度に設定される（例えば、閾値Ｉｉ＝０．７ｋＨｚ）。Δｉは、適宜、設定されてよい誤差範囲である。なお、ステップ１８０の判定は、出力信号強度が閾値Ｉｉ以上であるか否かを判定するようになっていてもよい。また、閾値Ｉｉは、本計測に使用される試料溶液の背景光に対応して設定され、例えば、観測対象粒子が濃度の低い発光粒子である場合には、実質的に発光しない溶液がウェル又はチューブ内に存在する場合の信号強度となる。一方、試料溶液中に背景光を生成する発光物質が分散されている場合には、閾値Ｉｉは、かかる発光物質が分散された溶液がウェル又はチューブ内に存在する場合の信号強度となる。

ステップ１８０の判定に於いて、検出された出力信号強度が予め記憶された閾値Ｉｉ±Δｉの範囲内でない場合（または、閾値Ｉｉ未満である場合）には、ウェル又はチューブ内に試料溶液が存在していないか、或いは、ウェル又はチューブの位置が予定された位置とずれていることが推定されるので、その旨を表示して、そのウェル又はチューブをスキップして、次のウェル又はチューブに進むか、若しくは、処理を中断させるかを使用者に選択させるようになっていてよい（ステップ１８５）。

ステップ１８０の判定に於いて、検出された出力信号強度が予め記憶された閾値Ｉｉ±Δｉの範囲内にある場合（又は閾値Ｉｉ以上である場合）には、光検出領域が試料溶液内に存在していると推定され、かくして、光強度の計測が実行可能であると判定される（ステップ１９０）。なお、試料溶液に対する対物レンズ８の焦点領域の相対的な位置を移動させて、検出される出力信号強度が予め記憶された閾値Ｉｉ±Δｉの範囲内にある（又は閾値Ｉｉ以上である）対物レンズ８の焦点領域の位置の範囲、即ち、光強度の計測が実行可能である位置の範囲が画定されてもよい。

更に、試料溶液内を光検出領域により走査しながら光検出領域からの光強度の計測を行う光分析技術が実行される場合には、試料溶液内にて光検出領域を予定された移動経路に沿って移動しながら光検出器の出力信号強度の検出が為され（ステップ２００）、出力信号強度が予め定められた閾値を越える部位が存在するか否かが確認される。かかる処理で、出力信号強度が予め定められた閾値を越える部位が存在しなければ、光強度の計測が実行可能であると判定される（ステップ２２０）。

一方、出力信号強度が予め定められた閾値を越える部位が存在したとき、以下に説明される態様にて処置が為されてよい（ステップ２２５）。具体的には、光検出領域の位置の移動が循環経路に沿って為される場合（図４（Ａ）左：回転走査）に於いて、回転走査の周期と関係なく、閾値を越えるピークが出現したときには、異物が混入している可能性有り、との趣旨のメッセージを表示して、そのまま本計測を実行するか、次のウェル又はチューブに進むか、或いは、処理を中断させるかを使用者に選択させるようになっていてよい。また、回転周期に同期して閾値を越えるピークが出現したときには、回転走査の中心を任意の距離だけ移動し（移動経路の変更）、改めて回転走査と信号強度の検出が為され、出力信号強度が予め定められた閾値を越える部位が存在するか否かが確認される。かかる処理を決められた回数実行しても回転周期に同期した閾値を越えるピークが出現する場合には、異物が混入している可能性有り、の趣旨のメッセージを表示して、そのまま本計測を実行するか、次のウェル又はチューブに進むか、或いは、処理を中断させるかを使用者に選択させるようになっていてよい。

また、光検出領域の位置の移動が非循環経路に沿って為される場合（図４（Ａ）右：ラスター走査）に於いて、複数回の走査を実行した際に、位置に関係なく、閾値を越えるピークが出現する場合には、異物が混入している可能性有り、の趣旨のメッセージを表示して、そのまま本計測を実行するか、次のウェル又はチューブに進むか、或いは、計測を中断させるかを使用者に選択させるようになっていてよい。一方、複数回の走査を実行した際に、特定の位置に閾値を越えるピークが出現し続ける場合には、走査位置を任意の距離だけ移動し（移動経路の変更）、改めてラスター走査と信号強度の検出が為され、出力信号強度が予め定められた閾値を越える部位が存在するか否かが確認される。かかる処理を決められた回数実行しても、特定の位置に閾値を越えるピークが出現する場合には、異物が混入している可能性有り、の趣旨のメッセージを表示して、そのまま本計測を実行するか、次のウェル又はチューブに進むか、或いは、処理を中断させるかを使用者に選択させるようになっていてよい。

かくして、上記の本発明の構成によれば、光検出器により出力された信号強度に基づいて、光検出領域からの光強度の計測の実行の前に、光検出領域が試料溶液中に配置され且つ光検出領域からの光強度の計測が実行可能である状態が達成されているか否かの確認が可能となるので、種々の試料溶液から光検出器までの光学系の状態の不具合に起因する計測の失敗の予防が図られることとなる。

Claims (21)

1. 共焦点顕微鏡又は多光子顕微鏡の光学系を用いて試料溶液中に配置された光検出領域からの光強度を計測し前記光強度の分析を行う光分析装置であって、
   試料容器に対する前記光検出領域の位置を移動する光検出領域位置移動器と、
   前記光検出領域からの光を検出するための光検出器と、
   前記試料容器に対する前記光検出領域の位置を移動させながら前記光検出器により出力された信号強度の大きさに基づいて、前記光検出領域が前記試料溶液中に配置され且つ前記光検出領域からの光強度の計測が実行可能であるか否か及び前記光強度の計測が実行可能である前記試料容器に対する前記光検出領域の位置又はその範囲のうちの少なくとも一つを判定する判定器と
   を含むことを特徴とする装置。
2. 請求項１の装置であって、前記判定器が、前記光検出領域が前記試料溶液中に配置され且つ前記光検出領域からの光強度の計測が実行可能であるときの第一の信号強度参照値範囲を記憶しており、前記光検出器により出力された信号強度の大きさが前記第一の光強度参照値範囲に在るとき、そのときの前記試料容器に対する前記光検出領域の位置に於いて前記光検出領域からの光強度の計測が実行可能であると判定することを特徴とする装置。
3. 請求項２の装置であって、前記光検出器により検出された光強度の大きさが前記第一の光強度参照値範囲から逸脱しているとき、前記光検出器により出力された信号強度の大きさに基づいて、前記光検出領域からの光強度の計測が実行可能でない理由が判定されることを特徴とする装置。
4. 請求項３の装置であって、（ｉ）前記試料容器内に試料溶液がない場合、（ii）対物レンズが液浸式である場合に前記対物レンズと前記試料容器との間に満たされるべき液体がない場合、（iii）前記光検出領域が前記試料容器の壁に位置している場合、（iv）前記光検出器が故障している場合及び（v）前記光強度の計測に於いて励起光の照射が必要な場合に前記励起光が予定された状態にて前記光検出領域に集光されていない場合のうちの少なくとも一つの場合の前記光検出器により出力される信号強度の大きさの範囲が予め記憶され、前記光検出器により出力される信号強度の大きさが前記予め記憶された範囲のうちの一つに在るとき、前記光検出領域からの光強度の計測が実行可能でない理由が、前記（i）〜（v）の場合のうちの前記光検出器により出力される信号強度の大きさの属する前記予め記憶された範囲に対応する場合であることが判定されることを特徴とする装置。
5. 請求項１又は２の装置であって、前記判定器が、前記光検出領域が前記試料溶液内に配置されていないときに前記光検出器により出力された信号強度の大きさに基づいて前記光検出領域からの光強度の計測が実行できない原因があるか否かを判定することを特徴とする装置。
6. 請求項１乃至５のいずれかの装置であって、前記試料溶液内に於ける前記光検出領域の位置を移動しながら前記光検出領域からの光強度の計測を行う装置にして、前記光検出領域からの光強度の計測の実行の前に前記光検出領域の位置を移動しながら前記光検出器により出力された信号強度の大きさに於いて第一の所定値を超える位置があったとき又は前記光検出領域の位置の移動周期と略同じ周期にて第二の所定値を超える位置があったときには、前記光検出領域の位置の移動経路を変更することを特徴とする装置。
7. 請求項１乃至６のいずれかの装置であって、前記判定器による前記判定が前記光検出領域からの光強度の計測の実行前に自動的に為されることを特徴とする装置。
8. 共焦点顕微鏡又は多光子顕微鏡の光学系を用いて試料溶液中に配置された光検出領域からの光強度を計測し前記光強度の分析を行う光分析方法であって、
   試料容器に対する前記光検出領域の位置を移動させる移動過程と、
   前記試料容器に対する前記光検出領域の位置を移動させながら光検出器により出力された信号強度を検出する信号検出過程と、
   前記信号強度の大きさに基づいて、前記光検出領域が前記試料溶液中に配置され且つ前記光検出領域からの光強度の計測が実行可能であるか否か及び前記光強度の計測が実行可能である前記試料容器に対する前記光検出領域の位置又はその範囲のうちの少なくとも一つを判定する判定過程と
   を含むことを特徴とする方法。
9. 請求項８の方法であって、前記判定過程に於いて、前記光検出器により出力された信号強度の大きさが、予め記憶された前記光検出領域が前記試料溶液中に配置され且つ前記光検出領域からの光強度の計測が実行可能であるときの第一の信号強度参照値範囲に在るとき、そのときの前記試料容器に対する前記光検出領域の位置に於いて前記光検出領域からの光強度の計測が実行可能であると判定されることを特徴とする方法。
10. 請求項９の方法であって、前記光検出器により検出された光強度の大きさが前記第一の光強度参照値範囲から逸脱しているとき、前記光検出器により出力された信号強度の大きさに基づいて、前記光検出領域からの光強度の計測が実行可能でない理由が判定されることを特徴とする方法。
11. 請求項１０の方法であって、前記光検出器により出力される信号強度の大きさが、予め記憶された（ｉ）前記試料容器内に試料溶液がない場合、（ii）対物レンズが液浸式である場合に前記対物レンズと前記試料容器との間に満たされるべき液体がない場合、（iii）前記光検出領域が前記試料容器の壁に位置している場合、（iv）前記光検出器が故障している場合、又は（v）前記光強度の計測に於いて励起光の照射が必要な場合に前記励起光が予定された状態にて前記光検出領域に集光されていない場合の前記光検出器により出力される信号強度の大きさの範囲のうちの一つに在るとき、前記光検出領域からの光強度の計測が実行可能でない理由が、前記（i）〜（v）の場合のうちの前記光検出器により出力される信号強度の大きさの属する前記予め記憶された範囲に対応する場合であることが判定されることを特徴とする方法。
12. 請求項８又は９の方法であって、前記判定過程に於いて、前記光検出領域が前記試料溶液内に配置されていないときに前記光検出器により出力された信号強度の大きさに基づいて前記光検出領域からの光強度の計測が実行できない原因があるか否かが判定されることを特徴とする方法。
13. 請求項８乃至１２のいずれかの方法であって、前記試料溶液内に於ける前記光検出領域の位置を移動しながら前記光検出領域からの光強度の計測を行う方法にして、前記光検出領域からの光強度の計測の実行の前に前記光検出領域の位置を移動しながら前記光検出器により出力された信号強度の大きさに於いて第一の所定値を超える位置があったとき又は前記光検出領域の位置の移動周期と略同じ周期にて第二の所定値を超える位置があったときには、前記光検出領域の位置の移動経路を変更することを特徴とする方法。
14. 請求項８乃至１３のいずれかの方法であって、前記光検出領域からの光強度の計測の実行前に前記判定過程を自動的に実行することを特徴とする方法。
15. 共焦点顕微鏡又は多光子顕微鏡の光学系を用いて試料溶液中に配置された光検出領域からの光強度を計測し前記光強度の分析を行うための光分析用コンピュータプログラムであって、
    試料容器に対する前記光検出領域の位置を移動する手順と、
    試料容器に対する前記光検出領域の位置を移動させながら光検出器により出力された信号強度を検出する手順と、
    前記信号強度の大きさに基づいて、前記光検出領域が前記試料溶液中に配置され且つ前記光検出領域からの光強度の計測が実行可能であるか否か及び／又は前記光強度の計測が実行可能である前記試料容器に対する前記光検出領域の位置又はその範囲のうちの少なくとも一つを判定する判定手順と
    をコンピュータに実行させることを特徴とするコンピュータプログラム。
16. 請求項１５のコンピュータプログラムであって、前記判定手順に於いて、前記光検出器により出力された信号強度の大きさが、予め記憶された前記光検出領域が前記試料溶液中に配置され且つ前記光検出領域からの光強度の計測が実行可能であるときの第一の信号強度参照値範囲に在るとき、そのときの前記試料容器に対する前記光検出領域の位置に於いて前記光検出領域からの光強度の計測が実行可能であると判定されることを特徴とするコンピュータプログラム。
17. 請求項１６のコンピュータプログラムであって、前記光検出器により検出された光強度の大きさが前記第一の光強度参照値範囲から逸脱しているとき、前記光検出器により出力された信号強度の大きさに基づいて、前記光検出領域からの光強度の計測が実行可能でない理由が判定されることを特徴とするコンピュータプログラム。
18. 請求項１７のコンピュータプログラムであって、前記判定手順に於いて、前記光検出器により出力される信号強度の大きさが、予め記憶された（ｉ）前記試料容器内に試料溶液がない場合、（ii）対物レンズが液浸式である場合に前記対物レンズと前記試料容器との間に満たされるべき液体がない場合、（iii）前記光検出領域が前記試料容器の壁に位置している場合、（iv）前記光検出器が故障している場合、又は（v）前記光強度の計測に於いて励起光の照射が必要な場合に前記励起光が予定された状態にて前記光検出領域に集光されていない場合の前記光検出器により出力される信号強度の大きさの範囲のうちの一つに在るとき、前記光検出領域からの光強度の計測が実行可能でない理由が、前記（i）〜（v）の場合のうちの前記光検出器により出力される信号強度の大きさの属する前記予め記憶された範囲に対応する場合であることが判定されることを特徴とするコンピュータプログラム。
19. 請求項１５又は１６のコンピュータプログラムであって、前記判定手順に於いて、前記光検出領域が前記試料溶液内に配置されていないときに前記光検出器により出力された信号強度の大きさに基づいて前記光検出領域からの光強度の計測が実行できない原因があるか否かが判定されることを特徴とするコンピュータプログラム。
20. 請求項１５乃至１９のいずれかのコンピュータプログラムであって、前記試料溶液内に於ける前記光検出領域の位置を移動しながら前記光検出領域からの光強度の計測を行うための光分析用コンピュータプログラムにして、前記光検出領域からの光強度の計測の実行の前に前記光検出領域の位置を移動しながら前記光検出器により出力された信号強度の大きさに於いて第一の所定値を超える位置があったとき又は前記光検出領域の位置の移動周期と略同じ周期にて第二の所定値を超える位置があったときには、前記光検出領域の位置の移動経路を変更する手順をコンピュータに実行させることを特徴とするコンピュータプログラム。
21. 請求項１５乃至２０のいずれかのコンピュータプログラムであって、前記光検出領域からの光強度の計測の実行前に前記判定手順を自動的にコンピュータに実行させることを特徴とするコンピュータプログラム。

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