ES2945686T3 - Medición y control de flujo para cuantificación mejorada de partículas en citometría de flujo - Google Patents
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Abstract
La presente invención se refiere a métodos que permiten una precisión mejorada para el conteo cuantitativo de partículas en una corriente de líquido que fluye. Los métodos de la presente invención utilizan la medición en tiempo real de los caudales y el control del caudal a través de mecanismos de retroalimentación para mejorar la cuantificación, y esta cuantificación mejorada se traduce en un recuento de partículas más preciso. En ciertas realizaciones, las partículas que se cuentan son partículas biológicas en una muestra líquida, como virus. (Traducción automática con Google Translate, sin valor legal)
Description
DESCRIPCIÓN
Medición y control de flujo para cuantificación mejorada de partículas en citometría de flujo
Antecedentes
La citometría de flujo es una técnica comercial establecida con muchas aplicaciones, incluyendo el uso común en hematología e inmunología. En la medida en que el nombre en sí lo implica, citometría de flujo tiene que ver con el análisis (es decir, la medición de propiedades físicas y/o químicas) de partículas biológicas o no biológicas individuales a medida que pasan (es decir, fluyen) a través de una región de sonda dentro de una celda de flujo. Se usa una variedad de procedimientos que incluyen procedimientos eléctricos, acústicos y ópticos para detectar y caracterizar partículas a medida que fluyen a través de la región de sonda. La información recogida puede usarse para determinar si hay un cierto tipo de partícula, cuántas partículas están presentes, características de las partículas o distribuciones relativas de partículas dentro de una población mixta. Además, muchos citómetros de flujo (llamados clasificadores celulares) tienen la capacidad de segregar partículas a medida que se examinan basándose en el análisis en tiempo real de sus propiedades.
Un experto en la técnica estará familiarizado con el funcionamiento típico de un citómetro de flujo en el que la muestra se bombea primero a través de una bomba mecánica o presión de gas hacia una celda de flujo. Dentro de la celda de flujo, la muestra se forma comúnmente en una corriente estrecha o corriente de gotitas mediante un medio de envoltura (líquido o gas). Al conformar la corriente de muestra, se permite que las partículas individuales de la muestra pasen, una a la vez, a través de una región de sonda donde se interrogan. Un procedimiento común es la interrogación óptica, en la que las partículas se cruzan con un haz láser enfocado o múltiples haces láser colineales. Las interacciones de las partículas con el o los láseres son monitoreadas por uno o más detectores que se usan para cuantificar propiedades detectables tales como dispersión de luz directa o lateral o fluorescencia en cualquier número de longitudes de onda específicas. Las amplitudes de señal desde el o los detectores se cuantifican para cada partícula y señales características se usan para identificar o categorizar partículas. Instrumentos comerciales simples pueden tener un único láser y monitorear la dispersión directa y lateral junto con una longitud de onda de fluorescencia, mientras que los citómetros de flujo del nivel de investigación pueden tener cuatro o más láseres para la excitación y 10 o más canales de detección capaces de medir la dispersión directa, la dispersión lateral y varias longitudes de onda de fluorescencia. Los datos generados a partir de cada canal de detección se pueden analizar solos o en combinación con datos de varios otros canales. En un experimento bien diseñado, este análisis multiparamétrico puede revelar una gran cantidad de información, pero también puede implicar una cantidad significativa de procesamiento e interpretación de datos complicados.
Los citómetros de flujo típicos disponibles comercialmente son ventajosos para determinadas aplicaciones en términos del alto contenido de información obtenida, pero generalmente se limitan a analizar partículas que son relativamente grandes, es decir, en el orden del tamaño de una bacteria o célula. Aunque el análisis de otros intervalos de tamaños con los citómetros de flujo tradicionales es posible a través de una optimización experimental especial, es típico el análisis de intervalos de tamaño entre 1-15 micrómetros. Además, los citómetros de flujo típicos no se usan habitualmente para la cuantificación precisa de partículas biológicas, ya que generalmente se utilizan para obtener información más específica como se describe a continuación. Ejemplos de análisis más típicos familiares para un experto en la técnica serían la identificación de varias poblaciones diferentes de células dentro de un espécimen sanguíneo (por ejemplo, determinando poblaciones de linfocitos, monocitos y neutrófilos correlacionando los datos de dispersión directa y lateral), y la evaluación de los marcadores de superficie celular por inmunólogos a través del uso de anticuerpos marcados con fluorescencia.
Los virus son un tipo de partícula biológica que requiere una enumeración precisa, pero su pequeño tamaño de partícula de entre diez y varios cientos de nanómetros los excluye del análisis usando citometría de flujo típica. Algunos de los procedimientos tradicionales utilizados para contar las partículas virales incluyen el ensayo de placa, microscopía de epifluorescencia (EFM) y microscopía electrónica de transmisión (TEM). El ensayo de placa es un procedimiento cuantitativo de cultivo tisular desarrollado en 1952. Si bien los ensayos de placa siguen siendo el estándar de oro para la cuantificación de virus, la técnica es relativamente imprecisa e inexacta, dando lugar a ~25 % de error relativo incluso cuando se realiza por individuos altamente capacitados. Además, los ensayos de placa se limitan a virus que son lisogénicos, y requieren mucha mano de obra, y el tiempo hasta el resultado es de 12 horas a 2 semanas. La EFM es una técnica en la que las partículas virales se concentran, se tiñen con un colorante altamente fluorescente, y se toman imágenes ópticamente. Los inconvenientes a la EFM incluyen la baja resolución de la imagen óptica resultante y la incapacidad de discriminar entre partículas virales infecciosas y no infecciosas. La TEM puede proporcionar una alta resolución espacial e información morfológica, pero las muestras deben ser interrogadas en condiciones de alto vacío que son irrelevantes para muestras biológicas. Además, la TEM es costosa y no está ampliamente disponible.
Existen ejemplos limitados del uso de citómetros de flujo típicos disponibles comercialmente para enumerar los virus libres en la solución. Brussaard menciona que estudios anteriores detallan el uso de citómetros de flujo disponibles comercialmente para enumerar los virus marinos (Brussaard, C. P. D. Appl. Envir. Microbiol., 2004, 70(3), 1506-1513 y referencias citadas en la misma). Estos estudios han usado generalmente citómetros de flujo disponibles
comercialmente costosos y tienen tamaños de partícula analizados mucho más grandes que un virus típico. Ninguno de estos estudios utilizó la medición o medición y control de velocidades de flujo para mejorar la precisión de la enumeración de partículas. Un enfoque de citometría de flujo alternativo para la enumeración de partículas de tamaño nanométrico que incluyen virus ha sido descrito por Ferris y col. (Ferris, M. M., Rowlen, K. L. Rev. Sci. Instrum. 2002, 73(6), 2404-2410 and Ferris y col. Anal Chem, 2002, 74, 1849-1856.). Se desarrolló un citómetro de flujo único, rápido y económico de un solo canal y se optimizó específicamente para la enumeración de virus. Este ejemplo no utilizó un fluido de envoltura para lograr el enfoque hidrodinámico del fluido de muestra como es común en la citometría de flujo tradicional. En cambio, se utilizó una geometría de detección confocal similar a la utilizada en estudios de detección de una sola molécula. Se usó un capilar de vidrio simple como celda de flujo, y una bomba de jeringa proporcionó la presión de la muestra. El instrumento y el procedimiento se validaron primero enumerando esferas fluorescentes bien caracterizadas con diámetros de 26 a 2600 nm, que abarcan el intervalo de tamaño de los virus más típicos. Esta configuración experimental se usó entonces para enumerar tres virus respiratorios distintos: adenovirus, virus sincitial respiratorio y virus de la gripe A. Se encontró que la amplitud de la señal se escala con el contenido de ácido nucleico, y los valores se correlacionaron con los valores obtenidos de otros procedimientos de detección estándar. Un inconveniente de este esquema de detección de color único es que esta configuración no permite la diferenciación entre partículas de virus enteras y partículas rotas o parciales. Este enfoque de detección de canal único tiende a sobreestimar el recuento de partículas intactas en una muestra debido a esta falta de discriminación, y esto se confirmó por comparación con el cultivo tisular (que solo mide las partículas virales infecciosas). Otros inconvenientes para este procedimiento incluyen la necesidad de análisis de datos posteriores a la adquisición (los resultados no se generaron en tiempo real) y que la configuración instrumental no era susceptible de fabricación rutinaria para comercialización. Además, la celda de flujo capilar de vidrio era susceptible de obstrucción.
Se ha descrito un citómetro de flujo de doble canal optimizado específicamente para contar las partículas de virus intactas (completas) (Stoffel, Finch, y Rowlen, Cytometry Parte A, 2005, 65A:140-147; Stoffel y col., Am. Biotech. Lab., 2005, 23(12), 24-25.). Una extensión del diseño de Ferris y col. descrito anteriormente, este instrumento utilizó un procedimiento de detección de dos colores añadiendo un segundo canal de detección. El material genómico (ADN/ARN) y la proteína del baculovirus se tiñeron diferencialmente. Los dos colorantes fluorescentes se excitaron con una única longitud de onda, y después se recogió la emisión de fluorescencia de cada mancha en canales separados. Los eventos simultáneos que ocurren en ambos canales se usaron para indicar partículas de virus intactas, y esta técnica de enumeración mostró una correlación directa con los procedimientos tradicionales de titulación de placa. Aunque este procedimiento de enumeración permitió una mejor discriminación de las partículas de virus completos, el instrumento era un instrumento de investigación y no fue susceptible de fabricación rutinaria para comercialización y padecía de la misma obstrucción periódica de la celda de flujo capilar como se describió en el instrumento de un solo canal anterior. Además, todo el procesamiento de datos y el análisis para este sistema se realizaron después de que la muestra se hubiera procesado (Stoffel y Rowen, Anal. Chem. 2005, 77(7), 2243-2246) y la entrada requerida de usuario en múltiples paquetes de software. Este análisis de datos posterior a la adquisición es el procedimiento típico usado en las aplicaciones de citometría de flujo tradicionales. Se usan convertidores rápidos de analógico a digital y sistemas de digitalización para adquirir y almacenar datos para un análisis adicional después de que la corrida de la muestra esté completa. El usuario establece límites e intervalos para cada canal de información y puede procesar los datos de una variedad de formas usando paquetes de software sofisticados, basándose en la experiencia de usuario para aplicar configuraciones apropiadas. En la mayoría de los casos, el usuario debe esperar hasta que se haya completado, procesar los datos y, a continuación, determinar que los ajustes fueron o no apropiados para la muestra. Las principales desventajas de estas sofisticadas herramientas de investigación de citómetro de flujo incluyen la necesidad de la experiencia del usuario, el tiempo de análisis y el coste.
Como se mencionó anteriormente, los citómetros de flujo tradicionales generalmente no se usan para la cuantificación precisa de partículas. El control de flujo se logra típicamente mediante el uso de uno de varios tipos de bombas que están configuradas para suministrar una presión constante. Aunque se esté administrando una presión constante, en última instancia, un número de variables puede afectar a las velocidades de flujo, y, a su vez afectar negativamente la cuantificación de las partículas.
La reciente disponibilidad comercial de pequeños sensores de flujo de masa capaces de medir con precisión bajas velocidades de flujo de líquido en el intervalo de nL/min a μl/min permite nuevas posibilidades en términos de manejo de flujo de líquido económico. Las patentes de EE.UU. Nos. 6550324 y 6813944 describen dispositivos de flujo de masa basados en CMOS pequeños que comprenden microsensores calorimétricos colocados a lo largo de un tubo que contiene líquido que fluye. Un elemento de calentamiento en el sensor CMOS aplica una pequeña cantidad de calor al líquido que fluye, y dos sensores de temperatura colocados por encima y por debajo de la fuente de calor miden la temperatura, y las diferencias de temperatura se relacionan entonces con la velocidad de flujo del líquido. La patente de EE. UU. N°. 6597438 describe un citómetro de flujo portátil en el que se ha incorporado este tipo de sensor de flujo anemométrico térmico, pero no se demostró la cuantificación de partículas, ya que el sensor de flujo másico se incorporó para reducir el tamaño global, la complejidad y el consumo de energía del dispositivo portátil. El documento US-2005/105077 A1 describe un citómetro portátil, miniaturizado y usable para proporcionar una advertencia temprana de posible infección para permitir a un usuario buscar atención médica en una etapa temprana cuando una infección puede ser más fácilmente tratable
A pesar de las mejoras realizadas en el área de enumeración de partículas virales incorporando aspectos de citometría de flujo tradicional con diferentes configuraciones experimentales que permiten una mejor discriminación y cuantificación mejorada, existe la necesidad en la técnica de mejorar aún más los procedimientos de cuantificación viral. Específicamente, nuevos dispositivos y procedimientos capaces de reemplazar los procedimientos estándar de oro utilizados durante mucho tiempo pero que requieren mucho trabajo y tiempo requieren una alta precisión de conteo, un tiempo rápido para obtener resultados y un caso de uso en un entorno de laboratorio típico.
Resumen de la invención
La presente invención proporciona un sistema según la reivindicación 1 y un procedimiento según la reivindicación 11.
Breve descripción de las figuras
Una mejor comprensión de la presente invención se tendrá en referencia a la siguiente descripción detallada leída junto con los dibujos adjuntos. En los dibujos adjuntos, caracteres de referencia similares se refieren a partes similares en todas partes, y en donde:
La Figura 1 es un diagrama esquemático que ilustra componentes de un posible modo de enumeración de partículas según las realizaciones descritas en la presente memoria.
La Figura 2(a) es un diagrama esquemático que ilustra el sistema de excitación y detección para un posible modo de enumeración de partículas según las realizaciones descritas en la presente memoria.
La Figura 2(b) es una representación gráfica de un modelo de detección.
La Figura 3 ilustra una correlación entre la respuesta del sensor de flujo y una medición de la bomba de jeringa estándar de oro según las realizaciones descritas en la presente memoria.
La Figura 4 ilustra que fluctuaciones de velocidad de flujo de fluido de muestra son posibles durante la aplicación de una presión de espacio vacío de fluido de muestra constante según las realizaciones descritas en esta invención. La Figura 5(a) ilustra las fluctuaciones de velocidad de flujo de fluido de envoltura posibles durante la aplicación de una presión de espacio vacío de fluido de envoltura constante según las realizaciones descritas en esta invención. La Figura 5(b) ilustra una velocidad de flujo constante suministrada si se usa un bucle de retroalimentación para controlar la presión aplicada.
La Figura 6 ilustra una anticorrelación entre la velocidad de flujo de fluido de envoltura y la velocidad de flujo de fluido de muestra según un posible modo de enumeración de partículas según las realizaciones descritas en la presente memoria.
La Figura 7 ilustra las diferencias en la concentración de partículas calculada usando una velocidad de flujo de fluido de muestra supuesto basada en una presión aplicada constante, y usando la velocidad de flujo de fluido de muestra medido durante el transcurso del tiempo del experimento.
La Figura 8(a) ilustra la velocidad de flujo del fluido de muestra constante suministrada si se utiliza un bucle de retroalimentación para controlar la presión de muestra aplicada durante la corrida.
La Figura 8(b) ilustra la concentración de partículas calculada.
Descripción detallada de la invención
Estas y otras características y ventajas de la invención descrita residen en la construcción de partes y la combinación de las mismas, y el modo de operación y uso, como se hará evidente a partir de la siguiente descripción y ejemplos, haciendo referencia a los dibujos adjuntos. Las realizaciones y características de la presente invención se describen e ilustran junto con sistemas, herramientas y procedimientos que están destinados a ejemplificarse y para ilustrar, no siendo limitantes en alcance. Para fines de ilustración, las realizaciones ejemplares que siguen se analizan en referencia a un procedimiento en el que se fusionan dos trayectorias de flujo de fluido, sin una mezcla sustancial, en una celda de flujo y se utilizan dos canales de detección. Debe entenderse que la presente invención no se limita a procedimientos que implican solo una o dos trayectorias de flujo de fluido y uno o dos canales de detección, y también es aplicable a dispositivos y procedimientos que implican más de dos trayectorias de flujo de fluido y más de dos canales de detección, y las realizaciones ilustrativas no pretenden ser limitantes en alcance.
Las realizaciones ilustrativas ilustran procedimientos para mejorar la precisión de cuantificación de partículas en una corriente que fluye mediante la medición de velocidades de flujo en tiempo real o casi real (denominado genéricamente en combinación como “tiempo real” ), y a través de la medición de velocidades de flujo en tiempo real y ajuste de
velocidad de flujo en tiempo real a través de un bucle de retroalimentación. En general, una muestra en un medio líquido y un fluido de envoltura se introducen desde dos trayectorias de flujo separadas hasta una única celda de flujo para producir un enfoque hidrodinámico del fluido de muestra. La velocidad de flujo de cada fluido puede medirse, y también puede controlarse mediante un bucle de retroalimentación entre cada sensor de flujo de fluido y un dispositivo de control de flujo en cada trayectoria de flujo. La muestra fluida se analiza a continuación mediante un sistema de excitación y detección de una manera para permitir la enumeración de partículas tales como virus en la corriente que fluye.
La Figura 1 ilustra una posible realización de los procedimientos divulgados en esta invención. Un gas comprimido 1 fluye a través de un regulador de presión de muestra 2 y regulador de presión de envoltura 3 configurados en paralelo, suministrando presión a un depósito de muestras 4 y a un depósito de envoltura 5. Aunque se muestra como un único gas comprimido 1, cada trayectoria de flujo puede estar provisto de un suministro de gas. Fluido de muestra contenido dentro del depósito de muestra 4 fluye a través de un sensor de flujo de muestra 6, y el fluido de envoltura contenido dentro del depósito de envoltura 5 fluye a través de un sensor de flujo de envoltura 7. Se mide una velocidad de flujo de fluido de muestra con el sensor de flujo de muestra 6, y una velocidad de flujo de fluido de envoltura se mide con el sensor de flujo de envoltura 7. El fluido de muestra y el fluido de envoltura se fusionan sin mezclar y luego fluyen hacia una celda de flujo 8 de manera que se produzca un efecto de enfoque hidrodinámico en el fluido de muestra. Como puede apreciarse, el enfoque hidrodinámico requiere que el fluido de envoltura y el fluido de muestra tengan un flujo laminar y no turbulento. Además, para facilitar el enfoque hidrodinámico, el fluido de muestra generalmente se inyecta en el centro del fluido de envoltura para formar un flujo de dos capas a través de la celda de flujo 8 donde el fluido de envoltura crea una pared o tubo de flujo de fluido separado alrededor del flujo de fluido de la muestra. El fluido de muestra en la celda de flujo 8 a continuación se interroga por el sistema de excitación y detección 9 que comprende una fuente de luz 10 que incide en el fluido de muestra y un sistema de detección y análisis 11. Después de salir de la celda de flujo 8, tanto el fluido de muestra como el fluido de envoltura pueden mezclarse y fluir hacia desechos 12.
La Figura 1 también ilustra otra posible realización de los procedimientos descritos en la presente memoria. Un gas comprimido 1 fluye a través de un regulador de presión de muestra 2 y regulador de presión de envoltura 3 configurados en paralelo, suministrando presión a un depósito de muestras 4 y a un depósito de envoltura 5. Fluido de muestra contenido dentro del depósito de muestra 4 fluye a través de un sensor de flujo de muestra 6, y el fluido de envoltura contenido dentro del depósito de envoltura 5 fluye a través de un sensor de flujo de envoltura 7. Se mide una velocidad de flujo de fluido de muestra con el sensor de flujo de muestra 6, y una velocidad de flujo de fluido de envoltura se mide con el sensor de flujo de envoltura 7. Se puede utilizar una velocidad de flujo de fluido de muestra medida en el bucle de retroalimentación 13 para cambiar la presión del espacio vacío en el depósito de muestras 4, cambiando así la velocidad de flujo de fluido de la muestra en tiempo real. Además, una velocidad de flujo de fluido de envoltura medido puede utilizarse en el bucle de retroalimentación 14 para cambiar la presión del espacio vacío en el depósito de envoltura 5. cambiando así la velocidad de flujo de fluido de envoltura en tiempo real. Si, por ejemplo, la velocidad de flujo de fluido de muestra está por encima de una velocidad de flujo umbral predefinida, el bucle de retroalimentación 13 cambiaría el punto de ajuste en el regulador de presión de muestra 2 para bajar la presión (y, por lo tanto, la velocidad de flujo) en el depósito de muestra 4. Si, por ejemplo, la velocidad de flujo de fluido de muestra está por debajo de una velocidad de flujo umbral predefinida, el bucle de retroalimentación 13 cambiaría el punto de ajuste en el regulador de presión de muestra 2 para elevar la presión (y, por lo tanto, la velocidad de flujo) en el depósito de muestra 4. El bucle de retroalimentación 14 funcionaría de manera similar en la trayectoria de flujo de fluido de envoltura. Alternativamente, el bucle de retroalimentación podría funcionar en base a las velocidades de flujo relativas entre la trayectoria de fluido de la muestra y la envoltura, en base a una velocidad de cambio de la velocidad de flujo, o similar. Alternativamente, valores de control de fluido pueden usarse para restringir o relajar el tamaño de la trayectoria de flujo para controlar las velocidades de flujo. El fluido de muestra y el fluido de envoltura fluyen a continuación a una celda de flujo 8 de manera que se produzca un efecto de enfoque hidrodinámico en el fluido de muestra. El fluido de muestra en la celda de flujo 8 a continuación se interroga por el sistema de excitación y detección 9 que comprende una fuente de luz 10 que incide en el fluido de muestra y un sistema de detección y análisis 11. Después de salir de la celda de flujo 8. tanto el fluido de muestra como el fluido de envoltura se combinan y fluyen a residuos 12. Al mantener la velocidad de flujo de fluido de la muestra, en cualquier momento dado se conoce el volumen de fluido de muestra que ha pasado a través de la celda de flujo. Por lo tanto, el número total de partículas en un volumen dado es determinable en tiempo real.
Para comprender mejor las realizaciones ejemplares descritas, es útil describir adicionalmente un sistema de excitación y detección y un procedimiento de recuento general que puede utilizarse en combinación con los procedimientos descritos en esta invención. La Figura 2 ilustra esquemáticamente un sistema de excitación y detección 9 compuesto por una fuente de luz 10 y sistema de detección y análisis 11. El sistema de detección y análisis 11 se describe para dos canales de detección (11a, 11b ) ; sin embargo, como cuestión de conveniencia, son posibles más o menos canales de detección. En la Figura 2a, la fuente de luz 10 incide en un fluido de muestra que fluye a través del centro de una celda de flujo 8. En una realización, las partículas dentro del fluido de muestra están marcadas con fluorescencia para permitir la enumeración mediante medición de fluorescencia. Como ejemplo no limitativo, el ácido nucleico y la proteína de las partículas de virus dentro de un fluido de muestra pueden marcarse con dos especies fluorescentes diferentes capaces de detectarse diferencialmente en dos canales de detección. Se usa un sistema óptico para recoger la señal de fluorescencia emitida desde las partículas dentro del fluido de muestra.
La señal emitida puede entonces filtrarse espacial y ópticamente para separar las dos firmas de fluorescencia diferentes para permitir la detección de estas señales en dos detectores separados. Se muestra una ilustración esquemática de la salida general de un sistema que utiliza dos detectores como se describió anteriormente en la Figura 2b. La señal medida de un detector se muestra como línea continua 15, y la señal medida de un segundo detector se muestra como línea de puntos 16. Un evento en un canal de detección puede definirse como cuando el borde de ataque de la señal es mayor que un voltaje de referencia alto (Vh) 17. La duración del evento se define por el tiempo que la señal está por encima de un voltaje de referencia bajo (Vl) 18. Los voltajes de referencia 17 y 18 se pueden ajustar para garantizar que las señales de fondo no constituyan un evento. Como ejemplo no limitativo, la línea continua 15 representa la señal medida de un canal optimizado para detectar la proteína que pasa a través de un volumen de detección durante un período de tiempo arbitrario, y una línea de puntos 16 representa la señal medida de un canal optimizado para detectar el ácido nucleico que pasa a través de un volumen de detección durante el mismo período de tiempo arbitrario. Eventos de detección 19 y 20 representan la proteína que pasa a través del volumen de detección, mientras que el evento de detección 21 representa ácido nucleico que pasa a través del volumen de detección. Debido a que 22 nunca supera Vh, 22 no se considera un evento de detección. Los eventos 23 y 24 se producen simultáneamente en ambos canales de detección.
El número de eventos de detección en cada canal individual así como el número de eventos simultáneos pueden contarse, y estos números de eventos pueden usarse para calcular una concentración de partículas que pasan a través del volumen de detección. Para el ejemplo no limitativo descrito en esta invención, el número de eventos simultáneos se puede usar para calcular la concentración de partículas de virus intactas que contienen tanto ácido nucleico como proteína dentro de un fluido de muestra. Un procedimiento de recuento descrito anteriormente en relación con la Figura 2 puede utilizarse para medir recuentos de partículas en tiempo real, y puede implementarse usando hardware, software o una combinación de hardware y software.
En última instancia, un número de variables puede afectar a las velocidades de flujo de fluido de la muestra y del fluido de la envoltura en un procedimiento que incorpora una estrategia de enfoque hidrodinámico. La velocidad de flujo de fluido de muestra, que es típicamente menor que -5000 nL/min para los ejemplos no limitantes descritos en la presente memoria, aumenta cuando la presión del espacio vacío por encima del fluido de muestra en el depósito de muestra 4 se ha incrementado. La velocidad de flujo de fluido de muestra puede disminuir debido a una mayor restricción en el tubo por una obstrucción intermitente, la fluctuación periódica de la temperatura, otro evento periódico o de un cambio más regular tal como una disminución en el diámetro del tubo. Además, el aumento de la velocidad de flujo de fluido de la envoltura puede disminuir drásticamente la velocidad de flujo de fluido de muestra debido a variaciones de contrapresión, de modo que cualquier variable que afecte a la velocidad de flujo de fluido de envoltura también pueda afectar a la velocidad de flujo de fluido de muestra. La velocidad de flujo de fluido de envoltura aumenta cuando la presión del espacio vacío por encima del fluido de envoltura en el depósito de envoltura 5 se aumenta, y también cuando el nivel de líquido en el depósito de envoltura 5 se ha incrementado. La velocidad de flujo de fluido de envoltura puede disminuir debido a aumentos en la contrapresión de la restricción del tubo, cambios de presión atmosférica en la salida de residuos o fuerzas gravimétricas en que las alturas relativas de los depósitos de muestra y envoltura han cambiado.
Curvas de respuesta del sensor de flujo
La Figura 3 ilustra la operación precisa tanto del sensor de flujo de muestra 6 y del sensor de flujo de envoltura 7 comparando velocidades de flujo medidas con estos sensores para velocidades de flujo medidas por una bomba de jeringa estándar. El sensor de fluido de muestra y el sensor de fluido de envoltura utilizados son los modelos LG 16-0150A y LG 16-1000A. respectivamente, (Sension Inc., Westlake Village, CA), y la bomba de jeringa usada fue modelo NE-1000 (New Era Pump Systems Inc., Farmingdale, NY). Diamantes cerrados 25 y línea continua 26 muestran la correlación entre las velocidades de flujo de muestras medidas con el sensor de flujo de muestra 6 en el eje y la bomba de jeringa en el eje x, ambas medidas en nL/min. Los datos representados por cuadrados abiertos 27 y línea discontinua 28 muestra la correlación entre las velocidades de flujo de la envoltura medidas con el sensor de flujo de la envoltura 7 en el eje Y y la bomba de jeringa en el eje x, ambas medidas en μL/min. Se observa una fuerte correlación con la velocidad de flujo de la bomba de jeringa para ambos sensores, con R2=0,998 (línea continua 26 ) y R2= 0,999 (línea discontinua 28 ) para el sensor de flujo de muestras y los datos del sensor de flujo de envoltura, respectivamente.
Variación de velocidad de flujo con presión aplicada constante
La Figura 4 ilustra el problema con la suposición comúnmente realizada de que una presión aplicada constante suministra una velocidad de flujo constante. La velocidad de flujo de muestra en numin mostrada en el eje y izquierdo corresponde a la serie de datos representada por la línea continua 29, mientras que la presión aplicada en psi en el eje y derecho corresponde a la serie de datos representada por la línea de puntos 30. En función de tiempo en segundos a lo largo del eje x, la Figura 4 muestra que, aunque se aplica una presión constante al espacio vacío en el depósito de muestras 4 usando el regulador de presión de la muestra 2, la velocidad de flujo medido del fluido de muestra es muy variable mostrado por línea continua 29. Este cambio en la velocidad de flujo puede ser causado por obstrucciones dentro del sistema u otros eventos periódicos o inesperados como se ha descrito anteriormente. La concentración de partículas en solución puede calcularse determinando el número de eventos de detección que pasan
a través del volumen de detección en un cierto período de tiempo. Por lo tanto, si la velocidad de flujo de la muestra se supone en lugar de medirse y/o controlarse durante ese mismo período de tiempo, la concentración final de la partícula calculada se ve afectada por cambios en la velocidad de flujo tales como los observados en la Figura 4.
La Figura 5a ilustra que aplicar una presión constante con regulador de presión de envoltura 3 al espacio vacío en el depósito de envoltura 5 no es suficiente para entregar una velocidad de flujo de envoltura constante. Aunque la presión aplicada al espacio vacío en el depósito de envoltura 5 permanece constante como se muestra por diamantes abiertos 31 y línea discontinua 32 (eje y izquierdo, medida en psi), a medida que aumenta el volumen medido en mL en el depósito de envoltura, hay un aumento constante en la velocidad del flujo medida por el sensor de flujo de envoltura 7 mostrada por triángulos cerrados 33 y línea continua 34 (eje y derecho en μL/min).
La Figura 5b ilustra que la medición de velocidad de flujo utilizada junto con un bucle de retroalimentación para compensar los cambios en la velocidad de flujo medida se puede utilizar para suministrar una velocidad de flujo constante. El sensor de flujo de envoltura 7 se utilizó para medir la velocidad de flujo de envoltura, y el bucle de retroalimentación 14 se utilizó para aplicar cambios a la presión del espacio vacío para compensar los cambios medidos en la velocidad del flujo de envoltura. Con control de retroalimentación, diamantes abiertos 35 y línea discontinua 36 indican que la presión aplicada sobre el espacio vacío (eje y izquierdo, medida en psi) se redujo automáticamente para compensar las diferencias de presión que resultaron del aumento de volumen en el depósito de envoltura 5. La mejora en la velocidad de flujo suministrado debido a la capacidad del bucle de retroalimentación de proporcionar compensación se muestra mediante la velocidad de flujo de envoltura medida constante (eje y derecho, medida en μl/min) mostrada por triángulos cerrados 37 y línea continua 38.
Efecto de la velocidad de flujo de fluido de envoltura sobre la velocidad de flujo del fluido de muestra
La Figura 6 ilustra la fuerte correlación entre la velocidad de flujo de fluido de envoltura en μL/min en el eje x y la velocidad de flujo de fluido de muestra en nL/min en el eje y. Aunque se puede aplicar una presión constante al espacio vacío sobre el fluido de muestra en el depósito de muestras 4 usando el regulador de presión de muestra 2, si se cambia la velocidad de flujo de fluido de envoltura, la velocidad de flujo de fluido de muestra también cambia como se ilustra mediante diamantes abiertos 39 y línea punteada 40 que muestra que la velocidad de flujo de fluido de envoltura y la velocidad de flujo de fluido de muestra están anticorrelacionadas debido a una contrapresión aumentada en la corriente de muestra a velocidades de flujo de fluido de envoltura más altos. Sin embargo, la velocidad de flujo de fluido de muestra medida puede utilizarse en el bucle de retroalimentación 13 para cambiar la presión del espacio vacío en el depósito de muestras 4 para suministrar una velocidad de flujo de fluido de muestra que permanecerá constante, independientemente de la velocidad de flujo de fluido de envoltura. Esta situación controlada por retroalimentación se ilustra con mediciones de la velocidad de flujo de muestra representada por triángulos cerrados 41 y línea continua 42 que indican una velocidad de flujo de muestra constante a medida que se varía la velocidad de flujo de fluido de la envoltura.
Medición de flujo y corrección para fluctuaciones de flujo mejora la cuantificación
La Figura 7 muestra la diferencia en las concentraciones calculadas que se obtienen dependiendo de si la velocidad de flujo de fluido de muestra medida se usa o no para corregir las fluctuaciones de flujo que se produjeron durante el transcurso de tiempo en segundos (eje x) de una corrida experimental. Como es común en citometría de flujo, la presión de la muestra se ajustó a un valor constante de 1,163 ± 0,006 psi. La línea sólida 43 muestra que algún evento durante el marco de tiempo del experimento provocó una caída aproximada del 50 % en la velocidad de flujo de la muestra (eje y izquierdo, medida en nL/min). Si la presión de muestra aplicada se usa para asumir una velocidad de flujo de fluido de muestra constante, y esta velocidad de flujo de fluido de muestra constante se usa a su vez para calcular la concentración de muestra (mostrada en el eje y derecho, medida en vμl/mL donde vμl son partículas de tipo viral), la concentración de muestra calculada durante el tiempo del experimento mostrada por línea de puntos 44 se obtiene e imita el perfil de tiempo de la velocidad de flujo de fluido de muestra. Sin embargo, la línea gris sólida 45 ilustra la medición de concentración que se obtiene si la velocidad de flujo de fluido de muestra medida durante el período de tiempo del experimento se usa para corregir esta fluctuación en el flujo. La concentración promedio de partículas calculada para la línea de puntos 44 es 2,1 x 108 vlp/mL, con una desviación estándar relativa de ~19 % (±0,4 x 108 vlp/mL). La concentración promedio de partículas calculada para la línea gris sólida 45 es 2,4 x 108 vlp/mL con una desviación estándar relativa de solo ~4 % (±0,1 x 108 ). Cuando se controla la velocidad de flujo de fluido de muestra, la concentración de muestra calculada es más estable y relativamente constante durante el período de tiempo del experimento con una desviación estándar relativa significativamente menor. Si la velocidad de flujo de fluido de muestra no se controla para que sea constante, el resultado vμl/ml será generalmente alto o bajo dependiendo de si la velocidad de flujo es alto o bajo. Este resultado de concentración corregido es claramente una mejora en la situación en la que la velocidad de flujo de fluido de muestra no se mide y/o corrige. El uso de una velocidad de flujo de fluido de muestra medida para corregir las fluctuaciones de flujo en el cálculo de la concentración de muestra se realizó en este caso como una etapa de procesamiento posterior a la adquisición. Como se muestra en la siguiente figura, esta compensación para la fluctuación de flujo también se puede hacer en tiempo real a través del uso de bucles de retroalimentación para mejorar de manera similar la precisión de la cuantificación de partículas.
La medición y control del flujo en tiempo real mejoran la cuantificación
La Figura 8 ilustra que la medición de la velocidad de flujo combinada con la corrección de fluctuaciones en tiempo real a través de un bucle de retroalimentación puede proporcionar una mejora “ instantánea” en la precisión de la cuantificación de partículas. En el experimento ilustrado en la Figura 8a, el bucle de retroalimentación 14 se usó para controlar la velocidad de flujo de fluido de la envoltura controlando la presión del espacio vacío en el depósito de envoltura 5 a través del regulador de presión de envoltura 3. Además, el bucle de retroalimentación 13 se usó para controlar la velocidad de flujo de fluido de la muestra controlando la presión del espacio vacío en el depósito de fluido de muestra 4 a través del regulador de presión de muestra 2. Un evento interrumpió la velocidad de flujo de fluido de la muestra y requirió un bucle de retroalimentación 13 para suministrar una presión variable sobre el espacio vacío en el depósito de fluido de muestra 4, ilustrado por línea continua 46 (medida en psi, eje y derecho). Esta presión aplicada variable dio como resultado el suministro de la velocidad de flujo de fluido de muestra relativamente constante en numin ilustrado por línea de puntos 47 (eje y derecho).
La Figura 8b ilustra el resultado cuando la velocidad de flujo de fluido de muestra medida 47 en la Figura 8a se utilizó en tiempo real para calcular la concentración de partículas en la muestra (ilustrada por una línea continua) 48, eje y en vμl/mL). Debido a que la cantidad de fluido que fluye más allá del sistema de excitación y detección 9 se conocía, el análisis posterior al procedimiento no fue necesario para calificar los resultados de modo que se pueda obtener el tiempo real vμl. La concentración promedio de partículas durante el transcurso del tiempo de este experimento es 1,6 *108 vlp/mL con una desviación estándar relativa de ~6 % (±0,1 x 108 vlp/mL). Esta desviación estándar relativa es similar a la mostrada en la Figura 7 para el caso en el que la concentración se calcula a partir de la velocidad de flujo de muestra corregido. Tanto la medición como el control de la velocidad de flujo de fluido de muestra en tiempo real a través del uso de un bucle de retroalimentación da como resultado la cuantificación de partículas con una precisión mejorada en comparación con una situación en la que se usa una velocidad de flujo no corregida para calcular la concentración de partículas. Además, la corrección de las fluctuaciones de velocidad de flujo de fluido de muestra durante la corrida permite que se muestre un resultado de concentración en tiempo real, eliminando la mayoría del procesamiento de recolección de datos posteriores y disminuyendo el tiempo global para resultado. En tercer lugar, el uso de un segundo bucle de retroalimentación para proporcionar una velocidad de flujo de fluido de envoltura constante tiene la ventaja adicional de estabilizar el efecto de enfoque hidrodinámico, y mejorar adicionalmente la cuantificación de las partículas.
Claims (11)
1. Un sistema para determinar una serie de partículas de virus en un volumen de fluido en tiempo real, que comprende:
al menos un suministro de fluido comprimido;
un depósito de muestras (4) que contiene un fluido de muestra que tiene un líquido y una pluralidad de partículas marcadas con fluorescencia de virus que tienen un tamaño menor de 1 micrómetro, estando el al menos un suministro de fluido comprimido en comunicación fluida con el depósito de muestra;
un regulador de presión de muestra (2) en comunicación fluida con el al menos un suministro de fluido comprimido y el depósito de muestra para regular una presión del depósito de muestra; un depósito de envoltura (5) que contiene fluido de envoltura, estando el al menos un suministro de fluido comprimido en comunicación fluida con el depósito de envoltura;
un regulador de presión de envoltura (3) en comunicación fluida con el al menos un suministro de fluido comprimido y el depósito de envoltura para regular una presión del depósito de envoltura; una celda de flujo (8), estando la celda de flujo en comunicación fluida tanto con el depósito de muestra como con el depósito de envoltura;
un sensor de flujo de muestra (6) en comunicación fluida con el depósito de muestra y la celda de flujo, el sensor de flujo de muestra acoplado al regulador de presión de muestra para alterar la presión del depósito de muestra para mantener una velocidad de flujo de muestra sustancialmente constante desde el depósito de muestra a la celda de flujo de menos de 5000 nanolitros por minuto; un sistema de excitación y detección (9) acoplado a la celda de flujo para contar mediante medición de fluorescencia el número de partículas de virus que fluyen a través de la celda de flujo, en donde el número total de partículas de virus en el volumen de fluido se proporciona en tiempo real.
2. El sistema de la reivindicación 1, que comprende además un sensor de flujo de envoltura (7) en comunicación fluida con el depósito de envoltura y la celda de flujo para determinar una velocidad de flujo de envoltura del fluido de envoltura, el sensor de envoltura acoplado al regulador de presión de envoltura para alterar la presión del depósito de envoltura para mantener una velocidad de flujo de envoltura sustancialmente constante.
3. El sistema de la reivindicación 1, en donde el sistema de excitación y detección se acopla ópticamente a la celda de flujo.
4. El sistema de la reivindicación 3, en donde el segundo dispositivo móvil comprende:
una fuente de luz (10), y
un sistema de detección y análisis (11), en donde la fuente de luz incide sobre el fluido de muestra y el sistema de detección y análisis recibe una señal óptica utilizada para determinar si la partícula está presente.
5. El sistema de la reivindicación 4, en donde los virus incluyen ácido nucleico y proteína marcada con dos especies fluorescentes diferentes capaces de ser detectadas diferencialmente en dos canales de detección (11a, 11 b), y el sistema de detección y análisis comprende dos detectores separados para detectar diferentes firmas fluorescentes de las dos especies fluorescentes diferentes.
6. El sistema de la reivindicación 1, en donde el sensor de flujo de muestra determina la velocidad del flujo de muestra.
7. El sistema de la reivindicación 6, en donde el sensor de flujo de muestra hace que el regulador de presión de muestra altere la presión del depósito de muestra cuando la velocidad del flujo de muestra esté fuera de un intervalo umbral predeterminado.
8. El sistema de la reivindicación 1, en donde el sensor de flujo de muestra se usa para determinar una velocidad de cambio del flujo de muestra y alterar la presión del depósito de muestra para mantener una velocidad de cambio del flujo de muestra sustancialmente cero.
9. El sistema de la reivindicación 1, en donde el al menos un fluido comprimido es un gas comprimido.
10. El sistema de una cualquiera de las reivindicaciones 1-9, en donde las partículas de virus tienen un tamaño entre diez y varios cientos de nanómetros.
11. Un procedimiento para usar el flujo controlado de un fluido de muestra para permitir la cuantificación de partículas de virus en la corriente de fluido de muestra en tiempo real, comprendiendo el procedimiento:
proporcionar un fluido de muestra que tiene un líquido y una pluralidad de partículas de virus marcadas con fluorescencia que tienen un tamaño inferior a 1 micrómetro en un depósito (4) en comunicación fluida con una celda de flujo (8);
presurizar el depósito de fluido de muestra para hacer que el fluido de muestra fluya desde el depósito de fluido de muestra hacia la celda de flujo;
medir un parámetro de flujo del fluido de muestra que fluye entre el depósito de fluido de muestra y la celda de flujo;
fusionar un flujo de fluido de envoltura con el flujo de fluido de muestra antes de entrar en la celda de flujo para enfocar el flujo de fluido de muestra en la celda de flujo;
controlar la presión del depósito de fluido de muestra usando el parámetro de flujo medido para mantener el flujo de fluido de muestra a una velocidad de flujo sustancialmente constante desde el depósito de muestra de fluido hacia la celda de flujo de menos de 5000 nanolitros por minuto; contar mediante medición fluorescente un número de partículas de virus que pasan a través de la celda de flujo; y
proporcionar el número de partículas de los virus en un volumen de fluido en tiempo real.
El procedimiento de la reivindicación 11, en donde la etapa de presurizar el depósito de fluido de muestra incluye acoplar un gas comprimido al depósito de fluido de muestra a través de un regulador de presión (2).
El procedimiento según la reivindicación 11, que comprende además
proporcionar el fluido de envoltura en un depósito (5) en comunicación fluida con la celda de flujo; presurizar el depósito de fluido de envoltura para hacer que el fluido de envoltura fluya desde el depósito de fluido de envoltura hacia la celda de flujo;
medir un parámetro de flujo del fluido de envoltura que fluye entre el depósito de fluido de envoltura y la celda de flujo; y
controlar la presión del depósito de fluido de envoltura usando el parámetro de flujo medido para mantener el flujo de fluido de envoltura a una velocidad de flujo sustancialmente constante.
El procedimiento de la reivindicación 11, en donde:
los virus incluyen ácido nucleico y proteína marcada con dos especies fluorescentes diferentes capaces de detectarse diferencialmente en dos canales de detección (11a, 11b); y
el recuento mediante medición fluorescente incluye detectar dos firmas fluorescentes diferentes de las dos especies fluorescentes diferentes en dos detectores separados.
El procedimiento de una cualquiera de las reivindicaciones 11-14, en donde las partículas de virus tienen un tamaño entre diez y varios cientos de nanómetros.
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