JP2004170307A - 測定装置 - Google Patents
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Abstract
【課題】試料に関するデータを長時間安定して測定できる測定装置を提供する。
【解決手段】試料９上の測定点からの光を光検出装置６で検出し、この検出した光強度値を統計解析装置７で統計解析するとともに、データ処理装置８より光強度値に基づいて測定点を移動させる測定点移動命令を出力し、この測定点移動命令に従って測定点移動装置３により試料９上の測定点を移動させる。
【選択図】 図１
【解決手段】試料９上の測定点からの光を光検出装置６で検出し、この検出した光強度値を統計解析装置７で統計解析するとともに、データ処理装置８より光強度値に基づいて測定点を移動させる測定点移動命令を出力し、この測定点移動命令に従って測定点移動装置３により試料９上の測定点を移動させる。
【選択図】 図１
Description
【０００１】
【発明の属する技術分野】
本発明は、蛍光信号を統計解析して蛍光を測定する測定装置に関するものである。
【０００２】
【従来の技術】
従来、蛍光信号を統計解析して蛍光を測定する測定装置には、蛍光相関分光による方法を用いたものが知られている。そして、この方法を用いた蛍光相関分光装置については、例えば、「”Ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｃｅ ｃｏｒｒｅｌａｔｉｏｎ ｓｐｅｃｔｒｏｓｃｏｐｙ”Ｒ．Ｒｉｇｌｅｒ，Ｅ．Ｓ．Ｅｌｓｏｎ（ｅｄｓ．）Ｓｐｒｉｎｇｅｒ（Ｂｅｒｌｉｎ）」や、「金城政孝「蛋白質核酸酵素」（１９９９）Ｖｏｌ４４，Ｎｏ．９，Ｐ１４３１−１４３７」や特表平１１−５０２６０８号公報などで論じられている。なお、蛍光相関解析は、一定期間（１〜１０秒）断続的にデータ取得を行い、標識した物質の挙動を数値化する新規な技術であり、蛍光強度のみを数値化して重畳表示する従来の技術とは異なる。
【０００３】
このような蛍光相関分光装置は、例えば、光源装置からの励起光を集光装置を介して試料に照射し、この励起光により、試料より蛍光を発生させる。そして、この試料からの蛍光を光検出装置に入射し、この光検出装置より出力される蛍光の強度を示す光強度値を統計解析装置に入力する。これにより統計解析装置において光強度値の統計解析が行われ、光強度統計解析値を出力するようになっている。
【０００４】
このようにして蛍光の統計解析が行われるが、さらに蛍光相関解析では、粒子の蛍光強度のゆらきを測定し、この結果を解析して自己相関関数を求め、この自己相関関数から、対象とする粒子の拡散時間、濃度、大きさなどを推測するようにもしている。
【０００５】
【発明が解決しようとする課題】
ところが、例えば、試料として、励起光照射によるダメージを受けやすい細胞のデータ測定を行うような場合、試料上のダメージを受けた領域からの光強度値についても、このことを考慮することなく、統計解析装置より統計解析結果を出力するようになるため、試料からのデータを長時間安定して測定することが難しいという問題があった。
【０００６】
本発明は上記事情に鑑みてなされたもので、試料に関するデータを長時間安定して測定できる測定装置を提供することを目的とする。
【０００７】
【課題を解決するための手段】
請求項１記載の発明は、試料上の測定点からの光を検出し光強度値を出力する光検出手段と、前記光検出手段の光強度値を統計解析する統計解析手段と、前記光検出手段の光強度値に基づいて前記測定点を移動させる測定点移動命令を出力するデータ処理手段と、前記データ処理手段の測定点移動命令に従って前記試料上の測定点を移動させる測定点移動手段とを具備したことを特徴としている。
【０００８】
請求項２記載の発明は、試料上の測定点からの光を検出し光強度値を出力する光検出手段と、前記光検出手段の光強度値を統計解析する統計解析手段と、前記統計解析手段の統計解析値に基づいて前記測定点を移動させる測定点移動命令を出力するデータ処理手段と、前記データ処理手段の測定点移動命令に従って前記試料上の測定点を移動させる測定点移動手段とを具備したことを特徴としている。
【０００９】
請求項３記載の発明は、試料上の測定点からの光を検出し光強度値を出力する光検出手段と、前記光検出手段の光強度値を統計解析する統計解析手段と、前記光検出手段の光強度値に基づいて前記測定点を移動させるべく測定点異常告知の信号を出力するデータ処理手段と、前記データ処理手段の測定点異常告知の信号に従って前記試料上の測定点を移動させるべく測定点を少なくとも１個入力する測定点入力手段とを具備したことを特徴としている。
【００１０】
請求項４記載の発明は、試料上の測定点からの光を検出し光強度値を出力する光検出手段と、前記光検出手段の光強度値を統計解析する統計解析手段と、
前記統計解析手段の統計解析値に基づいて前記測定点を移動させるべく測定点異常告知の信号を出力するデータ処理手段と、前記データ処理手段の測定点異常告知の信号に従って前記試料上の測定点を移動させるべく測定点を少なくとも１個入力する測定点入力手段とを具備したことを特徴としている。
【００１１】
請求項５記載の発明は、請求項３または４記載の発明において、光検出手段が指定した測定点以外の１以上の測定点についての光強度値を出力し、統計解析手段が統計解析し、光強度値または統計値に基づく測定可能部位または測定可能領域を試料画像とともに指定可能に表示する表示手段をさらに有することを特徴としている。
【００１２】
請求項１記載の発明は、第１の実施の形態が対応する。
【００１３】
光検出手段からは、試料上の測定点からの蛍光の強度を示す光強度値が出力される。この光強度値は、統計解析手段に送られると同時に、データ処理手段にも送られる。データ処理手段は、光検出手段からの光強度値に基づいて、測定点を移動させるための測定点移動命令を出力する。測定点移動手段は、この測定点移動命令に従って試料上の測定点を移動させる。
【００１４】
これにより、試料上の測定点でのダメージなどの劣化状態を許容範囲に止めながら、長時間にわたって光強度統計解析値などのデータ収集を安定して行うことができる。
【００１５】
請求項２記載の発明は、第２の実施の形態が対応する。
【００１６】
光検出手段からは、試料上の測定点からの蛍光の強度を示す光強度値が出力される。この光強度値は、統計解析手段に送られ、ここでの統計解析値がデータ処理手段にも送られる。データ処理手段は、統計解析値に基づいて、測定点を移動させるための測定点移動命令を出力する。測定点移動手段は、この測定点移動命令に従って試料上の測定点を移動させる。
【００１７】
これにより、試料上の測定点でのダメージなどの劣化状態を許容範囲に止めながら、長時間にわたって光強度統計解析値などのデータ収集を安定して行うことができる。
【００１８】
請求項３（請求項５）記載の発明は、第１の実施の形態の変形例が対応する。
【００１９】
データ処理手段は、試料より発せられた光を検出する光検出手段からの光強度値に基づいて測定可能部位または測定可能領域を判断するとともに、測定点を移動させるべく測定点異常告知の信号を出力する。これら測定可能部位または測定可能領域は、表示手段に送られ、試料画像とともに表示される。この状態で、データ処理手段からの測定点を移動させるべく測定点異常告知に従って、測定点入力手段を使って表示画面上で測定可能部位または測定可能領域の中から次の測定点を１以上指定すると、データ処理手段より測定点移動命令が生成され、この測定点移動命令に応じて、試料上での測定点が次の測定点に移動される。
【００２０】
これによっても、試料上の測定点でのダメージなどの劣化状態を許容範囲に止めながら、長時間にわたって光強度統計解析値などのデータ収集を安定して行うことができる。
【００２１】
請求項４（請求項５）記載の発明は、第２の実施の形態の変形例が対応する。
【００２２】
データ処理手段は、統計解析手段の統計解析値に基づいて測定可能部位または測定可能領域を判断するとともに、測定点を移動させるべく測定点異常告知の信号を出力する。これら測定可能部位または測定可能領域は、表示手段に送られ、試料画像とともに表示される。この状態で、データ処理手段からの測定点を移動させるべく測定点異常告知に従って、測定点入力手段を使って次の測定点を１以上入力すると、データ処理手段より測定点移動命令が生成され、この測定点移動命令に応じて、試料上での測定点が次の測定点に移動される。
【００２３】
これによっても、試料上の測定点でのダメージなどの劣化状態を許容範囲に止めながら、長時間にわたって光強度統計解析値などのデータ収集を安定して行うことができる。
【００２４】
【発明の実施の形態】
以下、本発明の実施の形態を図面に従い説明する。
【００２５】
（第１の実施の形態）
図１は、本発明の第１の実施の形態が適用された測定装置の概略構成を示している。
【００２６】
図において、１は光源装置で、この光源装置１には、励起光発生源として、例えば発振波長４８８ｍｍのアルゴンレーザが用いられている。
【００２７】
光源装置１からの光路上には、分光装置２が配置されている。この分光装置２には、例えば波長５００ｍｍ以下の光を反射し、５００ｍｍ以上の光を透過するダイクロイックミラーが用いられる。
【００２８】
分光装置２の反射光路には、測定点移動手段としての測定点移動装置３、集光装置４および試料保持装置５が配置されている。ここで、測定点移動装置３には、ガルバノスキャナーが用いられる。集光装置４には、例えば倍率４０倍で開口数１．２の対物レンズが用いられる。さらに、試料保持装置５は、顕微鏡用試料ステージで、この試料保持装置５には、試料９が載置されている。
【００２９】
なお、試料９は、試料保持ユニット５以外の、例えばウェルのような容器などに収容されていてもよい。
【００３０】
分光装置２の透過光路には、光検出手段としての光検出装置６が配置されている。この光検出装置６には、アバランシェフォトダイオードが用いられていて、分光装置２を介して入射される試料９からの蛍光を検出し、このときの蛍光量に応じた光強度値を出力するようになっている。
【００３１】
光検出装置６には、統計解析手段としての光強度統計解析装置７が接続されている。この光強度統計解析装置７は、統計解析を行うための相関関数解析ボードが設けられており、光検出装置６より入力される光強度値を統計解析して統計解析値を求め、この結果を外部に出力するようにしている。
【００３２】
光検出装置６には、データ処理手段としてデータ処理装置８が接続されている。また、データ処理装置８には、測定点移動装置３が接続されている。
【００３３】
データ処理装置８には、パーソナルコンピューターが用いられている。データ処理装置８は、光検出装置６からの光強度値に基づいて測定点移動装置３の移動量を決定する測定点移動命令を生成するようになっている。
【００３４】
なお、試料９として細胞を観察するような場合は、細胞をローダミングリーン色素で標識することが望ましく、また、光検出装置６の光路は、共焦点光学系を構成するのが望ましい。
【００３５】
次に、このように構成した実施の形態を説明する。
【００３６】
光源装置１から励起光が出射されると、この励起光は、分光装置２で反射し、測定点移動装置３、集光装置４を通過して試料９に照射される。試料９は、励起光の照射により蛍光を発する。この試料９より発せられた蛍光は、集光装置４、測定点移動装置３を通り、分光装置２を透過して光検出装置６に入射される。
【００３７】
この場合、測定点移動装置３により試料９上の測定点の位置が制御されるが、このときの試料９上の移動位置は、励起光路と蛍光光路が一致しているので、これらの光路を一つの測定点移動装置３により移動させることができる。
【００３８】
光検出装置６は、入射される蛍光の強度に対応した光強度値を出力する。この光強度値は、光強度統計解析装置７とデータ処理装置８に送られる。
【００３９】
光強度統計解析装置７は、相関関数解析ボードにより光強度値を統計解析して光強度統計解析値を求め、この統計解析値を外部に出力する。また、データ処理装置８は、光検出装置６からの光強度値に基づいて測定点移動装置３に対する測定点移動命令を生成する。
【００４０】
このデータ処理装置８の測定点移動命令は、測定点移動装置３へ出力される。測定点移動装置３は、このときの測定点移動命令に従い、試料９上での測定点を移動させる。
【００４１】
なお、測定点の移動量が０、つまり、測定点の固定も可能である。この場合、統計解析装置７の光強度統計解析値に応じて直接測定点を移動させることができる。
【００４２】
このような第１の実施の形態によれば、例えば、励起光照射によるダメージを受けやすい試料９の測定において、試料９上のダメージを受けていない領域のみの測定を長時間行うことができる。つまり、試料９が励起光照射によりダメージを受けると、試料９からの光強度値が異常な上昇や低下を示すことがある。そこで、データ処理装置８は、光検出装置６からの光強度値が試料９が正常と判断される領域外にあると判断すると、試料９上での測定点を移動させるための測定点移動命令を出力するようなデータ処理を行う。これにより、光強度値が予め設定された所定範囲外の値を示したときには、試料９上の測定点を移動し、励起光照射によるダメージを受けていない測定点での測定を行うことにより、励起光によるダメージを受けた領域での測定を避けながら、長時間のデータの積算が可能になる。
【００４３】
ここで、測定点の移動経路の具体的な例として、測定点Ａから測定点Ｂへの２点間の移動がある。まず、測定点Ａにおいて測定を始める。測定点Ａにおいてサンプルがダメージを受けたと判断されるまで、測定点Ａにおいて測定を続ける。
【００４４】
そして、測定点Ａにおいてサンプルがダメージを受けたと判断されると、測定点Ｂに測定点を移動する。そして、この測定点Ｂにおいてサンプルがダメージを受けたと判断されるまで、測定点Ｂにおいて測定を続ける。
【００４５】
その後、測定点Ｂにおいてサンプルがダメージを受けたと判断されると、再び測定点Ａに測定点を移動する。そして、この測定点Ａにおいてサンプルがダメージを受けたと判断されるまで、測定を続ける。このような工程を、測定終了まで繰り返す。
【００４６】
このような測定点を移動しながらの測定は、励起光照射によるサンプルのダメージの蓄積に比べて、励起光を照射しない時のサンプルのダメージの回復が早いような場合に極めて有効である。この場合、測定点Ａと測定点Ｂの位置は任意であるが、これら２点でのサンプルの条件はなるべく等しいことが望ましい。例えば、サンプルが生細胞のような場合、両測定点ともに核と細胞核からの距離を等しくなるように設定すると、生化学的に条件の近い場所のみからのデータの積算が可能である。
【００４７】
測定点の移動経路の他の例として、設定点０からの等距離移動がある。
【００４８】
この場合、２次元直交座標系を用いる。設定点０の位置を（０，０）とすると、例えば、測定点を（ａ，０）、（０，ａ）、（−ａ，０）、（０，−ａ）、（ａ，０）．．．の順に繰り返し移動するようにする。ここで、ａの値は任意である。この移動の軌跡は、設定点０から距離ａの円に相当する。
【００４９】
このような測定点の移動によれば、設定点０から距離ａの地点からのデータを常にとり続けることができる。このことは、例えば、試料９上の特異点の影響を測定したい場合、設定点０を特異点に設定し、距離ａの各点測定結果から特異点に対する依存性を調べることができる。
【００５０】
なお、このような測定法は、３次元に拡張してもよいし、測定点を円状に４つではなく任意の数だけ設定することもできる。
【００５１】
従って、このようにすれば、試料９より発せられた光を検出する光検出装置６からの光強度値に基づいて、データ処理装置８より測定点移動装置３に対する測定点移動命令を生成し、この測定点移動命令に応じて、試料９上での測定点を移動させるようにしたので、試料９上の測定点のダメージなどの劣化状態を許容範囲に止めながら、長時間にわたって光強度統計解析値などの測定データの収集を安定して行うことができる。
【００５２】
（変形例）
この変形例では、図１において、さらに、データ処理装置８には、表示手段としての表示装置１０が接続されている。また、表示装置１０には、測定点入力手段としてマウスなどのポインタ手段を有する入力装置１１が接続されている。
【００５３】
この場合、データ処理装置８は、試料９より発せられた光を検出する光検出装置６からの光強度値に基づいて測定可能部位または測定可能領域を判断するとともに、測定点を移動させるべく測定点異常告知の信号（例えば警報音、警告マーク、警報色など）を出力する。
【００５４】
データ処理装置８で判断された測定可能部位または測定可能領域は、表示装置１０に送られ、表示画面上に試料９の画像とともに表示される。この場合、表示画面上での測定可能部位または測定可能領域の表示は、外部から一目で識別できる状態（例えば表示の色を変える）になっている。
【００５５】
この状態から、データ処理装置８からの測定点を移動させるべく測定点異常告知に従って、マウスを使って表示画面上で測定可能部位または測定可能領域の中から次の測定点を１以上指定する。
【００５６】
すると、表示装置１０から信号が出力され、データ処理装置８に移動先の情報が伝えられる。これにより、データ処理装置８より測定点移動装置３に対する測定点移動命令が生成され、この測定点移動命令に応じて、試料９上での測定点が次の測定点に移動される。
【００５７】
従って、このようにしても、試料９上の測定点のダメージなどの劣化状態を許容範囲に止めながら、長時間にわたって光強度統計解析値などの測定データの収集を安定して行うことができる。
【００５８】
なお、この発明の実施の形態の各構成は、当然、各種の変形、変更が可能である。例えば、試料９より発せられた光として、蛍光について述べたが、蛍光以外にも、化学発光、電気化学発光のような他の光信号を発する試料であってもよい。また、測定点移動装置３の代わりに可動式の試料保持装置を用いることができる。また、測定点移動装置３は、図中位置に限定されるものでなく、光路上の他の位置に配置してもよい。また、励起光路と検出光路の重なる領域が無いように構成すれば、分光装置２を省略することができる。さらに、試料が十分な蛍光を発する場合、光源装置１および分光装置２を省略することもできる。また、励起光学系や検出光学系を複数用いて構成したり、検出された信号を画像処理したりして、特殊な効果を得ることができる。さらには、光強度値から算出される様々な値を用いて測定点移動量を制御するようにしてもよい。
【００５９】
また、試料９は、固定化された細胞に限らず、例えば浮遊細胞や組織、あるいはポリマーなどの細胞以外のものでもよい。さらに、細胞９は、単一の細胞でなく、複数設置されてもよい。なお、タンパク質間の結合の様子として、同一細胞内の異なる細胞器官同士の比較だけでなく、同一細胞内の同種の細胞器官同士や複数細胞間の同種の細胞器官同士の比較も行ってよい。ローダミングリーン以外の蛍光物質の例として、ＧＦＰ（緑色蛍光タンパク）、シアニン系色素、ＴＡＭＲＡ、Ａｌｅｘａなどが挙げられる。これらの色素を用いるときは、本実施の形態と異なる励起光源、ダイクロイックミラーを用いる必要が生じる場合もある。標識用物質は、例えば化学的発光物質、電気化学的発光物質などの蛍光物質以外でもよい。また、統計解析は、自己相関のみでなく、相互相関であってもよい。測定点は、光軸方向に垂直な面上のみならず、３次元の任意の位置に設置されてよい。光軸方向の測定点移動は、ステージの移動を用いることなどにより可能である。
【００６０】
また、測定点移動の方式には、以下のような変形例が挙げられる。例えば、測定点の任意の一定方向に、一定距離づつ動かすようにしてもよい。また、移動予定点を全て任意に設定してもよい。移動量または移動方向の指示内容は、統計解析値または試料の画像情報に基づいてノイズおよび他の障害物の影響が無い移動位置となるように決定されてもよい。移動量または移動方向を決定するために、あらかじめ移動可能領域を画像情報により決定し、好ましくは一つ以上の移動予定点を決定して、データとして読み出し可能にデータ処理装置上に記憶しておいてもよい。
【００６１】
（第２の実施の形態）
次に、第２の実施の形態を説明する。
【００６２】
図２は、第２の実施の形態の概略構成を示すもので、図１と同一部分には、同符号を付している。
【００６３】
この場合、光強度統計解析装置７には、データ処理装置８が接続されている。データ処理装置８は、光強度統計解析装置７からの光強度統計解析値に基づいて測定点を移動させるための測定点移動命令を生成するようになっている。測定点移動装置３は、この測定点移動命令に従って測定点を移動させる。
【００６４】
その他は、図１と同様である。
【００６５】
次に、このように構成した実施の形態を説明する。
【００６６】
光源装置１から励起光が出射されると、この励起光は、分光装置２で反射し、測定点移動装置３、集光装置４を通過して試料９に照射される。試料９は、励起光の照射により蛍光を発する。この試料９より発せられた蛍光は、集光装置４、測定点移動装置３を通り、分光装置２を透過して光検出装置６に入射される。
【００６７】
この場合、測定点移動装置３により試料９上の測定点の位置が制御されるが、このときの試料９上の移動位置は、励起光路と蛍光光路が一致しているので、これらの光路を一つの測定点移動装置３により移動させることができる。
【００６８】
光検出装置６は、入射される蛍光の強度に対応した光強度値を出力する。この光強度値は、光強度統計解析装置７に送られる。
【００６９】
光強度統計解析装置７は、相関関数解析ボードにより光強度値を統計解析して統計解析値を求め、この統計解析値を外部に出力するとともに、データ処理装置８にも送られる。
【００７０】
データ処理装置８は、光強度統計解析装置７の光強度統計解析値に基づいて測定点移動装置３に対する測定点移動命令を生成する。
【００７１】
このデータ処理装置８の測定点移動命令は、測定点移動装置３へ出力される。測定点移動装置３は、このときの測定点移動命令に従い、試料９上での測定点を移動させる。
【００７２】
なお、測定点の移動量が０、つまり、測定点の固定も可能である。この場合、統計解析装置７の光強度統計解析値に応じて直接測定点を移動させることができる。
【００７３】
このような第２の実施の形態によっても、例えば、励起光照射によるダメージを受けやすい試料９の測定において、試料９上のダメージを受けていない領域のみの測定を長時間行うことができる。つまり、試料９が励起光照射によりダメージを受けると、光強度統計解析値、特に光強度統計解析値から算出される１粒子あたりのフォトンカウントが異常な上昇や低下を示すことがある。そこで、データ処理装置８において、光強度統計解析値より１粒子あたりのフォトンカウントを算出し、このときのフォトンカウントが正常と判断される領域外にあると判断すると、試料９上での測定点を移動させるための測定点移動命令を出力するようなデータ処理を行う。これにより、１粒子あたりのフォトンカウントが予め設定された所定範囲外の値を示したときには、試料９上の測定点を移動し、励起光照射によるダメージを受けていない測定点での測定おこなうことにより、励起光によるダメージを受けた領域での測定を避けながら、長時間のデータの積算が可能になる。
【００７４】
この場合も測定点の移動経路の具体的な例として、測定点Ａから測定点Ｂへの２点間の移動を考えると、まず、測定点Ａにおいて測定を始め、測定点Ａにおいてサンプルがダメージを受けたと判断されるまで、測定点Ａにおいて測定を続ける。
【００７５】
そして、測定点Ａにおいてサンプルがダメージを受けたと判断されると、測定点Ｂに測定点を移動する。そして、この測定点Ｂにおいてサンプルがダメージを受けたと判断されるまで、測定点Ｂにおいて測定を続ける。
【００７６】
その後、測定点Ｂにおいてサンプルがダメージを受けたと判断されると、再び測定点Ａに測定点を移動する。そして、この測定点Ａにおいてサンプルがダメージを受けたと判断されるまで、測定を続ける。このような工程を、測定終了まで繰り返す。
【００７７】
このような測定点を移動しながらの測定は、励起光照射によるサンプルのダメージの蓄積に比べて、励起光を照射しない時のサンプルのダメージの回復が早いような場合に極めて有効である。この場合、測定点Ａと測定点Ｂの位置は任意であるが、これら２点でのサンプルの条件はなるべく等しいことが望ましい。例えば、サンプルが生細胞のような場合、両測定点ともに核と細胞核からの距離を等しくなるように設定すると、生化学的に条件の近い場所のみからのデータの収集が可能である。
【００７８】
また、測定点の移動経路の他の例として、設定点０からの等距離移動がある。
【００７９】
この場合、２次元直交座標系を用いる。設定点０の位置を（０，０）とすると、例えば、測定点を（ａ，０）、（０，ａ）、（−ａ，０）、（０，−ａ）、（ａ，０）．．．の順に繰り返し移動するようにする。ここで、ａの値は任意である。この移動の軌跡は、設定点０から距離ａの円に相当する。
【００８０】
このような測定点の移動によれば、設定点０から距離ａの地点からのデータを常にとり続けることができる。このことは、例えば、試料９上の特異点の影響を測定したい場合、設定点０を特異点に設定し、距離ａの各点測定結果から特異点に対する依存性を調べることができる。
【００８１】
なお、このような測定法は、３次元に拡張してもよいし、測定点を円状に４つではなく任意の数だけ設定することもできる。
【００８２】
従って、このようにしても、試料９からの光を検出する光検出装置６の光強度値を光強度統計解析装置７により統計解析した光強度統計解析値に基づいて、データ処理装置８により１粒子あたりのフォトンカウントを算出し、このフォトンカウントにより測定点移動装置３に対する測定点移動命令を生成し、命令に応じて試料９上での測定点を移動させるようにしたので、試料９上の測定点のダメージなどの劣化状態を許容範囲に止めながら、長時間にわたって光強度統計解析値などの測定データの収集を安定して行うことができる。
【００８３】
（変形例）
この変形例では、図２において、さらに、データ処理装置８には、表示手段としての表示装置１２と、測定点入力手段として入力装置１３が接続されている。
【００８４】
この場合、データ処理装置８は、統計解析装置７で統計解析した光強度統計解析値に基づいて、測定可能部位または測定可能領域を判断するとともに、測定点を移動させるべく測定点異常告知の信号（例えば警報音、警告マーク、警報色など）を出力する。
【００８５】
データ処理装置８で判断された測定可能部位または測定可能領域は、表示装置１２に送られ、表示画面上に試料９の画像とともに表示される。この場合、表示画面上での測定可能部位または測定可能領域の表示は、適宜の記号または文字、数値などのＩＤによって表わされている。
【００８６】
この状態から、データ処理装置８からの測定点を移動させるべく測定点異常告知に従って、入力装置１３から表示画面上の測定可能部位または測定可能領域に対応するＩＤを１以上入力する。
【００８７】
すると、入力装置１３から信号が出力され、データ処理装置８に移動先のＩＤ信号が伝えられる。これにより、データ処理装置８より測定点移動装置３に対する測定点移動命令が生成され、この測定点移動命令に応じて、試料９上での測定点が次の測定点に移動される。
【００８８】
従って、このようにしても、試料９上の測定点のダメージなどの劣化状態を許容範囲に止めながら、長時間にわたって光強度統計解析値などの測定データの収集を安定して行うことができる。
【００８９】
なお、この発明の実施の形態の構成についても、当然、各種の変形、変更が可能である。例えば、試料９より発せられた光として、蛍光について述べたが、蛍光以外にも、化学発光、電気化学発光のような他の光信号を発する試料であってもよい。また、測定点移動装置３の代わりに可動式の試料保持装置を用いることができる。また、測定点移動装置３は、図中位置に限定されるものでなく、光路上の他の位置に配置してもよい。また、励起光路と検出光路の重なる領域が無いように構成すれば、分光装置２を省略することができる。さらに、試料が十分な蛍光を発する場合、光源装置１および分光装置２を省略することもできる。また、励起光学系や検出光学系を複数用いて構成したり、検出された信号を画像処理したりして、特殊な効果を得ることができる。さらには、光強度統計解析値から算出される、１粒子あたりのフォトンカウント以外の値を用いて測定点の移動を制御するようにしてもよい。
【００９０】
また、試料９は、固定化された細胞に限らず、例えば浮遊細胞や組織、あるいはポリマーなどの細胞以外のものでもよい。さらに、細胞９は、単一の細胞でなく、複数設置されてもよい。なお、タンパク質間の結合の様子として、同一細胞内の異なる細胞器官同士の比較だけでなく、同一細胞内の同種の細胞器官同士や複数細胞間の同種の細胞器官同士の比較も行ってよい。ローダミングリーン以外の蛍光物質の例として、ＧＦＰ（緑色蛍光タンパク）、シアニン系色素、ＴＡＭＲＡ、Ａｌｅｘａなどが挙げられる。これらの色素を用いるときは、本実施の形態と異なる励起光源、ダイクロイックミラーを用いる必要が生じる場合もある。標識用物質は、例えば化学的発光物質、電気化学的発光物質などの蛍光物質以外でもよい。また、統計解析は、自己相関のみでなく、相互相関であってもよい。測定点は、光軸方向に垂直な面上のみならず、３次元の任意の位置に設置されてよい。光軸方向の測定点移動は、ステージの移動を用いることなどにより可能である。
【００９１】
さらに、測定点移動の方式には、以下のような変形例が挙げられる。例えば、測定点の任意の一定方向に、一定距離づつ動かすようにしてもよい。また、移動予定点を全て任意に設定してもよい。移動量または移動方向の指示内容は、統計解析値または試料の画像情報に基づいてノイズおよび他の障害物の影響が無い移動位置となるように決定されてもよい。移動量または移動方向を決定するために、あらかじめ移動可能領域を画像情報により決定し、好ましくは一つ以上の移動予定点を決定して、データとして読み出し可能にデータ処理装置上に記憶しておいてもよい。
【００９２】
【発明の効果】
以上述べたように本発明によれば、試料に関するデータを長時間安定して測定できる測定装置を提供できる。
【図面の簡単な説明】
【図１】本発明の第１の実施の形態の概略構成を示す図。
【図２】本発明の第２の実施の形態の概略構成を示す図。
【符号の説明】
１…光源装置
２…分光装置
３…測定点移動装置
４…集光装置
５…試料保持装置
６…光検出装置
７…統計解析装置
８…データ処理装置
９…試料
１０、１２…表示装置
１１、１３…入力装置
【発明の属する技術分野】
本発明は、蛍光信号を統計解析して蛍光を測定する測定装置に関するものである。
【０００２】
【従来の技術】
従来、蛍光信号を統計解析して蛍光を測定する測定装置には、蛍光相関分光による方法を用いたものが知られている。そして、この方法を用いた蛍光相関分光装置については、例えば、「”Ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｃｅ ｃｏｒｒｅｌａｔｉｏｎ ｓｐｅｃｔｒｏｓｃｏｐｙ”Ｒ．Ｒｉｇｌｅｒ，Ｅ．Ｓ．Ｅｌｓｏｎ（ｅｄｓ．）Ｓｐｒｉｎｇｅｒ（Ｂｅｒｌｉｎ）」や、「金城政孝「蛋白質核酸酵素」（１９９９）Ｖｏｌ４４，Ｎｏ．９，Ｐ１４３１−１４３７」や特表平１１−５０２６０８号公報などで論じられている。なお、蛍光相関解析は、一定期間（１〜１０秒）断続的にデータ取得を行い、標識した物質の挙動を数値化する新規な技術であり、蛍光強度のみを数値化して重畳表示する従来の技術とは異なる。
【０００３】
このような蛍光相関分光装置は、例えば、光源装置からの励起光を集光装置を介して試料に照射し、この励起光により、試料より蛍光を発生させる。そして、この試料からの蛍光を光検出装置に入射し、この光検出装置より出力される蛍光の強度を示す光強度値を統計解析装置に入力する。これにより統計解析装置において光強度値の統計解析が行われ、光強度統計解析値を出力するようになっている。
【０００４】
このようにして蛍光の統計解析が行われるが、さらに蛍光相関解析では、粒子の蛍光強度のゆらきを測定し、この結果を解析して自己相関関数を求め、この自己相関関数から、対象とする粒子の拡散時間、濃度、大きさなどを推測するようにもしている。
【０００５】
【発明が解決しようとする課題】
ところが、例えば、試料として、励起光照射によるダメージを受けやすい細胞のデータ測定を行うような場合、試料上のダメージを受けた領域からの光強度値についても、このことを考慮することなく、統計解析装置より統計解析結果を出力するようになるため、試料からのデータを長時間安定して測定することが難しいという問題があった。
【０００６】
本発明は上記事情に鑑みてなされたもので、試料に関するデータを長時間安定して測定できる測定装置を提供することを目的とする。
【０００７】
【課題を解決するための手段】
請求項１記載の発明は、試料上の測定点からの光を検出し光強度値を出力する光検出手段と、前記光検出手段の光強度値を統計解析する統計解析手段と、前記光検出手段の光強度値に基づいて前記測定点を移動させる測定点移動命令を出力するデータ処理手段と、前記データ処理手段の測定点移動命令に従って前記試料上の測定点を移動させる測定点移動手段とを具備したことを特徴としている。
【０００８】
請求項２記載の発明は、試料上の測定点からの光を検出し光強度値を出力する光検出手段と、前記光検出手段の光強度値を統計解析する統計解析手段と、前記統計解析手段の統計解析値に基づいて前記測定点を移動させる測定点移動命令を出力するデータ処理手段と、前記データ処理手段の測定点移動命令に従って前記試料上の測定点を移動させる測定点移動手段とを具備したことを特徴としている。
【０００９】
請求項３記載の発明は、試料上の測定点からの光を検出し光強度値を出力する光検出手段と、前記光検出手段の光強度値を統計解析する統計解析手段と、前記光検出手段の光強度値に基づいて前記測定点を移動させるべく測定点異常告知の信号を出力するデータ処理手段と、前記データ処理手段の測定点異常告知の信号に従って前記試料上の測定点を移動させるべく測定点を少なくとも１個入力する測定点入力手段とを具備したことを特徴としている。
【００１０】
請求項４記載の発明は、試料上の測定点からの光を検出し光強度値を出力する光検出手段と、前記光検出手段の光強度値を統計解析する統計解析手段と、
前記統計解析手段の統計解析値に基づいて前記測定点を移動させるべく測定点異常告知の信号を出力するデータ処理手段と、前記データ処理手段の測定点異常告知の信号に従って前記試料上の測定点を移動させるべく測定点を少なくとも１個入力する測定点入力手段とを具備したことを特徴としている。
【００１１】
請求項５記載の発明は、請求項３または４記載の発明において、光検出手段が指定した測定点以外の１以上の測定点についての光強度値を出力し、統計解析手段が統計解析し、光強度値または統計値に基づく測定可能部位または測定可能領域を試料画像とともに指定可能に表示する表示手段をさらに有することを特徴としている。
【００１２】
請求項１記載の発明は、第１の実施の形態が対応する。
【００１３】
光検出手段からは、試料上の測定点からの蛍光の強度を示す光強度値が出力される。この光強度値は、統計解析手段に送られると同時に、データ処理手段にも送られる。データ処理手段は、光検出手段からの光強度値に基づいて、測定点を移動させるための測定点移動命令を出力する。測定点移動手段は、この測定点移動命令に従って試料上の測定点を移動させる。
【００１４】
これにより、試料上の測定点でのダメージなどの劣化状態を許容範囲に止めながら、長時間にわたって光強度統計解析値などのデータ収集を安定して行うことができる。
【００１５】
請求項２記載の発明は、第２の実施の形態が対応する。
【００１６】
光検出手段からは、試料上の測定点からの蛍光の強度を示す光強度値が出力される。この光強度値は、統計解析手段に送られ、ここでの統計解析値がデータ処理手段にも送られる。データ処理手段は、統計解析値に基づいて、測定点を移動させるための測定点移動命令を出力する。測定点移動手段は、この測定点移動命令に従って試料上の測定点を移動させる。
【００１７】
これにより、試料上の測定点でのダメージなどの劣化状態を許容範囲に止めながら、長時間にわたって光強度統計解析値などのデータ収集を安定して行うことができる。
【００１８】
請求項３（請求項５）記載の発明は、第１の実施の形態の変形例が対応する。
【００１９】
データ処理手段は、試料より発せられた光を検出する光検出手段からの光強度値に基づいて測定可能部位または測定可能領域を判断するとともに、測定点を移動させるべく測定点異常告知の信号を出力する。これら測定可能部位または測定可能領域は、表示手段に送られ、試料画像とともに表示される。この状態で、データ処理手段からの測定点を移動させるべく測定点異常告知に従って、測定点入力手段を使って表示画面上で測定可能部位または測定可能領域の中から次の測定点を１以上指定すると、データ処理手段より測定点移動命令が生成され、この測定点移動命令に応じて、試料上での測定点が次の測定点に移動される。
【００２０】
これによっても、試料上の測定点でのダメージなどの劣化状態を許容範囲に止めながら、長時間にわたって光強度統計解析値などのデータ収集を安定して行うことができる。
【００２１】
請求項４（請求項５）記載の発明は、第２の実施の形態の変形例が対応する。
【００２２】
データ処理手段は、統計解析手段の統計解析値に基づいて測定可能部位または測定可能領域を判断するとともに、測定点を移動させるべく測定点異常告知の信号を出力する。これら測定可能部位または測定可能領域は、表示手段に送られ、試料画像とともに表示される。この状態で、データ処理手段からの測定点を移動させるべく測定点異常告知に従って、測定点入力手段を使って次の測定点を１以上入力すると、データ処理手段より測定点移動命令が生成され、この測定点移動命令に応じて、試料上での測定点が次の測定点に移動される。
【００２３】
これによっても、試料上の測定点でのダメージなどの劣化状態を許容範囲に止めながら、長時間にわたって光強度統計解析値などのデータ収集を安定して行うことができる。
【００２４】
【発明の実施の形態】
以下、本発明の実施の形態を図面に従い説明する。
【００２５】
（第１の実施の形態）
図１は、本発明の第１の実施の形態が適用された測定装置の概略構成を示している。
【００２６】
図において、１は光源装置で、この光源装置１には、励起光発生源として、例えば発振波長４８８ｍｍのアルゴンレーザが用いられている。
【００２７】
光源装置１からの光路上には、分光装置２が配置されている。この分光装置２には、例えば波長５００ｍｍ以下の光を反射し、５００ｍｍ以上の光を透過するダイクロイックミラーが用いられる。
【００２８】
分光装置２の反射光路には、測定点移動手段としての測定点移動装置３、集光装置４および試料保持装置５が配置されている。ここで、測定点移動装置３には、ガルバノスキャナーが用いられる。集光装置４には、例えば倍率４０倍で開口数１．２の対物レンズが用いられる。さらに、試料保持装置５は、顕微鏡用試料ステージで、この試料保持装置５には、試料９が載置されている。
【００２９】
なお、試料９は、試料保持ユニット５以外の、例えばウェルのような容器などに収容されていてもよい。
【００３０】
分光装置２の透過光路には、光検出手段としての光検出装置６が配置されている。この光検出装置６には、アバランシェフォトダイオードが用いられていて、分光装置２を介して入射される試料９からの蛍光を検出し、このときの蛍光量に応じた光強度値を出力するようになっている。
【００３１】
光検出装置６には、統計解析手段としての光強度統計解析装置７が接続されている。この光強度統計解析装置７は、統計解析を行うための相関関数解析ボードが設けられており、光検出装置６より入力される光強度値を統計解析して統計解析値を求め、この結果を外部に出力するようにしている。
【００３２】
光検出装置６には、データ処理手段としてデータ処理装置８が接続されている。また、データ処理装置８には、測定点移動装置３が接続されている。
【００３３】
データ処理装置８には、パーソナルコンピューターが用いられている。データ処理装置８は、光検出装置６からの光強度値に基づいて測定点移動装置３の移動量を決定する測定点移動命令を生成するようになっている。
【００３４】
なお、試料９として細胞を観察するような場合は、細胞をローダミングリーン色素で標識することが望ましく、また、光検出装置６の光路は、共焦点光学系を構成するのが望ましい。
【００３５】
次に、このように構成した実施の形態を説明する。
【００３６】
光源装置１から励起光が出射されると、この励起光は、分光装置２で反射し、測定点移動装置３、集光装置４を通過して試料９に照射される。試料９は、励起光の照射により蛍光を発する。この試料９より発せられた蛍光は、集光装置４、測定点移動装置３を通り、分光装置２を透過して光検出装置６に入射される。
【００３７】
この場合、測定点移動装置３により試料９上の測定点の位置が制御されるが、このときの試料９上の移動位置は、励起光路と蛍光光路が一致しているので、これらの光路を一つの測定点移動装置３により移動させることができる。
【００３８】
光検出装置６は、入射される蛍光の強度に対応した光強度値を出力する。この光強度値は、光強度統計解析装置７とデータ処理装置８に送られる。
【００３９】
光強度統計解析装置７は、相関関数解析ボードにより光強度値を統計解析して光強度統計解析値を求め、この統計解析値を外部に出力する。また、データ処理装置８は、光検出装置６からの光強度値に基づいて測定点移動装置３に対する測定点移動命令を生成する。
【００４０】
このデータ処理装置８の測定点移動命令は、測定点移動装置３へ出力される。測定点移動装置３は、このときの測定点移動命令に従い、試料９上での測定点を移動させる。
【００４１】
なお、測定点の移動量が０、つまり、測定点の固定も可能である。この場合、統計解析装置７の光強度統計解析値に応じて直接測定点を移動させることができる。
【００４２】
このような第１の実施の形態によれば、例えば、励起光照射によるダメージを受けやすい試料９の測定において、試料９上のダメージを受けていない領域のみの測定を長時間行うことができる。つまり、試料９が励起光照射によりダメージを受けると、試料９からの光強度値が異常な上昇や低下を示すことがある。そこで、データ処理装置８は、光検出装置６からの光強度値が試料９が正常と判断される領域外にあると判断すると、試料９上での測定点を移動させるための測定点移動命令を出力するようなデータ処理を行う。これにより、光強度値が予め設定された所定範囲外の値を示したときには、試料９上の測定点を移動し、励起光照射によるダメージを受けていない測定点での測定を行うことにより、励起光によるダメージを受けた領域での測定を避けながら、長時間のデータの積算が可能になる。
【００４３】
ここで、測定点の移動経路の具体的な例として、測定点Ａから測定点Ｂへの２点間の移動がある。まず、測定点Ａにおいて測定を始める。測定点Ａにおいてサンプルがダメージを受けたと判断されるまで、測定点Ａにおいて測定を続ける。
【００４４】
そして、測定点Ａにおいてサンプルがダメージを受けたと判断されると、測定点Ｂに測定点を移動する。そして、この測定点Ｂにおいてサンプルがダメージを受けたと判断されるまで、測定点Ｂにおいて測定を続ける。
【００４５】
その後、測定点Ｂにおいてサンプルがダメージを受けたと判断されると、再び測定点Ａに測定点を移動する。そして、この測定点Ａにおいてサンプルがダメージを受けたと判断されるまで、測定を続ける。このような工程を、測定終了まで繰り返す。
【００４６】
このような測定点を移動しながらの測定は、励起光照射によるサンプルのダメージの蓄積に比べて、励起光を照射しない時のサンプルのダメージの回復が早いような場合に極めて有効である。この場合、測定点Ａと測定点Ｂの位置は任意であるが、これら２点でのサンプルの条件はなるべく等しいことが望ましい。例えば、サンプルが生細胞のような場合、両測定点ともに核と細胞核からの距離を等しくなるように設定すると、生化学的に条件の近い場所のみからのデータの積算が可能である。
【００４７】
測定点の移動経路の他の例として、設定点０からの等距離移動がある。
【００４８】
この場合、２次元直交座標系を用いる。設定点０の位置を（０，０）とすると、例えば、測定点を（ａ，０）、（０，ａ）、（−ａ，０）、（０，−ａ）、（ａ，０）．．．の順に繰り返し移動するようにする。ここで、ａの値は任意である。この移動の軌跡は、設定点０から距離ａの円に相当する。
【００４９】
このような測定点の移動によれば、設定点０から距離ａの地点からのデータを常にとり続けることができる。このことは、例えば、試料９上の特異点の影響を測定したい場合、設定点０を特異点に設定し、距離ａの各点測定結果から特異点に対する依存性を調べることができる。
【００５０】
なお、このような測定法は、３次元に拡張してもよいし、測定点を円状に４つではなく任意の数だけ設定することもできる。
【００５１】
従って、このようにすれば、試料９より発せられた光を検出する光検出装置６からの光強度値に基づいて、データ処理装置８より測定点移動装置３に対する測定点移動命令を生成し、この測定点移動命令に応じて、試料９上での測定点を移動させるようにしたので、試料９上の測定点のダメージなどの劣化状態を許容範囲に止めながら、長時間にわたって光強度統計解析値などの測定データの収集を安定して行うことができる。
【００５２】
（変形例）
この変形例では、図１において、さらに、データ処理装置８には、表示手段としての表示装置１０が接続されている。また、表示装置１０には、測定点入力手段としてマウスなどのポインタ手段を有する入力装置１１が接続されている。
【００５３】
この場合、データ処理装置８は、試料９より発せられた光を検出する光検出装置６からの光強度値に基づいて測定可能部位または測定可能領域を判断するとともに、測定点を移動させるべく測定点異常告知の信号（例えば警報音、警告マーク、警報色など）を出力する。
【００５４】
データ処理装置８で判断された測定可能部位または測定可能領域は、表示装置１０に送られ、表示画面上に試料９の画像とともに表示される。この場合、表示画面上での測定可能部位または測定可能領域の表示は、外部から一目で識別できる状態（例えば表示の色を変える）になっている。
【００５５】
この状態から、データ処理装置８からの測定点を移動させるべく測定点異常告知に従って、マウスを使って表示画面上で測定可能部位または測定可能領域の中から次の測定点を１以上指定する。
【００５６】
すると、表示装置１０から信号が出力され、データ処理装置８に移動先の情報が伝えられる。これにより、データ処理装置８より測定点移動装置３に対する測定点移動命令が生成され、この測定点移動命令に応じて、試料９上での測定点が次の測定点に移動される。
【００５７】
従って、このようにしても、試料９上の測定点のダメージなどの劣化状態を許容範囲に止めながら、長時間にわたって光強度統計解析値などの測定データの収集を安定して行うことができる。
【００５８】
なお、この発明の実施の形態の各構成は、当然、各種の変形、変更が可能である。例えば、試料９より発せられた光として、蛍光について述べたが、蛍光以外にも、化学発光、電気化学発光のような他の光信号を発する試料であってもよい。また、測定点移動装置３の代わりに可動式の試料保持装置を用いることができる。また、測定点移動装置３は、図中位置に限定されるものでなく、光路上の他の位置に配置してもよい。また、励起光路と検出光路の重なる領域が無いように構成すれば、分光装置２を省略することができる。さらに、試料が十分な蛍光を発する場合、光源装置１および分光装置２を省略することもできる。また、励起光学系や検出光学系を複数用いて構成したり、検出された信号を画像処理したりして、特殊な効果を得ることができる。さらには、光強度値から算出される様々な値を用いて測定点移動量を制御するようにしてもよい。
【００５９】
また、試料９は、固定化された細胞に限らず、例えば浮遊細胞や組織、あるいはポリマーなどの細胞以外のものでもよい。さらに、細胞９は、単一の細胞でなく、複数設置されてもよい。なお、タンパク質間の結合の様子として、同一細胞内の異なる細胞器官同士の比較だけでなく、同一細胞内の同種の細胞器官同士や複数細胞間の同種の細胞器官同士の比較も行ってよい。ローダミングリーン以外の蛍光物質の例として、ＧＦＰ（緑色蛍光タンパク）、シアニン系色素、ＴＡＭＲＡ、Ａｌｅｘａなどが挙げられる。これらの色素を用いるときは、本実施の形態と異なる励起光源、ダイクロイックミラーを用いる必要が生じる場合もある。標識用物質は、例えば化学的発光物質、電気化学的発光物質などの蛍光物質以外でもよい。また、統計解析は、自己相関のみでなく、相互相関であってもよい。測定点は、光軸方向に垂直な面上のみならず、３次元の任意の位置に設置されてよい。光軸方向の測定点移動は、ステージの移動を用いることなどにより可能である。
【００６０】
また、測定点移動の方式には、以下のような変形例が挙げられる。例えば、測定点の任意の一定方向に、一定距離づつ動かすようにしてもよい。また、移動予定点を全て任意に設定してもよい。移動量または移動方向の指示内容は、統計解析値または試料の画像情報に基づいてノイズおよび他の障害物の影響が無い移動位置となるように決定されてもよい。移動量または移動方向を決定するために、あらかじめ移動可能領域を画像情報により決定し、好ましくは一つ以上の移動予定点を決定して、データとして読み出し可能にデータ処理装置上に記憶しておいてもよい。
【００６１】
（第２の実施の形態）
次に、第２の実施の形態を説明する。
【００６２】
図２は、第２の実施の形態の概略構成を示すもので、図１と同一部分には、同符号を付している。
【００６３】
この場合、光強度統計解析装置７には、データ処理装置８が接続されている。データ処理装置８は、光強度統計解析装置７からの光強度統計解析値に基づいて測定点を移動させるための測定点移動命令を生成するようになっている。測定点移動装置３は、この測定点移動命令に従って測定点を移動させる。
【００６４】
その他は、図１と同様である。
【００６５】
次に、このように構成した実施の形態を説明する。
【００６６】
光源装置１から励起光が出射されると、この励起光は、分光装置２で反射し、測定点移動装置３、集光装置４を通過して試料９に照射される。試料９は、励起光の照射により蛍光を発する。この試料９より発せられた蛍光は、集光装置４、測定点移動装置３を通り、分光装置２を透過して光検出装置６に入射される。
【００６７】
この場合、測定点移動装置３により試料９上の測定点の位置が制御されるが、このときの試料９上の移動位置は、励起光路と蛍光光路が一致しているので、これらの光路を一つの測定点移動装置３により移動させることができる。
【００６８】
光検出装置６は、入射される蛍光の強度に対応した光強度値を出力する。この光強度値は、光強度統計解析装置７に送られる。
【００６９】
光強度統計解析装置７は、相関関数解析ボードにより光強度値を統計解析して統計解析値を求め、この統計解析値を外部に出力するとともに、データ処理装置８にも送られる。
【００７０】
データ処理装置８は、光強度統計解析装置７の光強度統計解析値に基づいて測定点移動装置３に対する測定点移動命令を生成する。
【００７１】
このデータ処理装置８の測定点移動命令は、測定点移動装置３へ出力される。測定点移動装置３は、このときの測定点移動命令に従い、試料９上での測定点を移動させる。
【００７２】
なお、測定点の移動量が０、つまり、測定点の固定も可能である。この場合、統計解析装置７の光強度統計解析値に応じて直接測定点を移動させることができる。
【００７３】
このような第２の実施の形態によっても、例えば、励起光照射によるダメージを受けやすい試料９の測定において、試料９上のダメージを受けていない領域のみの測定を長時間行うことができる。つまり、試料９が励起光照射によりダメージを受けると、光強度統計解析値、特に光強度統計解析値から算出される１粒子あたりのフォトンカウントが異常な上昇や低下を示すことがある。そこで、データ処理装置８において、光強度統計解析値より１粒子あたりのフォトンカウントを算出し、このときのフォトンカウントが正常と判断される領域外にあると判断すると、試料９上での測定点を移動させるための測定点移動命令を出力するようなデータ処理を行う。これにより、１粒子あたりのフォトンカウントが予め設定された所定範囲外の値を示したときには、試料９上の測定点を移動し、励起光照射によるダメージを受けていない測定点での測定おこなうことにより、励起光によるダメージを受けた領域での測定を避けながら、長時間のデータの積算が可能になる。
【００７４】
この場合も測定点の移動経路の具体的な例として、測定点Ａから測定点Ｂへの２点間の移動を考えると、まず、測定点Ａにおいて測定を始め、測定点Ａにおいてサンプルがダメージを受けたと判断されるまで、測定点Ａにおいて測定を続ける。
【００７５】
そして、測定点Ａにおいてサンプルがダメージを受けたと判断されると、測定点Ｂに測定点を移動する。そして、この測定点Ｂにおいてサンプルがダメージを受けたと判断されるまで、測定点Ｂにおいて測定を続ける。
【００７６】
その後、測定点Ｂにおいてサンプルがダメージを受けたと判断されると、再び測定点Ａに測定点を移動する。そして、この測定点Ａにおいてサンプルがダメージを受けたと判断されるまで、測定を続ける。このような工程を、測定終了まで繰り返す。
【００７７】
このような測定点を移動しながらの測定は、励起光照射によるサンプルのダメージの蓄積に比べて、励起光を照射しない時のサンプルのダメージの回復が早いような場合に極めて有効である。この場合、測定点Ａと測定点Ｂの位置は任意であるが、これら２点でのサンプルの条件はなるべく等しいことが望ましい。例えば、サンプルが生細胞のような場合、両測定点ともに核と細胞核からの距離を等しくなるように設定すると、生化学的に条件の近い場所のみからのデータの収集が可能である。
【００７８】
また、測定点の移動経路の他の例として、設定点０からの等距離移動がある。
【００７９】
この場合、２次元直交座標系を用いる。設定点０の位置を（０，０）とすると、例えば、測定点を（ａ，０）、（０，ａ）、（−ａ，０）、（０，−ａ）、（ａ，０）．．．の順に繰り返し移動するようにする。ここで、ａの値は任意である。この移動の軌跡は、設定点０から距離ａの円に相当する。
【００８０】
このような測定点の移動によれば、設定点０から距離ａの地点からのデータを常にとり続けることができる。このことは、例えば、試料９上の特異点の影響を測定したい場合、設定点０を特異点に設定し、距離ａの各点測定結果から特異点に対する依存性を調べることができる。
【００８１】
なお、このような測定法は、３次元に拡張してもよいし、測定点を円状に４つではなく任意の数だけ設定することもできる。
【００８２】
従って、このようにしても、試料９からの光を検出する光検出装置６の光強度値を光強度統計解析装置７により統計解析した光強度統計解析値に基づいて、データ処理装置８により１粒子あたりのフォトンカウントを算出し、このフォトンカウントにより測定点移動装置３に対する測定点移動命令を生成し、命令に応じて試料９上での測定点を移動させるようにしたので、試料９上の測定点のダメージなどの劣化状態を許容範囲に止めながら、長時間にわたって光強度統計解析値などの測定データの収集を安定して行うことができる。
【００８３】
（変形例）
この変形例では、図２において、さらに、データ処理装置８には、表示手段としての表示装置１２と、測定点入力手段として入力装置１３が接続されている。
【００８４】
この場合、データ処理装置８は、統計解析装置７で統計解析した光強度統計解析値に基づいて、測定可能部位または測定可能領域を判断するとともに、測定点を移動させるべく測定点異常告知の信号（例えば警報音、警告マーク、警報色など）を出力する。
【００８５】
データ処理装置８で判断された測定可能部位または測定可能領域は、表示装置１２に送られ、表示画面上に試料９の画像とともに表示される。この場合、表示画面上での測定可能部位または測定可能領域の表示は、適宜の記号または文字、数値などのＩＤによって表わされている。
【００８６】
この状態から、データ処理装置８からの測定点を移動させるべく測定点異常告知に従って、入力装置１３から表示画面上の測定可能部位または測定可能領域に対応するＩＤを１以上入力する。
【００８７】
すると、入力装置１３から信号が出力され、データ処理装置８に移動先のＩＤ信号が伝えられる。これにより、データ処理装置８より測定点移動装置３に対する測定点移動命令が生成され、この測定点移動命令に応じて、試料９上での測定点が次の測定点に移動される。
【００８８】
従って、このようにしても、試料９上の測定点のダメージなどの劣化状態を許容範囲に止めながら、長時間にわたって光強度統計解析値などの測定データの収集を安定して行うことができる。
【００８９】
なお、この発明の実施の形態の構成についても、当然、各種の変形、変更が可能である。例えば、試料９より発せられた光として、蛍光について述べたが、蛍光以外にも、化学発光、電気化学発光のような他の光信号を発する試料であってもよい。また、測定点移動装置３の代わりに可動式の試料保持装置を用いることができる。また、測定点移動装置３は、図中位置に限定されるものでなく、光路上の他の位置に配置してもよい。また、励起光路と検出光路の重なる領域が無いように構成すれば、分光装置２を省略することができる。さらに、試料が十分な蛍光を発する場合、光源装置１および分光装置２を省略することもできる。また、励起光学系や検出光学系を複数用いて構成したり、検出された信号を画像処理したりして、特殊な効果を得ることができる。さらには、光強度統計解析値から算出される、１粒子あたりのフォトンカウント以外の値を用いて測定点の移動を制御するようにしてもよい。
【００９０】
また、試料９は、固定化された細胞に限らず、例えば浮遊細胞や組織、あるいはポリマーなどの細胞以外のものでもよい。さらに、細胞９は、単一の細胞でなく、複数設置されてもよい。なお、タンパク質間の結合の様子として、同一細胞内の異なる細胞器官同士の比較だけでなく、同一細胞内の同種の細胞器官同士や複数細胞間の同種の細胞器官同士の比較も行ってよい。ローダミングリーン以外の蛍光物質の例として、ＧＦＰ（緑色蛍光タンパク）、シアニン系色素、ＴＡＭＲＡ、Ａｌｅｘａなどが挙げられる。これらの色素を用いるときは、本実施の形態と異なる励起光源、ダイクロイックミラーを用いる必要が生じる場合もある。標識用物質は、例えば化学的発光物質、電気化学的発光物質などの蛍光物質以外でもよい。また、統計解析は、自己相関のみでなく、相互相関であってもよい。測定点は、光軸方向に垂直な面上のみならず、３次元の任意の位置に設置されてよい。光軸方向の測定点移動は、ステージの移動を用いることなどにより可能である。
【００９１】
さらに、測定点移動の方式には、以下のような変形例が挙げられる。例えば、測定点の任意の一定方向に、一定距離づつ動かすようにしてもよい。また、移動予定点を全て任意に設定してもよい。移動量または移動方向の指示内容は、統計解析値または試料の画像情報に基づいてノイズおよび他の障害物の影響が無い移動位置となるように決定されてもよい。移動量または移動方向を決定するために、あらかじめ移動可能領域を画像情報により決定し、好ましくは一つ以上の移動予定点を決定して、データとして読み出し可能にデータ処理装置上に記憶しておいてもよい。
【００９２】
【発明の効果】
以上述べたように本発明によれば、試料に関するデータを長時間安定して測定できる測定装置を提供できる。
【図面の簡単な説明】
【図１】本発明の第１の実施の形態の概略構成を示す図。
【図２】本発明の第２の実施の形態の概略構成を示す図。
【符号の説明】
１…光源装置
２…分光装置
３…測定点移動装置
４…集光装置
５…試料保持装置
６…光検出装置
７…統計解析装置
８…データ処理装置
９…試料
１０、１２…表示装置
１１、１３…入力装置
Claims (5)
- 試料上の測定点からの光を検出し光強度値を出力する光検出手段と、
前記光検出手段の光強度値を統計解析する統計解析手段と、
前記光検出手段の光強度値に基づいて前記測定点を移動させる測定点移動命令を出力するデータ処理手段と、
前記データ処理手段の測定点移動命令に従って前記試料上の測定点を移動させる測定点移動手段と
を具備したことを特徴とする測定装置。 - 試料上の測定点からの光を検出し光強度値を出力する光検出手段と、
前記光検出手段の光強度値を統計解析する統計解析手段と、
前記統計解析手段の統計解析値に基づいて前記測定点を移動させる測定点移動命令を出力するデータ処理手段と、
前記データ処理手段の測定点移動命令に従って前記試料上の測定点を移動させる測定点移動手段と
を具備したことを特徴とする測定装置。 - 試料上の測定点からの光を検出し光強度値を出力する光検出手段と、
前記光検出手段の光強度値を統計解析する統計解析手段と、
前記光検出手段の光強度値に基づいて前記測定点を移動させるべく測定点異常告知の信号を出力するデータ処理手段と、
前記データ処理手段の測定点異常告知の信号に従って前記試料上の測定点を移動させるべく測定点を少なくとも１個入力する測定点入力手段と
を具備したことを特徴とする測定装置。 - 試料上の測定点からの光を検出し光強度値を出力する光検出手段と、
前記光検出手段の光強度値を統計解析する統計解析手段と、
前記統計解析手段の統計解析値に基づいて前記測定点を移動させるべく測定点異常告知の信号を出力するデータ処理手段と、
前記データ処理手段の測定点異常告知の信号に従って前記試料上の測定点を移動させるべく測定点を少なくとも１個入力する測定点入力手段と
を具備したことを特徴とする測定装置。 - 光検出手段が指定した測定点以外の１以上の測定点についての光強度値を出力し、統計解析手段が統計解析し、光強度値または統計値に基づく測定可能部位または測定可能領域を試料画像とともに指定可能に表示する表示手段をさらに有することを特徴とする請求項３または４記載の測定装置。
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Citations (4)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| JPH11502608A (ja) * | 1993-01-18 | 1999-03-02 | エボテック・バイオシステムズ・ゲゼルシャフト・ミット・ベシュレンクテル・ハフツング | 生体高分子の適応度を評価するための方法および装置 |
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Patent Citations (4)
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|---|---|---|---|---|
| JPH11502608A (ja) * | 1993-01-18 | 1999-03-02 | エボテック・バイオシステムズ・ゲゼルシャフト・ミット・ベシュレンクテル・ハフツング | 生体高分子の適応度を評価するための方法および装置 |
| JP2002538427A (ja) * | 1999-02-26 | 2002-11-12 | ジェネラル・スキャンニング・インコーポレイテッド | 光学式スキャナ較正装置 |
| JP2001194305A (ja) * | 2000-01-13 | 2001-07-19 | Bunshi Biophotonics Kenkyusho:Kk | 蛍光相関分光解析装置 |
| WO2002048693A1 (fr) * | 2000-12-14 | 2002-06-20 | Olympus Optical Co., Ltd. | Analyseur fluorometrique et analyse fluorometrique |
Cited By (2)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
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