JP6215454B2 - イメージフローサイトメーター、システム及び方法 - Google Patents

Description

本願は、２０１３年５月１５日に出願され、発明の名称を「走査型イメージフローサイトメーター」とする米国特許出願１３／８９４,５２１に対する優先権とその利益を主張するものであり、参照によりその全部が本明細書に取り込まれる。

本願は、フローサイトメトリーに関し、特にイメージフローサイトメーターに関する。

遺伝学、免疫学、分子生物学及び環境科学のような生命科学の分野では、生体細胞、酵母及びバクテリアなどの微小粒子状試料の分析にフローサイトメトリーが広く用いられている。一般に、５００ｎｍから５０ミクロンの粒子や細胞がフローサイトメーターにより測定可能である。フローサイトメーターで細胞などを分析する場合、一般的に、分析される細胞の表面に蛍光物質による標識が付される。次いで、フローチャンバの流路内で標識された細胞を輸送するために、水や生理的食塩水などの液体が用いられ、細胞を照射するために比較的高出力のレーザ光が所定の位置に照射される。そして、細胞の大きさや構造により生じた前方散乱光及び側方散乱光、励起光放射により生じる蛍光が観察される。細胞からの蛍光を観察する場合には、透過または散乱した励起光による悪影響を避けるため、励起光の照射経路の方向とは異なる方向に集光された蛍光を分光分析する構成が広く用いられる。各種の細胞に付着又は結合する蛍光物質は既知である。よって、蛍光の波長及び強度を観測し、重畳する強度成分を補正することで、流路内を流れる各細胞の種類が識別される。

レーザ光での細胞の測定は、個別に行う必要がある。フローチャンバには、試料を収容したバイアルなどの容器からチューブを通って、多数の微小粒子状試料が供給される。フローチャンバは、一般に、ハイドロダイナミックフォーカシングと称される手法にて微小粒子状試料が一列に並んで流動するように構成される。

ハイドロダイナミックフォーカシングについて簡単に説明する。ハイドロダイナミックフォーカシングを用いる場合、微小粒子状試料を含むサンプルフローは細長いノズルから吐出される。吐出されたサンプルフローは、例えば水又は生理的食塩水などの等浸透圧流体のシースフローに囲まれ、フローチャンバの流路を流動する。サンプルフローの吐出圧力をシースフローの吐出圧力よりも高く設定することで、ランダムに分布していた微小粒子状試料はサンプルフロー中で一列に並んで流動することができる。この現象は、流体力学では３次元（３−Ｄ）層流と称される。これにより、細胞などの微小粒子状試料のそれぞれに個別にレーザ光を照射し、その散乱光や励起蛍光を検出して分析することができる。

次に、代表的なフローサイトメトリーシステム（フローサイトメーター）について説明する。代表的なフローサイトメトメーターは、レーザ光照射光学系、フローチャンバ、検出光学系及び制御部を有する。レーザ光照射光学系は、フローチャンバ内の微小粒子状試料にレーザ光を照射する。レーザ光照射光学系は、励起する標識に対応した波長のレーザ光を出力する１以上のレーザと、レーザ光をフローチャンバに集光する集光光学系とを有する。検出光学系は、微小粒子状試料からの透過光、散乱光及び蛍光などの光の強度を検出することができる。

例えば、フローチャンバのオリフィスを通って水流が吐出される、いわゆるジェットインエアーシステムと呼ばれるシステムにおいて、オリフィスの近傍にレーザ光が照射される場合について検討する。この場合、円筒形の断面形状の水流に断面に対して略垂直な方向からレーザ光が照射すると、水流はシリンドリカルレンズとして振る舞う。よって、レーザ光は、水流と垂直な方向において扁平な楕円形のビームとして、微小粒子状試料に照射される。レーザ光の照射スポットは１０μｍ（短軸）×７０μｍ（長軸）の略楕円形や、他の形状又は大きさとすることができる。照射スポットは、例えば、微小粒子状試料の特性が決定できるように微小粒子状試料に十分なレーザ光があたる、微小粒子状試料の領域である。キュベットと呼ばれるフローチャンバを用いる場合には、水流の幅と同程度の幅の扁平ビームが微小粒子状試料などの粒子状物体の観測に用いられる。但し、異なる波長の複数のレーザビームを照射する場合には、異なる波長のレーザビーム間の迷光を減らすため、照射スポットは波長ごとに流れ方向に互いに離れて配置されるのが一般的である。

微小粒子状試料がレーザ照射スポットを通過すると、散乱光及び標識物質の励起による蛍光が生じる。散乱光には、微粒子の大きさを示す散乱角が小さい前方散乱光と、微粒子の内部構造を示す散乱角が大きい側方散乱光と、を含まれる。前方散乱光、側方散乱光及び蛍光は、それぞれ検出光学系の光検出器で検出される。蛍光は、強度が小さく、かつ、全立体角に均一に放射される。そのため、蛍光は、大きな開口数を有する集光レンズによって集光された後、光電子増倍管（ＰＭＴ：photomultiplier）と称される超高感度の光検出器で検出される。そして、制御部が、光検出器で検出された光信号に対して、増幅、アナログ−デジタル変換及び演算を行う。

更に、上述のフローサイトメーターには、細胞などの微小粒子状試料の分別採取（ソーティング）を行うための機構が設けられる。典型的な方法では、オリフィスから吐出された水流に超音波振動を与えて液滴に分離することで、液滴にはそれぞれ微小粒子状試料が含まれることとなる。そして、制御部での測定に基づいて、正又は負の電荷が液滴に印加される。正又は負の電荷を有する液滴は、強い電場を通過する際に、電荷の極性によって反対方向に偏向する。その後、偏向した液滴が捕集される。その結果、分別した細胞を種別ごとに採取でき、特定の分析や培養などに必要な特定の種類の細胞のみを得ることができる。このような分別採取機能を有するフローサイトメーターは、ソーターと称される。このような分別採取機能を有せず、分析機能のみを有するフローサイトメーターは、アナライザーと称される。

参照文献は、以下の通りである。
「真空中の流体を有するフローサイトメーターの制御」、米国特許第５，３９５，５８８号明細書 「試料分析用フローサイトメーターの調整、補償及び校正の方法、及び、そのマイクロビーズ標準キット」、米国特許第５，０９３，２３４号明細書 「流体の細胞成分の分析方法」、米国特許第５，０４７，３２１号明細書 「流体媒体中に分散された粒子の計数及び／又は測定装置」、米国特許第４，０５６，３２４号明細書 「細胞学的性質の測定装置」、米国特許第４，２２５，２２９号明細書 「光学要素内のオリフィス」、米国特許第４，３４８，１０７号明細書 「粒子分離器」、米国特許第３，３８０，５８４号明細書

また、発明の名称が「焦点絞りモジュール」である１９８０年１１月２４日に出願されて１９８３年７月２６日に出願公開された米国特許第４，３９５，６７６号、発明の名称が「液滴生成システムでの分離点変化を検出する方法及び装置」である１９８０年１１月３日に出願されて１９８４年１２月１１日に出願公開された米国特許第４，４８７，３２０号、発明の名称が「フローサイトメトリー装置での光ビームの焦点距離の延長」である１９８２年３月２５日に出願されて１９８５年２月１２日に出願公開された米国特許第４，４９８，７６６号、発明の名称が「コンピュータ制御された自動細胞識別スリット走査型サイトフローメーター」である１９７０年４月３日に出願されて１９７２年４月１８日に出願公開された米国特許第３，６５７，５３７号、Ｖａｃｃａらの米国特許第８，１５９，６７０号、米国特許出願公開第２００５／０４６８４８Ａ１、米国特許出願公開第２００５／０５７７４９、米国特許出願公開第２０１２／０２７０３０６米国特許出願公開第２０１２／２２００２２も参照文献であり、それぞれが参照により本明細書に取り込まれるものである。

また、参照文献は、以下の通りである。
Fulwyler MJ. "Electronic Separation of Biological Cells by Volume". Science 1965; 150: 910-911. Fulwyler MJ, Glascock, RB, Hiebert, RD, and Johnson NM. "Device which Separates Minute Particles According to Electronically Sensed Volume" 1969; Rev. Sci. Inst: 40: 42-48 Van Dilla MA, Mullaney PF, and Coulter JR. "Health Division Annual Report," Los Alamos Scientific Laboratory (July 1966 - June 1967). Van Dilla MA, Trujillo TT, Mullaney P., and Coulter JR. "Cell Microfluorometry: A New Method for the Rapid Measurement of biological Cells Stained with Fluorescent Dyes." Science 1969; 163: 1213-1214 Mullaney PF, Van Dilla MA, Coulter JR, and Dean PN. "A Light Scattering Photometer for Rapid Volume Determination." Rev. Sci. Instr. 1969; 40: 1029-1032 Kay and Wheeless, "Experimental findings on Gynecologic cell orientation and dynamics for three flow nozzle geometries." J. Histochem. Cytochem 1977, 25: 870

従来のフローサイトメトリーについての更なる情報は、「Shapiro, H.M., “Practical Flow Cytometry”, John Wiley & Sons, Feb 25, 2005.」で見出すことができる。

しかし、上述のような従来のフローサイトメーターは、様々な問題又は制限を有している。例えば、上述のフローサイトメーターは、微小粒子状試料からの散乱光及び蛍光の分光分析を行う。その結果、微小粒子状試料の平均サイズと種類とを区別でき、統計的分析が可能となる。しかし、従来のサイトメーターは、細胞内の微細構造を測定することができない。従来のフローサイトメトリースキームは、細胞のような微小粒子状試料の内部の蛍光点の位置を測定することができない。また、従来のスキームは、２次元（２−Ｄ）形状や３次元形状など、微小粒子状試料の形状を測定することはできない。

よって、本明細書で説明される様々な態様は、微小粒子状試料の構造を観察することができるイメージフローサイトメーターを提供する。様々な態様により、高いスループットを維持しつつ、すなわち、秒ごとに大量の粒子（又は他の微小粒子状試料）を測定しつつ、構造の観察を行うことができる。

第１の態様にかかる微小粒子状試料を観察するイメージフローサイトメーターは、前記微小粒子状試料を流れ方向に流動させることができる流路が形成されたフローチャンバと、選択された代表的サイズよりも小さな照射スポットの入射光で前記微小粒子状試料を照射するように、かつ、前記流れ方向に対して実質的に垂直な方向に前記照射スポットの照射位置を走査するように構成された、少なくとも１つの照射光学系と、フローチャンバからの結果光の光強度を検出し、前記フローチャンバを介して前記照射光学系と向き合う、又は、前記入射光の光軸から外れた位置に配置される、少なくとも１つの検出光学系と、前記検出光学系で検出された前記結果光の前記光強度の変化に応じて、前記微小粒子状試料を検出する制御部と、を有する。

第２の態様にかかる微小粒子状試料を観察するイメージフローサイトメーターは、上記のイメージフローサイトメーターであって、前記照射光学系は、前記入射光を回折限界まで収束させるように構成される。

第３の態様にかかる微小粒子状試料を観察するイメージフローサイトメーターは、上記のイメージフローサイトメーターであって、前記制御部は、前記微小粒子状試料の前記流れ方向に対して垂直である前記マイクロ流路の断面の中心を前記入射光の焦点が通過するように、前記照射光学系に前記照射位置を走査させるように構成される。

第４の態様にかかる微小粒子状試料を観察するイメージフローサイトメーターは、上記のイメージフローサイトメーターであって、前記検出光学系は、前方散乱光又は側方散乱光を含む前記結果光を検出するように構成される。

第５の態様にかかる微小粒子状試料を観察するイメージフローサイトメーターは、上記のイメージフローサイトメーターであって、前記照射光学系はレーザを有し、前記入射光はレーザ光である。

第６の態様にかかる微小粒子状試料を観察するイメージフローサイトメーターは、上記のイメージフローサイトメーターであって、前記照射光学系は、前記照射位置を走査するために、実質的に前記マイクロ流路内の前記微小粒子状試料の前記流れ方向に対して垂直な方向に沿って、前記入射光を偏向させる光デフレクタを有する。

第７の態様にかかる微小粒子状試料を観察するイメージフローサイトメーターは、上記のイメージフローサイトメーターであって、前記光デフレクタは、音響光学デフレクタ又は電気光学デフレクタである。

第８の態様にかかる微小粒子状試料を観察するイメージフローサイトメーターは、上記のイメージフローサイトメーターであって、前記制御部は、前記微小粒子状試料の流速から決定される座標及び走査速度を、前記検出光学系で検出された前記結果光の前記光強度と関連付け、前記微小粒子状試料の前記結果光の２次元分布を取得する、ように構成される。

第９の態様にかかる微小粒子状試料を観察するイメージフローサイトメーターは、上記のイメージフローサイトメーターであって、前記制御部は、前記微小粒子状試料の前記結果光の２次元分布を示す２次元画像を提供するように構成される。

第１０の態様にかかる微小粒子状試料を観察するイメージフローサイトメーターは、上記のイメージフローサイトメーターであって、前記制御部は、複数の前記検出光学系は、前記フローチャンバを介して、それぞれ複数の前記照射光学系と向き合い、前記制御部は、前記複数の検出光学系のそれぞれからの前記微小粒子状試料の前記結果光の２次元分布を取得し、取得した前記微小粒子状試料の前記結果光の２次元分布を組み合わせることで、前記微小粒子状試料の前記結果光の３次元分布を生成する、ように構成される。

第１１の態様にかかる微小粒子状試料を観察するイメージフローサイトメーターは、上記のイメージフローサイトメーターであって、前記制御部は、前記微小粒子状試料の前記結果光の３次元分布を示す３次元画像を提供するように構成される。

第１２の態様にかかる微小粒子状試料を観察するイメージフローサイトメーターは、上記のイメージフローサイトメーターであって、前記微小粒子状試料の前記流速を測定し、前記制御部へ測定結果を出力する流速測定部を更に備える。

第１３の態様にかかる微小粒子状試料を観察するイメージフローサイトメーターは、上記のイメージフローサイトメーターであって、前記制御部は、前記流速測定部からの前記測定結果に応じて、前記微小粒子状試料の前記流速を連続的に更新するように構成される。

第１４の態様にかかる微小粒子状試料を観察するイメージフローサイトメーターは、上記のイメージフローサイトメーターであって、前記流速測定部は、前記マイクロ流路内に配置され、又は、前記マイクロ流路に接続され、前記マイクロ流路を流れる前記微小粒子状試料の前記流速を観測する。

第１５の態様にかかる微小粒子状試料を観察するイメージフローサイトメーターは、上記のイメージフローサイトメーターであって、前記流速測定部は、前記照射光学系と前記制御部とを含み、前記照射光学系は、複数の回折光ビームを含む前記入射光を提供する位相格子を有し、前記照射光学系は、前記マイクロ流路の流れの前記方向の沿った互に異なる位置に前記複数の回折光ビームを指向させ、前記制御部は、前記複数の回折光ビームから選択された２つの回折光ビームの照射位置の間の距離と、前記微小粒子状試料が前記照射位置を通過するときに得られる時間差とから、前記微小粒子状試料の前記流速を算出するように構成される。

第１６の態様にかかる微小粒子状試料を観察するイメージフローサイトメーターは、上記のイメージフローサイトメーターであって、前記照射光学系は、前記流れ方向に対して実質的に垂直な方向に、前記照射位置のそれぞれを走査するように構成される。

第１７の態様にかかる微小粒子状試料を観察するイメージフローサイトメーターは、上記のイメージフローサイトメーターであって、前記照射光学系は、複数の光ビームを含む前記入射光を提供するように構成され、前記照射光学系は、互いに異なる角度で、前記複数の光ビームを前記照射スポットに指向させ、前記検出光学系は、前記光ビームのそれぞれに対応する、互いに分離された前記結果光の光強度を検出するように構成され、前記制御部は、前記分離された光強度を用いて、前記微小粒子状試料の３次元画像を算出するように構成される。

第１８の態様にかかる微小粒子状試料を観察するイメージフローサイトメーターは、上記のイメージフローサイトメーターであって、前記照射光学系は、光源と、前記複数の光ビームを含む前記入射光を提供するために前記光源からの光を回折させる位相格子と、を有する。

第１９の態様にかかる微小粒子状試料を観察するイメージフローサイトメーターは、上記のイメージフローサイトメーターであって、前記照射光学系は、照射体積にわたって前記照射位置を走査し、前記マイクロ流路は前記１つの前記微小粒子状試料のみが前記照射体積内に存在できるように形成される。

本明細書で説明する例示的な態様によれば、イメージフローサイトメーターは、微小粒子状試料のそれぞれの構造を観察することができる。微小粒子状試料よりも小さな入射光スポットを用いることで、例えば細胞内などの特徴的構造を観察することができる。

上記又は他の目的、特徴的構造及び利点は、本明細書の以下の詳細な説明及び付随する図面からより十分に理解されるであろう。図は例として与えられたものに過ぎず、したがって、本発明を限定するものとして解釈されるべきではない。

実施の形態１のかかるイメージフローサイトメーター１００の概略構成を示す構成図である。 フローチャンバ１の例示的な構成を模式的に示す斜視図である。 図２Ａの線ＩＩＢ−ＩＩＢでの平面におけるフローチャンバ１の例示的な断面構成を模式的に示す断面図である。 図２Ｂに示す例示的な合流部１６を模式的に示す拡大断面図である。 図２Ｃの線ＩＩＤ−ＩＩＤにおけるフローチャンバ１の例示的な断面構成を模式的に示す断面図である。 様々な態様にかかるマイクロ流路１２の要部を示す拡大正面図である。 図２Ｅの例示的なＹ−Ｚ断面でのマイクロ流路１２の要部を示す拡大断面図である。 照射光学系２の例示的な構成を模式的に示すブロック図である。 照射光学系２の他の構成である例示的な照射光学系２０を模式的に示すブロック図である。 検出光学系３の例示的な構成を模式的に示す構成図である。 検出光学系３の光検出器３４の構成例を示す構成図である。 検出光学系４の例示的な構成を模式的に示す構成図である。 制御部５の例示的な構成を示すブロック図である。 制御部５の他の例示的な構成を示すブロック図である。 マイクロ流路１２内を流れる微小粒子状試料６１の要部を示す図である。 時間経過による照射スポットの例示的な走査位置を示すグラフである。 一例において制御部５で検出される検出信号ＳＩＧ＿Ｔの強度を示すグラフである。 実施の形態２にかかるイメージフローサイトメーター２００の概要構成を示す構成図である。 実施の形態３にかかるイメージフローサイトメーター３００の概要構成を示す構成図である。 例示的な照射光学系７の構成を模式的に示すブロック図である。 イメージフローサイトメーター３００の検出光学系３の例示的な構成を模式的示す構成図である。 様々な態様にかかるイメージフローサイトメーター３００のマイクロ流路１２近傍を示す拡大図である。 一例にかかる検出信号ＳＩＧ＿＋１Ｔ、検出信号ＳＩＧ＿０Ｔ、検出信号ＳＩＧ＿−１Ｔのそれぞれの変動を示すタイミング図である。 ＋１次回折光Ｌ＿＋１、０次回折光Ｌ＿０、−１次回折光Ｌ＿−１が同じ位置「×」に入射する例におけるマイクロ流路１２の近傍を示す拡大図である。 観察点と観察対象物との距離が遠い場合の視角の例を示す図である。 観察点と観察対象物との距離が短い場合の視角の例を示す図である。 様々な態様にかかる３次元視差を示すマイクロ流路１２の近傍の拡大図である。 実施の形態４にかかるイメージフローサイトメーター４００の概要構成を示す構成図である。 データ処理システムのコンポーネントを示す上位図である。

添付される図面は説明のためのものであり、必ずしも縮尺に従っていない。

以下、図面を参照して実施の形態について説明する。図においては、同じ要素には同じ符号が付され、冗長な説明については適宜省略する。

実施の形態１
まず、実施の形態１にかかるイメージフローサイトメーター１００について説明する。イメージフローサイトメーター１００は、走査型イメージフローサイトメーター１００とすることができる。典型的なフローサイトメーターは、検出した信号の測定に基づいて粒子又は細胞を識別できるが、それらの信号と粒子又は細胞の位置を関連付けることは、一般に不可能である。「イメージサイトメーター」は、検出された信号と細胞又は粒子の位置との空間関係に関するデータを提供することができる。イメージサイトメーターは、例えば本明細書で説明するように、空間データを生成するために実際のイメージングカメラを用いることができ、又は、他の装置を用いることができる。

図１は、実施の形態１のかかるイメージフローサイトメーター１００の概略構成を示す構成図である。イメージフローサイトメーター１００は、フローチャンバ１、照射光学系２、検出光学系３、検出光学系４及び制御部５を有する。

照射光学系２は、例えばフローチャンバ１内の微小粒子状試料を照射するために、フローチャンバ１にレーザ光Ｌを照射する。後に詳述するように、照射光学系２は、レーザ光Ｌを回折限界まで収束させることで、フローチャンバ１にレーザ光Ｌを照射する。照射光学系２は、レーザ光Ｌでフローチャンバ１を走査することができる。フローチャンバ１を流れる微小粒子状試料にレーザ光Ｌが照射されると、透過光／前方散乱光Ｌ＿Ｔ−ＦＳと蛍光／側方散乱光Ｌ＿Ｆ−ＳＳとがフローチャンバ１から出射する。なお、蛍光と散乱光とは、フローチャンバ１から全方位に出力される。しかし、本実施の形態では説明の簡略化のため、ここではレーザ光Ｌの光軸に対して略垂直な方向に出射する蛍光及び散乱光について記述する。光は、検出光学系３及び検出光学系４で検出され、処理される。検出光学系３及び４は、それぞれ信号ＳＩＧ＿Ｔ、ＳＩＧ＿ｆを生成し、制御部５へ供給する。ＳＩＧ＿Ｔ又はＳＩＧ＿ｆは、光検出器３４に入射した光の１以上の波長又は成分のデータを含むことができる。本明細書では、検出光学系３は、配置される角度又は方向性が制限されない並列検出光学系として言及される。これについて、図１７を参照して説明する。

本明細書では、レーザ光Ｌ又はフローチャンバ１に照射される他の光を「入射光」と称する。本明細書では、フローチャンバ１を透過した光、又は、フローチャンバ１内の微小粒子状試料、染料又は他の物質から放射された他の光を、「結果光」と称する。結果光は、前方散乱（ＦＳ：forward-scattered）光及び側方散乱（ＳＳ：side-scattered）光を含むことができる。ＦＳ及びＳＳは、実質的に光源と同じ波長を有する。また、蛍光はフローチャンバ１内の物質から放射されるので、結果光は蛍光を含むことができる。結果光は、実質的に指向性（例えば、図４Ａの光検出器３４を参照して以下で説明する、レーザ光Ｌの透過光）たり得るし、又は、実質的に無指向性（例えば、蛍光）たり得る。

レーザ光Ｌの全てが微小粒子状試料６１に入射する必要はない。例えば、細胞に当たっていない照射スポットが有っても、細胞膜上で照射スポットを走査して有用な情報を収集することができる。

様々な態様においては、レーザＬは、レーザ以外の光源により供給される。光源は、例えば放物面反射鏡の焦点に配置されたランプ、レンズで集光される発光ダイオード（ＬＥＤ：light-emitting diode）などの、照射される微小粒子状試料よりも小さな照射スポットを形成するための集光が可能な任意の光源とすることができる。

一例においては、透過光／前方散乱光Ｌ＿Ｔ−ＦＳは、微小粒子状試料へのレーザ光の照射による光の散乱、屈折、吸収、偏光面の回転その他の影響を受けたコヒーレント光である。蛍光／側方散乱光Ｌ＿Ｆ−ＳＳは、インコヒーレント光である。透過光、蛍光、前方散乱光及び側方散乱光については、以下で詳述する。コヒーレントな側方散乱及び後方散乱光も検出可能である。

一態様においては、フローチャンバ１は、分析対象の微小粒子状試料が流動するマイクロ流路を有する平板型フローチャンバとして構成される。フローチャンバ１は、微小粒子状試料が、ハイドロダイナミックフォーカシングにより一列に並んでマイクロ流路を流動できるように構成される。換言すれば、フローチャンバ１では、サンプルフローは等浸透圧液体である生理的食塩水を含むシースフローに囲まれ、マイクロ流路を流動する。この場合、サンプルフローの吐出圧力は、シースフローの吐出圧力よりも高く設定される。これにより、ランダムに分布する微小粒子状試料がサンプルフロー中で一列に並んで流動する。

図２Ａは、フローチャンバ１の構成を模式的に示す斜視図である。シースフローＳＨは流入口ＩＮ１からフローチャンバ１に流れ込む。例えば、等浸透圧液体である生理的食塩水をシースフローＳＨとして用いることができる。しかし、シースフローＳＨは、生理的食塩水に限られるものではなく、水、他の水溶液（等浸透圧性であるか否かにかかわらず）及び有機溶媒などの各種の液体を用い得る。

また、微小粒子状試料を含むサンプルフローＳＭは、流入口ＩＮ２からフローチャンバ１に流れ込む。例えば、等浸透圧液体である生理的食塩水をサンプルフローＳＭとして用いることができる。しかし、サンプルフローＳＭは、生理的食塩水に限られるものではなく、水、他の水溶液（等浸透圧性であるか否かにかかわらず）及び有機溶媒などの各種の液体を用い得る。サンプルフローＳＭの流入圧力は、シースフローＳＨの流入圧力よりも高くすることができる。

シースフローＳＨとサンプルフローＳＭとはフローチャンバ１で合流し、サンプルフローＳＭがシースフローＳＨで囲まれたフローＦＬが形成される。例えば、フローチャンバ１の外部にフローＦＬを吐出することができる。

図２Ｂは、様々な態様にかかる図２Ａの線ＩＩＢ−ＩＩＢでの平面におけるフローチャンバ１の断面構成を模式的に示す断面図である。なお、図２Ｂでは、Ｙ方向に垂直かつ紙面に平行な方向をＸ方向とする。フローチャンバ１には、マイクロ流路１２、流路１３及び流路１４が、レーザ光が透過可能な平板形状部材１１上に形成される。流路１３は、フローチャンバ１の表面に穿たれたパイプラインである流入口ＩＮ１に接続される。よってシースフローＳＨは流路１３を流れる。流路１３は、例えば２つの流路に分岐される。流路１４は、例えば、フローチャンバ１の表面に穿たれたパイプラインである流入口ＩＮ２に接続される。よって、サンプルフローＳＭは流路１４を流れる。流路１４と分岐された流路１３とは合流して、マイクロ流路１２に接続される。マイクロ流路１２は、分析対象の微小粒子状試料が通過するマイクロ流路である。照射光学系２からのレーザ光Ｌは、図２Ｂの紙面の表側から裏側の方向、すなわちＹ方向に対して垂直な方向で、マイクロ流路１２に照射される。例示した成分の方向性は、この例に限られない。

図２Ｃは、様々な態様にかかる図２Ｂに示す合流部１６を模式的に示す拡大断面図である。シースフローＳＨは、サンプルフローＳＭを包み込むように、サンプルフローＦＭと合流する。この場合、サンプルフローＳＭの流入圧力はシースフローＳＨの流入圧力よりも高いので、ランダムに分布する微小粒子状試料６１が一列に並んでマイクロ流路１２内のサンプルフローＳＭ中を流動する。

図２Ｄは、様々な態様にかかる図２Ｃの線ＩＩＤ−ＩＩＤにおけるフローチャンバ１の断面構成を模式的に示す断面図である。マイクロ流路１２は、平板形状部材１１に溝として形成される。平板形状部材１１とマイクロ流路１２とは、レーザ光が透過可能な平板形状部材１７で覆われる。図２Ｂでは、照射光学系２からのレーザ光Ｌは、Ｘ方向及びＹ方向のそれぞれと垂直な方向であるＺ方向から、フローチャンバ１の上面に入射する。平板形状部材１１及び平板形状部材１７のそれぞれのＺ方向の厚みは、例えば１ｍｍである。平板形状部材１１及び平板形状部材１７は、レーザ光Ｌを透過可能な樹脂、ガラス、水晶などの光透過性の材料で形成される。

フローサイトメトリーでは、分析対象である微小粒子状試料は、しばしば生体組織の細胞である。人間の血液を例にとると、血液中の観察対象物の例としては、赤血球（直径７〜８μｍ、厚さ約２μｍ）、白血球（好中球：直径１２〜１５μｍ、好酸球：直径１０〜１５μｍ、好塩基球：直径１０〜１５μｍ、リンパ球：直径６〜１５μｍ、単球：直径２０〜３０μｍ）、及び、血小板（直径１〜４μｍ）があげられる。マイクロ流路１２は、流路内で微小粒子状試料がＹ方向に一列に並んで、重複することなく移動できる寸法で形成される。マイクロ流路１２は、例えば図２Ｂの構成においては、５０μｍ四方の断面寸法を有する。

図２Ｅは、様々な態様にかかるマイクロ流路１２の要部を示す拡大正面図である。図２Ｆは、図２ＥのＹ−Ｚ断面でのマイクロ流路１２の要部を示す拡大断面図である。マイクロ流路１２内の液体の流速は、断面中央に位置するサンプルフローＳＭ（図２Ｅ及び２Ｆの流速Ｖ１）が最も速く、かつ、シースフローＳＨがマイクロ流路１２の壁面へ向かうにつれて遅くなる（図２ＥのＶ２〜Ｖ４（Ｖ１＞Ｖ２＞Ｖ３＞Ｖ４）、図２ＦのＶ５及びＶ６（Ｖ１＞Ｖ５＞Ｖ６））、放物線状の変化を示す。その結果、マイクロ流路１２内を移動する微小粒子状試料６１は、マイクロ流路１２の断面中央付近を移動し、重心位置（Ｘ、Ｙ、Ｚ）は実質的にサンプルフローＳＭ内に収まる。よって、マイクロ流路１２の断面寸法が微小粒子状試料６１の寸法よりも大きい場合でも、複数の微小粒子状試料６１が整列し、マイクロ流路１２の断面において微小粒子状試料６１が互いに重複することなく流れ方向（図２Ｃ及び２ＤのＹ方向）一列に並んで移動できる。

図３Ａに示すように、デフレクタ２３を通過したレーザ光Ｌは、対物レンズ２４によりフローチャンバ１のマイクロ流路１２に、例えば回折限界まで収束される。一例においては、レーザ光は、約２．０μｍの半値幅のレーザスポットに収束される。以降、レーザ照射スポットは、スポット中心から光強度がスポット中心の半分となる位置までの領域として定義される。微小粒子状試料は、上述のマイクロ流路の性質により、マイクロ流路の中心付近にセルフアライメントされる。よって、レーザ光の焦点は、照射スポットにより走査される経路がマイクロ流路の中心を通過するように構成され、例えば回折限界まで収束されるレーザ光を、マイクロ流路を流動する微小粒子状試料上に照射することを容易にする。なお、この例では、レーザ光Ｌのデフレクタ２３による偏向角は小さい。従って、レーザ光がフローチャンバ１の平板形状部材１７を介して入射しても、屈折による焦点位置の変位のような影響は、無視できるほどに小さい。

図３Ｂは、照射光学系２の他の構成である照射光学系２０の構成を模式的に示すブロック図である。照射光学系２０は、図３Ａに示す照射光学系２にλ／４板２５が追加された構成を有する。λはレーザ光源２１からの光の波長である。λ／４板２５は、レーザ光Ｌの光路に配置される。例えば、λ／４板２５は、デフレクタ２３と対物レンズ２４との間に挿入される。λ／４板２５は、直線偏光を円偏光に変換する。円偏光をもたらす他の光学構造も用いることができる。生体細胞又はタンパク質は、一般的に偏光特性を示す。よって、偏光顕微鏡は、生物学的観察にとって有益である。微小粒子状試料中の材質の偏光特性を検出するには、入射光ビームは全方位で対称であることが望ましい。円偏光ビームは、この性質を示す点で好都合である。しかし、多くのＡＯＤ及びＥＯＤは入射ビームの直線偏光、典型的には垂直偏光を用いて動作する。直線偏光から円偏光への変換のために１／４波長板を挿入することで、ＡＯＤ又はＥＯＤを用いることができるようになり、かつ、円偏光の好ましい生物学的性質を保つことができる。以下で図６を参照して説明するように、ｐ及びｓ偏光成分の検出により、微小粒子状試料の偏光特性を決定できる。図４Ａ及び４Ｂに、偏光成分検出のために設計される検出光学系の例を示す。

デフレクタ２３は、コリメータ２２を通過したレーザ光Ｌの光軸方向を偏向させるデフレクタである。本実施の形態では、デフレクタ２３は、フローチャンバ１のマイクロ流路１２の断面と平行な方向（すなわち、マイクロ流路１２の流れ方向と直交する方向）にレーザ光Ｌを走査できるように構成される。この場合、デフレクタ２３は、１ＭＨｚ以上の走査周波数でＸ方向（図２Ｅの経路６２）にマイクロ流路１２を走査する。このような高速走査を実現するため、音響光学偏向器（ＡＯＤ：acoustic optical deflector）、電気光学偏向器（ＥＯＤ：electro-optic deflector）、音響光学変調器（ＡＯＭ：acoustic optic modulator）などの高周波偏向素子をデフレクタ２３として用いることができる。ＡＯＤ、ＥＯＤ及びＡＯＭは、光と、加える力（ＡＯＤ又はＡＯＭ）又は電場（ＥＯＤ）により電磁放射との相互作用を変更することができる材料と、の間の相互作用を利用する。入射光は、レーザ電子写真プリンタで用いられるような回転ポリゴンを用いて走査することができる。入射光は、電気的に角度制御が可能な微小電気機械システム（ＭＥＭＳ：microelectromechanical system）マイクロミラーを用いて走査することができる。

図３Ａに示すように、デフレクタ２３を通過したレーザ光Ｌは、対物レンズ２４によりフローチャンバ１のマイクロ流路１２に、例えば回折限界まで収束される。一例においては、レーザ光は、約２．０μｍの半値幅のレーザスポットに収束される。以降、レーザ照射スポットは、スポット中心から光強度がスポット中心の半分となる位置までの領域として定義される。微小粒子状試料は、上述のマイクロ流路の性質により、マイクロ流路の中心付近にセルフアライメントされる。よって、レーザ光の焦点は、照射スポットにより走査される経路がマイクロ流路の中心を通過するように構成され、例えば回折限界まで収束されるレーザ光を、マイクロ流路を流動する微小粒子状試料上に照射することを容易にする。なお、この例では、レーザ光Ｌのデフレクタ２３による偏向角は小さい。従って、レーザ光がフローチャンバ１の平板形状部材１３を介して入射しても、屈折による焦点位置の変位のような影響は、無視できるほどに小さい。

図３Ｂは、照射光学系２の他の構成である照射光学系２０の構成を模式的に示すブロック図である。照射光学系２０は、図３Ａに示す照射光学系２にλ／４板２５が追加された構成を有する。λはレーザ光源２１からの光の波長である。λ／４板２５は、レーザ光Ｌの光路に配置される。例えば、λ／４板２５は、デフレクタ１２と対物レンズ２４との間に挿入される。λ／４板２５は、直線偏光を円偏光に変換する。円偏光をもたらす他の光学構造も用いることができる。生体細胞又はタンパク質は、一般的に偏光特性を示す。よって、偏光顕微鏡は、生物学的観察にとって有益である。微小粒子状試料中の材質の偏光特性を検出するには、入射光ビームは全方位で対称であることが望ましい。円偏光ビームは、この性質を示す点で好都合である。しかし、多くのＡＯＤ及びＥＯＤは入射ビームの直線偏光、典型的には垂直偏光を用いて動作する。直線偏光から円偏光への変換のために１／４波長板を挿入することで、ＡＯＤ又はＥＯＤを用いることができるようになり、かつ、円偏光の好ましい生物学的性質を保つことができる。以下で図６を参照して説明するように、ｐ及びｓ偏光成分の検出により、微小粒子状試料の偏光特性を決定できる。図４Ａ及び４Ｂに、偏光成分検出のために設計される検出光学系の例を示す。

図１に戻り、イメージフローサイトメーター１００の構成について更に説明する。検出光学系３は、フローチャンバ１を介して照射光学系２と向かい合う位置に配置される。検出光学系３は、マイクロ流路１２に照射されたレーザ光の透過光を検出し、かつ、微小粒子状試料へのレーザ光照射により生じた前方散乱光も検出する。「前方散乱光」という用語は、レーザ光Ｌの光軸の進行方向に対して小さな角度で散乱された光を指す。この前方散乱光は、レーザ光が各微小粒子状試料の表面で散乱された場合に生じる散乱光、又は、レーザ光が各微小粒子状試料に照射された場合に生じる回折光又は屈性光が含まれ得る。一例においては、レーザ光で照射される微小粒子状試料が細胞である場合、前方散乱光は、例えば細胞表面の状態、核の形または有無、細胞の形、または、各細胞を通過するレーザ光の方向などに依存して変化する。

図４Ｂは、検出光学系３の光検出器３４の構成例を示す構成図である。光検出器３４は、上述の照射光学系２０と共に用いられる。光検出器３４は、偏光ビームスプリッタ３４１、ｓ偏光検出器３４３及びｐ偏光検出器３４２を有する。共焦点絞り３６を通過した光は、偏光ビームスプリッタ３４１に入射する。光Ｌ１１に含まれるｓ偏光Ｌ＿ｓはビームスプリッタ３４１で反射され、光Ｌ１１に含まれるｐ偏光Ｌ＿ｐは偏光ビームスプリッタ３４１を透過する。ｓ偏光検出器３４３は、ｓ偏光の光強度を検出し、検出信号ＳＩＧ＿Ｔｓを検出結果として出力する。ｐ偏光検出器３４２は、ｐ偏光の光強度を検出し、検出信号ＳＩＧ＿Ｔｐを検出結果として出力する。検出信号ＳＩＧ＿Ｔｓ及びＳＩＧ＿Ｔｐは、図４Ａに示す検出信号ＳＩＧ＿Ｔの一部である。

共焦点絞り３６は、例えばピンホールであり、光Ｌ１１から、少なくともレーザ光の光軸に対して選択された角度の前方散乱光を除去する。これにより、光Ｌ１１に含まれる透過光が光検出器３４に入射する。一例においては、Ｌ１１の透過光のみが光検出器３４に入射する。光検出器３４は、透過光の光強度を検出し、検出結果を検出信号ＳＩＧ＿Ｔとして出力する。

光Ｌ１２は、光Ｌ１の一部である。ブロックフィルタ３７は、光Ｌ１２の光軸に沿って伝搬する透過光を光Ｌ１２から除去する。ブロックフィルタ３７は、例えばスリット構造を有することができる。ブロックフィルタは、例えば１〜１０°の限定された散乱角成分を収集できる。これにより、光検出器３５に前方散乱光は入射できるが、透過光は入射できない（その他のいずれの余分な成分もダイクロイックミラー３２で除去されている）。光検出器３５は、光Ｌ１２に含まれる前方散乱光の光強度を検出し、検出結果を検出信号ＳＩＧ＿ＦＳとして出力する。

図４Ｂは、検出光学系３の光検出器３４の構成例を示す構成図である。光検出器３４は、上述の照射光学系２０と共に用いられる。光検出器３４は、偏光ビームスプリッタ３４１、ｓ偏光検出器３４２及びｐ偏光検出器３４３を有する。共焦点絞り３６を通過した光は、偏光ビームスプリッタ３４１に入射する。光Ｌ１１に含まれるｓ偏光Ｌ＿ｓはビームスプリッタ３４１で反射され、光Ｌ１１に含まれるｐ偏光Ｌ＿ｐは偏光ビームスプリッタ３４１を透過する。ｓ偏光検出器３４２は、ｓ偏光の光強度を検出し、検出信号ＳＩＧ＿Ｔｓを検出結果として出力する。ｐ偏光検出器３４３は、ｐ偏光の光強度を検出し、検出信号ＳＩＧ＿Ｔｐを検出結果として出力する。検出信号ＳＩＧ＿Ｔｓ及びＳＩＧ＿Ｔｐは、図４Ａに示す検出信号ＳＩＧ＿Ｔの一部である。

図１に戻り、イメージフローサイトメーター１００の構成について更に説明する。検出光学系４は、レーザ光Ｌの光軸から外れた位置に配置される。例えば、検出光学系４は、レーザ光Ｌの光軸に対して実質的に直交する方向、又は、レーザ光Ｌの光軸から少なくとも４５°離れた方向に配置される。よって、レーザ光Ｌの光軸に対して実質的に直交する方向に伝搬する蛍光が、検出光学系４に入射する。「側方散乱光」という用語は、レーザ光Ｌの光軸に対して実質的に垂直（約９０°）方向に散乱される光を指す。一般に、側方散乱光は、前方散乱光よりも光強度が弱い。一例においては、レーザ光で照射される微小粒子状試料は細胞であり、側方散乱光は細胞内の微小体又は核などの各細胞の内部構造によって生じる。

図５は、検出光学系４の例示的な構成を模式的に示す構成図である。検出光学系４は、対物レンズ４１、ダイクロイックミラーＭ１、Ｍ２及びＭ３、光電子増倍管ＰＭＴ１、ＰＭＴ２及びＰＭＴ３を有する。まず、フローチャンバ１からの蛍光／側方散乱光Ｌ＿Ｆ−ＳＳが対物レンズ４１を通過する。対物レンズ４１は、対物レンズ４１から選択された焦点距離に、入射光を結像させる。対物レンズ４１からの光は、ダイクロイックミラーＭ１に入射する。ダイクロイックミラーＭ１は、蛍光／側方散乱光Ｌ＿Ｆ−ＳＳのうちから、レーザ光の波長である波長λＬ以外の波長を有する光を反射する。これにより、蛍光Ｌｆ（または、波長λＬ以外の他の余分な成分）がダイクロイックミラーＭ２に入射する。Ｌｆは、蛍光／側方散乱光Ｌ＿Ｆ−ＳＳから、レーザ光の波長を有する側方散乱光を除去することで得られる。一例においては、蛍光Ｌｆは、３つの波長λ１、λ２、λ３（λ１＜λ２＜λ３）を含んでいる。蛍光Ｌｆに関しては、ダイクロイックミラーＭ２が波長λ１を有する蛍光Ｌｆ１のみを透過させ、波長λ２を有する蛍光Ｌｆ２と波長λ３を有する蛍光Ｌｆ３とを反射する。その後、波長λ２を有する蛍光Ｌｆ２はダイクロイックミラーＭ３を透過し、波長λ３を有する蛍光Ｌｆ３はダイクロイックミラーＭ３で反射される。

光電子増倍管ＰＭＴ１は、波長λ１を有し、ダイクロイックミラーＭ２を透過した蛍光Ｌｆ１の光強度を検出し、検出結果を検出信号ＳＩＧ＿ｆ１として出力する。光電子増倍管ＰＭＴ２は、波長λ２を有し、ダイクロイックミラーＭ３を透過した蛍光Ｌｆ２の光強度を検出し、検出結果を検出信号ＳＩＧ＿ｆ２として出力する。光電子増倍管ＰＭＴ３は、波長λ３を有し、ダイクロイックミラーＭ３で反射された蛍光Ｌｆ３の光強度を検出し、検出結果を検出信号ＳＩＧ＿ｆ３として出力する。なお、検出信号ＳＩＧ＿ｆ１〜ＳＩＧ＿ｆ１は、図１の検出信号ＳＩＧ＿ｆの一部である。

参照を図１に戻すと、制御部５は、例えばコンピュータなどの情報処理が実行可能なハードウェア資源として構成される。制御部５は、検出光学系３からの検出信号ＳＩＧ＿Ｔ及びＳＩＧ＿ＦＳ、検出光学系４からの検出信号ＳＩＧ＿ｆ１〜ＳＩＧ＿ｆ３に基づき、演算処理を行う。また、制御部５は、デフレクタ２３におけるレーザ光Ｌの偏向動作の速度及び周期を制御することもできる。制御部５に含まれ得るハードウェア及びソフトウェアの他の例については、以下で図１８を参照して説明する。

制御部５の構成例について説明する。図６は、制御部５の構成例を示すブロック図である。制御部５は、信号処理部５０、記憶部５６及び演算部５７を有する。信号処理部５０は、増幅器５１及び５２、減算器５３、加算器５４及び除算器５５を有する。信号処理部５０には、図４Ｂに示す光検出器３４から出力される検出信号ＳＩＧ＿Ｔｓ及び検出信号ＳＩＧ＿Ｔｐが入力される。

増幅器５１は、検出信号ＳＩＧ＿Ｔｓを増幅し、増幅した検出信号ＳＩＧ＿Ｔｓを減算器５３及び加算器５４へ出力する。増幅器５２は、検出信号ＳＩＧ＿Ｔｐを増幅し、増幅した検出信号ＳＩＧ＿Ｔｐを減算器５３及び加算器５４へ出力する。増幅器５１、５２は、ユニティゲイン増幅器、すなわち（アナログ又はデジタルの）バッファとすることができる。減算器５３は、検出信号ＳＩＧ＿Ｔｓから検出信号ＳＩＧ＿Ｔｐを減算し、減算結果ＲＳを除算器５５へ出力する。なお、減算器５３は、検出信号ＳＩＧ＿Ｔｐから検出信号ＳＩＧ＿Ｔｓを減算し、減算結果ＲＳを除算器５５へ出力してもよい。加算器５４は、検出信号ＳＩＧ＿Ｔｓと検出信号ＳＩＧ＿Ｔｐとを加算し、加算結果ＲＡを除算器５５へ出力する。また、加算器５４は、加算結果ＲＡを記憶部５６に書き込む。除算器５５は、例えば、減算結果ＲＳを加算結果ＲＡで除算し、除算結果ＲＤを記憶部５６に書き込む。例えば、

除算結果ＲＤは、透過光の偏光の偏りを表すことができる。

演算部５７は、記憶部５６から、加算結果ＲＡ及び除算結果ＲＤを読み出す。演算部５７は、透過光の強度を示す加算結果ＲＡを用いて、透過光強度の２次元分布（２次元画像）ＯＵＴ１を出力することができる。２次元分布は、例えば以下で図８を参照して説明するように、照射スポットの走査パターンに関連する。なお、除算結果ＲＤは、透過光の偏光の偏りを示す。よって、演算部５７は、透過光強度の２次元分布を示す２次元画像に、偏光の偏りを色彩などで表示できる。これにより、微小粒子状試料の形状のみならず、偏光の原因である微小粒子状試料内の構造を観察することも可能となる。細胞偏光画像は、蛍光又は蛍光染料を要することなく生体細胞を分析するのに用いることができる。細胞分裂も偏光観測により観察することができる。偏光は、細胞膜の脂質（例えば、脂質二重層）の構造の測定に用いることができる。例えば、細胞の固さは、２つの偏光（垂直及び水平）を用いて測定することができる。細胞の固さは、細胞の年齢と関連が有り、かつ、活性化状態を示すことができる。組織構造（例えば、アクチン又はコラーゲン）は、偏光を用いると高い方向応答性を示す。

様々な態様においては、流速、スポットサイズ、および、Ｘ軸偏向周波数パラメータは、（１）微小粒子状試料の望ましい領域の蛍光染料マーカーの励起強度レベルが閾値を超えるように、かつ、（２）望ましい走査イメージの解像度、ビット深さ、及び精細さをもたらすように設定される。様々な態様においては、スポットサイズが選択され、その後、流速と走査周波数とが制御される。例としては、半値全幅（ＦＷＨＭ）が２．０μｍ、偏向周波数が１ＭＨｚ、流速が１ｍ／ｓのスポットが挙げられる。この例では、ガウス分布のスポットの光強度の１／２よりも大きな光強度を有する１μｍの走査垂直解像度をもたらす。２μｍの半値全幅は、例えば血球のような１０μｍの粒子からのデータを有効な焦点深度にて有測定するのに好都合である。他の例においては、スポットサイズは０．５μｍであり、より高い解像度をもたらす。流速は１／４ｍ／ｓとすることができ、走査周波数を４ＭＨｚとすることができ、又は、これらの組み合わせとすることができる。一般に、スポットサイズを小さくするのと同じ割合で、流速を減少させ、又は、走査周波数を増加させることができ、その逆もまた成立する（スポットを大きくし、流速を増大又は走査周波数を減少させる）。流速は、望ましい解像度とスループットとを両立させるように選択される。速い流れは、高いスループットと低い垂直解像度をもたらす。遅い流れでは、スループットが低下するとともに、垂直解像度が改善される。水平解像度は、走査周波数とサンプリング周波数（例えば、１走査あたりのサンプル数）とで決定される。粒子の絶対的なサイズと形状とを有利に測定できるように、これらのパラメータを選択することができる。従来のフローサイトメーターは、このような測定を行う能力を提供しない。

増幅器５８１（ユニティゲインバッファとすることが可能）は、検出信号ＳＩＧ＿Ｔを増幅し、増幅した検出信号ＳＩＧ＿ＴをＡ／Ｄ変換器５８２へ供給する。Ａ／Ｄ変換器５８２は、アナログ信号である検出信号ＳＩＧ＿Ｔをデジタル信号ＳＩＧ＿ＴＤに変換する。ＦＰＧＡ５８３は、クロック信号生成器５８４からのクロック信号ＣＬＫに同期して、デジタル信号ＳＩＧ＿ＴＤを用いたデジタル信号処理を行い、透過光の強度を示す信号を演算部へ出力する。演算部５９は、例えば画像処理装置であり、ＦＰＧＡ５８３から出力された信号を用いて、透過光の強度の２次元分布を示す２次元画像を出力する。なお、検出信号ＳＩＧ＿Ｔｓ及び検出信号ＳＩＧ＿Ｔｐが検出信号ＳＩＧ＿Ｔの一部である場合には、図７に示す制御部５は、図６に示す制御部５と同様の処理を行うことができる。

続いて、イメージフローサイトメーター１００での検出動作について説明する。図８Ａは、マイクロ流路１２内を流動する微小粒子状試料６１の要部の例示的な正面図である。本実施の形態では、マイクロ流路１２の内部を、微小粒子状試料が一定の速度で流動する。本実施の形態では、例えば微小粒子状試料の流速は１ｍ／ｓである。流速１ｍ／ｓは、人間の体内の血管（末梢の毛細血管は除く）での血液の典型的な流速と実質的に同等である。よって、微小粒子状試料が人間の血球である場合には、血管内と同等の状態で観測することができる。

様々な態様においては、流速、スポットサイズ、および、Ｘ軸偏向周波数パラメータは、（１）微小粒子状試料の望ましい領域の蛍光染料マーカーの励起強度レベルが閾値を超えるように、かつ、（２）望ましい走査イメージの解像度、ビット深さ、及び精細さをもたらすように設定される。様々な態様においては、スポットサイズが選択され、その後、流速と走査周波数とが制御される。例としては、半値全幅（ＦＷＨＭ）半径が２．０μｍ、偏向周波数が１ＭＨｚ、流速が１ｍ／ｓのスポットが挙げられる。この例では、ガウス分布のスポットの光強度の１／２よりも大きな光強度を有する１μｍの走査垂直解像度をもたらす。２μｍの半値全幅は、例えば血球のような１０μｍの粒子からのデータを有効な焦点深度にて有測定するのに好都合である。他の例においては、スポットサイズは０．５μｍであり、より高い解像度をもたらす。流速は１／４ｍ／ｓとすることができ、走査周波数を４ＭＨｚとすることができ、又は、これらの組み合わせとすることができる。一般に、スポットサイズを小さくするのと同じ割合で、流速を減少させ、又は、走査周波数を増加させることができ、その逆もまた成立する（スポットを大きくし、流速を増大又は走査周波数を減少させる）。流速は、望ましい解像度とスループットとを両立させるように選択される。速い流れは、高いスループットと低い垂直解像度をもたらす。遅い流れでは、スループットが低下するとともに、垂直解像度が改善される。水平解像度は、走査周波数とサンプリング周波数（例えば、１走査あたりのサンプル数）とで決定される。粒子の絶対的なサイズと形状とを有利に測定できるように、これらのパラメータを選択することができる。従来のフローサイトメーターは、このような測定を行う能力を提供しない。

イメージフローサイトメーター１００では、デフレクタ２３（図３Ａ）がレーザ光を走査して、すなわちＸ方向かつＹ方向に実質的に照射位置を移動させる。この例では、Ｙ方向はマイクロ流路１２内の液体の流れ方向である。レーザ走査の周波数は、例えば１ＭＨｚとすることができる。一例においては、微小粒子状試料の流速が１ｍ／ｓである場合に、微小粒子状試料がＹ方向に１μｍだけ動く間に、レーザ光はＸ方向の１周期（微小粒子状試料を横切って戻る）を完了する。図８Ａでは、走査経路６３は、微小粒子状試料６１がＹ方向に動く間に、照射位置をＸ方向に走査することの効果を示している。微小粒子状試料６１内部の多くの構造や点を継続して個別に照射するように、照射位置は微小粒子状試料６１上で走査される。様々な態様では、Ｙ方向で一定の速さの粒子流がもたらされるのが好都合である。よって、Ｘ軸走査では、２次元画像のみが生成される。これは、固定試料がＸ−Ｙガルバノミラーのような２軸走査装置で走査するレーザ走査共焦点顕微鏡（例えば、ＺＥＩＳＳ ＬＳＭ ７１０）とは異なるものである。２軸走査装置は、１軸走査装置よりも、はるかに多くの駆動部品が必要であり、機械的により複雑である。単純でより信頼性の高い構造を実現するには、１軸走査装置を用いるのが好都合である。更に、１軸走査装置を用いることで大量の微小粒子状試料６１を間断なく測定することができる。レーザ走査共焦点顕微鏡は、例えばスライド上に準備された試料と、試料に焦点を合わせるために移動される顕微鏡の焦点が必要である。本明細書で説明する様々な態様は、これらのステップが必要なく、これらを要することなく２次元データを生成することができる。

例えば、微小粒子状試料が白血球の１つである好中球（直径１２〜１５μｍ）であれば、好中球を、１つの微小粒子状試料６１あたりＸ方向に１２〜１５周期程度走査（例えば、図８Ａの走査経路６３）できることとなる。この場合、好中球を走査する１２〜１５周期程度の間、光検出器３４で検出される透過光の光強度（図４Ａ）と、光検出器３５で検出される前方散乱光の光強度（図４Ａ）とが変化する。例えば、レーザ光の照射スポットが好中球の上又は内部にある場合には、レーザ光は好中球での反射、散乱、吸収などで、透過光の強度が小さくなり、前方散乱光の強度が大きくなる。これに対し、レーザ光の照射スポットがどの好中球からも外れている（照射されない）場合には、レーザ光は好中球で反射、散乱、吸収されないので、レーザ光の照射スポットが好中球の上又は内部にある場合と比べて、透過光の強度が大きくなり、前方散乱光の強度が小さくなる。

様々な態様においては、制御部５は微小粒子状試料や他の対象物の内部機構の特徴的構造を決定するため、照射光学系２及び３からの信号を処理する。例えば、ライフテクノロジー（LIFE TECHNOLOGIES）社のMITOSOX赤色ミトコンドリア超酸化物インジケータ（LIFE TECHNOLOGIES MITOSOX red mitochondrial superoxide indicator）による蛍光タグ付けを用いて、細胞内部の個々のミトコンドリアを探すことができる。ＭＩＴＯＳＯＸで染色された細胞を照射スポットで走査すると、照射スポットが生きたミトコンドリア上に来ると、赤色の蛍光が検出される。この手法では、細胞内でのミトコンドリアの位置、数及び分布を決定することができる。他の例においては、ミトコンドリアの検出のためにＤＨＲ１２３のような染料が同様に用いられる。

他の対象物の内部構造を決定することもできる。例えば、標識された核のようないかなる内部構造をも、他の細胞小器官と区別して認識することができる。他の細胞小器官も認識することができる。他の例においては、ｍＲＮＡのような、原位置ハイブリッド形成法問題を明確に認識することができる。ＲＮＡ転写は、異なる蛍光プローブにより認識することができる。

制御部５は、検出信号ＳＩＧ＿Ｔにより透過光の光強度の変動を検出し（図４Ａ）、検出信号ＳＩＧ＿ｆ１〜ＳＩＧ＿ｆ３により蛍光の光強度の変動を観測することができる（図５）。図８Ｂは、時間経過によるＸ方向の照射位置の走査を示すグラフである。図８Ｃは、制御部５で検出される検出信号ＳＩＧ＿Ｔの強度を示すグラフである。図８Ｃでは、横軸は時間（ｔ）を表す。範囲８６１は、微小粒子状試料６１の上又は中に照射スポットがある時間を示している。グラフに示されるように、レーザ光のスポットがＸ軸方向に走査されてレーザ光のスポットが微小粒子状試料６１に当たると（範囲８６１）、微小粒子状試料６１の外部でのレベルと比べて、検出信号ＳＩＧ＿Ｔのレベルが低下する（範囲８６１）。

様々な態様においては、制御部５により、例えば、ポンプのような流動誘起装置に制御信号を与えることで、マイクロ流路１２内の微小粒子状試料６１の流速が設定される。他の態様においては、制御部５は外部のフローコントローラー（図示せず）から流速を示す指標を受け取る。同様に、制御部５は、入射光の強度を制御するために照射光学系２を動作させることができ、又は、外部の光コントローラー（図示せず）から光強度に関する情報を受け取ることができる。これらの態様にいずれにおいても、制御部５は、光強度及び流速に関する情報からそれぞれの好中球の光強度分布を得ることができる。

上述の通り、本構成では、微小粒子状試料のそれぞれよりも小さな領域に収束させるために、レーザ光Ｌが収束され又は指向される。（あるいは、微小粒子状試料よりも小さなサイズのコアのレーザ光を使用可能であり、ビームが微小粒子状試料６１の走査のために指向される）。よって、本構成では、微小粒子状試料を走査することで、局所的な散乱光などのプロファイルを得ることができる。このプロファイルに基づき、走査速度、走査方向、微小粒子状試料の流速を考慮して、微小粒子状試料の２次元画像を得ることが可能となる。すなわち、本構成によれば、蛍光を用いることなく、透過光を観測することで、微小粒子状試料のそれぞれの形状を直接観察するこができる。現在のサイトメーターは、前方及び側方散乱信号を用いて、平均サイズと細胞の複雑さを測定する。蛍光は、個々の細胞の形状に関する情報を与えない。従来のサイトメーターは、対応する散乱光強度を決定するために、既知のサイズの校正ビーズを測定する。測定された細胞の強度は、サイズを推定するために校正ビーズの強度と比較される。このプロセスは、校正ステップを必要とし、高いレベルの正確性を有する結果をもたらさない。反対に、本発明の走査型イメージサイトメーターは、２−Ｄ透過光画像に偏光（図４ＢのＳＩＧ＿Ｔｐ及びＳＩＧ＿Ｔｓ）を加え、及び、蛍光に（ｘ，ｙ）位置（図５のＳＩＧ＿ｆｎ、ｎ∈［１，２，３］）を与えることができる。２つの画像を組み合わせることで、細胞又は他の微小粒子状試料の完全な形状、構造及び蛍光に、（ｘ，ｙ）位置を与えることができる。様々な態様においては、複合２次元画像を用いて、微小粒子状試料６１について３次元構造を決定することができる。決定された３次元構造は、微小粒子状試料の蛍光プローブの位置を決定するために処理される。

以下、本構成で得られる他の利点について説明する。本構成では、各試料に照射されたレーザ光は、光学系の回折限界まで収束させるために集中及び指向され、光密度が増大する。これにより、試料の検出感度及び空間分解能が向上する。一例においては、波長λのレーザの照射スポットλ／１．４からλ／２の直径を有する。結果として、極小の微小粒子状試料、例えばウイルスのようなサブミクロンサイズからナノメーターサイズの試料を検出することができる。このような微小試料は、従来のフローサイトメーターでは検出できない。更に、レーザ光は微小領域を照射するように指向されるので、典型的なフローサイトメーターと比べて、照射照度（Ｗ／ｍ^２）を減少させることなくレーザ光源のトータルの光出力を減少させることができる。様々な態様においては、照射光学系２は、微小粒子状試料、微小粒子状試料内のいずれの蛍光染料及び測定される他の成分又は構造の性質に基づいて選択された微小粒子状試料への照射照度を与えるように構成される。

大きなビームスポットで試料を照射する一般的なフローサイトメトリー装置では、ビームスポットの光強度は分布（例えば、ガウス分布）を有する。そのため、ビームスポット内での試料の位置により、検出感度にばらつきが生じる。例えば、微小粒子状試料が従来のフローサイトメーターの照射領域の中心にない場合、微小粒子状試料が照射領域の中心にある場合よりも信号強度が低くなる。一方、本構成を含む、本明細書で説明する様々な発明態様においては、ビームスポットは微小粒子状試料よりも小さい。これにより、試料の位置による検出感度の変動を大きく低減し、ほとんど排除することができる。また、これにより、直線掃引範囲でのレーザ照射スポットの光強度分布による変動を実質的に低減できる。微小粒子状試料を走査する小スポットは、一定の走査速度の領域内で均一な照明を提供できる。従来のスキームは、先端の幅が広い油性マーカーペンと幾分似ている。掃引領域の端よりも中央の方がカバレッジが大きい（光強度がより強い、又は、インクがより濃い）。微小スポットを用いることで、光強度の中心から端へのロールオフを都合よく減少させることができる。

本構成では、上述のように、微小粒子状試料の形状を２次元画像として得ることができる。そのため、２次元画像から微小粒子状試料のそれぞれの大きさ（直径）や形状（輪郭）などの具体的な情報を得ることができる。また、蛍光の分光分析によらずとも、微小粒子状試料の大きさや形状に基づいて、観察対象の試料の種別、例えば生体試料として用いられた細胞の種類を識別することも可能である。従来のシステムでは、例えば蛍光染色された抗体などを用いて細胞の種類を区別する。レーザ照射下で放射された蛍光は、抗体の種類、つまり抗体が結合する細胞の種類を示す。しかし、これには、検出可能な量の蛍光を生成するため、細胞に結合する十分な数の抗体が必要である。反対に、本構成では、細胞の種類を直接決定できる。これは、抗体の不十分な結合による細胞の種類の誤識別のおそれを低減するのに好都合である。また、これにより、異なる形状を有するが、同じ抗原を有する、つまり同じ抗体と結合する２種類の細胞を見分けることができる。

本構成例及び他の構成例においては、透過光を検出する光学系として共焦点光系が用いられる。共焦点光学系は、局所照明をもたらすレーザ光源２１及び対物レンズ２４（両者とも図３Ａ）、及び、焦点外の光をブロックするピンホール３６（図４Ａ）を有する。これは、レーザ共焦点顕微鏡での微小粒子状試料の観察の解像度と実質的に等しい解像度での観測に好都合である。よって、微小粒子状試料のそれぞれの表面及び内部構造の画像情報を高精度にて得ることができる。

様々な態様においては、微小粒子状試料６１を観察するためのイメージフローサイトメーター１００は、フローチャンバ１を有する。フローチャンバ１は、流れ方向（例えば＋Ｙ）に微小粒子状試料６１を流動させるようにフローチャンバ１に形成されたマイクロ流路１２を有する。少なくとも１つの照射光学系（例えば照射光学系２）は、選択された代表的サイズよりも小さな照射スポットの入射光Ｌで、フローチャンバ１の微小粒子状試料を照射できるように構成される。代表的サイズは、観察される微小粒子状試料６１又は他の対象物の性質に応じて選択される。例えば、上述のように、血球は、〜１０μｍの直径を有する。代表的サイズは、２μｍよりも大きなＦＷＨＭ、例えばＦＷＨＭが３μｍに設定され、２μｍのスポット（３μｍよりも小さい）を用いることができる。また、照射光学系２は、流れ方向に実質的に直交する方向（例えば、図８Ａの±Ｘ）に照射スポットの照射位置を走査する。少なくとも１つの検出光学系（例えば、検出光学系３又は４）が、フローチャンバ１から生じた光（例えば、Ｌ＿Ｔ−ＦＳ、Ｌ＿Ｔ−ＳＳ、Ｌｆ）の光強度を検出する。検出光学系３は、フローチャンバ１を介して照射光学系２と向かい合っている。また、検出光学系４（例えば検出光学系４）は、入射光の光軸からずれた位置に配置することができる。ＦＳ検出器は、正確に入射光Ｌの光軸上にある必要はないが（図１）、例えば光軸の±１°、±５°、±１０°又は±１５°以内とすることができる。制御部５は、検出光学系３で検出された結果光の光強度の変化に応じて微小粒子状試料を検出する。

実施の形態２
次に、実施の形態２にかかるイメージフローサイトメーター２００について説明する。イメージフローサイトメーター２００は、走査型イメージフローサイトメーターとして構成することができる。図９は、実施の形態２にかかるイメージフローサイトメーター２００の概要構成を示す構成図である。イメージフローサイトメーター２００は、実施の形態１にかかるイメージフローサイトメーター１００に、流速測定器６を追加した構成を有する。

従来のフローサイトメーターは、標識物質として蛍光物質を用いて（例えば、上述のように抗体を用いて）、微小粒子状試料を標識する必要がある。これにより、例えば、多大の時間の準備作業を行わねばならず、生体細胞の観察の間に生物試料の生存率や純度が悪影響を受けてしまうという問題が生じる。しかし、本実施の形態にかかるイメージフローサイトメーターは、標識なしの細胞測定、すなわち蛍光物質での標識を要しない測定が可能である。よって、準備作業を要することなく、かつ、生物試料の生存率や純度がなんらの悪影響を受けることなく、細胞測定を実現することができる。

様々な態様においては、微小粒子状試料６１を観察するためのイメージフローサイトメーター１００は、フローチャンバ１を有する。フローチャンバ１は、流れ方向（例えば＋Ｙ）に微小粒子状試料６１を流動させるようにフローチャンバ１に形成されたマイクロ流路１２を有する。少なくとも１つの照射光学系（例えば系２）は、選択された代表的サイズよりも小さな照射スポットの入射光Ｌで、流路１の微小粒子状試料を照射できるように構成される。代表的サイズは、観察される微小粒子状試料６１又は他の対象物の性質に応じて選択される。例えば、上述のように、血球は、〜１０μｍの直径を有する。代表的サイズは、２μｍよりも大きなＦＷＨＭ、例えばＦＷＨＭが３μｍに設定され、２μｍのスポット（３μｍよりも小さい）を用いることができる。また、照射光学系２は、流れ方向に実質的に直交する方向（例えば、図８Ａの±Ｘ）に照射スポットの照射位置を走査する。少なくとも１つの検出光学系（例えば、検出光学系３又は４）が、フローチャンバ１から生じた光（例えば、Ｌ＿Ｔ−ＦＳ、Ｌ＿Ｔ−ＳＳ、Ｌｆ）の光強度を検出する。検出光学系３は、フローチャンバ１を介して照射光学系２と向かい合っている。また、検出光学系４（例えば検出光学系４）は、入射光の光軸からずれた位置に配置することができる。ＦＳ検出器は、正確に入射光Ｌの光軸上にある必要はないが（図１）、例えば光軸の±１°、±５°、±１０°又は±１５°以内とすることができる。制御部５は、検出光学系３で検出された結果光の光強度の変化に応じて微小粒子状試料を検出する。

実施の形態２
次に、実施の形態２にかかるイメージフローサイトメーター２００について説明する。イメージフローサイトメーター２００は、走査型イメージフローサイトメーターとして構成することができる。図９は、実施の形態２にかかるイメージフローサイトメーター２００の概要構成を示す構成図である。イメージフローサイトメーター２００は、実施の形態にかかるイメージフローサイトメーター１００に、流速測定器６を追加した構成を有する。

流速測定器６は、フローチャンバ１のマイクロ流路１２又はマイクロ流路１２と接続される他の流路に挿入され、マイクロ流路１２内の微小粒子状試料又は液体の流速を測定する。この際、例えば、マイクロ流路１２の中央付近の流速（すなわち、ある断面におけるマイクロ流路１２内の流速の最大値）を測定することが望ましい。流速測定器６は、測定した流速を示す流速信号ＳＩＧ＿Ｖを、制御部５に出力する。

実施の形態３
次に、実施の形態３にかかるイメージフローサイトメーター３００について説明する。イメージフローサイトメーター３００は、走査型イメージフローサイトメーターとして構成することができる。図１０は、実施の形態３にかかるイメージフローサイトメーター３００の概要構成を示す構成図である。イメージフローサイトメーター３００は、実施の形態１にかかるイメージフローサイトメーター１００の照射光学系２を、照射光学系７に置換した構成を有する。

制御部５は、予め定められた流速を用いて微小粒子状試料の２次元画像を生成する。実際には、温度（流体の粘度に影響する）のような外部要因などにより、マイクロ流路１２内の流速は変動し得る。流速の変動が増大し、かつ、増大した変動を考慮しないと、演算で得られる２次元画像が歪んでしまい、微小粒子状試料の実際の形状から乖離してしまうおそれが有る。

よって、本構成では、流速測定器６がリアルタイムにマイクロ流路１２内の流速Ｖｆを監視する。制御部５は、２次元画像の生成に用いる流速を常に最新の流速Ｖｆに更新しながら、微小粒子状試料の２次元画像を生成することができる。そのため、本構成及び類似の態様によれば、流速Ｖｆの変動があった場合でも、歪みが低減された２次元画像を生成することができる。よって、本構成によれば、微小粒子状試料の２次元画像をより高精度に取得することが可能となる。

実施の形態３
次に、実施の形態３にかかるイメージフローサイトメーター３００について説明する。イメージフローサイトメーター３００は、走査型イメージフローサイトメーターとして構成することができる。図１０は、実施の形態３にかかるイメージフローサイトメーター３００の概要構成を示す構成図である。イメージフローサイトメーター３００は、実施の形態にかかるイメージフローサイトメーター１００の照射光学系２を、照射光学系７に置換した構成を有する。

図１１は、例示的な照射光学系７の構成を模式的に示すブロック図である。照射光学系７は、照射光学系２に位相回折格子を、例えば位相回折格子７１を追加した構成を有する。位相回折格子７１は、デフレクタ２３と対物レンズ２４との間に挿入される。レーザ光Ｌは、位相回折格子７１で回折され、０次回折光Ｌ＿０、＋１次回折光Ｌ＿＋１、−１次回折光Ｌ＿−１が生じる。対物レンズ２４は、０次回折光Ｌ＿０、＋１次回折光Ｌ＿＋１、−１次回折光Ｌ＿−１を、フローチャンバ１のマイクロ流路１２のＹ方向（図１０に図示）の異なる位置に、回折限界で収束させるように構成される。

様々な態様においては、レーザ光Ｌが位相回折格子７１で回折されることで、±１次よりも次数が大きい回折光が生じる。しかし、次数が大きい回折光は回折角が大きいため、対物レンズ２４に入射しない、或いは、対物レンズ２４に入射しても焦点位置がマイクロ流路１２から外れやすい事態が想定される。また、次数が大きい回折光は、光強度が弱くなる。例示的な回折格子では、入射強度の９０％は１次以内であり、高次のスポットは無視できるほどの強度しか有しない。そのため、本明細書の様々な例においては、±１よりも次数が大きい回折光は、検出に利用しないものとする。しかし、±１よりも次数が大きい回折光を検出に利用することを妨げるものではない。このような光は、対物レンズ２４を好適に構成することで、又は、±２次以上を導くミラーなどの他の要素を追加することで用いることができる。様々な形態においては、回折光の正の次数のみ又は負の次数のみが０次回折光とともに用いられる（例えば、０及び＋１、又は、０及び−１）。

０次回折光Ｌ＿０、＋１次回折光Ｌ＿＋１、−１次回折光Ｌ＿−１は、マイクロ流路１２において、Ｙ方向に離隔した異なる位置で焦点を結ぶ。マイクロ流路１２で焦点を結んだ０次回折光Ｌ＿０、＋１次回折光Ｌ＿＋１、−１次回折光Ｌ＿−１のそれぞれからは、実施の形態１と同様に、透過光、前方散乱光、蛍光、側方散乱光が生じる。

図１２を参照すると、０次回折光Ｌ＿０の透過光は、透過光Ｌ＿０Ｔである。＋１次回折光Ｌ＿＋１の透過光は、透過光Ｌ＿＋１Ｔである。−１次回折光Ｌ＿−１の透過光は、−１次回折光の透過光Ｌ＿−１Ｔである。図１２は、イメージフローサイトメーター３００の検出光学系３の例示的な構成を模式的示す構成図である。検出光学系３の対物レンズ３１は、０次回折光の透過光Ｌ＿０Ｔ、１次回折光の透過光Ｌ＿＋１Ｔ、−１次回折光の透過光Ｌ＿−１Ｔが、光検出器３４の受光面の異なる位置で結像するように配置される。よって、光検出器３４は、０次回折光の透過光Ｌ＿０Ｔ、１次回折光の透過光Ｌ＿＋１Ｔ及び−１次回折光の透過光Ｌ＿−１Ｔを、区別して受光することができる。光検出器３４は、０次回折光の透過光Ｌ＿０Ｔを示す信号ＳＩＧ＿０Ｔ、１次回折光の透過光Ｌ＿＋１Ｔを示す信号ＳＩＧ＿＋１Ｔ、−１次回折光の透過光Ｌ＿−１Ｔを示す信号ＳＩＧ＿−１Ｔを、制御部５へ出力する。

例示的なイメージフローサイトメーター３００の動作について説明する。図１３は、イメージフローサイトメーター３００のマイクロ流路１２近傍の拡大正面図である。イメージフローサイトメーター３００のマイクロ流路１２内では、微小粒子状試料６１は、＋１次回折光Ｌ＿＋１の焦点位置Ｆ＿＋１、０次回折光Ｌ＿０の焦点位置Ｆ＿０、及び、−１次回折光Ｌ＿−１の焦点位置Ｆ＿−１を順に通過する。本図では、レーザ光Ｌ（図１０）が紙面手前から紙面後方に通り抜けることを示すため、焦点位置は×でマーキングされている。

これにより、制御部５では、信号ＳＩＧ＿＋１Ｔ、検出信号ＳＩＧ＿０Ｔ及び信号ＳＩＧ＿−１Ｔが順に変化することが観測できる。また、＋１次回折光Ｌ＿＋１の焦点位置Ｆ＿＋１、０次回折光Ｌ＿０の焦点位置Ｆ＿０及び−１次回折光Ｌ＿−１の焦点位置Ｆ＿−１の間の距離は、位相回折格子７１、対物レンズ２４及びマイクロ流路１２の配置と、位相回折格子７１の格子ピッチと、対物レンズ２４のＮＡ（開口数）とから、一意に決定できる既知の値である。一例においては、＋１次回折光Ｌ＿＋１の焦点位置Ｆ＿＋１と、０次回折光Ｌ＿０の焦点位置Ｆ＿０との間の距離を、ΔＤとする。同様に、０次回折光Ｌ＿０の焦点位置Ｆ＿０と、−１次回折光Ｌ＿−１の焦点位置Ｆ＿−１との間の距離を、ΔＤとする。一例においては、ΔＤは２５〜５０μｍである。

一例においては、レーザ光Ｌは回折限界であり、対物レンズ２４は開口数（ＮＡ）０．１５、焦点距離２０ｍｍを有する。１ｍ／ｓのサンプルフローでは、スポット間距離ΔＤは２０ｕｍ（ΔＤ＝２０ｕｍ）である。全試料について、１秒当たり最大２５０００個の細胞の検出が可能である。スポット間の時間は、〜２０ｕｍ又は〜４０ｕｍである。

様々な態様においては、例えば３つの画像をつなぎあわせることでより高い解像度が実現される。これにより、走査解像度を、１μｍから０．３μｍに向上できる。

他の例においては、ＮＡ＝０．７５である。＋／−１次の光ビームは、テストされる対象物に対して３０°の角度を有する。これにより、対象物の３次元画像又は構造を決定できる。この例及び他の例においては、３次元画像は、ボクセルアレイ、ポリゴンとして、又は、他の表現手法で表すことができる。テストされる対象物は、様々なサイズとすることができる。

図１４は、本例における検出信号ＳＩＧ＿＋１Ｔ、検出信号ＳＩＧ＿０Ｔ及び検出信号ＳＩＧ＿−１Ｔの変動を示すタイミング図である。この場合、制御部５は、検出信号ＳＩＧ＿＋１Ｔ、検出信号ＳＩＧ＿０Ｔ及び検出信号ＳＩＧ＿−１Ｔの変化の時間間隔Δｔを観測することができる。よって、制御部５は、距離ΔＤと時間間隔Δｔとから、マイクロ流路１２内の微小粒子状試料の流速Ｖｆを算出することができる（Ｖｆ＝ΔＤ／Δｔ）。よって、制御部５は、実施の形態２と同様に、流速Ｖｆを用いた演算処理を行うことにより、微小粒子状試料のそれぞれの２次元画像を生成することができる。

本構成では、制御部５がリアルタイムにマイクロ流路１２内の流速Ｖｆを監視することができる。これにより、制御部５は、流速Ｖｆの変動を反映して微小粒子状試料のそれぞれの２次元画像を生成することができる。そのため、本構成によれば、実施の形態１と比べ、流速Ｖｆの変動があった場合でも、生成する２次元画像の歪みを低減することが可能となる。よって、本構成によれば、微小粒子状試料の２次元画像をより高精度に取得することが可能となる。

なお、実施の形態２では、流速測定手段の一例として流速測定器６を設ける例について説明した。これに対し、本構成では、位相回折格子７１と制御部５とが、協働してマイクロ流路１２内の微小粒子状試料の流速Ｖｆを求めることができる。したがって、本実施の形態では、位相回折格子７１と制御部５とが流速測定器を構成するものとして理解することもできる。また、流速測定器６は、例えばＶｆ確定のノイズを減らすため、位相回折格子７１及び制御部５と組み合わせて用いることができる。

本実施の形態では、＋１次回折光Ｌ＿＋１、０次回折光Ｌ＿０及び−１次回折光Ｌ＿−１が、平行にマイクロ流路１２に入射する場合について説明したが、これらの光の次数が収束するように対物レンズ２４を設計することで、＋１次回折光Ｌ＿＋１、０次回折光Ｌ＿０及び−１次回折光Ｌ＿−１を同じ位置に入射させることもできる。図１５は、＋１次回折光Ｌ＿＋１、０次回折光Ｌ＿０及び−１次回折光Ｌ＿−１を同じ位置「×」に入射させる場合のマイクロ流路１２の拡大図である。この場合、図１４を参照して上述したように流速Ｖｆは算出されない。Ｖｆは、例えば流速測定器６（図９）を用いて決定される。本例においては、微小粒子状試料に異なる３方向から同時に光を照射することができる。従って、透過光、散乱光、蛍光等には、異なる３方向から入射した光により得られる情報が含まれることとなる。制御部５で異なる３方向から入射した光により得られる情報を、３次元視差を利用して適宜処理することにより、微小粒子状試料の３次元構造の解析を行うことも可能である。また、例えば、複数のレーザ、レーザ光源、又は、共通の光源対して異なる位置へ共通の光源からの光を導く複数の光ファイバなど、複数の方向から共通の位置「×」に向かうように光を指向させることもできる。

実施の形態４
次に、実施の形態４にかかるイメージフローサイトメーター４００について説明する。イメージフローサイトメーター４００は、走査型イメージフローサイトメーターとして構成することができる。図１７は、実施の形態４にかかるイメージフローサイトメーター４００の概要構成を示す構成図である。イメージフローサイトメーター４００は、実施の形態１にかかるイメージフローサイトメーター１００に追加的な照射光学系８及び検出光学系９を追加した構成を有する。図面の簡略化のため、図１７では、検出光学系４（図１）の表示を省略している。検出光学系４は、系２、３、８、９と共に用いることも、用いないこともできる。４つの検出光学系は、入射光（例えば、光Ｌａ、Ｌｂ）の２つの異なる軸に沿った前方及び側方散乱の測定を行うために用いることもできる。

照射光学系８は、照射光学系２と同様の構成を有し、フローチャンバ１を基準として照射光学系２に対して、例えば９０°回転した位置に配置される。検出光学系９（配置角度又は方向性の制限なく、垂直検出光学系として参照される）は、検出光学系３（平行検出光学系）と同様の構成を有し、フローチャンバ１を介して照射光学系８と向かい合う位置に配置される。この例では、照射光学系８と検出光学系９とは、Ｘ−Ｚ平面に配置される。照射光学系８と検出光学系９とは、Ｘ−Ｙ平面、又は、例えばＸ−Ｙ、Ｘ−Ｚ又はＹ−Ｚ平面に対して４５°の他の面に配置することもできる。参照を図１に戻すと、一例においては、照射光学系２、８と検出光学系３、９とは、Ｘ−Ｚ平面に配置され、（照射光学系２に対応する測方散乱光Ｌ＿Ｆ−ＳＳを検出するための）検出光学系４は、Ｚ軸周りに例えば５°〜８５°、具体的には１５°、３０°、４５°又は６０°の少量だけＸ−Ｚ平面が回転された平面に配置することができる。

視差は、微小粒子状試料６１及び他の対象物の移動の見え方に影響する。ある距離において対象物が移動すると、観察点に近い対象物の特徴的構造は、観察点から遠い対象物の構造よりも広い角度範囲で移動する。これは、図１６Ａ及び１６Ｂに示されており、観察者の目の間の距離が、対象物がより遠い場合の角度α１よりも対象物が近い場合の大きな角度α２に対応していることを示している。参照を図１６Ｃに戻すと、微小粒子状試料６１の構造（例えば、細胞内のミトコンドリア）は、Ｌ＿＋１画像では、Ｌ＿−１画像とは異なる位置に有る。構造が照射光学系７に近づくほど、２枚の画像での位置はより異なることとなる。よって、制御部５は、Ｌ＿＋１、Ｌ＿０及びＬ＿−１画像（又は、これらの画像又は異なる角度のいずれの画像のいずれの組み合わせ）において、共有する構造の位置を特定することができる。制御器は、３つの画像において対応する構造の位置を比較して、微小粒子状試料６１内のそれらの構造の３−Ｄ位置を推測するために、幾何学的及び三角法的な関係を用いることができる。構造としては、細胞小器官、含有物、細胞膜の定められた部位、又は、微小粒子状試料６１よりも小さい或いは含まれる他の対象物とすることができる。

実施の形態４
次に、実施の形態４にかかるイメージフローサイトメーター４００について説明する。イメージフローサイトメーター４００は、走査型イメージフローサイトメーターとして構成することができる。図１７は、実施の形態４にかかるイメージフローサイトメーター４００の概要構成を示す構成図である。イメージフローサイトメーター４００は、実施の形態にかかるイメージフローサイトメーター１００に追加的な照射光学系８及び検出光学系９を追加した構成を有する。図面の簡略化のため、図１７では、検出光学系４（図１）の表示を省略している。検出光学系４は、系２、３、８、９と共に用いることも、用いないこともできる。４つの検出光学系は、入射光（例えば、光Ｌａ、Ｌｂ）の２つの異なる軸に沿った前方及び側方散乱の測定を行うために用いることもできる。

照射光学系８は、照射光学系２と同様の構成を有し、フローチャンバ１を基準として照射光学系２に対して、例えば９０°回転した位置に配置される。検出光学系９（配置角度又は方向性の制限なく、垂直検出光学系として参照される）は、検出光学系３（平行検出光学系）と同様の構成を有し、フローチャンバ１を介して照射光学系８と向かい合う位置に配置される。この例では、照射光学系８と検出光学系９とは、Ｘ−Ｚ平面に配置される。照射光学系８と検出光学系９とは、Ｘ−Ｙ平面、又は、例えばＸ−Ｙ、Ｘ−Ｚ又はＹ−Ｚ平面に対して４５°の他の面に配置することもできる。参照を図１に戻すと、一例においては、照射光学系１、８と検出光学系３、９とは、Ｘ−Ｚ平面に配置され、（照射光学系１に対応する測方散乱光Ｌ＿Ｆ−ＳＳを検出するための）検出光学系４は、Ｚ軸周りに例えば５°〜８５°、具体的には１５°、３０°、４５°又は６０°の少量だけＸ−Ｚ平面が回転された平面に配置することができる。

図１７では、照射光学系２から出力される入射光をレーザ光「Ｌａ」で示し、照射光学系８から出力される入射光を「Ｌｂ」で示している。また、検出光学系３に入射する透過光／前方散乱光を透過光／前方散乱光Ｌａ＿Ｔ−ＦＳとラベリングし、検出光学系９に入射する透過光／前方散乱光を透過光／前方散乱光Ｌｂ＿Ｔ−ＦＳとラベリングしている。検出光学系３が出力する検出信号は検出信号ＳＩＧ＿Ｔａ、検出光学系９が出力する検出信号は検出信号ＳＩＧ＿Ｔｂである。光Ｌａ、Ｌｂの方向は、実質的に垂直することも、しないことも可能である。それぞれからの入射光がフローチャンバ１の適切な位置に指向するのであれば、いかなる数の照射光学系／検出光学系ペアを、任意の平面において任意の角度で用いることが可能である。

一例においては、検出光学系３が照射光学系２からの入射光に対応する結果光の一部である第１の透過光を検出する。また、検出光学系９が照射光学系８からの入射光に対応する結果光の一部である第２の透過光を検出する。制御部５は、検出光学系３が出力する検出信号ＳＩＧ＿Ｔａから得られる２次元画像と、検出光学系９が出力する検出信号ＳＩＧ＿Ｔｂから得られる２次元画像とから、微小粒子状試料のそれぞれの立体的構造を示す３次元画像を生成する。例えば、対応する構造を、２つの画像において認識することができる。一方の画像は認識された構造のＸ座標をもたらし、一方の画像は認識された構造のＺ座標をもたらし、時間又は流れ距離の測定は認識された構造のＹ座標をもたらす。

本構成によれば、照射光学系と透過光の検出光学系からなる光学系を異なる角度で２組設けることで、容易に観察対象となる微小粒子状試料のそれぞれの３次元構造を知ることが可能となる。

本明細書を通じて、いくつかの態様は、通常、ソフトウェアプログラムとして実行されるものとして記述される。当業者は、容易にこのようなソフトウェアと同等のものを（固定的なシーケンス、又は、プログラマブルな）ハードウェア、ファームウェア、又は、マイクロコードにおいて構成できることが理解できる。よって、本発明の態様は、全体としてハードウェア形態、全体としてソフトウェア（ファームウェア、常駐ソフトウェア又はマイクロコードを含む）形態、又は、ソフトウェアおよびハードウェア態様を組み合わせた形態をとることができる。ソフトウェア、ハードウェア及び組み合わせは、本明細書においては、一般に、「サービス」、「回路」、「モジュール」又は「システム」として総称することができる。様々な態様は、システム、方法、又はコンピュータプログラム製品として具現化される。データ操作アルゴリズム及びシステムは既知であるので、本明細書は、具体的には、本明細書で説明するシステム及び方法の一部を構成する、又は、本明細書で説明するシステム及び方法とよりより直接的に協働するアルゴリズム及びシステムを対象とする。アルゴリズム及びシステム、ハードウェア、又は、信号又は含まれるデータを生成又は処理するソフトウェアの他の態様は、本明細書では具体的には示さないが、この分野における既知のこのようなシステム、アルゴリズム、コンポーネント及び素子から選択される。本明細書で説明するようなシステム及び方法に鑑み、いかなる態様における実施に有用な、本明細書では具体的に示されず、示唆されず、かつ、説明されていないソフトウェアは従来通りであり、このような分野における通常の知識の範囲内のものである。

図１８は、本明細書で説明されるデータ分析及び他の分析を行う例示的なデータ処理システムのコンポーネントを示す上位図である。このシステムは、データ処理システム１８１０、周辺システム１８２０、ユーザインターフェイスシステム１８３０及びデータ格納システム１８４０を有する。周辺システム１８２０、ユーザインターフェイスシステム１８３０及びデータ格納システム１８４０は、データ処理システム１８１０と通信可能に接続される。データ処理システム１８１０は、以下で説明するように、例えばインターネット又はＸ．２５ネットワークなどのネットワーク１８５０と通信可能に接続される。制御部５（図１、６、７、９、１０又は１７）は、データ処理システム１８１０、周辺システム１８２０、ユーザインターフェイスシステム１８３０及びデータ格納システム１８４０のうち１以上を含むことができ、１以上のネットワーク１８５０と接続することができる。データ処理システム１８１０及び本明細書で説明する他の処理装置は、それぞれ、１以上のマイクロプロセッサ、マイクロコントローラ、フィールドプログラマブルゲートアレイ（ＦＰＧＡ：field-programmable gate array）、プログラマブルロジックデバイス（ＰＬＤ：programmable logic device）、プログラマブルロジックアレイ（ＰＬＡ：programmable logic array）、プログラマブルアレイロジックデバイス（ＰＡＬ：programmable array logic device）又はデジタルシグナルプロセッサ（ＤＳＰ：digital signal processor）を含むことができる。

データ処理システム１８１０は、本明細書で説明する様々な態様での処理を実行する１以上のデータプロセッサを含む。「データプロセッサ」は、データを自動的に処理する装置であり、電気的、磁気的、光学的、生物的コンポーネント又はそれ以外で実行するかにかかわらず、中央演算器（ＣＰＵ：central processing unit）、デスクトップコンピュータ、ラップトップコンピュータ、メインフレームコンピュータ、個人用デジタル補助装置（personal digital assistant）、デジタルカメラ、携帯電話、スマートフォン、又は、データの取り扱い、データ管理又はデータ処理のための他の装置を、含むことができる。

「通信可能に接続される」なる表現は、データの通信が可能な、装置、データプロセッサ又はプログラム間を、有線又は無線の任意の種類の接続を含む。周辺システム１８２０のようなサブシステム、ユーザインターフェイスシステム１８３０及びデータ格納システム１８４０は、データ処理システム１８１０と分離して示されているが、データ処理システム１８１０内に全て又は一部が収納されてもよい。

データ格納システム１８４０は、様々な態様にかかる処理を実行するのに必要な情報を含む情報を格納するように構成された、１以上の具体的な非一時的コンピュータ可読記憶媒体を含むか、１以上の具体的な非一時的コンピュータ可読記憶媒体と通信可能に接続される。本明細書で用いられる「具体的な非一時的コンピュータ可読記憶媒体」とは、例えば制御部５において、データ処理システム１８１０に実行のために提供される格納命令に関与する、いかなる非一時的装置又は製品を示す。このような非一時的媒体は、不揮発性又は揮発性の媒体である。不揮発性媒体の例としては、フロッピーディスク、フレキシブルディスク又は他の携帯型コンピュータディスケット、ハードディスク、磁気テープ又は他の実施の磁気メディア、コンパクトディスク、コンパクトディスクリードオンリーメモリー（ＣＤ−ＲＯＭ：compact-disc read-only memory）、ＤＶＤ、ブルーレイ（ＢＬＵ−ＲＡＹ）ディスク、ＨＤ−ＤＶＤディスク、他の光学記憶媒体、フラッシュメモリ、リードオンリーメモリ（ＲＯＭ：read-only memory）、イレーサブルプログラマブルリードオンリーメモリ（ＥＰＲＯＭ：erasable programmable read-only memory、又は、ＥＥＰＲＯＭ）が含まれる。揮発性媒体の例としては、レジスタやランダムアクセスメモリ（ＲＡＭ：random access memory）などのダイナミックメモリが含まれる。記憶媒体は、データを電気的、磁気的、光学的、化学的、機械的又の他の方法でデータを記録することができ、かつ、電気的、磁気的、電磁気的、赤外線又は半導体コンポーネントを含むことができる。

本発明の態様は、コンピュータ可読プログラムコードが具現化されている１以上非一時的コンピュータ可読媒体で実現されるコンピュータプログラム製品の形態をとることができる。このような媒体は、例えばＣＤ−ＲＯＭをプレスすることで、通常の通り、これらの製品を製造することができる。媒体にて具現化されたプログラムは、ロードされた場合にデータ処理システム１８１０に特定の一連の処理ステップを実行させるコンピュータプログラム指令を含み、これにより本明細書にて特定される機能又は動作が実行される。

一例においては、データ格納システム１８４０は、例えばランダムアクセスメモリであるコードメモリ１８４１と、例えばハードディスクのような具体的な非一時的コンピュータ可読回転式記憶媒体であるディスク１８４３とを有する。コンピュータプログラム指令は、ディスク１８４３から、無線、有線、光ファイバ、又は他の接続で、コードメモリ１８４１に読み込まれる。そして、本明細書で説明した処理ステップ実行の結果として、データ処理システム１８１０は、コードメモリ１８４１にロードされたコンピュータプログラム指令の１以上のシーケンスを実行する。この場合、データ処理システム１８１０は、コンピュータに実装された処理を実行する。例えば、本明細書のフローチャートやブロック図のブロック及びこれらの組み合わせが、コンピュータプログラム指令により実行される。また、コードメモリ１８４１は、データを記憶することも記憶しないことも可能である。データ処理システム１８１０は、ハーバードアーキテクチャ（Harvard-architecture）コンポーネント、修正ハーバードアーキテクチャ（modified-Harvard-architecture）コンポーネント、又は、フォンノイマンアーキテクチャ（Von-Neumann-architecture）コンポーネントを含むことができる。

コンピュータプログラムコードは、例えばＪＡＶＡ、スモールトーク（Smalltalk）、Ｃ＋＋、Ｃ又は好適なアセンブリ言語などの、１以上のプログラミング言語のいかなる組み合わせを用いての記述することができる。本明細書で説明する方法を実行するプログラムコードは、もっぱら１つのデータ処理システム１８１０で行うことができ、又は、通信可能な複数のデータ処理システム１８１０で行われてもよい。例えば、コードは、ユーザのコンピュータで全て又は部分的に実行でき、遠隔のコンピュータ又はサーバで全て又は部分的に実行できる。サーバは、ネットワーク１８５０を介してユーザのコンピュータと接続されることができる。

周辺システム１８２０は、データ処理システム１８１０にデジタルコンテンツレコードを提供するように構成された１以上の装置を含むことができる。例えば、周辺システム１８２０は、デジタルスチルカメラ、デジタルビデオカメラ、携帯電話又は他のデータプロセッサを含むことができる。データ処理システム１８１０は、周辺システム１８２０の装置からデジタルコンテンツレコードを受け取ると、データ格納システム１８４０にデジタルコンテンツレコードを格納することができる。

ユーザインターフェイス１８３０は、マウス、キーボード、（例えばネットワーク又はヌルモデムケーブルを介して接続される）他のコンピュータ又はいかなる装置、又は、データ処理システム１８１０にデータを入力する装置の組み合わせを含むことができる。これについては、周辺システム１８２０がユーザインターフェイス１８３０と分離して表示されているが、周辺システム１８２０はユーザインターフェイス１８３０の一部として含まれることも可能である。

また、ユーザインターフェイス１８３０は、表示装置、プロセッサがアクセスできるメモリ又は任意の装置、又は、データ処理システム１８１０がデータを出力する装置の組み合わせを含むことができる。これについては、プロセッサがアクセスできるメモリをユーザインターフェイス１８３０が含む場合、図１８においてユーザインターフェイス１８３０とデータ格納システム１８４０とが分離して表示されているものの、このようなメモリをデータ格納システム１８４０の一部とすることもできる。

様々な態様においては、データ処理システム１８１０は、ネットワークリンク１８１６を介してネットワーク１８５０と接続される通信インターフェイス１８１５を含む。例えば、通信インターフェイス１８１５は、ＩＳＤＮ（integrated services digital network）カードや電話線に対応する種類のデータ通信接続を提供できるモデムとすることができる。他の例のように、通信インターフェイス１８１５は、例えば、イーサネットＬＡＮなどの互換性のあるＬＡＮ（local-area network）やＷＡＮ（wide-area network）にデータ通信接続を提供できるネットワークカードとすることができる。例えばＷｉＦｉやＧＳＭなどの無線リンクを用いることができる。通信インターフェイス１８１５は、様々な種類の情報を示すデジタルデータを、ネットワークリンク１８１６を経てネットワーク１８５０に運ぶ、電気的、電磁気的、又は光学的信号を送受信する。ネットワークリンク１８１６は、スイッチ、ゲートウェイ、ハブ、ルーター又は他のネットワーク装置を介してネットワーク１８５０と接続することができる。

ネットワークリンク１８１６は、１以上のネットワークを介した他のデータ装置へのデータ通信を提供できる。例えば、ネットワークリンク１８１６ローカルネットワークを介したホストコンピュータ又はインターネットサービスプロバイダ（Internet Service Provider (ISP)）により運用されるデータ装置への通信を提供することができる。

データ処理システム１８１０は、ネットワーク１８５０、ネットワークリンク１８１６及び通信インターフェイス１８１５を介して、プログラムコードを含むメッセージを送信し、データを受信することができる。例えば、サーバは、アプリケーションプログラム（例えば、ＪＡＶＡアプレット）のために要求されたコードを、接続された具体的な不揮発性コンピュータ可読記憶媒体に記録することができる。サーバは、媒体からコードを読み取り、インターネット、ローカルＩＳＰ、ローカルネットワーク、通信インターフェイス１８１５を介して送信することができる。受信されたコードは、受信されるとデータ処理システム１８１０により実行され、又は、後の実行のためにデータ格納システム１８４０に格納することができる。

その他の実施の形態
なお、本発明は上記実施の形態に限られたものではなく、適宜変更することが可能である。例えば、実施の形態４にかかるイメージフローサイトメーター４００に実施の形態２にかかる流速測定器６を追加し、流速Ｖｆを用いて３次元画像の生成を行うことも可能である。この場合、流速Ｖｆの変動があった場合でも、生成する３次元画像の歪みを低減することが可能となる。よって、本構成によれば、微小粒子状試料のそれぞれの３次元画像をより高精度に取得することが可能となる。

例えば、実施の形態４にかかるイメージフローサイトメーター４００において、照射光学系２及び照射光学系８を実施の形態３にかかる照射光学系７と同様の構成としてもよい。これにより、流速Ｖｆを用いて３次元画像の生成を行うことも可能である。この場合、流速Ｖｆの変動があった場合でも、生成する３次元画像の歪みを低減することが可能となる。よって、本構成によれば、微小粒子状試料のそれぞれの３次元画像をより高精度に取得することが可能となる。

様々な態様には、細胞よりも小さい、又は細胞よりもはるかに小さい照射スポットを用いる。これは、細胞の内部構造を決定するのに好都合である。様々な態様は、例えば微小粒子状試料あたり５点以上、１０点以上又は１００点以上にわたるたいへん高い解像度で観察する。これにより、微小粒子状試料のイメージマップを作成できる。これらのイメージマップは、微小粒子状試料の全体にわたる様々な点での結果光データを含むことができる。イメージマップは、細胞小器官に関する蛍光又は対象物の選択されたコンポーネントの位置の詳細を含むことができる。イメージマップの全部又は一部の描写を、理解しやすい可視画像とすることができる。２−Ｄ画像は、従来のフローサイトメーターよりもさらなる詳細を与えるのに好都合である。例えば流れに直交する２つの面などの２つの異なる平面での走査により、２−Ｄイメージマップを決定することができる。これらは、細胞の３−Ｄイメージマップをもたらすために組み合わせることもできる。これは、容量測定に類似しているが、ハードウェアはより単純である。

様々な態様は、様々な種類の血球のカウントのような血液学での応用に有用である。従来のコールター計数器と比べて、本明細書のイメージフローサイトメーターの様々な態様は、測定させる各細胞のより多くの細部を決定することができる。

様々な態様においては、フォローサイトメトリーを実行する方法は、フローチャンバを通じる流体の流れの供給を含み、流体の流れは微小粒子状試料のような対象物を輸送する。レーザ又は他の入射光は、対象物よりも小さな照射スポットを形成するように指向される。照射スポットは、対象物が流体とともに移動する間に、少なくとも流れの方向と実質的に垂直な方向に移動される。フローチャンバから発する結果光が検出され、例えば、透過光、前方散乱光、側方散乱光、又は任意の方向又は特定の方向の蛍光である。光は、ＰＭＴ、ＣＣＤ、ＰＩＮダイオード又は他の光センサで検出される。対象物の性質を決定するために、検出された光に対応する信号は制御器（例えば制御部５）を用いて自動的に処理される。様々な態様においては、スポットの動き及び光検出ステップは、複数の対象物のために繰り返され、複数の対象物の性質を検定するために対応する信号が処理される。様々な態様においては、制御器は自動的に対象物の２次元画像、例えば前方散乱光強度に対する側方散乱光強度のプロット、又は、例えば特定の蛍光を呈する対象物の数のヒストグラムを自動的に生成する。

様々な態様においては、複数の入射光ビームは、フローチャンバの流れ軸に沿った異なる位置に与えられる。結果光は、ビームごとに分離して検出される。制御器は、自動的に、それぞれが１つのビームに対応する、複数の２次元画像を決定するために結果光を自動的に処理する。そして、制御器は、複数の２次元画像を用いて、対象物の３次元モデルを自動的に生成する。この例は、図１５、１６Ａ、１６Ｂ及び１６Ｃを参照して、上記で説明されている。様々な態様においては、制御器は、２次元画像に初めにマーキングを行うことなく、検出された結果光を用いて３次元モデルを自動的に生成する。

上述を考慮すると、様々な態様は、既存のスキームよりもよい高い解像度を実現するフローサイトメトリーを行うフローサイトメーター及び手段をもたらす。技術的効果は、細胞のような微小粒子状試料の形状を測定することと、それらの試料の内部構造に関するデータを測定することである。

本明細書の説明より、実施の形態は様々に変更可能であることは明らかである。このような変更は、本発明の思想及びスコープのから乖離したものではないとして考えられるべきであり、当業者にとって自明であるこのような修正は、全て以下のクレームのスコープの範囲内で提供される。

本発明は、本明細書で説明した態様の組み合わせを含むものである。「特定の態様」（または、実施の形態、バージョン）への言及は、本発明の態様の少なくとも１つに存在する特徴的構成を指す。「一態様」又は「特定の態様」などと分けて言及することは、同じ態様を指すことを要しない。しかし、このような態様は、特に示された場合又は当業者にとって容易に自明である場合を除き、相互に排他的である。単一の「方法」又は複数の「方法」などへの言及を用いることは、限定されない。本開示において「又は（または）」という語は、明確に示されない限り、非排他的な意味で用いられる。

本発明は、好ましい特定の態様への特定の参照により詳細に説明されているが、当然のことながら、当業者は、本発明の思想およびスコープの範囲内で変更、組み合わせ及び修正を行うことができる。

Claims (20)

1. 微小粒子状試料を観察するイメージフローサイトメーターであって、
   前記微小粒子状試料を流れ方向に流動させることができる流路が形成されたフローチャンバと、
   ２μｍ以下の半値全幅を有する照射スポットの入射光で前記流路内の前記微小粒子状試料を照射するように、かつ、前記流路内の前記微小粒子状試料を横切って前記照射スポットの照射位置を走査するように構成され、前記流れ方向に対して実質的に垂直な軸に沿った第１の方向に前記照射スポットの照射位置を走査するように構成される、少なくとも１つの照射光学系と、
   前記照射位置が前記第１の方向に走査されている間に前記フローチャンバからの透過光の光強度に対応する第１の結果光データを与えるように構成される第１の光検出器と、前記照射位置が前記第１の方向に走査されている間に前記フローチャンバからの散乱光の光強度に対応する第２の結果光データを与えるように構成される第２の光検出器と、を有する少なくとも１つの検出光学系と、
   前記検出光学系からの前記第１の結果光データまたは前記第２の結果光データの変化に基づいて前記微小粒子状試料を検出する制御部と、を備える、
   イメージフローサイトメーター。
2. 前記照射光学系は、前記入射光を回折限界まで収束させるように構成される、
   請求項１に記載のイメージフローサイトメーター。
3. 前記制御部は、前記微小粒子状試料の前記流れ方向に対して垂直である前記流路の断面の中心を前記入射光の焦点が通過するように、前記照射光学系に前記照射位置を走査させるように構成される、
   請求項１に記載のイメージフローサイトメーター。
4. 前記検出光学系は、前記照射位置が前記第１の方向に走査されている間に前記フローチャンバからの側方散乱光の光強度に対応する第３の結果光データを与えるように構成される第３の光検出器を更に備え、
   前記制御部は、更に、前記検出光学系からの第３の結果光データの変化に基づいて前記微小粒子状試料を検出するように構成される、
   請求項１に記載のイメージフローサイトメーター。
5. 前記照射光学系はレーザを有し、前記入射光は前記レーザからの光を含む、
   請求項１に記載のイメージフローサイトメーター。
6. 前記照射光学系は、前記第１の方向に前記照射スポットの照射位置を走査するように、前記入射光を偏向させる光デフレクタを有する、
   請求項５に記載のイメージフローサイトメーター。
7. 前記光デフレクタは、音響光学デフレクタ又は電気光学デフレクタを含む、
   請求項６に記載のイメージフローサイトメーター。
8. 微小粒子状試料を流れ方向に流動させることができる流路が形成されたフローチャンバと、
   照射スポットの入射光で前記流路内の前記微小粒子状試料を照射するように、前記流れ方向に対して実質的に垂直に、かつ、前記流路内の前記微小粒子状試料を横切って前記照射スポットの照射位置を走査するように構成される、少なくとも１つの第１の照射光学系と、
   前記照射位置が走査されている間に前記フローチャンバからの透過光の光強度に対応する第１の結果光データを与えるように構成される第１の光検出器と、前記照射位置が走査されている間に前記フローチャンバからの散乱光の光強度に対応する第２の結果光データを与えるように構成される第２の光検出器と、を有する少なくとも１つの第１の検出光学系と、
   前記第１の結果光データまたは前記第２の結果光データの変化に基づいて前記微小粒子状試料を検出する制御部と、を備え、
   前記制御部は、
   前記微小粒子状試料の流速および走査速度から決定される座標を、少なくとも前記第１の結果光データまたは前記第２の結果光データと関連付け、
   少なくとも前記微小粒子状試料の前記透過光または前記散乱光の２次元分布を決定する、
   ように構成される、
   システム。
9. 前記制御部は、前記２次元分布を示す２次元画像を提供するように構成される、
   請求項８に記載のシステム。
10. 複数の検出光学系と複数の照射光学系とを更に備え、前記複数の検出光学系は少なくとも１つの前記第１の検出光学系を有し、前記複数の照射光学系は少なくとも１つの前記第１の照射光学系を有し、
    前記複数の検出光学系のそれぞれは、前記複数の照射光学系のそれぞれに対して、前記フローチャンバの反対側に配置され、
    前記制御部は、
    前記複数の検出光学系のそれぞれについて複数の２次元分布のそれぞれを決定し、前記複数の２次元分布は前記２次元分布を含み、
    前記複数の２次元分布のそれぞれを複数組み合わせることで、少なくとも前記微小粒子状試料の前記透過光または前記散乱光の３次元分布を生成する、
    ように構成される、
    請求項８に記載のシステム。
11. 前記制御部は、少なくとも前記微小粒子状試料の前記透過光または前記散乱光の３次元分布を示す３次元画像を生成するように構成される、
    請求項１０に記載のシステム。
12. 前記微小粒子状試料の前記流速を測定し、前記制御部へ測定結果を出力する流速測定部を更に備える、
    請求項８に記載のシステム。
13. 前記制御部は、前記流速測定部からの前記測定結果に応じて、前記微小粒子状試料の前記流速を連続的に更新するように構成される、
    請求項１２に記載のシステム。
14. 前記流速測定部は、前記流路内に配置され、又は、前記流路に接続され、前記流路を流れる前記微小粒子状試料の前記流速を観測する、
    請求項１２に記載のシステム。
15. 前記流速測定部は、前記第１の照射光学系と前記制御部とを含み、
    前記第１の照射光学系は、複数の回折光ビームを含む前記入射光を提供する位相格子を有し、
    前記第１の照射光学系は、前記流路の流れの前記方向に沿った互いに異なる位置に前記複数の回折光ビームを指向させ、
    前記制御部は、前記複数の回折光ビームから選択された２つの回折光ビームの照射位置の間の距離と、前記微小粒子状試料が前記照射位置を通過するときに得られる時間差とから、前記微小粒子状試料の前記流速を算出するように構成される、
    請求項１２に記載のシステム。
16. 前記第１の照射光学系は、前記流れ方向に対して垂直な１以上の軸に実質的に沿って、前記照射位置のそれぞれを走査するように構成される、
    請求項１５に記載のシステム。
17. 前記照射光学系は、複数の光ビームを含む前記入射光を提供するように構成され、
    前記照射光学系は、互いに異なる角度で、前記複数の光ビームを前記照射スポットに指向させ、
    前記検出光学系は、前記光ビームのそれぞれに対応する前記第１及び第２の結果光データを与えるように構成され、
    前記制御部は、前記光ビームのそれぞれに対応する前記第１及び第２の結果光データを用いて、前記微小粒子状試料の３次元画像を算出するように構成される、
    請求項１に記載のイメージフローサイトメーター。
18. 前記照射光学系は、光源と、前記複数の光ビームを含む前記入射光を提供するために前記光源からの光を回折させる位相格子と、を有する、
    請求項１７に記載のイメージフローサイトメーター。
19. 複数の微小粒子状試料を前記流路に供給するように構成された流動誘起装置を更に備え、
    前記複数の微小粒子状試料は前記微小粒子状試料を含み、
    前記照射光学系は、照射体積にわたって前記照射位置を走査し、前記流路は前記複数の微小粒子状試料のうち１つのみが前記照射体積内に存在できるように形成される、
    請求項１に記載のイメージフローサイトメーター。
20. 微小粒子状試料を輸送する流体の流れをフローチャンバに与え、
    前記フローチャンバ内の前記微小粒子状試料を横切って前記微小粒子状試料よりも小さい照射スポットを走査し、前記走査は前記流体の流れの方向に対して実質的に垂直な軸に沿った第１の方向の走査を含み、
    照射位置が前記第１の方向に走査されている間に、透過光の第１の検出信号と、前記照射スポットでの波長と実質的に同じ波長を有する散乱光の第２の検出信号と、を検出し、
    前記第１及び第２の検出信号と前記流体の流れの速度を用いて前記微小粒子状試料のイメージマップを決定する、
    方法。

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