ES2378352T3 - Procedimiento para analizar una muestra sanguínea o una muestra de un derivado sanguíneo usando un sistema hematológico basado en citometría de flujo - Google Patents
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Abstract
Un procedimiento para analizar una muestra sanguinea o una muestra de un derivado sanguineo usando un sistema hematologico basado en citometria de flujo que comprende un sistema de deteccion optico, comprendiendo el procedimiento: proporcionar un tubo consumible cerrado (60) teniendo en un extremo del mismo un septo que es perforable por una aguja, conteniendo dicho tubo: un numero conocido de particulas de referencia, teniendo cada una de dichas particulas de referencia un diametro predeterminado y siendo distinguibles de las celulas objetivo de la muestra sanguinea o de la muestra del derivado sanguineo basandose en al menos una medicion optica de una medicion de extincion, una medicion de dispersion anterograda de la luz de angulo pequeno, una medicion de la dispersion de angulo recto, una medicion de la dispersion de la luz de angulo elevado y una medicion de la duracion de vuelo; y al menos un reactivo para permitir la determinacion de la composicion celular de la muestra sanguinea o muestra de derivado sanguineo, comprendiendo el al menos un reactivo al menos un colorante; perforar el septo con una aguja (11) y alicuotar una primera porcion de sangre completa y un volumen conocido de disolucion envolvente en el tubo consumible cerrado (60) a traves de la aguja (11), formando la primera porcion de sangre completa, el volumen conocido de disolucion envolvente, las particulas de referencia y el al menos un reactivo, una primera disolucion; succionar un volumen conocido de la primera disolucion desde el tubo consumible cerrado (60) en el sistema de deteccion optico a traves de la aguja (11); usar el sistema de deteccion optico para medir la dispersion de la luz y la absorcion de la luz por parte de eritrocitos, p laquetas y particulas de r eferencia i ndividuales dentro del vo lumen co nocido d e l a primera disolucion, y para medir la absorcion de luz del al menos un colorante dentro del volumen conocido de la primera disolucion; alicuotar una segunda porcion de sangre y un volumen de disolucion envolvente en el tubo consumible cerrado (60) a traves de la aguja (11); alicuotar una alicuota de lisado en el tubo consumible (60) a traves de la aguja (11), formando el contenido del tubo consumible cerrado (60) y el lisado, una segunda disolucion; succionar un volumen conocido de la segunda disolucion en el sistema de deteccionoptico a traves de la aguja (11): usar el sistema de deteccion optico para medir la dispersion de la luz y la absorcion de la luz por parte de los leucocitos, las particulas de referencia y el al menos un colorante individuales dentro del volumen conocido de la segunda disolucion.
Description
Procedimiento para analizar una muestra sanguinea o una muestra de un derivado sanguineo usando un sistema hematologico basado en citometria de flujo
5 Esta invencion se refiere en general al analisis de bioparticulas, y mas especificamente a un procedimiento para analizar una muestra sanguinea o una muestra de un derivado sanguineo usando un sistema hematologico basado en citometria de flujo. Dicho sistema emplea un conjunto de caracteristicas seleccionadas que, en combinacion, proporcionan al menos un recuento sanguineo completo, un recuento diferencial en cinco partes de leucocitos, y un
recuento de reticulocitos en un sistema que es pequeno, fiable y lo suficientemente economico como para ser adecuado para su uso en pequenos laboratorios clinicos, consultas medicas, consultas veterinarias y similares. La sangre periferica de los mamiferos contiene habitualmente tres clasificaciones principales de los tipos celulares sanguineos - eritrocitos (red blood cells, "RBCs"), leucocitos (white blood cells, "WBCs) y plaquetas (platelets,
15 "PLT"). Estas celulas estan suspendidas en una disolucion denominada plasma, que contiene muchas proteinas, enzimas e iones diferentes. Las funciones de los componentes plasmaticos engloban la coagulacion sanguinea, el mantenimiento de la osmolalidad, la inmunovigilancia y muchas otras funciones. Los mamiferos tienen habitualmente cualquier cifra entre 2-10 x 1012 eritrocitos por litro. Los eritrocitos son
responsables del transporte de oxigeno y de dioxido de carbono en el sistema circulatorio. En muchos mamiferos, incluyendo los seres humanos, los eritrocitos maduros normales tienen una forma transversal biconcava y carecen de nucleo. Los eritrocitos pueden tener un diametro de entre 4 y 9 micrometros, dependiendo de la especie, y tienen un espesor que generalmente es inferior a 2 micrometros. Dentro de los eritrocitos hay una proteina conocida como hemoglobina, que realiza el doble papel de transporte de oxigeno y de dioxido de carbono, y que esta presente a
25 una concentracion muy alta. La hemoglobina es responsable de la coloracion global roja de la sangre, debido a la presencia de hierro en la molecula. En la presente solicitud, los terminos "eritrocitos", "celulas rojas sanguineas", "celulas rojas" y "RBCs" se usan de forma intercambiable para referirse a las celulas sanguineas que contienen hemoglobina presentes en la circulacion, segun se describio anteriormente.
Ademas de los eritrocitos normales, a menudo pueden encontrarse mas formas inmaduras de los eritrocitos en muestras de sangre periferica. La forma ligeramente inmadura de los eritrocitos se denomina reticulocito, y las formas muy inmaduras se denominan ampliamente eritrocitos nucleados (nucleated red blood cells, NRB Cs). Practicamente todos los animales no mamiferos tienen exclusivamente eritrocitos nucleados en su sangre.
35 Un reticulocito es un precursor de un eritrocito que ha completado la mayoria de las etapas de desarrollo celular normales en la medula osea, y que ha expulsado su nucleo. La ultima porcion que queda por abandonar del reticulocito antes de que se transforme en un eritrocito realmente maduro es el ARN transferente. La deteccion de los reticulocitos es importante en la evaluacion clinica de la capacidad de los pacientes para producir nuevos eritrocitos. El recuento de reticulocitos tambien puede usarse para distinguir entre los distintos tipos de anemia. En la
anemia, la produccion de eritrocitos esta disminuida hasta el punto en que ya no se puede continuar con la eliminacion de eritrocitos, y como resultado el recuento eritrocitario global y el hematocrito son bajos. La presencia de un incremento en el numero de reticulocitos en estos pacientes proporciona una prueba de que la medula osea esta funcionando, y de que esta intentando compensar la deficiencia de eritrocitos. Si hay una cifra baja o n o detectable de reticulocitos en estos pacientes, la medula osea no esta respondiendo adecuadamente a la deficiencia
45 en eritrocitos. Los leucocitos ( white blood cells, WBCs) existen en la sangre periferica en concentraciones muy bajas en comparacion con los eritrocitos. Las concentraciones normales de estas celulas varian entre 5-15 x 109 por litro, lo que es aproximadamente tres ordenes de magnitud menos que los eritrocitos. Estas celulas son generalmente
mayores que los eritrocitos, teniendo unos diametros de entre 6 y 13 micrometros, dependiendo del tipo de linfocito y de la especie. Al contrario que los eritrocitos, existe una variedad de tipos celulares de linfocitos que realizan diferentes funciones en el cuerpo. En esta solicitud, los terminos "celulas blancas sanguineas", "celulas blancas" y "WBCs" se usan de forma intercambiable para referirse a las celulas sanguineas nucleadas que no contienen hemoglobina presentes en la circulacion, segun se describio anteriormente.
55 La medicion del numero de leucocitos es importante en la deteccion y la monitorizacion de diversas alteraciones fisiologicas. Unas cifras elevadas de leucocitos anormales son un signo de leucemia, que es una proliferacion incontrolada de una celula mielogena o linfogena. La neutrofilia, o cifras muy aumentadas de neutrofilos, es una indicacion de inflamacion o de destruccion tisular en el cuerpo, por cualquiera que sea la causa.
Los leucocitos pueden clasificarse ampliamente como granulares o agranulares. Las celulas granulares, o granulocitos, se subdividen adicionalmente en neutrofilos, eosinofilos y basofilos. Los linfocitos agranulares se denominan a menudo celulas mononucleares, y se subclasifican en linfocitos y monocitos. Las mediciones de estas dos subclasificaciones principales de los linfocitos (granulocitos y celulas mononucleares) suponen lo que se
65 denomina un recuento diferencial de leucocitos en dos partes (o diferencial en dos partes). Las mediciones de los componentes de estas subclasificaciones (neutrofilos, eosinofilos, basofilos, linfocitos y monocitos), producen un
recuento diferencial de leucocitos en cinco partes (o diferencial en cinco partes).
Los neutrofilos son la mas prevalente de las cinco principales clases de leucocitos, suponiendo habitualmente un poco mas de la mitad del numero total de leucocitos totales. Los neutrofilos se denominan asi porque contienen granulos en su citoplasma, que pueden ser tenidos con una tincion de pH neutro. Estas celulas tienen una vida relativamente corta, del orden de un dia o menos. Los neutrofilos atacan y destruyen bacterias invasoras, y otros agentes extranos en los tejidos o la sangre circulante como parte de los mecanismos de respuesta inmunitaria del cuerpo.
Los eosinofilos son l os siguientes mas prevalentes d e l os granulocitos, por detras de l os neutrofilos, p ero generalmente suponen menos del cinco por ciento del numero total de leucocitos. Los eosinofilos tambien pueden contener granulocitos en su citoplasma, que pueden ser tenidos con una tincion de eosina. Al igual que los neutrofilos, estas celulas no existen durante largos periodos de tiempo en la sangre periferica. Los eosinofilos juegan un papel enlos mecanismosde respuesta inmunitariadel cuerpo que se asocianhabitualmentecon alergiaso infecciones parasitarias.
Los basofilos son los menos comunes de los granulocitos, y los menos comunes de las cinco clasificaciones de leucocitos. Dado que son granulocitos, contienen granulos en su citoplasma que pueden ser tenidos, en este caso usando una tincion a pH basico (alto). Tambien se sabe que estas celulas juegan un papel en los mecanismos de respuesta inmunitaria del cuerpo, pero no se conocen en concreto.
Los linfocitos son los mas prevalentes de los tipos celulares mononucleares, y generalmente suponen entre el 20 y el 30 por ciento del numero total de leucocitos. Los linfocitos no tienen granulos en su citoplasma, y su nucleo ocupa una gran mayoria del volumen celular. La pequena zona de ci toplasma de l os linfocitos puede tenirse, ya que contiene ARN. Los linfocitos circulan en la sangre periferica, abandonan la circulacion como parte del mecanismo de respuesta inmunitaria del cuerpo, y finalmente retornan a la sangre periferica. Muchos linfocitos son celulas relativamente longevas.
Los monocitos son formas inmaduras de los macrofagos que, por si mismos, tienen poca capacidad para enfrentarse a agentes infecciosos en la sangre circulante. Sin embargo, cuando hay una infeccion en los tejidos que rodean a un vaso sanguineo, estas celulas abandonan la sangre circulante y entran en los tejidos circundantes. Cuando esto se produce, los monocitos experimentan una drastica transformacion para formarlos macrofagos, aumentando su diametro t anto co mo hast a cinco v eces y desarrollando un gr an n umero d e m itocondrias y lisosomas en su citoplasma. Entonces los macrofagos atacan a los objetos extranos invasores mediante fagocitosis y la activacion de otras celulas del sistema inmunitario, tales como los linfocitos T. Un incremento en las cifras de macrofagos es una senal de que se esta produciendo una inflamacion en el cuerpo.
Las plaquetas se encuentran en todas las especies demamiferos, y estan implicadas en la homeostasis. Los animales nor males tendran ge neralmente ent re 1 -5 x 1 011 plaquetas por litro. E stas particulas celulares so n habitualmente mucho mas pequenas que los eritrocitos, teniendo un diametro de entre 1 y 3 !m. Las plaquetas se forman como yemas en las superficies de los megacariocitos, grandes celulas que se encuentran en la medula osea que por si mismas no abandonan la medula para entrar en la circulacion sanguinea. En su lugar, las yemas se desprenden y entran en la circulacion como plaquetas. Al igual que los eritrocitos, las plaquetas carecen de nucleo y por lo tanto no pueden reproducirse. Funcionalmente, las plaquetas actuan agregandose de forma que taponan o reparan pequenos agujeros de los vasos sanguineos. En el caso de agujeros mas grandes, la agregacion plaquetar actua como una etapa temprana en la formacion del coagulo. Como resultado, el recuento y la funcion plaquetares son clinicamente muy importantes. Recuentos anormalmente bajos de plaquetas pueden provocar alteraciones en la coagulacion.
En conjunto, el recuento y el tamano de los eritrocitos, el recuento de los leucocitos y el recuento de plaquetas se denomina h emograma co mpleto ( complete blood count, C BC). La c ategorizacion de l os leucocitos en ci nco clasificaciones principales, expresadas como una base de porcentaje, se denomina diferencial en cinco partes. La categorizacion de los eritrocitos en dos clasificaciones, eritrocitos maduros y eritrocitos reticulados, sobre una base de porcentaje, se denomina recuento de reticulocitos.
La determinacion de un hemograma completo, con un recuento diferencial en cinco partes y de reticulocitos, es un procedimiento diagnostico comun realizado para diagnosticar, rastrear y tratar numerosas dolencias. Estas pruebas suponen la gran mayoria de los analisis hematologicos que se realizan en laboratorios clinicos humanos y animales en el mundo. Estas tres pruebas pueden realizarse usando un microscopio, una centrifugadora, una camara de recuento, un portaobjetos y los reactivos apropiados. Sin embargo, las habilidades necesarias para realizar estas pruebas manualmente son poco frecuentes y requieren anos de entrenamiento. Adicionalmente, el tiempo necesario para realizar cada una de estas pruebas manualmente es muy elevado. Como resultado, en este campo se ha perseguido una si gnificativa automatizacion a t raves de l a i nstrumentacion desde l os i nicios de 19 50, cu ando aparecieron los primeros contadores celulares Coulter de impedancia.
Un contador de impedancia consiste en dos camaras rellenas con una disolucion salina y conectadas a traves de un
pequeno orificio. En presencia de un voltaje constante a traves del orificio, las celulas pasan individualmente a traves del orificio desplazando un volumen de disolucion salina e incrementando asi la impedancia del orificio. El tamano de la celula puede relacionarse con el pulso de voltaje generado por el paso de la celulaa traves del orificio. Como resultado, cuando una celula pasa a traves del orificio, su presencia y tamano puede determinarse a partir del pulso de voltaje resultante.
Al evolucionar la tecnologia de impedancia, se desarrollaron contadores celulares automatizados que eran capaces de contar eritrocitos, leucocitos y plaquetas simultaneamente en el mismo instrumento, basandose en los diferentes tamanos de estas clases de celulas. Esta automatizacion mostro ser de gran ayuda en los laboratorios hospitalarios. Sin embargo, estos sistemas eran incapaces de distinguir entre todos los diferentes tipos de leucocitos, y por lo tanto eran incapaces de proporcionar un recuento diferencial de cinco partes. Adicionalmente, estos instrumentos tambien eran incapaces de distinguir entre reticulocitos y eritrocitos normales, y por lo tanto tampoco podrian proporcionar un recuento de reticulocitos.
La citometria de flujo es un poderoso procedimiento de analisis para determinar el contenido celular de diversos tipos de muestras, y en particular de muestras que contienen celulas vivas. En aplicaciones clinicas, los citometros de flujo son utiles para el recuento y la clasificacion de linfocitos, para la caracterizacion inmunologica de leucemias y linfomas y para las pruebas de histocompatibilidad para trasplantes. En la mayoria de las tecnicas de citometria de flujo, se hace que las celulas de una disolucion fluida fluyan individualmente a traves de un rayo de luz, producido habitualmente por una fuente de luz laser. Al incidir la luz sobre cada celula, la luz es dispersada, y la luz dispersada resultante es analizada para determinar el tipo de celula. La celula tambien puede marcarse opcionalmente con un marcador unido a u na molecula fluorescente, que f luoresce cuando laluz que incide sobre ella y revela asi la presencia del marcador en la celula. De esta forma puede obtenerse informacion sobre los componentes superficiales de l a ce lula. Algunos ejemplos de di chas moleculas fluorescentes i ncluyen F ITC ( fluorescein isothiocyanate, i sotiocianato de f luoresceina), TRITC ( tetramethyl rhodamine isothiocyanate, i sotiocianato de tetrametil rodamina), rojo de Texas (sulforrodamina 101) y PE (phycoerythrin, ficoeritrina). Ademas, los componentes intracelulares de la celula, tales como los acidos nucleicos, pueden tenirse y subsiguientemente detectarse por fluorescencia. Algunos ejemplos de dichos compuestos incluyen bromuro de etidio, yoduro de propidio, YOYO-1, YOYO-3, TOTO-1, TOTO-3, BO-PRO-1, YO-PRO-1 y TO-PRO-1.
Las mediciones de las celulas sanguineas realizadas usando citometria de flujo emplean a menudo dos mediciones por separado - una para medir los eritrocitos y las plaquetas, y la otra para medir los mucho menos habituales leucocitos. La razon de las medidas por separado es que los eritrocitos son mucho mas habituales que los demas tipos de celulassanguineas, y por lo tanto la deteccion de otro tipo celular en presencia de los eritrocitos requiere bien qu e l os er itrocitos sean eliminados o bi en gr andes volumenes de l a m uestra qu e se va a m edir. Alternativamente, estas celulas pueden distinguirse sobre la base de una tincion inmunoquimica de los antigenos de la superficie celular en particular y/o una tincion diferencial del tipo celular. Por lo tanto, en la patente de EE.UU. N°
5.047.321 (Loken y col.), un procedimiento de etapa unica para el analisis de celulas sanguineas emplea al menos dos pigmentos fluorescentes y un marcador celular marcado para diferenciar las celulas entre si. Sin embargo, salvo que se realicen dos diluciones por separado de la misma muestra, el procedimiento aun requiere grandes volumenes de muestra para proporcionar los datos estadisticos suficientes con respecto a los componentes sanguineos menos habituales.
Las medicionesde la dispersion de la luz se usan ampliamente en los citometros de flujo para medir los tamanos celulares y distinguir entre los muchos y diferentes tipos de celulas. Se sabe que la luz incidente es dispersada por las celulas con un angulo pequeno (de aproximadamente 0,5 - 20°) con respecto a lalinea recorrida por la luz incidente que interroga las celulas, y que la intensidad de la luz dispersada es proporcional al volumen celular. La luz dispersada con angulos pequenos se denomina luz dispersada anterograda. La luz dispersada anterograda (denominada tambien dispersion de la luz anterograda o dispersion de angulo pequeno para angulos de dispersion de entre 0,5 -2.0°) es util en la determinacion del tamano celular. La capacidad de medir los tamanos celulares se ve afectada por la longitud de onda empleada y el intervalo preciso de angulos sobre los que se recoge la luz. Por ejemplo, el material interior de las celulas, con una fuerte absorcion a la longitud de onda iluminante, puede interferir con la determinacion del tamano porque las celulas que contienen estematerial producen senales de dispersion anterograda mas pequenas de lo que se esperaria de otro modo, dando lugar a subestimaciones del tamano celular. Ademas, las diferencias en el indice de refraccion entre las celulas y el medio circundante tambien pueden influir en las medidas de dispersion de angulo pequeno.
Los diferentes tipos celulares pueden distinguirse sobre la base de la cantidad de luz ortogonal dispersada (o dispersion lateral de angulo recto) que producen. Las celulas con un alto grado de granularidad, tales como los granulocitos sanguineos, dispersan laluz incidente con un angulo elevado mucho mas que las celulas con baja granularidad, tales como los linfocitos. Como resultado, la medicion de la dispersion lateral de angulo anterogrado y recto se usa habitualmente para distinguir entre los diferentes tipos de celulas sanguineas, tales como eritrocitos, linfocitos, monocitos y granulocitos. Adicionalmente, los eosinofilos pueden distinguirse de los neutrofilos y otros linfocitos y otros granulocitos sobre la base de la medicion de la polarizacion de la dispersion lateral de angulo recto. Normalmente, la luz polarizada incidente es dispersada ortogonalmente y permanece polarizada. Sin embargo, los eosinofilos provocan que la luz polarizada incidente dispersada ortogonalmente se despolarice en mayor extension
que ot ras celulas. E ste m ayor gr ado de d espolarizacion per mite l a i dentificacion es pecifica de p oblaciones de eosinofilos en m uestras sanguineas. La S olicitud de P atente d e E E.UU. pend iente de t ramitacion 09/ 507.515, presentada el 18 de febrero de 2000, desvela un citometro de flujo mejorado de alta apertura numerica que emplea un detector de la luz dispersada lateral de angulo elevado para detectar eosinofilos en una muestra sanguinea. El uso de un detector la luz dispersada lateral de angulo elevado (a unos angulos de aproximadamente 130°) permite una mayor discriminacion de los eosinofilos en las poblaciones celulares sanguineas. Sin embargo, al contrario que en los sistemas convencionales, el sistema descrito en la Solicitud de Patente de EE.UU. pendiente de tramitacion N° 09/507.515 no requiere que la luz incidente este polarizada.
La p atente de E E.UU. N ° 5.492.833 (Rodriguez y col.) desve la un pr ocedimiento para distinguir er itrocitos de reticulocitos tratando las celulas conun reactivo fantasma, seguido de la medicion dela dispersion de la luz. La patente de EE.UU. N° 5.559.037 (Kim y col.) desvela un procedimiento para contar eritrocitos nucleados (nucleated red blood cells, NRBCs) en primer lugar dejando reposar los eritrocitosy despues exponiendo los NRBCs a una tincion nuclear y midiendo la fluorescencia la dispersion de la luz. La patente de EE.UU. N° 5.733.784 (Studholme y col.) ensena un procedimiento para medir la concentracion de reticulocitos en una muestra sanguinea que emplea un reactivo de tincion de reticulocitos que es incubado durante un periodo de entre 15 minutos y 4 horas antes de que se realicen las mediciones de dispersion de la luz. La patente de EE.UU. N° 5.879.900 (Kim y col.) desvela un procedimiento par a el a nalisis simultaneo y c uantitativo de leucocitos y eritrocitos nucleados l esionados, y subpoblaciones de l eucocitos, que em plea m ediciones multidimensionales de l a di spersion de l a l uz y d e la fluorescencia. La p atente de E E.UU. N ° 5.891.734 ( Gill y co l.) desvela un s istema par a d iferenciar c elulas sanguineas en una muestra sanguinea que aspira una porcion de sangre y la mezcla con un reactivo fluorescente, y despues automaticamente hace pasar la muestra tenida a t raves de un citometro de flujo y midela dispersion multiangular de la luz y la fluorescencia.
Para o btener una informacion si gnificativa so bre el numero y l os tipos de ce lulas en u na m uestra, o de la concentracion de marcadores en las superficies celulares, las muestras deben ser estandarizadas con respecto a la cantidad de di spersion de la luz, fluorescencia o impedancia aso ciada con pob laciones estandarizadas de l as celulas. Ademas, el propio instrumento de citometria de flujo debe ser calibrado para asegurar un rendimiento apropiado. La calibracion del instrumento se realiza tipicamente haciendo pasar particulas estandar a traves del instrumento y m idiendo l a di spersion, f luorescencia o i mpedancia r esultantes. Los ci tometros de f lujo p ueden calibrarse bien con materiales estandar sinteticos (por ejemplo, perlas de poliestireno) o bien concelulas u otro material biologico (por ejemplo, polen o nucleos tenidos). Estos materiales de estandarizacion estan realizados con un tamano extremadamente uniforme y contienen cantidades precisas de moleculas fluorescentes que sirven para calibrar los t ubos fotomultiplicadores usados en la deteccion de l as sondas fluorescentes. S in embargo, l os procedimientos de ca libracion so n largos y c omplicados, y r equieren una am plia f ormacion p ara que r indan apropiadamente. Adicionalmente, estos procedimientos de calibracion se realizan tipicamente una vez al comienzo del analisis. Los cambios en el instrumento, es decir, la deriva, o en l a muestra, pueden alterar el rendimiento del instrumento. Consecuentemente, hay una necesidad de un medio pararealizar una calibracion automatica de la maquina de los citometros de flujo que elimine la necesidad de una calibracion manual cualificada y que pueda ajustar la calibracion segun las necesidades para tener en cuenta los cambios en el instrumento con el tiempo y con las diferencias en las muestras, de forma que se consiga un rendimiento optimo del instrumento para cada muestra medida.
La patente deEE.UU. N° 5.627.037 (Ward y col.) desvela un procedimiento en una etapa para determinar los miembros absolutos de una o mas poblaciones de reticulocitos y/o leucocitos en una muestra sanguinea completa usando citometria de flujo. El procedimiento comprende mezclar una muestra sanguinea con un diluyente, en el que el diluyente contiene un fijador, uno o mas marcadores celulares fluorescentes y un numero conocido de microparticulas fluorescentes por unidad de volumen, y analizar a continuacion la muestra mediante citometria de flujo. La fluorescencia debida a las microparticulas debe ser distinguible de la debida a los marcadores celulares. El citometro de flujo se hace funcionar con un conjunto activador de la fluorescencia, de forma que todas las celulas y las microparticulas superen el nivel de activacion. Entonces se reanalizan los acontecimientos en unas condiciones en las que las microparticulasson distinguibles de los marcadores celulares. Entonces se cuentan el numero de microparticulas y el numero de celulas (determinado por el numero de marcadores celulares). El numero de celulas y el num ero d e m icroparticulas proporciona un a pr oporcion que puede usa rse, co nociendo el num ero d e microparticulas por unidad de volumen y el volumen total de muestra, para calcular el numero absoluto de celulas en la muestra sanguinea completa. Sin embargo, el procedimiento descrito en la patente de EE.UU. N° 5.627.037 depende de dos etapas analiticas para proporcionar el numero absoluto de celulas por muestra, y no ensena o sugiere que el citometro de flujo podria estandarizarse simultaneamente usando las microparticulas incluidas en la muestra.
La patente de EE.UU. N° 5.380.663 (Schwartz y col.) desvela un procedimiento para calibrar un citometro de flujo, que emplea poblaciones combinadas de microesferas fluorescentes y un programa informatico correspondiente a cada poblacion co mbinada de m icroesferas. C ada l ote de m icroesferas contiene al m enos dos pob laciones diferentes de microesferas fluorescentes, y cada poblacion t iene una intensidad de f luorescencia diferente. E l programa informatico contiene informacion sobre la intensidad de fluorescencia de cada poblacion de microesferas del l ote. E l pr ograma i nformatico m onitoriza las microesferas fluorescentes comprobando l a degradacion d e l a
fluorescencia, y alerta al operador cuando la intensidad de la fluorescencia cae por debajo de unos niveles aceptables. El procedimiento no proporciona un medio para estandarizar muestras automaticamente de forma que se reduzca o elimine la variabilidad en las mediciones debida a las diferencias entre los citometros de flujo.
La patente de EE.UU. N° 5.451.525 (Shenkin y col.) desvela un procedimiento para determinar el numero total de celulas en una muestra queno requiere un volumen de muestra conocido. El procedimiento emplea un numero conocido de particulas aisladas que se anaden a un especimen sanguineo antes de que el especimen sea ensayado en un citometro de flujo. Contando las particulas anadidas y las celulas y relacionando el numero de particulas contadas con el numero de particulas anadidas, puede determinarse el numero de celulas en la muestra sanguinea completa sin necesidad de medir el volumen de la muestra medida. Debido a que el volumen de la muestra medida es desconocido, el procedimiento desvelado es incapaz de determinar si se han realizado las diluciones apropiadas de la muestra. Ademas el procedimiento no desvela un medio automatico para calibrar el instrumento para asegurar que se reduce o se elimina la variabilidad de las mediciones debida a las diferencias entre los citometros de flujo.
Las tecnicas de citometria de flujo que usan caracteristicas de dispersion de la luz por parte de las celulas fueron aplicadas por T echnicon al co mienzo de l os anos 70 par a r ealizar un analisis diferencial d e l eucocitos, e n combinacion con la determinacion del hemograma completo. El analisis automatizado de reticulocitos se desarrollo en los anos 80 en Becton-Dickinson y en sistemas de citometria de flujo fluorescente de Coulter. Sin embargo, estos sistemas tempranos no realizaban un hemograma completo ni un diferencial de leucocitos. Finalmente, algunos fabricantes como Technicon (Bayer), Coulter (Beckman-Coulter) y Abbott incorporaron el recuento de reticulocitos en sus sistemas automatizados de hemograma completo y diferencial de leucocitos, en sistemas hematologicos de gama alta tales como Technicon (Bayer) H*3, Bayer Advia 120, Coulter STKS, Coulter Genesis, y Abbotts CeliDyn 3500 y CellDyn 4000. Estos sistemas instrumentales eran capaces de medir todos los parametros para un analisis hematologico completo que son clinicamente importantes para la valoracion del paciente, a saber, hemograma completo, diferencial de leucocitos en cinco partes y recuento de reticulocitos. Sin embargo, estos instrumentos emplean tipicamente unos sistemas opticos caros y complejos. Adicionalmente, los sistemas hematologicos de gama alta estan disenados para ser maquinas de alto rendimiento, por lo que a menudo se estan procesando multiples muestras de especimenes diferentes simultaneamente, que requieren diferentes combinaciones de tratamientos y analisis. El analisis de eritrocitos y de leucocitos requiere diferentes sistemas de reactivos, y a menudo estan optimizados de forma que requieren vias hidraulicas completamente diferentes. Como resultado, para realizar simultaneamente analisis tanto de eritrocitos como de leucocitos, se crean vias hidraulicas completamente separadas y distintas paracada tipode muestra. Esta combinacion de multiples vias hidraulicas de muestras simultaneas crea una indeseable elevada complejidad debido al uso de un gran numero de valvulas, lineas de vacio, camaras de reaccion, jeringas y similares.
Ademas, se r equiere una c antidad si gnificativa de entrenamiento para apr ender a usa r est os instrumentos adecuadamente, y estos sistemas instrumentales requieren un mantenimiento varias veces al ano, como minimo. Como resultado, los elevados costes asociados a la adquisicion, uso y mantenimiento de estos instrumentos de alto rendimiento los hacen financieramente inaccesibles para las pequenas clinicas y consultas medicas. Los medicos pueden t ener acce so a es tos instrumentos utilizando laboratorios comerciales que r ecogeran l as muestras sanguineas de la clinica o la consulta del medico y transportaran las muestras de vuelta a laboratorio para su analisis en estos sistemas hematologicos de gama alta. Entonces los resultados se envian al medico. Este proceso requiere mucho tiempo y a menudo el medico no tendra los resultados hasta el dia siguiente como muy pronto.
Por lo tanto, si un medico deseauna valoracion hematologica completa (hemograma completo, y diferencialde leucocitos en cinco partes y recuento de reticulocitos) rapidamente, entonces el laboratorio de la clinica debe usar una combinacion de procedimientos manuales. Los instrumentos, tales como los contadores de impedancia que realizan hemogramas completos con u nos diferenciales de leucocitos l imitados, est an d isponibles par a est os laboratorios de clinicas, pero los sistemas que pueden producir los diferenciales en cinco partes y los recuentos de reticulocitos no lo estan. Por lo tanto, para obtener valores para estos parametros se emplean procedimientos manuales. Sin embargo, estos procedimientos manuales son lentos, laboriosos y tendentes a presentar errores del operador.
Los contadores de impedancia de gama baja disponibles en las clinicas y las consultas medicas incluyen sistemas tales como Abbott 1200, ABX Micros y Sysmex K-21. Mientras que los sistemas hematologicos de gama alta mejoraron mediante la incorporacion de tecnicas citometricas de flujo y otros avances, la tecnologia usada en los sistemas de gama baja ha cambiado muy poco. Estas unidades de gama baja se han vuelto mucho mas compactas y eficientes mediante la incorporacion de una microelectronica semiconductora cuando es aplicable; sin embargo, al final estos sistemas no so n funcionalmente di ferentes de l os instrumentos Coulter us ados por los laboratorios clinicos a finales de los 70 y principios de los 80. En particular, estos instrumentos aun no pueden realizar un diferencial de leucocitos en cinco partes, ni pueden producir un recuento del reticulocitos.
Los instrumentos de impedancia de gama baja usados en las clinicas pequenas y las consultas medicas usan generalmente paquetes de reactivos a granel que estan destinados a laboratorios mayores. Dado que el numero de muestras analizadas en est os instrumentos es bajo e n co mparacion co n su s equivalentes de l aboratorios, s e desperdician significativos volumenes de reactivos en la realizacion de los ciclos de inicio y cierre, asi como en la
limpieza del sistema entre muestras. Por lo tanto, es imposible predecir cuantas muestras de pacientes obtendra un usuario a partir de un paquete de reactivos.Como resultado, el usuariodebe mantener una cantidad en exceso de reactivos a mano, dando lugar inevitablemente a un sustancial desperdicio de reactivos. Ademas, la hidraulica de estos instrumentos, aunque generalmente menos compleja que los sistemas de laboratorio de gama alta, aun tiende a las mismas cuestiones de fiabilidad asociadas con las tuberias, las numerosas valvulas, las bombas de vacio y el pequeno tamano de las aberturas usadas para contar las celulas. Por lo tanto, para aplicaciones en clinicas y en consultas, l os i nstrumentos de i mpedancia de gam a b aja so n gr avemente d eficientes en l a produccion d e l os resultados necesarios para un completo analisis hematologico, son consumidores muy ineficaces de los reactivos y tienen los mismos problemas de fiabilidad inherentes que estan asociados con los sistemas de analisis de fluidos de gama alta la misma.
Se han r ealizado algunos intentos de abordar las necesidades de analisis clinicos de muestras sanguineas en laboratorios pequenos y consultas medicas, pero estos esfuerzos solo han tenido un exito limitado. Por ejemplo, la tecnologia QBC®, desarrollada por Becton-Dickinson, no requiere citometria de flujo ni otra tecnologia cara. La unica parte movil requerida es una centrifuga para forzar a los componentes celulares de la sangre a estratificarse en un tubo capilar sobredimensionado y perforado de forma precisa. Dentro del tubo capilar, un "flotador" de plastico que esta elaborado de forma precisa para las caracteristicas de densidad y tamano, establece un equilibrio de densidad en las capas de leucocitos y de plaquetas, expandiendo asi diez veces las capas. Esto permite estimaciones bastante precisas del recuento plaquetario, el recuento leucocitario y un recuento leucocitario diferencial en dos partes (granular y agranular), asi como una medicion muy precisa del hematocrito. El sistema QBC® no utiliza ningun reactivo liquido, y es por lo tantomuy fiable. Este procedimiento es tambien un procedimiento de dosis unitaria, ya que se usa un unico tubo capilar y flotador para cada analisis.Como resultado, no se desperdicia reactivo.
Mientras que la tecnologia QBC® aborda aspectos de fiabilidad y desperdicio de reactivos para el usuario de la clinica, se queda bastante corta proporcionando los parametros requeridos de un hemograma completo, produce un diferencial incompleto y no cuantifica los reticulocitos. Adicionalmente, la precision y exactitud de los parametros producidos por el sistema QBC®, excepto para el hematocrito, son peores que los de los sistemas de impedancia de gama baja. Consecuentemente, permanece una gran necesidad de un sistema de analisis de fluidos biologicos barato que sea capaz de producir los parametros de los que dependen los profesionales clinicos y los medicos para tomar decisiones que afectan al tratamiento de un gran porcentaje de sus pacientes.
Para abordar la necesidad de parametros hematologicos que estan mas alla de la capacidad de los instrumentos de impedancia de gama baja en un entorno de clinica, deben abordarse muchos factores principales. Eltamano, el coste y la complejidad asociada con los sistemas hematologicos de gama alta deben reducirse, conservando la capacidad d e r ealizar u n al to n umero de a nalisis sanguineos completos. L os principales subsistemas que contribuyen al coste y la complejidad de los sistemas hematologicos de gama alta son el diseno de la optica y el diseno de manipulacion de fluidos, asi como los sistemas de reactivos.
Para reducir eltamano del sistema optico de laser, la incorporacionde un diododelaser sobre un gas de laser reduce significativamente el tamano total del conjunto. Adicionalmente, un diodo de laser tambien puede reducir el coste del sistema de laser. Sin embargo, los diodos de laser no tienen las caracteristicas opticas de los laseres de gas. Son astigmaticos, y tienen regiones ruidosas dependientes de la temperatura, que se denominan "salto modal". Este ruido por salto modal hace que la deteccion de particulas pequenas tales como las plaquetas sea muy dificil. El control de la temperatura del diodo de laser a un area termica tranquila puede reducir este problema de salto modal. Esto puede conseguirse mediante diversos sistemas de retroalimentacion de la temperatura, tales como un refrigerador termico electrico, que mantienela temperatura del laser de diodo en un intervalo muy estrecho de temperatura. Sin embargo, cualquier tipo de control termico es costoso, especialmente dado que el propio diodo de laser es una fuente de calor. Por lo tanto, incluso el acto de encender el laser de diodo provoca efectos de salto modal hasta que se alcanza el equilibrio termico, lo que puede tardar entre cinco y diez minutos.
Ademas de la fuente de luz laser, hay un coste y una complejidad significativos asociados con el modelado del rayo y la optica de recoleccion de la luz para los instrumentos del tipo de citometria de flujo.
Las opticas demodelado de rayo estan generalmente destinadas a tomar un rayolaser gausiano circular, y crear una elipse en la que la distribucion de la potencia sea tanto mas intensa como mas uniformemente distribuida en el area de interes. Muchos instrumentos hematologicos usan una metodologia colimada, estando bloqueadas las colas de la curva gausiana por una abertura. Esto crea un efecto sombrero de copa que aporta uniformidad en la region de interes y reduce la necesidad de control de fluidos, y una estabilidad en la punteria del laser, pero sacrifica la densidad de potencia en la celula.
Adicionalmente, para crear un rayo muy fino que sea de tamano subcelular ( 4 micrometros), que sea util para la medicion de la duracion del vuelo, la metodologia tradicional ha tenido que expandir primero el rayo laser inicial, de forma que pueda ser enfocado entonces hacia un punto de pequeno tamano. Tanto la etapa de expansion como la etapa de focalizacion se consiguen usando diversos elementos opticos, tales como lentes, divisores de rayo y espejos. En estos casos se incurre en unos costes significativos al tener muchos componentes opticos. Ademas del
elevado coste de elaboracion de cada uno de estos componentes, cada componente optico incurre en un coste adicional ya que cada uno necesita ser mantenido de forma segura en el espacio y alineado cuidadosamente.
Las opticas de recoleccion de luz en los sistemas de citometria de flujo son incluso mas complejas que las opticas de modelado de rayo. Esto es debido a que en la mayoria de las aplicaciones se realiza una medida de la luz. Para conseguir esto se necesitan dos o mas fuentes de deteccion. Cada detector requiere diversos componentes opticos que conducen la luz desde el area de interes hasta el detector. Como en el caso del modelado de rayo, se incurre en unos costes significativos por el requerimiento de numerosos componentes opticos, cada uno de los cuales debe ser mantenido en el espacio y alineado cuidadosamente.
A partir del documento US5093234 se sabe proporcionar un recipiente para su uso en un sistema hematologico basado en citometria de flujo que comprende un tubo cerrado, un numero conocido de particulas de referencia en dicho tubo, teniendo cada una de dichas particulas de referencia un diametro predeterminado, de forma que cuando dichas particulas de referencia son iluminadas por la luz, dicha luz es dispersada por dichas particulas de referencia de forma que dicha luz dispersada cae en al menos uno de una pluralidad de canales predeterminados de dispersion de la luz.
La invencion esta definida por las reivindicaciones.
Esta memoria descriptiva desvela un procedimiento que comprende una etapa de proporcionar un recipiente consumible para su uso en un sistema que emplea un conjunto seleccionado de caracteristicas que, combinadas, crean un dispositivo que es capaz de producir un analisis hematologico completo. Este sistema es un citometro de flujo que incluye un sistema de deteccion optico sin lentes para la recoleccion de la luz emitida a partir de una fuente de luz laser, tras interactuar con una celula o particula. La fuente de luzlaser es unafuente de luzlaser de diodo estandar que esta modelada para producir una linea fina, segun se desvela en la patente de EE.UU. N° 6612719. La forma del rayo de luz laser esta ajustada para la deteccion de la luz dispersada. Adicionalmente, la fiabilidad del sistema esta mejorada adicionalmente mediante el uso de una matriz fotodetectora que no incluye ninguna parte movil, ni requiere ninguna lente. La matriz fotodetectora es tal que la luz dispersada es detectable, y estos datos recogidos proporcionan un analisis hematologico completo cuando se usa en combinacion con una tecnica de elevada apertura numerica. El recipiente consumible actua como camara de reaccion, camara de mezcla y camara de desechos para los analisis demuestras sanguineas. El recipiente consumible incorpora particulas de latex o similar (celulas fijadas), que actuan como estandares internos para asegurar que las diluciones realizadas durante el procesado de las muestras se han realizado correctamente. El uso de estos recipientes consumibles da como resultado menos desechos y una precision y validacion de los resultados altamente mejoradas.
Ahora se describiran formas de realizacion de la invencion, unicamente a modo de ejemplo, y con referencia a los dibujos anexos, en los que:
La Figura 1 es una representacion esquematica de la hidraulica del sistema que muestra las valvulas de los sistemas (1, 2, 3, 4, 5),lasjeringas (6, 7), los frascos de reactivosagranel(8, 9), y otros componentes principalesde un sistema de citometria de flujo, que comprende el recipiente de la presente invencion;
La Figura 2 es un dibujo del conjunto de la celula de flujo usada en el sistema de deteccion optico del sistema decitometria de flujo de la Figura 1. Este contiene tres puertos para tubos (20, 21, 23) que permiten el flujo laminar a traves del canal de flujo de cuarzo (22) en el que el laser interactua con las celulas.
Las Figuras 3A y 3B son representaciones esquematicas de la optica de modelado del rayo laser. La Figura 3A proporciona una representacion cenital, y La Figura 3B proporciona una representacion lateral. La fila de diodos laser, 30, emite una luz que diverge en dos ejes separados. Una lente de colimacion 31 elimina la divergencia en ambos ejes e ilumina la lente 32. La lente 32 actua convergiendo el rayo en un eje de forma que practicamente toda la luz del rayo laser puede pasar a traves del ancho del canal de flujo de 22. W representa este ancho. Una tercera lente 33 se introduce entre 32 y W, de forma que produce un foco nitido en W. El punto focal de la lente 33 es la interseccion deseada entre la luz laser y la particula o celula de interes. El punto focal de la lente 32 es el plano deseado para colocar los fotodetectores para medir los parametros de dispersion, ya que aqui es donde el laser ha convergido hasta su punto mas pequeno en ese eje.
La FIG. 4 es una ilustracion del sistema de deteccion celular, que muestra las celulas o particulas fluyendo a traves de 22, que se mantiene en el espacio alrededor de al menos dos, pero preferiblemente cuatro, detectores de fotodiodo, sin ninguna lente de recoleccion o de imagen. Estos detectores recogen la dispersion ortogonal, 42, la dispersion anterograda de angulo pequeno, 45, la perdida o extincion de luz axial, 44, y la dispersion anterograda de angulo elevado, 43. La luz laser es iluminada sobre 22 a traves de 41, que contiene la optica de modelado de rayo de la figura 3.
La F IG. 5 es un dibujo d e la m ascara de f otodiodo q ue ac omoda t res mediciones opt icas independientes en direccion anterograda del laser. La dispersion anterograda de angulo pequeno es enmascarada por 51, la perdida de la luz axial por 52, y la dispersion anterograda de angulo elevado por 53. Estas tres areas pueden estar en una unica
fabricacion 50, de un m aterial semiconductor en el que solo la geometria deseada es una parte activa del material semiconductor. Otras metodologias tendrian 50 como una mascara metalica que podria asentarse sobre tres pequenos fotodiodos.
La FIG. 6 es una representacion esquematica de lo que sucede en el consumible durante el ciclo del sistema. El tubo c onsumible, 60, c omienza co n un a p equena ca ntidad d e r eactivos del pr ocedimiento, a l q ue se a naden cantidades medidas de forma precisa de sangre completa a traves de 6, u otro material desconocido con el fluido de revestimiento de los sistemas, desde 8, a traves de 7, mediante la aguja hidraulica 11. Esto crea 60, que se analiza entonces mediante la optica de la Figura 4. Para crear 62, se anade mas sangre completa u otro material desconocido al tubo consumible. Al analizador se anaden leucocitos, un agente litico y fluido de revestimiento, para crear 63, que se analiza e ntonces co n l a o ptica de l a f igura 4. F inalmente, se l impian l as lineas hidraulicas descargando de nuevo en el tubo consumible para crear 64, que es ahora un tubo de desecho.
La FIG. 7 es un dibujo del conjunto de posicionamiento de tubos que mueve los tubos mostrados en la Fig. 6. Pueden mantenerse simultaneamente 4 tubos de prueba. La ranura A esta destinada a la muestra del paciente de sangre completa, u otro tipo de especimen apropiado. La ranura B esta destinada al tubo consumible representado en la Figura 6. La ranura C es para un tubo que contiene un lisado que permanece en el sistema en la ranura C, para numerosos usos de consumibles (uno por kit de mas de 20, idealmente 50 consumibles). La ranura D es para un tubode limpieza del sistema, que tambien estadestinado a actuar como tubo de cebado, para posicionar apropiadamente los fluidos en el inicio del sistema.
La FIG. 8 es un dibujo del conjunto de mezcla y perforacion. Para conseguir elaborar las diluciones representadas en la Figura 6, las ranuras de tubos de la Figura 7 se mueven entre una estacion de perforacion donde las agujas 11 y 12 se insertan simultaneamente en los tubos de prueba taponados mediante un motor 81. Cuando se inyecta un fluido en el tubo mediante una jeringa 6 o 7, a traves de la aguja 11, la aguja 12 purga el cambio de presion hacia un filtro de aire 13, que esta a presion atmosferica. Una vez que se crea la nueva de disolucion en el consumible, el carro de la Figura 7 mueve el consumible por debajo de 80, donde mediante el uso de varios motores, incluyendo 82, se mezcla el consumible, haciendo homogenea la disolucion de su interior.
La FIG. 9 es un dibujo del sistema mostrado en la Figura 1. Un bloque colector sustenta las valvulas que tienen vias hidraulicas apropiadas, e integra las jeringas y la mecanica motriz del motor.
La FIG. 10 muestra los datos del histograma de eritrocitos (C), plaquetas (A) y latex (B) obtenidos a partir del sistema. La Figura 10 A representa los datos del histograma del canal digitalizado de alta dispersion anterograda, 43, sobre el eje x (desde 0 hasta 1023, u 8 bits) frente al numero de eventos (o acontecimientos) recogidos por cada uno de los canales individuales. La Figura 10 B muestra la misma serie datos, excepto porque representa el canal de extincion o perdida de luz axial, 44. La Figura 10 C muestra la misma serie datos, excepto porque representa el canal de dispersion de angulo recto, 42. La Figura 10 D muestra la misma serie datos, excepto porque representa la medicion de la duracion del vuelo o ancho del pulso. Las mediciones del ancho del pulso pueden realizarse fuera de cualquiera de los demas canales que utilizan un fotodetector, pero se prefiere usar bien el de extincion, 44, o bien el de baja dispersion anterograda, 45.
La F IG. 11 m uestra los mismos datos de er itrocitos, pl aquetas y latex de l a F igura 1 0, p ero en f orma d e representacion grafica de la dispersion. Las representaciones graficas de la dispersion son simplemente una representacion de los datos que se recogen simultaneamente a partir de una celula o particula, a partir de una medicion, representados sobre el eje x, frente a cualquier otra medicion representada en el eje y. Las particulas de latex son distinguibles en A en la Figura 11 A, y en B en la figura 11 B.
La FIG. 12 A muestra los datos del histograma de leucocitos para el canal de extincion, que muestra claramente tres poblaciones, A son los linfocitos, B son los monocitos y C son los granulocitos. La Figura 12 B muestra la misma muestra del p aciente, e xcepto por que est a se rie de d atos incorpora particulas d e l atex. D e n uevo, A so n los linfocitos, B son los monocitos, y C son los granulocitos. Las particulas de latex estan indicadas por D, y se distinguen facilmente de los leucocitos. Las Figuras 12 C y 12 E muestran la misma muestra del paciente para el parametro de baja dispersion anterograda 12 C, y dispersion de angulo recto 12 E, sin particulas de latex anadidas. Las Figuras 12 D y 1 2 F muestran la misma m uestra de l p aciente par a l os parametros de b aja dispersion anterograda 12 D, y dispersion de angulo recto 12 F, con particulas de latex anadidas.
Las FIGS. 13 A y 13 B muestran los mismos datos de leucocitos y latex de las 12 B, 12 D y 12 F, pero en forma de representacion grafica de la dispersion.
La FIG. 14 muestra los datos del histograma de eritrocitos y el reticulocitos para la dispersion de angulo recto, Figura 14 A, y de la extincion, Figura 14 B, obtenidos del sistema.
La FIG. 15 muestra los datos en representacion grafica de dispersion de eritrocitos y reticulocitos obtenidos de la misma muestra que la representada en las figuras 14 A y 14 B. Aqui, cuando se representan uno frente a otro, la extincion (eje y) y la dispersion de angulo recto (eje x) muestran la separacion de los reticulocitos de la poblacion
principal de eritrocitos maduros. El valor de 1,72% de reticulocitos esta en excelente acuerdo con el procedimiento de referencia del manual de 1,60%.
La FIG. 16 muestra los datos del histograma diferencial de leucocitos obtenidos a partir de la dispersion de angulo recto, Figura 16 A, y de la duracion de vuelo, o ancho del pulso, figura 16 B, del sistema.
La FIG. 17 muestra los datos en representacion grafica de dispersion diferencial de leucocitos obtenidos a partir de la misma muestra que los representados en la figura 16 A y en la figura 16 B. Aqui, cuando se representan uno frente a otro, la extincion (eje y) y la dispersion de angulo recto (eje x) muestran la separacion de varias partes del diferencial de leucocitos. El area indicada por a representa los linfocitos, el area indicada por B representa los monocitos, el area indicada por C representa los neutrofilos (un subconjunto de granulocitos), y el area indicada por D representa los eosinofilos (otro subconjunto de granulocitos). Las celulas de eosinofilos presentes en D suponen el 20,63% del total, lo que esta en excelente acuerdo con el procedimiento de referencia del manual de 21,70% de eosinofilos.
La FIG. 18 muestra una exploracion espectrofotometrica de la disolucion de colorante de reticulocitos, que seria representativa de 61, sin la presencia de sangre.
La FIG. 19 A muestra una exploracion espectrofotometrica del lisado de una disolucion de sangre completa, que se lee a 540 nm para un procedimiento de referencia de hemoglobina (cianohemoglobina). La Figura 19 B muestra una exploracion espectrofotometrica del lisado de una disolucion de sangre completa, que cuando se lee a 540 nm para una hemoglobina indica la oxihemoglobina, y a 580 representa la desoxihemoglobina.
La FIG. 20 muestra una exploracion espectrofotometrica de una disolucion diluida de sangre de completa.
La Figura 21 m uestra una exp loracion es pectrofotometrica del l isado de una disolucion de sangre completa y colorante de reticulocitos;
La Figura 22 muestra una exploracion espectrofotometrica de una disolucion diluida de sangre de completa y una disolucion de colorante de reticulocitos;
La Figura 23 muestra la salida del analizador de espectro de un laser de diodo que opera en monomodal, Figura 23A, y el mismo laser operando con una alta modulacion de frecuencia, Figura 23B. Los picos de la Figura 23A muestran altos niveles de ruido a muchas frecuencias diferentes. Aunque la linea de base para esto es excelente, los picos de ruido alta frecuencia provocan problemas significativos cuando se intenta implementar una medicion de la extincion y un sistema recolector de la dispersion sin lente. El efecto neto es el recuento de un evento falso y una inadecuada cuantificacion de la altura de pulso o area. El espectro del laser modulado de alta frecuencia de la Figura 23B no es tan bajo como el nivel de la linea base, pero no tiene puntas altas. Esto ayuda a permitir una cuantificacion precisa de la extincion, y la implementacion de un sistema recolector sin lente para los otros canales;
La Figura 24 muestra una representaciondel ruido (raiz cuadratica media) frente a latemperatura para un diodo laser dirigido a pot encia co nstante, o m onomoda, y el mismo d ispositivo di rigido c on u na m odulacion d e a lta frecuencia. Esto muestra que un laser monomodal que esta dirigido a una potencia constante puede conseguir unos niveles de r uido iguales o inferiores a l os laseres modulados d e a lta f recuencia en algunos intervalos de temperatura. Por lo tanto, la modulacion a alta frecuencia o un laser controlado por la temperatura es capaz de permitir una cuantificacion precisa de la extincion, y la implementacion de un sistema recolector sin lente para los otros canales. Debido a que el coste del control de la temperatura es mucho mayor que el coste de oscilar (modular) un laser, la forma de realizacion preferida es una modulacion de alta frecuencia;
La Figura 25 es un diagrama en bloque de la electronica del sistema;
La Figura 26 es un diagrama en bloque de la electronica de procesado de la senal.
Aunque se hace referencia a muchos componentes de un sistema de citometria de flujo, debe apreciarse que la presente invencion se limita a un procedimiento segun se define en las reivindicaciones anexas.
El procedimiento usa un sistema hematologico basado en citometria de flujo. Dichos sistema es capaz de determinar al menos un hemograma completo, un diferencial de leucocitos en cinco partes y un recuento de reticulocitos. El sistema tiene un alto nivel de fiabilidad, y utiliza volumenes muy bajos de reactivos de procedimiento. El sistema es muy barato de construir, y ademas es utilizable sin la necesidad de niveles significativos de entrenamiento del operador. El sistema esta particularmente bien adaptado para su uso en entornos en los que hay una necesidad de un instrumento que pueda analizar un gran numero de muestras sanguineas rapidamente y de forma barata, y que proporcione un analisis sanguineo completo para cada muestra. Dichos entornos incluirian, por ejemplo, clinicas medicas, consultas medicas y consultas veterinarias.
El sistema hematologico basado en citometria de flujo combina un sistema unico de deteccion optico sin lentes con
el uso de tubos consumibles de la invencion que contienen particulas de referencia que se usan para la estandarizacion optica y para comprobar si el instrumento esta realizando correctamente las diluciones. El sistema tambien emplea un laser de diodo con una cierta forma del rayoque es critica para el exito de la operacion del sistema. El uso de un laser de diodo para el analisis de bioparticulas en sistemas basados en citometria de flujo se ha evitado hasta el momento debido a la propension de estos sistemas a mostrar fenomenos ruidosos periodicos. Aunque no forma parte de la presente invencion, los presentes inventores han descubierto que dichos problemas pueden superarse mediante el uso de una tecnica de modulacion de alta frecuencia, discutida con mayor detalle a continuacion. La combinacion de estos elementos crea un sistema que tiene un coste mucho menor y una fiabilidad mayor que los sistemas hematologicos basados en citometria de flujo existentes, y que puede medir al menos un hemograma completo (CBC), un recuento de leucocitos diferencial en cinco partes y un recuento de reticulocitos, sin la necesidad de mediciones de fluorescencia o de absorcion de luz. Sin embargo, no se descarta que el sistema usado en la presente invencion incorpore mediciones de fluorescencia de absorcion de luz para medir uno o mas parametros deseados, segun se describe en este documento.
TUBO CONSUMIBLE
El pr imer aspecto q ue se debe co nsiderar co mo par te del pr ocedimiento d e l a presente invencion es el t ubo consumible. Cada tubo consumible tiene una etiqueta codificada unica, como la tiene cualquier otro tubo colocado en el instrumento. Preferiblemente, la etiqueta codificada es una etiqueta con codigo de barras. El tubo consumible contiene uno o mas tipos distintos de particulas que se usan para comprobaciones de cuantificacion del recuento, asi como para la estandarizacion optica. Cada lote de reactivos se distribuye en alicuotas en los tubos consumibles, junto con un numero definido de particulas de referencia. Dichas particulas de referencia son conocidas por los expertos en la materia y pueden ser, por ejemplo, granos de polen, celulas fijadas o particulas de latex.
La clave para seleccionar las particulas adecuadas para el sistema es que las particulas sean distinguibles de las celulas objetivo de la muestra, en al menos uno de los ejes de las mediciones opticas. Las particulas de latex tienen un i ndice de refraccion di ferente a l d e l os componentes celulares, y hay disponibles comercialmente m uchos tamanos de particulas de latex. En el caso de las particulas de 4,1 micrometros, estas se distinguen de los eritrocitos y de las plaquetas por los canales de extincion (EXT), de dispersion anterograda de la luz de angulo pequeno (FSL) y de dispersion en angulo recto (RAS), pero se superponen con los eritrocitos en los canales de dispersion anterograda de la luz de angulo elevado (FSH) y de duracion del vuelo (TOF). Funcionalmente, no importa que eje tiene la mejor separacion con la(s) particula(s) de r eferencia. Siempre que a l menos uno de los cinco canales muestre separacion, toda la poblacion de particulas puede ser controlada y analizada completamente por separado de cualquier otro componente celular de la muestra.
A menudo se emplean como particulas de referencia eritrocitos fijados procedentes de varias especies diferentes. Estas celulas pueden ocultarse completamente en todos los canales durante el analisis de los eritrocitos, y por lo tanto pueden no ser apropiadas para su uso en la deteccion y el recuento de eritrocitos. Sin embargo, todavia se pueden usar en la deteccion y el recuento de leucocitos, porque como el proceso de fijacion los hace inmunes a los sistemas de lisado, se distinguiran facilmente en todos los canales durante el analisis de leucocitos. Los eritrocitos fijados procedentes de especies aviares ofrecen la caracteristica anadida de tener un nucleo, lo que ayuda a distinguirlos de los eritrocitos de mamiferos exclusivamente mediante dispersion en angulo recto.
Las particulas de referencia interna deben usarse a una concentracion conocida y deben actuar como un sustituto celular. Este sustituto debe tener unas propiedades tales que el instrumento pueda distinguirlo, en al menos una tecnica de medicion, de los constituyentes celulares de la muestra. Este sustituto celular actua como una muestra interna, un estandar interno con el proposito de control de calidad. Esto asegura que las mediciones del instrumento se realizan adecuadamente. La forma de realizacion preferida de este sustituto es particulas de poliestireno. Sin embargo, podrian usarse otras particulas tales como polen, vidrio, celulas fijadas o coloides grandes, siempre que se cumplan las condiciones anteriores. El intervalo de tamano de particula es preferiblemente desde aproximadamente 1 micrometro hasta aproximadamente 10micrometros, y tienen unas caracteristicas opticas que les separa de forma unica de las plaquetas, leucocitos y eritrocitos en al menos un eje de medicion del instrumento.
Las particulas de poliestireno estan disponibles comercialmente en diversos fabricantes, tales como Seradyn y Duke. El tamano preferido es de 4,0 micrometros, que se distingue facilmente de los componentes celulares de la sangre a lo largo de varios ejes de recoleccion de datos en el instrumento. La eleccion de este tamano para las particulas permite determinar f acilmente l a c oncentracion de particulas. Los sistemas de r eactivos del c onsumible s on sensibles a una medicion porcentual de solidos (volumen de particula tiempo de concentracion de particulas); por lo tanto, cuanto menor sea el volumen elegido mayor sera la concentracion de particulas, y mas amplio el intervalo que puede llevarse a cabo. La forma de realizacion preferida debe tener una concentracion de particulas en el consumible de 10.000 por !l. A este nivel, el numero de eventos de particulas de referencia contados estara en el mismo rango que el numero de leucocitos contados.
La co ncentracion d e l as particulas y s us caracteristicas opt icas se d eterminan m ediante un procedimiento de referencia. Se obtienen las caracteristicas de las particulas, tales como su recuento por microlitro para cada tipo de particula, la senal media para una medicion optica para cada tipo de particula, el coeficiente de variacion para una
medicion optica para cada tipo de particula. El experto en la materia apreciaria que tambien pueden medirse otros parametros asociados con cada tipo de particula y usarse ventajosamente en el sistema de la presente invencion, segun se desee, y la presente invencion no pretende estar limitada en modo alguno por los parametros especificos enumerados anteriormente.
A partir de esta informacion se genera una etiqueta de codigo de barras encriptado que referencia una cualquiera o cualquier combinacion de al menos los siguientes parametros:
- 1.
- Tipo de prueba
- 2.
- Numero de lote
- 3.
- Fecha de caducidad
- 4.
- Numero de serie
- 5.
- Concentracion de la particula 1 (expresada en terminos de numero de particulas x 103 / !l)
- 6.
- Concentracion de la particula 2 (expresada en terminos de numero de particulas x 103 / !l)
- 7.
- EXT media de la particula 1
- 8.
- EXT media de la particula 2
- 9.
- FSL media de la particula 1
- 10.
- FSL media de la particula 2
- 11.
- FSH media de la particula 1
- 12.
- FSH media de la particula 2
- 13.
- RAS media de la particula 1
- 14.
- RAS media de la particula 2
- 15.
- TOF medio de la particula 1
- 16.
- TOF medio de la particula 2
- 17.
- CV de EXT media de la particula 1
- 18.
- CV de EXT de la particula 2
- 19.
- CV de FSL de la particula 1
- 20.
- CV de FSL de la particula 2
- 21.
- CV de FSH de la particula 1
- 22.
- CV de FSH de la particula 2
- 23.
- CV de RAS de la particula 1
- 24.
- CV de RAS de la particula 2
- 25.
- CV de TOF de la particula 1
- 26.
- CV de TOF de la particula 2
- 27.
- Densidad optica del fluido a 488 nm
- 28.
- Densidad optica del fluido a 540 nm
- 29.
- Densidad optica del fluido a 580 nm
- 30.
- Densidad optica del fluido a 635 nm
Para cada tipo de particula usado en el sistema se genera una tabla de valores de referencia, y se almacena en el ordenador conectado con el instrumento. Los valores de la tabla de referencia pueden contener, como parametros, uno o mas de los siguientes:
- 1.
- Numero de particula
- 2.
- EXT media
- 3.
- FSL media
- 4.
- FSH media
- 5.
- RAS media
- 6.
- TOF medio
- 7.
- CV de EXT
- 8.
- CV de FSL
- 9.
- CV de FSH
- 10.
- CV de RAS
- 11.
- CV de TOF
Como ejemplo asumimos que unas particulas de latex d e 4, 1 m icrometros se d enominan par ticulas 7. Lo s siguientes valores de referencia asociados con esas particulas de referencia pueden almacenarse en el ordenador:
- 1.
- Particula = 7
- 2.
- EXT media = 520
- 3.
- FSL media = 430
- 4.
- FSH media = 824
- 5.
- RAS media = 941
- 6.
- TOF medio = 252
- 7.
- CV de EXT = 3,1
- 8.
- CV de FSL = 2,9
- 9.
- CV de FSH = 4,2
- 10.
- CV de RAS = 7,9
- 11.
- CV de TOF = 2,1
Adicionalmente, para cada colorante que se usa en el sistema hay un espectro caracteristico de absorcion de luz asociado que tambien se almacena en una tabla en el ordenador conectado con el sistema. Para cada lote se probara la absorcion del fluido colorante en una o mas longitudes de onda caracteristicas de estos espectros, es decir, una longitud de onda a la cual la absorcion del colorante esta en un punto maximo o minimo, o que es identificada de f orma uni ca con el co lorante. C omo ej emplo, pu ede pr obarse l a a bsorcion de u n r eactivo q ue contiene un colorante a las siguientes longitudes de onda:
- 1.
- Densidad optica del fluido a 488 nm
- 2.
- Densidad optica del fluido a 540 nm
- 3.
- Densidad optica del fluido a 580 nm
- 4.
- Densidad optica del fluido a 635 nm
La medicion a 635 nm es util para detectar colorantes azules, que absorben luz a esta longitud de onda. La hemoglobina absorbe fuertemente luz verde, por lo que se usa una medicion a 540 nm para medir la concentracion de hemoglobina. Las mediciones a 580 nm son utiles para detectar los productos de algunos ensayos de quimica clinica, que absorben luz amarilla. Finalmente, una medicion a 488 nm es util como calibracion verdadera de longitud de onda, dado que ni la hemoglobina ni ninguno de los colorantes de reticulocitos usados habitualmente absorben a esta longitud de onda, y por lo tanto interfieren minimamente con esta medicion.
Como ejemplo asumimos que el colorante azul de metileno nuevo se denomina colorante 3, y tiene los siguientes valores de absorcion en la tabla de referencia:
- 1.
- Densidad optica del fluido a 488 nm = 0,85
- 2.
- Densidad optica del fluido a 540 nm = 0,62
- 3.
- Densidad optica del fluido a 580 nm = 0,73
- 4.
- Densidad optica del fluido a 635 nm = 0,20
Ahora asumimos que el cuarto lote de tubos para pruebas de hemograma completo, elaborado en marzo de 2001 (4c01) que caducara en 2 anos (2), contiene dos conjuntos diferentes de particulas de referencia. El primer conjunto de particulas de referencia hace referencia a la entrada 7 de la tabla, que se refiere a particulas de 4,1 micrometros a una concentracion de 1.200 particulas por microlitro (0712). El segundo conjunto de particulas de referencia hace referencia a la entrada 25 de la tabla, que se refiere a una particula celular fijada a una concentracion de 32.500 por microlitro (25325), en una disolucion de azul de metileno nuevo, que es la entrada de la tabla D (d). Los tubos consumibles que contienen la disolucion descrita anteriormente se serializan desde 0 -50.000. Por lo tanto, se crearian los siguientes codigos de barras:
4c012071225325d00000 hasta 4c012071225325d50000
Este ejemplo de codigo de barras de referencia es de demostracion. Para el experto en la materia seria obvio que puede reducirse significativamente el numero de digitos sin perdida de informacion.
La co locacion de est os codigos de b arras en l os tubos consumibles pr oporcionara al si stema l a i nformacion necesaria para realizar las determinaciones de control de calidad en las muestras individuales para demostrar que las diluciones se realizaron adecuadamente, y que todas las mediciones opticas fueron precisas.
Como ejemplo de uso de los datos que en codigo de barras en determinaciones del control de calidad, asumimos que cuando se realiza una dilucion de eritrocitos, el volumen de reactivos del consumible se diluye a la mitad. Por lo tanto, en el ejemplo anterior, el recuento de celulas fijadas durante este recuento de la porcion de eritrocitos deberia ser de 16. 250 ( 32.500/2). S i el r ecuento de ce lulas fijadas no est a dentro de una ba nda d e t olerancia d e aproximadamente 16.250, no apareceran los resultados del recuento. De forma similar, dado que el sistema espera que haya particulas de latex de 4,1 micrometros en el tubo consumible, un recuento de 600 (1.200/2) confirmara una dilucion correcta. Sin embargo, si se detecta una dilucion incorrecta, el sistema puede comparar el valor obtenido para las particulas celulares fijadas con el obtenido para las particulas de latex. Si la desviacion relativa con respecto a los valores esperados es la misma para cada medicion de particula, entonces se sospecha de un error de dilucion.
El sistema tambien puede referenciar los valores opticos esperados en las tablas, que son independientes de la dilucion. La comparacion de los datos de la media y el coeficiente de variacion (CV) de las particulas, en comparacion con las tablas de referencia, permite una determinacion de si se ha producido un error de dilucion, y tambien proporciona una perspectiva sobre las caracteristicas de alineacion optica, estabilidad de la potencia del laser y corriente de flujo. Como con el ejemplo de dilucion, si los datos de dispersion de la luz recuperados no se ajustan con los datos esperados en una tolerancia preestablecida, no apareceran algunos o todos de los analisis de clasificacion celular. De este modo, puede mostrarse un error de precision al operador que ayudara a tomar las
medidas correctoras adecuadas. A dicionalmente, el si stema puede r egistrar est e r endimiento co n el t iempo, y mantener una base de datos del rendimiento del sistema con el tiempo para registrar tendencias del sistema. Basandose e n l os d atos obtenidos, y en l as tendencias recientes, pue den g enerarse automaticamente recomendaciones de tecnicas de mantenimiento, recalibrado o solucion de problemas.
SISTEMA DE DETECCION OPTICO SIN LENTE Y POR LASER
Para obtener datos razonablemente precisos sobre cualquier sistema hematologico basado en citometria de flujo, las celulas o particulas individuales deben pasar a traves de la zona sensora de una celula de flujo. Para conseguir esto usando contadores celulares de impedancia estandar, habitualmente se diluye la sangre completa en el orden de 1:10.000, debido al gran volumen de la zona sensora de la abertura de la celula de flujo (es decir, 60 micrometros de ancho por 100 micrometros de largo). Un sistema hematologico basado en citometria de flujo puede funcionar, sin embargo, con unas concentraciones mayores de sangre completa porque la zona sensora de los instrumentos tipicos tiene habitualmente alrededor de 10 micrometros de ancho (corriente del nucleo) por 20 micrometros de largo (altura del rayo laser). Consecuentemente, pueden usarse diluciones de sangre completa del orden de 1:500 hasta
1:1.000.
Para el tubo consumible descrito anteriormente, la dilucion ideal de sangre completa es de 1:100 para el analisis de eritrocitos, que utiliza menos del 20% del volumen del tubo consumible. Esto deja el 80% o mas del volumen del tubo para realizar una dilucion de leucocitos, y un lavado final del sistema (camara de desecho). Para conseguir esto, la zona sensora debe estar adicionalmente comprimida con procedimientos disponibles habitualmente. Esto puede conseguirse de dos formas. La primera es controlar la tasa de flujo de masa hasta unas tasas muy bajas pero constantes (de 0,05 microlitros por segundo), para mantener la corriente del nucleo con un ancho del orden de 7 micrometros. La segunda es limitar la altura del rayo laser hasta aproximadamente 3 micrometros.
Esto se consiguio mediante el uso de un sistema emisor en linea del laser de diodo, segun se describe en la patente de EE.UU. pendiente de tramitacion N° 6.612.719. El aparato contiene un laser semiconductor que produce una salida d e l uz que esta or ientada en un primer y u n s egundo ej es perpendiculares entre si qu e so n ambos perpendiculares a la direccion de propagacion de la luz. El aparato tambien incluye un sistema optico que esta dispuesto de una forma tal que enfoque la salida del laser hacia el primer y segundo ejes en la primera y segunda parte focal, que estan separadas aparte en la direccion de propagacion de la luz laser. En un plano que intersecta cada uno de los puntos focales se forma la luz, en una linea con un ancho en un eje y una longitud en el otro eje.
Los citometros de flujo y los sistemas hematologicos basados en citometria de flujo clasicos recogen la luz que es dispersada por las celulas a diversos angulos. Estos sistemas convencionales utilizan una lente recolectora que refleja la corriente del nucleo, recoge toda la luz dispersada por el componente celular de una muestra y despues la hace pasar a traves de una abertura que determina el angulo de recoleccion. Esta luz filtrada se dirige entonces a un fotodetector, que recoge el cono completo de luz dispersada a los angulos deseados. Si se desea mas de un angulo anterogrado de recoleccion de la luz, se usan divisores del haz y espejos para separar los distintos conos de luz. Para la recoleccion de la dispersion en angulo recto, comercialmente se usa una lente para reflejar la corriente de flujo, con objeto de mantener bajos los niveles de luz de fondo.
En la metodologia del diseno sin lentes, los detectores, sin ninguna lente anexa ni otros elementos opticos, se fijan en el espacio para recoger las senales apropiadas inducidas por las celulas al atravesar el rayo laser. Estas senales incluyen la extincion (EXT) (0° -�0,5°); la dispersion anterograda de angulo pequeno (FSL) (�1° -�3°); la dispersion anterograda de angulo elevado (FSH) (�4° -�9°); y la dispersion en angulo recto (RAS) (�50° -�130°). Con objeto de recoger tres medidas diferentes de angulo pequeno a partir de la trayectoria del rayo laser, la optica de modelado del rayo laser forma dos focos de la luz del laser de diodo. Vease la patente de EE.UU. pendiente de tramitacion N°
6.612.719. El primer foco es el plano conel que laluzlaser intersecta las corrientes del nucleo delas celulas/ particulas. Este foco es perpendicular al plano de movimiento de las celulas, y la luz se dispersa debido al paso de las celulas ortogonalmente a traves del delgado centro (plano focal) de un rayo ancho.
Como resultado de tener un rayo con una altura minima (es decir, una dimension minima en la direccion de la particula a traves de la celula de flujo), puede analizarse un gran numero de celulas a elevadas concentraciones sin la interferencia de eve ntos coincidentes. Esto minimiza los volumenes de liquido y la necesidad de manipular grandes volumenes de liquido. Adicionalmente, esta disposicion produce una elevada distribucion de la potencia de la luz en las celulas en este primer foco, por lo que puede medirse la dispersion en angulo recto (RAS) usando un detector mucho mas barato que el que se emplea en los sistemas convencionales. En particular, un fotodiodo puede reemplazar el uso de un tubo foto multiplicador. La distribucion horizontal de la potencia permite que la corriente de flujo fluctue en ese eje sin una deriva apreciable, y ademas minimiza la dispersion de la luz procedente de los bordes de la celula de flujo al mantener la distribucion de potencia de la luz paralela al canal de la celula de flujo.
El segundo foco esta en el plano en el que se colocan los detectores. Aqui, la porcion ancha del rayo procedente de la celula de flujo se reduce a un minimo (es decir, se focaliza), y la luz que ha pasado a traves del primer foco se ha expandido formando una linea larga de luz con una cierta altura. Dentro de esta larga linea de luz se coloca un detector de fotodiodo en el punto en el que el nivel de luz es mayor. Este es el detector de extincion (EXT), que mide
toda la luz axial que se ha perdido (la suma de la luz absorbida y la luz dispersada) segun la celula cruza el rayo laser. Esta medicion contiene una gran cantidad de informacion, pero esta informacion solo puede extraerse cuando hay una elevada proporcion entre la senal y el ruido (signal to noise, S/N). Los laseres de gas empleados convencionalmente en los sistemas hematologicos basados en citometros de flujo producen unas senales fuertes, pero los altos niveles de ruido asociados con estos laseres han minimizado su utilidad para las medidas de la EXT. Esto puede compensarse utilizando tubos de plasma mas largos, ya que cuanto mas largo es el tubo de plasma, menor es el nivel de ruido, y por lo tanto mayor es la proporcion S/N. Los laseres de diodo tienen inherentemente unos niveles de ruido menores que los laseres de gas, pero muestran unos altos niveles periodicos de ruido. Estos estallidos intermitentes de ruido se denominan "salto modal". Unos cambios sutiles en la temperatura o la corriente electrica provocan que el diodo laser cambie bruscamente de un estado monomodal a otro estado monomodal. Cuando se es tan pr oduciendo sa ltos modales, l a pr oporcion S /N de l a m edicion de e xtincion e s muy ba ja, haciendola inutil para la medicion de particulas pequenas o para distinguir diferencias sutiles en las mas grandes.
Para eliminar los saltos modales puede implementarse un control cuidadoso de la temperatura y un control preciso la corriente. S i se r ealiza est o, ca da di odo d e l aser de be caracterizarse i ndividualmente par a e ncontrar un ar ea tranquila de temperatura/corriente en la que no se produzcan saltos modales. Debe realizarse un laborioso esfuerzo para caracterizar cada diodo de laserindividual para encontrar la configuracionideal de temperatura y corriente. Ademas, segun envejece el laser, el area tranquila de temperatura/corriente cambia, y reconfigura los controles de temperatura y corriente. Adicionalmente, incluso si se determina la temperatura apropiada, cuando se enciende por primera vez un laser de diodo, genera su propio calor. El equilibrio en la temperatura del laser de diodo puede tardar hasta 3 0 m inutos en est ablecerse. E ste t iempo de e quilibrio y disminuye l a vi da ut il de l l aser. F inalmente, l a implementacion del control de la temperatura limita gravemente las temperaturas operativas a las que puede usarse una unidad, y anade un coste y un tamano significativos a un diodo de laser relativamente barato y pequeno.
Para obtener una medicion precisa de la extincion usando un laser de fotodiodo, puede emplearse una modulacion de alta frecuencia. La modulacion de alta frecuencia elimina los saltos modales manteniendo el laser en un estado multimodal. Cuando cambia la temperatura o la corriente, el modo primario del diodo cambia, pero dado que el laser de diodo esta funcionando en muchos modos con los que comenzar, estos cambios no producen ninguna punta de ruido. Adicionalmente, la frecuencia de modulacion puede elegirse para que sea mucho mas mayor que las secuencias de interes para los eventos celulares, de forma que la modulacion sea invisible para el sistema.
La modulacion de alta frecuencia resuelve los problemas relacionados con el uso del control de la temperatura y la corriente a la hora de abordar los saltos modales. Un sistema de modulacion de alta frecuencia es estable durante segundos, por lo que no hay necesidad de controlar la temperatura generada por el laser de diodo tras su activacion. Por lo tanto, la vida util del laser se prolonga. Adicionalmente, al contrario que los sistemas de enfriamiento de temperatura, los sistemas de modulacion de alta frecuencia son establesa lo largo de un amplio intervalo de temperaturas operativas. Con la modulacion de alta frecuencia, no hay necesidad de encontrar el area tranquila de temperatura para corriente, y no hay necesidad de reconfigurar el equipo segun envejece el laser. Por lo tanto, se evita el coste del trabajo realizado para hallar y mantener un area tranquila de temperatura/corriente para el laser de diodo.
La modulacion de alta frecuencia se impone en un laser de diodo de la siguiente forma. Un laser de diodo que funciona en un modo de longitud de onda continua (continuous wavelength, CW) tiene un fotodiodo integrado que se usa para la retroalimentacion, de forma que la potencia no varie con la temperatura. Este circuito cambia la corriente entrante en el diodo de laser, de forma que la potencia de la luz se mantiene constante. En una forma de realizacion, el punto de establecimiento de la CW del controlador del laser se configura de forma que produzca la mitad de la potencia de salida nominal del laser. A continuacion, un circuito de modulacion que usa un oscilador de cristal para producir una corriente electrica con una salida de onda sinusal, se "suma" con la corriente de CW. Como resultado, la potencia de salida del laser toma una forma de onda sinusal, con una potencia maxima proxima al nivel de potencia nominal del laser en el pico de la onda sinusal, y una potencia de practicamente cero en el minimo de la onda sinusal.
Dado que el rayo laser converge en un foco en el plano del detector, puede recoger la dispersion de luz de angulo pequeno (FSL) a pequenas distancias lineales del eje del rayo convergente sinla necesidad de lentes, como se requiere en los sistemas convencionales. La FSL puede usarse para medir tamanos de particulas. La FSL se mide colocando un fotodetector de FSL tan proximo al fotodetector de EXT como sea fisicamente posible. Esto puede realizarse confotodiodos aislados o con una matriz de fotodiodos que tenga un tamano adecuado para las dos medidas independientes (EXT & FSL).
La informacion relativa al indice de refraccion y la complejidad interna de las particulas se obtiene usando angulos mayores de dispersion anterograda de la luz (FSH). Esta medicion de la dispersion se realiza generalmente en la region de aproximadamente 4° -9°, medida desde el eje del laser. Esta medicion puede realizarse sin el uso de lentes, bien posicionando un fotodiodo aislado para recoger esa area de dispersion de luz, o bien usando una matriz de f otodiodos co n co mponentes activos que s e co rresponden co n la ge ometria a propiada. E n una f orma d e realizacion se crea una matriz de fotodiodos que es eficaz para medir la EXT, la FSL y la FSH, todas en la misma matriz.
En el sistema de la presente invencion, el fotodetector esta preferiblemente en forma de una fotomatriz en un unico circuito integrado, co n l os detectores separados y or ientados par a r ecoger l a l uz di spersada en l os an gulos apropiados. Esta configuracion permite realizar tres o mas mediciones independientes, sin el requisito de ninguna lente de recoleccion o de reflejo. Mientras que se ha descrito la matriz fotodetectora para la recoleccion de EXT, FSL y FSH, dicha matriz podria extenderse hasta unos angulos de recoleccion tan elevados como de 40°. Por encima de este valor, el canal de flujo cuadratico interferiria con las mediciones.
Para asegurar la alineacion de todos los diodos en los angulos apropiados, y para recoger solo angulos puros de interes, puede colocarse una mascara que actue como filtro de luz sobre los diodos individuales o sobre la matriz de fotodiodos. Esta mascara tiene preferiblemente aberturas con forma curva, para conservar los angulos verdaderos de la luz dispersada al cubrir las esquinas de cualquier fotodiodo cuadrado o rectangular que se usen. Una mascara creada de forma precisa con la geometria apropiada que se fija sobrelos fotodiodos reduce el requerimiento de alineacion optica de l co njunto de diodos multiples a la al ineacion de uni camente el di odo d etector de E XT, simplificando asi su construccion y calibrado. Este conjunto de fotodiodos enmascarado se posiciona preferiblemente de forma que el sensor de extincion tenga el maximo nivel de luz incidente, es decir, en el segundo foco del rayo de luz laser.
La posicion del fotodiodo de dispersion de angulorecto (RAS) es esencial para preservar una elevada apertura numerica, que solo puede conseguirse sin el uso de una lente. Por lo tanto, el fotodiodo se fija cerca de la celula de flujo, paralelo al plano del laser. Toda la luz que sea dispersada ortogonalmente por la celula o particula hacia un lado de la celula de flujo intersecta el fotodiodo RAS.Esto proporciona unos angulos de aceptacion ortogonal de
50°-130°, o una apertura numerica (NA) de 0,9.
Este fotodiodoRAS de alta apertura numerica ocupa toda una caralateral de la celula de flujo, de forma que no pueden realizarse otras medidas en esta cara de la celula de flujo. Sin embargo, la cara opuesta del detector RAS todavia esta disponible, y puede usarse para obtener otras medidas. Por ejemplo, esta cara de la celula de flujo puede usarse para generar datos de fluorescencia estandar en el citometro de flujo, empleando detectores capaces de detectar la luz fluorescente emitida. Esta cara tambien puede contener uno o mas de los siguientes: una lente de recoleccion (de baja apertura numerica) que reflejara la corriente de flujo en el centro de la celula de flujo; divisores del h az y f iltros de i nterferencia, par a se parar va rios ejes de i nformacion f luorescente; l entes reflejantes para focalizar la luz hacia el detector; y tubos fotomultiplicadores para detectar bajos niveles de emisiones fluorescentes.
El uso de un sistema detector de luz sin lentes elimina la necesidad de elementos opticos asociados, tales como lentes, stops y espejos. El sistema de deteccion de luz resultante es significativamente mas pequeno, mas ligero, mas barato y mas fiable que los sistemas de deteccion de luz convencionales, que se basan en dichos elementos opticos para dirigir rayos de luz dentro del instrumento.
Un inconveniente de usar sistemas de recoleccion de luz sin lentes es que la luz parasita llega facilmente a los detectores. Las lentes se usan convencionalmente para dirigir la luz que refleja la corriente del nucleo, de forma que solo aquella que surge de la corriente del nucleo alcanza el detector. Las lentes tambien se usan para focalizar la luz recogida desde los angulos de cono completo hacia un punto en el que se coloca un pequeno fotodetector. El uso de fotodetectores relativamente pequenos minimiza el ruido de corrienteresidual, que es proporcionar al area del fotodiodo. Sin embargo, dado que un sistema sin lentes mantiene un nivel constante de luz de la luz de fondo en todos los detectores del sistema, no se puede conseguir una linea de base del ruido de la corriente residual. La constante luz de fondo sobre los fotodiodos genera una fotocorriente constante en la electronica de procesado de las senales. Esta fotocorriente constante es electronicamente analoga a la corriente continua (direct current, o DC), por lo que el sistema sin lentes genera un elevado nivel de DC en cada fotodiodo. Por lo tanto es mas dificil eliminar en dicho sistema sin lentes la contribucion del nivel de luz de la DC, y es imposible conseguir un minimo de ruido de corriente residual del fotodetector. Sin embargo es necesario para que la luz de DC no interfiera con las senales generadas por las celulas con las particulas. Esto se consigue electronicamente mediante el uso de un servocircuito de retroalimentacion, de forma que las porciones de senal deseadas (corriente alterna o componente AC) puedan ser medidas de forma precisa y reproducible, independientemente de los cambios de temperatura, los cambios en la potencia del laser u otros cambios ambientales o electronicos que puedan afectar al nivel de luz de DC.
Con objeto de mantener las salidas en un valor de linea de base cuando no hay ninguna senal presente, hay un servobucle local para cada uno de los circuitos de preamplificacion asociados con los canales opticos (EXT, FSL, FSH, RAS). Las corrientes residuales de fotodiodo, las corrientes de polarizacion de entrada o losvoltajes de compensacion pueden provocar compensaciones derivadas en las salidas de los circuitos de preamplificacion. Hay dos procedimientos de retroalimentacion u sados en l os circuitos de pr eamplificacion. El primer procedimiento consiste en untransistor de efecto de campo de canal Pcon su puerta conectada a la salida de la segunda etapa. Debido a la mayor corriente residual del sensor EXT, se usa un convertidor de voltaje a corriente de retroalimentacion de transistor de efecto de campo para mantener una elevada impedancia en el nodo suma del amplificador operacional de primera etapa. El resistor de retroalimentacion produce una corriente proporcional al voltaje de sa lida de la se gunda et apa. E l se gundo p rocedimiento de r etroalimentacion us a u n am plificador operacional configurado como un integrador para devolver una proporcion de la senal de vuelta al amplificador
operacional de primera etapa para reducir los niveles de compensacion a traves de los amplificadores operacionales de primera y segunda etapa. Los servobucles locales reducen las senales de baja frecuencia. La ecuacion (1) puede usarse para determinar la frecuencia de esquina a la cual el servobucle proporcionara una atenuacion (-3 dB).
Ecuacion (1) f-3dB = Rdiodo * G2/(2 1 Rt Rf Cf)
en la que
Rdiodo = resistor de retroalimentacion a traves del amplificador operacional de primera etapa
G2 = ganancia de la segunda etapa
Rt = resistor de conversion de corriente a voltaje
Rf = servorresistor de entrada
Cf = servocondensador de integracion
MODULO DE HGB
La concentracion de hemoglobina es un parametro hematologico muy habitual que generalmente se mide mediante la absorcion de luz a 540 nm. Para conseguir esta medicion, generalmente los eritrocitos se lisan en una disolucion que contiene 1 parte de sangre completa por 250 partes de disolucion. La disolucion tambien contiene generalmente un ba jo ni vel de sa l de ci anuro ( es decir, K CN). E l c ianuro r educe t oda l a hem oglobina ( oxi-y deso xi-) a cianohemoglobina, qu e t iene un m aximo de abs orcion a 540 nm . E sta m edicion de l a a bsorcion se r ealiza habitualmente en una cubeta de 1,0 cm2 (NCCLS), pero tambien funcionan otras variantes del estandar con una alta correlacion con el procedimiento de referencia.
En los instrumentos hematologicos convencionales, la concentracion de hemoglobina se mide generalmente en una disolucion por lo demas clara, y esta referenciada siempre con respecto a un fluido transparente. La lisis de los eritrocitos permite m edir l a co ncentracion de hem oglobina en el m ismo ca nal de f luidos que l os leucocitos. Alternativamente, en algunos sistemas el contenido de hemoglobina se mide en un canal por separado.
En el instrumento usado en la presente invencion, el contenido en hemoglobina (HGB) se mide de una forma no convencional. El procedimiento de la presente invencion implica dos mediciones por separado, que no solo se combinan para dar un valor preciso de HGB, sino que tambien verifica la precision de la dilucion que ha realizado el sistema. La primera medicion de HGB se produce despues de que se haya diluido 100 veces una parte de la sangre completa con una disolucion de tincion de reticulocitos. Esto se denomina "disolucion de eritrocitos". Esta disolucion de tincion de reticulocitos tiene un espectro de absorcion especifico asociado a ella. La disolucion de eritrocitos se aspira en un bloque colector. Este bloque contiene al menos tres fuentes emisoras de luz, configuradas para iluminar un agujero cilindrico, en el que se mantiene la disolucion de eritrocitos. Los fotodetectores se colocan en linea con la fuente de luz y el agujero cilindrico, con reservas para filtros de interferencia. Esta configuracion permite la medicion de al m enos tres longitudes de on da de absorcion di ferentes. S e us an t res longitudes de o nda d e a bsorcion diferentes debido a la presencia de un colorante en la disolucion de tincion de reticulocitos.
Las mediciones iniciales de absorcion de la disolucion de eritrocitos no proporcionan una medicion precisa de la concentracion de HGB como otras tecnicas convencionales. Sin embargo, el valor de esta medicion radica en su uso como un punto de datos para la determinacion de la precision de la dilucion de sangre completa. Segun continua el instrumento su ci clo t ras realizar la m edicion i nicial de hemoglobina " sin l isar", se r ealizan l as m ediciones de eritrocitos totales y volumen celular medio en la porcion del citometro del instrumento. Esto permite el calculo de lo siguiente:
Hematocrito (HCT) = RBC * MCV / 10
Concentracion de H emoglobina Corpuscular Media ( Mean Corpuscular Hemoglobin Concentration) (MCHC) = 100 * (HGB / HCT)
Hemoglobina Corpuscular Media (Mean Corpuscular Hemoglobin) (MCH) = HGB / RBC
Segun continua el ciclo del instrumento se anade mas sangre completa a la disolucion original, asi como un agente litico. El agente litico destruye las membranas celulares de los eritrocitos (lisis), liberando la HGB para que quede libre en disolucion. Esto rinde aproximadamente 1 parte de sangre completa por entre 15 y 50 partes de disolucion, que se denomina "dilucion de leucocitos". La disolucion de leucocitos contiene todos los colorantes de la disolucion de eritrocitos medida previamente. La concentracion original de la disolucion colorante se ha diluido ahora en un factor de entre 1:1 y 1:4, con un fluido opticamente transparente.
La disolucion de leucocitos se aspira en el bloque colector donde se realizan multiples medidas de absorcion, y se calcula un valor de HGB. A partir de este segundo valor de HGB, pueden recalcularse el HCT, la MCHC y la MCH. Ademas del valor de HGB, puede medirse la concentracion de colorante y compararlo con los valores obtenidos a partir de la disolucion de eritrocitos. Si, dentro de una tolerancia definida, las dos mediciones independientes de HGB (HCT, MCHC, MCH) coinciden, y las proporciones de colorante entre las disoluciones coinciden, el instrumento ha verificado, por medicion, que todas sus diluciones se realizaron con precision.
Los calculos de la HGB de los leucocitos, debido a la lisis de los eritrocitos, rinden una medicion precisa de la concentracion de HGB. Los calculos de HGB de los eritrocitos no son tan precisos como los calculos de HGB de los leucocitos, debido a que las membranas intactas de los eritrocitos dispersan la luz. Sin embargo, una comparacion de las diferencias en las absorbancias que son debidas al colorante de tincion de reticulocitos en cada medicion permite co mprobar l a pr ecision de l as d iluciones. E sto es, l a m uestra q ue co ntiene er itrocitos no l isados (la disolucion de eritrocitos) tiene un cierto nivel de absorcion de luz que se basa en la concentracion del colorante en el tubo consumible. Posteriormente en el ciclo, se mide la muestra que contiene eritrocitos lisados (la disolucion de leucocitos) para comprobar la absorcion de luz debida al pigmento. Dado que las vias hidraulicas para los analisis de eritrocitos y leucocitos son comunes, la precision de las diluciones puede determinarse sin la necesidad de una disolucion de referencia aparte. Se conoce el intervalo aceptable de proporciones en las mediciones de HGB, bien por estar impreso en una etiqueta de codigo de barras sobre el tubo consumible, o bien a partir de un codigo en la etiqueta de codigo de barras del tubo consumible que hace referencia a un valor en una tabla de proporciones almacenada en el ordenador. Como segunda comprobacion de la precision de las diluciones, las mediciones de HGB tambien deberian coincidir con una cierta tolerancia. De otro modo deberia sospecharse de un error de dilucion. El unico caso en el que el error de dilucion no se detectaria es la altamente improbable situacion en la que se realizasen errores de dilucion identicos en ambas muestras.
En un ejemplo preferido de la metodologia anterior, el codigo de barras del tubo consumible contiene informacion de referencia sobre los valores esperados de absorcion de colorante para las muestras no diluidas (CAL). El instrumento verifica esta informacion para cada numero de lote en uso.
Tras la primera dilucion, la disolucion de eritrocitos deberia tener un valor de absorcion del colorante y un valor de concentracion de HGB que entra dentro de un primer conjunto de intervalos esperados. Estos intervalos deberian ser producto de CAL x un primer factor de dilucion (D1). Tras la segunda dilucion, la disolucion de leucocitos deberia tener un valor de absorcion del colorante y una concentracion de HGB que entrasen dentro de un segundo conjunto de intervalos esperados. Estos intervalos deberian ser el producto de CAL x D1 x un segundo factor de dilucion (D2). Siempre que ambos conjuntos de mediciones esten en los intervalos aceptables, los resultados de las mediciones se notifican sin los mensajes de error asociados.
REACTIVOS
En la determinacion de la composicion celular de una muestra sanguinea, el instrumento usado en la presente invencion emplea al menos dos reactivos de procedimiento primarios y un tercer sistema de reactivos. Estos tres reactivos trabajan conjuntamente para, en primer lugar, contar y clasificar las plaquetas y los eritrocitos, y a continuacion, tras una manipulacion adicional del reactivo, contar y clasificar los leucocitos. El recuento y la clasificacion tienen lugar en dos fases separadas, y en cada una de las dos fases separadas las mezclas de sangrereactivos se hacen pasar a traves de un citometro de flujo, y las celulas de las muestras se identifican y se cuentan.
Un reactivo del procedimiento, denominado reactivo del procedimiento RBC / Retic, se coloca en un tubo de ensayo estandar taponado, denominado "consumible". El consumible contiene lo siguiente:
azul de metileno nuevo, en un intervalo de concentracion de 0,1 a 0,5 gramos por litro. Este componente sirve para tenir el ARN residual de los reticulocitos con un color azul. La concentracion preferida es de 0,3 gramos por litro.
Purafac-A-39-Pric, en un intervalo de concentracion desde 0,1 hasta 0,6 gramos por litro. Este componente actua modificando la forma biconcava normal de los eritrocitos, al interactuar con la membrana celular y la hemoglobina interna, para formar celulas esfericas. La concentracion preferida es de 0,3 gramos por litro.
particulas de referencia interna que tienen una concentracion conocida, que es nominalmente de 104 particulas por !l, pero puede usarse en un intervalo de 103 a 105 por !l.
tampones y conservantes. Los tampones y co nservantes consisten en bicarbonato s odico (preferiblemente 8,0 gramos por litro, pero puede variar desde 6,0 a 10,0 gramos por litro); cloruro sodico (preferiblemente a 3,1 gramos por litro); Tricina (preferiblemente a 1,8 gramos por litro, pero variando entre 1,0 y 5,0 gramos por litro); EDTA disodico preferiblemente a 1,0 gramos por litro, pero variando entre 0,5 y 3,0 gramos por litro); etilparabeno (0,3 gramos por litro) y metilparabeno (0,2 gramos por litro). El pH de esta disolucion deberia estar en un intervalo ligeramente basico entre 7,2 y 8,9, con una osmolaridad de entre 275 y 294 miliosmoles, y una conductividad de entre 11,0 y 13,0.
Las particulas de referencia interna deben usarse a una concentracion conocida, y deben actuar como un sustituto celular. Este sustituto debe tener unas propiedades tales que el instrumento, en al menos una unica tecnica de medicion, pueda distinguirlo de forma unica de los constituyentes celulares de la muestra. Este sustituto celular actua como una muestra interna, un estandar interno para propositos de control de calidad. Esto asegura que las
mediciones del instrumento se r ealizan a decuadamente, y que t odas l as diluciones se ha n r ealizado adecuadamente. La f orma de realizacion preferida de este sustituto es particulas de poliestireno. Sin embargo, podrian usarse otras particulas, tales como celulas fijadas, polen, vidrio o grandes coloides, siempre que se cumplan las condiciones anteriores. El intervalo del tamano de particula es preferiblemente desde aproximadamente 1 micrometro hasta aproximadamente 10 micrometros, y tiene unas caracteristicas opticas que lo separan de forma unica de las plaquetas, los leucocitos y los eritrocitos en al menos un eje de medicion del instrumento.
Las particulas de poliestireno estan disponibles comercialmente en diversos fabricantes, tales como Seradyn y Duke. El tamano preferido es de 4,0 micrometros, que se distingue facilmente de los componentes celulares de la sangre a lo largo de varios ejes de recoleccion de datos en el instrumento. La eleccion de este tamano para las particulas permite determinar f acilmente l a c oncentracion de particulas. Los sistemas de r eactivos del c onsumible s on sensibles a una medicion porcentual de solidos (volumen de particula tiempo de concentracion de particulas); por lo tanto, cuanto menor sea el volumen elegido, mayor sera la concentracion de particulas, y mas amplio el intervalo de concentraciones de particulas que puede utilizarse. La forma de realizacion preferida debe tener una concentracion de particulas en el consumible de 10.000 por !l. A este nivel, el numero de eventos de poliestireno contados estara en el mismo rango que el numero de leucocitos contados.
El segundo reactivo de procedimientos se denomina "lisado". El lisado actua destruyendo los eritrocitos pero dejando intactos los leucocitos. De esta manera, pueden analizarse los leucocitos sin la interferencia de un gran numero de eritrocitos. Este reactivo puede envasarse en un tubo de ensayo estandar taponado, preferiblemente en una forma que permita su uso con hasta 50 pruebas de consumibles por separado.
El lisado contiene preferiblemente:
Saponina, qu e pue de usarse a u nas concentraciones de ent re 6,0 y 20,0 gr amos por l itro. La concentracion preferida es de 18 gramos por litro.
Tampones y conservantes, que consisten en sulfato sodico (preferiblemente a 12,0 gramos por litro, pero eficaz en un intervalo de 10,0 a 16,0 gramos por litro); EDTA disodico (preferiblemente a 1,0 gramos por l itro, per o ef icaz en u n intervalo d e 0,5 a 3,0 gr amos por l itro); p ro-clin 3 00 (preferiblemente a una concentracion de 0,5 ml por litro); y germabox (preferiblemente a 1,0ml por litro). Este pH de este reactivo deberia estar en un intervalo de entre 4,2 y 5,2, con una osmolaridad de entre 235 y 285 miliosmoles, y una conductividad de entre 14 y 16.
El r eactivo del si stema act ua pr incipalmente co mo u n diluyente de l a sa ngre co mpleta, co mo una d isolucion envolvente y como un reactivo de lavado. El reactivo del sistema tambien se denomina "disolucion envolvente". La disolucion envolvente realiza varias funciones, tales como reactivo de dilucion de la sangre completa, reactivo envolvente p ara an alisis citometricos de flujo, r eactivo de l avado para l as vi as hidraulicas del i nstrumento y coadyuvante litico para el reactivo litico para eliminar los eritrocitos. El envolvente se envasa preferiblemente en un recipiente que soportara lo suficiente para usarse en 50 pruebas de consumible distintas por separado.
El envolvente contiene lo siguiente:
Disolucion salina tamponada confosfato (preferiblemente con una osmolaridad de 25 miliosmoles, pero que puede usarse en un intervalo desde 5 hasta 50 miliosmoles).
Tensioactivo para coadyuvar tanto en la limpieza de los componentes internos del sistema como para evitar que se adhieran burbujas de aire a las superficies humedas internas. El tensioactivo preferido es Plurafac-A-39, que puede usarse en un intervalo de 0,1 gramos por litro a 0,3 gramos por litro, y preferiblemente a una co ncentracion de aproximadamente 0,1 gramos por litro. Ademas de Plurafac, podrian usarse otros tensioactivos no ionicos como tales.
Conservantes
Para crear automaticamente las diluciones de sangre completa con los reactivos del procedimiento descrito, se usa un sistema hidraulico y diversos mecanismos. El usuario presenta al instrumento un tubo consumible marcado con un codigo de barras, asi como la muestra de sangre completa adecuadamente anticoagulada. El instrumento lee la informacion necesaria a partir del codigo de barras, y automaticamente alicuota una pequena cantidad de sangre completa en el tubo consumible, junto con un volumen de disolucion envolvente. Esto crea idealmente una dilucion total de 1 parte de sangre por 100 partes de disolucion (reactivo y envolvente RBC / retic), pero la dilucion puede variar desde 1:50 hasta 1:5.000.
Entonces se introduce en el instrumento un volumen conocido de esta disolucion desde el tubo consumible, y se mueve a una posicion cercana a la entrada de la celula de flujo optico. Entonces se hace pasar la disolucion, a una tasa de flujo de masa lenta de menos de 0,25 microlitros por segundo mediante focalizacion hidrodinamica, a traves de un sistema de deteccion optico en el que se mide la dispersion de luz y la absorcion de luz para los eritrocitos,
plaquetas y microparticulas individuales, asi como la absorcion de luz por parte de un colorante de la disolucion.
Una vez completado el analisis de eritrocitos/plaquetas, el instrumento alicuota una segunda cantidad mayor de sangre completa en el tubo consumible, junto con una alicuota de lisado y las cantidades apropiadas de disolucion envolvente, para formar una dilucion de preferiblemente una parte de sangre por veinte partes de disolucion. Esta disolucion puede variar desde 1:10 hasta 1:100. La intencion es proporcionar una disolucion que pueda lisar los eritrocitos, pero mantener intactos los leucocitos de la muestra de sangre completa durante un periodo de al menos un minuto.
Entonces se empuja un volumen conocido de esta segunda disolucion en el instrumento desde el tubo consumible y se mueve hasta una posicion cercana a la entrada de la celula de flujo optico. Entonces se hace pasar la disolucion, a una t asa d e f lujo de m asa m oderada de apr oximadamente u n m icrolitro p or se gundo us ando f ocalizacion hidrodinamica, a traves de un sistema de deteccion optico en el que se mide la dispersion de luz y la absorcion de luz para los leucocitos, microparticulas y colorantes individuales.
La siguiente descripcion describe el sistema usado en la presente invencion en relacion con las figuras anexas. El experto en la materia comprendera que pueden realizarse algunas modificaciones en la invencion segun se describe a continuacion sin desviarse del ambito de las reivindicaciones anexas.
El usuario abre una puerta del sistema, cuando esta en estado READY, que expone dos ranuras de tubo abiertas (ranura A de la figura 7 y ranura B de la figura 7). En estas ranuras vacias el usuario coloca un tubo consumible (60), y una muestra de sangre completa que contiene un anticoagulante (es decir, EDTA, Citrato y Heparina). Entonces el usuario cierre la puerta. El sistema verifica la presencia y la identidad de los dos tubos anadidos, y mueve el carro portador de viales (70) de forma que el consumible se posicione bajo el mezclador (80). El motor 82 posiciona el mezclador de forma que este en contacto con la parte superior del tubo consumible (60). Centrifugandolo en una direccion, y despues revertiendo la direccion, mezcla el tubo. Durante el proceso de centrifugado se lee el codigo de barras, que contiene la informacion de calibracion del lote. Despues de mezclar adecuadamente el tubo consumible para homogeneizar las particulas, el carro 70 posiciona la muestra de sangre completa bajo la mezcladora, y de una forma similar mezcla el tubo de sangre completa para asegurar la homogeneidad de la muestra.
El carro posiciona entonces el tubo de sangre completa debajo de la aguja hidraulica 11 y de la aguja neumatica 12. Moviendo el motor 81, las agujas perforan el septo del tubo de sangre completa, y continuan penetrando en el tubo hasta que ambas agujas entran en contacto con la superficie de la sangre. Esto asegura que el orificio de la aguja hidraulica 11 este completamente sumergido, pero que el orificio de la aguja de purga 12 no lo este.
Abriendo la valvula 3, y moviendo la jeringa 6 succiona la sangre dentro de la punta de la aguja 11. Idealmente, se aspiraran 5 microlitros de sangre completa para esta porcion. Entonces se cierra la valvula 3. Entonces se retiran las agujas de la muestra de sangre completa del paciente. Segun se retiran las agujas a traves del septo, las agujas son limpiadas casi completamente por el septo. Ahora el carro 70 posiciona el tubo consumible 60 bajo las agujas. Como antes, moviendo el motor 81, las agujas 11 y 12 perforan el septo del tubo consumible 60, y penetran en el tubo hasta que ambas agujas entran en contacto con la superficie del reactivo.
Entonces se abren las valvulas 5 y 3, mientras que la jeringa 7, que esta llena con el diluyente del sistema, comienza a dispensar. Esto empuja la sangre desde la punta de la aguja 11 y un volumen de fluido envolvente hacia dentro del consumible, que ahora esta representado por 61. Durante la dispensacion, el motor 81 ha movido las agujas 11 y 12 hacia arriba para evitar que el orificio de la aguja 12 entre en contacto con la disolucion. Esta disolucion es ahora bastante homogenea, pero para asegurar la homogeneidad se cierran las valvulas 3 y 5, y se extraen las agujas de 61, que entonces se mueve a la posicion de mezcla debajo de 80, y se mezcla mediante centrifugacion, segun se describio anteriormente. Durante este proceso se abren la valvula 3 y la valvula 5, y la jeringa 7 crea un espacio de aire en la punta de la aguja.
A continuacion el tubo consumible 61 se coloca debajo de las agujas 11 y la aguja 12. Moviendo el motor 81, las agujas 11 y 12 perforan el septo del tubo consumible 60, y penetran en el tubo hasta que ambas agujas entran en contacto con la superficie de la disolucion. Entonces la jeringa 7 aspira un volumen conocido de disolucion en la punta de la aguja. Entonces las agujas 11 y 12 se retiran de la disolucion, pero no se extraen del tubo consumible 61, mediante el motor 81. Esto crea un condensado de la sangre completa diluida en la aguja 11. La jeringa 7 succiona este condensado a traves del modulo de HGB 10, donde se evalua su absorcion a cuatro longitudes de onda de luz separadas. Dichos datos espectrales estan representados en la figura 22. El volumen de condensado tambien puede evaluarse aqui evaluando los valores de absorcion de los canales detectores, que cambian segun pasan a su traves los espacios de aire de cada lado del condensado.
La jeringa 7 continua succionando el condensado hasta pasar la valvula 3, y lo posiciona cerca de la valvula 5. La valvula 3 se cierra mientras que la valvula 2 se abre, punto en el cual lajeringa 7 revierte su direccion y empuja el condensado traves de la valvula 2, hasta la punta del conjunto de la celula de flujo 20.
Entonces la valvula 2 se cierra, y la valvula 4 se abre, lo que permite rellenar las jeringas 6 y 7 desde el deposito de
diluyente del sistema 8. Entonces la valvula 5 se cierra, la valvula 1 se abre, y las jeringas 6 y7 dispensan muy lentamente. La disolucion envolvente de la jeringa 7 se dispensa a traves de 21, y el condensado de sangre completa diluida es empujado por la jeringa 6 a traves de 20. Esto forma una corriente de nucleo confinada en una envoltura de sangre completa diluida en 25, que transporta la corriente al embudo de la celula de flujo 22, donde las celulas son interrogadas por las fuentes de luz que emiten desde el conjunto optico 41. Esta corriente de fluido pasa completamente a traves de la celula de flujo 22, y dentro de los tubos de 23, que estan fijados en la celula de flujo 22 mediante un tapon de celula de flujo 24. Este camino conduce al desecho del sistema 9.
Mientras la co rriente del f luido est a pasando a t raves de l a c elula de f lujo 22, el c onjunto optico 41 i lumina individualmente las celulas de la sangre completa diluida. Las celulas pasan a traves de un punto focal optico 34 del laser 30, que maximiza la potencia incidente sobre las celulas. Este estrecho foco es generado por la lente 33. La luz efectuada por el paso de las celulas atraves del punto 34 cambia la cantidades de luz que inciden sobre los fotodiodos 42, 43, 44 y 45. Estos cambios son capturados por la electronica de procesado de senales de la figura 26, y almacenados a traves de la electronica del sistema de la figura 25. Algunos ejemplos de los datos recogidos de esta forma se muestran en las FIGS. 10 A -10 D.
La Fig. 10 A muestra datos que han sido recogidos para la senal de baja dispersion anterograda (FSL), a partir del detector 45. La 10 B muestra datos que han sido recogidos para la senal de extincion o de perdida de luz axial (EXT), a partir del detector 44. La Fig. 10 C muestra datos que han sido recogidos para la senal de dispersion en angulo recto (RAS), o detector 42. La Fig. 10 D muestra los datos del ancho de pulso que se han recogido a partir de la senal de baja dispersion anterograda (FSL), o detector 45, pero midela duracion del vuelo, o el tiempo que la celula esta frente al rayo laser. Para las figuras 10 A, 10 B, 10 C y 10 D, los picos mostrados por A representan eventos de plaquetas, los picos mostrados por B representan eventos de particulas de latex, y los picos mostrados por C representan eventos de eritrocitos. Estos mismos datos se muestran en forma de una representacion grafica de la dispersion en las figuras 11 A y 11 B. Para la figura 11 A, los puntos del cuadrado A representan los eventos de las particulas de latex, y en 11 B, el circulo B representa eventosde particulasde latex. Los datos de la representacion grafica de la dispersion podrian estar representados por cualquier par de los hasta cuatro detectores, y la duracion del vuelo.
Si los reactivos usados para crear esta dilucion usan un colorante de tincion de ARN, tal como azul de metileno nuevo, los datos pueden ser analizados adicionalmente mirando unicamente las porciones de eritrocitos, C, en las Figuras 10 A -10 D para evaluar los reticulocitos. Los histogramas de dichos analisis se muestran en las figuras 14 A y 14 B, y se muestra unarepresentacion grafica de la dispersion enla Figura 15. La Figura 15 muestra una poblacion calculada del 1,72%, que son reticulocitos. Esto se comparafavorablemente con un procedimiento de referencia del manual 1,60% de recuento de reticulocitos.
Despues de contar y clasificar satisfactoriamente los eritrocitos, reticulocitos, plaquetas y latex, las agujas 11 y 12 son retiradas del consumible 61. El carro 70 mueve la muestra de sangre completa de forma que se posicione debajo de las agujas 11 y 12. Moviendo el motor 81, las agujas perforan el septo del tubo de sangre completa, y continuan penetrando en el tubo hasta que ambas agujas11 y 12 entran en contacto con la superficie de la sangre. Esto asegura que el orificio de la aguja hidraulica 11 este completamente sumergido, pero que el orificio de la aguja de purga 12 no lo este. Abriendo la valvula 3, y moviendo la jeringa 6, se hace que la sangre sea succionada dentro de la punta de la aguja 11. Idealmente, se aspiraran 100 microlitros para esta porcion. Entonces se cierra la valvula
3. Entonces se retiran las agujas 11 y 12 de la muestra de sangre completa del paciente. Segun se retiran las agujas 11 y 12 a traves del septo, las agujas son limpiadas casi completamente por el septo. Ahora el carro 70 posiciona el tubo consumible 61 bajo las agujas 11 y 12. Moviendo el motor 81, las agujas 11 y 12 perforan el septo del tubo consumible 61, y penetran en el tubo hasta que ambas agujas 11 y 12 entran en contacto con la superficie de la disolucion.
Se abren las valvulas 5 y 3, mientras que la jeringa 7, que esta llena con el diluyente del sistema, comienza a dispensar. Esto empuja los 100 microlitros de sangre a traves de la punta de la aguja 11. Un volumen de fluido envolvente sigue a la sangre completa hacia dentro del consumible, que ahora esta representado por 62. Durante la dispensacion, el motor 81 h a movido las agujas hacia arriba para evitar que e l orificio de l a aguja 12 ent re en contacto con la disolucion. Ahora se extraen las agujas 11 y 12 del tubo consumible 62, y el carro 70 se mueve a las posiciones de la ranura C de la figura 7, que contiene un tubo de reactivo de lisado, debajo de las agujas 11 y 12. Moviendo el motor 81, las agujas 11 y 12 perforan el septo del tubo de lisado, y continuan penetrando en el tubo hasta que ambas agujas 11 y 12 entran en contacto con la superficie del lisado. Abriendo la valvula 3, y moviendo la jeringa 6 succiona el lisado dentro de la punta del aguja 11. Idealmente, se aspiraran 100 microlitros de lisado para esta porcion, que a continuacion esta seguido por un poco de aire. Retirando la aguja 11 de la disolucion, y moviendo despues la jeringa 6, se crea este hueco de aire. Entonces se cierra la valvula 3. Entonces se retiran las agujas 11 y 12 del tubo de lisado. Segun se retiran las agujas a traves del septo, las agujas son limpiadas casi completamente por el septo. El carro 70 posiciona el tubo consumible 62 bajo las agujas 11 y 12. Entonces se abren las valvulas 5 y 3 mientras que la jeringa 7, que esta llena con el diluyente del sistema, comienza a dispensar. Esto empuja los 100 microlitros de lisado traves de la punta de la aguja 11. Un volumen de fluido envolvente sigue a esto en el consumible, que ahora esta representado por 63. Durante la dispensacion, el motor 81 ha m ovido las agujas hacia arriba, de forma que se evite que el orificio del aguja 12 entre en contacto con la disolucion.
La disolucion del tubo consumible 63 es bastante homogenea, pero para asegurar la homogeneidad se cierran las valvulas 3 y 5, y se extraen las agujas de 63, que entonces se mueve a la posicion de mezcla debajo de 80, y se mezcla mediante centrifugacion, segun se describio anteriormente. Durante este proceso se abren las valvulas 3 y 5, y la jeringa 7 crea un espacio de aire en la punta de la aguja.
El tubo consumible 63 se coloca debajo de las agujas 11 y 12. Moviendo el motor 81, las agujas 11 y 12 perforan el septo del tubo consumible 63, y penetran en el tubo hasta que ambas agujas 11 y 12 entran en contacto con la superficie de la disolucion. Entonces la jeringa 7 aspira un volumen conocido de disolucion en la punta de la aguja
11. Entonces las agujas 11 y 12 se retiran de la disolucion, pero no se extraen completamente del tubo consumible 61, mediante el motor 81. Esto crea un condensado del lisado de sangre completa en la aguja 11. La jeringa 7 succiona este condensado del lisado de sangre completa a traves del modulo de HGB 10, donde se evalua su absorcion a cuatro longitudes de onda de luz separadas. En este caso los eritrocitos han sido lisados, liberando la hemoglobina de lascelulas. Los datos de absorcionpueden mostrarse en la figura 19 A si se usocianuro en el agente de lisado, en la figura 19 B si solo se uso un agente litico, y en la figura 21 si la lisis celular se produjo en presencia de una tincion de reticulocitos. El volumen de condensado tambien puede evaluarse aqui evaluando los valores de absorcion de los canales detectores, que cambian segun pasan a su traves los espacios de aire de cada lado del condensado.
La jeringa 7 continua succionando el condensado hasta pasar la valvula 3, y cerca de la valvula 5. La valvula 3 se cierra y la valvula 2 se abre, punto en el cual la jeringa 7 revierte su direccion y empuja el condensado traves de la valvula 2, hasta la punta del conjunto de la celula de flujo 20.
Entonces la valvula 2 se cierra, y la valvula 4 se abre, lo que permite rellenar las jeringas 6 y 7 desde el deposito de diluyente del sistema 8. Entonces la valvula 5 se cierra, la valvula 1 se abre, y las jeringas 6 y7 dispensan muy lentamente. La disolucion envolvente de la jeringa 7 se dispensa a traves de 21, y el condensado de sangre completa lisada es empujado por la jeringa 6 a traves de 20. Esto forma una corriente de nucleo confinada en una envoltura de sangre completa lisada en 25, que transporta la corriente al embudo de la celula de flujo 22, donde las celulas son interrogadas por las fuentes de luz que emiten desde el conjunto optico 41. Esta corriente de fluido pasa completamente a traves de la celula de flujo 22, y dentro de los tubos de 23, que estan fijados en la celula de flujo 22 mediante un tapon de celula de flujo 24. Este camino conduce al desecho del sistema 9.
Mientras la co rriente del f luido est a pasando a t raves de l a c elula de f lujo 22, el c onjunto optico 41 i lumina individualmente las celulas de la sangre completa diluida. Las celulas pasan a traves de un punto focal optico 34 del laser 30, que maximiza la potencia incidente sobre las celulas. Este estrecho foco es generado por la lente 33. La luz efectuada por el paso de las celulas atraves del punto 34 cambia la cantidades de luz que inciden sobre los fotodiodos 42, 43, 44 y 45. Estos cambios son capturados por la electronica de procesado de senales de la figura 26, y almacenados a traves de la electronica del sistema de la figura 25. Algunos ejemplos de los datos recogidos de esta forma se muestran en las FIGS. 12 A -12 F.
La Fig. 12 A muestra datos que han sido recogidos para la senal de extincion o de perdida de luz axial (EXT), a partir del detector 44; sin particulas de latex presentes, la 12 B muestra la misma muestra con latex presente. La 12 C muestra los datos que han sido recogidos para la senal de baja dispersion anterograda, a partir del detector 45 sin latex presente, y la 12 D muestra la misma muestra con latex presente. La fig. 12 E muestra datos que han sido recogidos para la senal de dispersion en angulo recto (RAS), o detector 42 sin latex presente, y la figura 12 F muestra la misma muestra con latex presente.
Para las figuras 12 A, 12 B, 12 C, 12 D, 12 E y 12 F, el pico mostrado por A representa eventos de linfocitos, el pico mostrado por B representa eventos de monocitos, y el pico mostrado por C representa eventos de granulocitos, y el pico mostrado por D representa eventos de latex. Estos mismos datos se muestran en forma de una representacion grafica de la dispersion en las figuras 13 A y 13 B. Para la figura 11 A, los puntos del circulo D representan los eventos de las particulas de latex, y en 11 B, el circulo D tambien representa los eventos de particulas de latex. Los datos de la representacion grafica de la dispersion podrian estar representados por cualquier par de los hasta cuatro detectores, y la duracion del vuelo.
Para las muestras que contienen eosinofilos en la poblacion de granulocitos, la separacion de la subpoblacion se consigue en el canal de dispersion en angulo recto del detector 42. La Figura 16 A muestra el histograma de los datos en los que A representa linfocitos, B monocitos, C neutrofilos y D eosinofilos. La Figura 17 muestra los mismos datos que la Figura 16, en forma de representacion grafica de la dispersion. Las poblaciones rodeadas con un circulo de A representan linfocitos, B monocitos, C neutrofilos y D eosinofilos. Los datos de la representacion grafica de la dispersion podrian estar representados por cualquier par de los hasta cuatro detectores, y la duracion del vuelo, pero para distinguir los eosinofilos es necesaria la dispersion en angulo recto.
Una vez que los leucocitos han sido contados y clasificados, la jeringa 7 se carga con fluido procedente el deposito de reactivos 8, mediante la apertura de la valvula 4. La valvula 4 se cierra, 3 y 5 se abre, lo que permite que la jeringa 7 limpie las lineas de muestras retrodescargando fluido en el tubo consumible 63 a traves de la aguja 11. La
aguja 12 actua purgando el tubo a traves del filtro 13 a la atmosfera. Esto rinde un tubo consumible que tiene la configuracion mostrada en 64. El carro 70 se mueve ahora a su posicion inicial, donde el usuariopuede abrir la puerta del sistema y retirar los tubos de las ranuras A y B de la figura 7. El tubo consumible es ahora un tubo de desecho, y se desecha.
5 Otros modos operativos,junto con las mismas lineas segun se describio anteriormente, podrian permitir realizar inmunoensayos mediante tecnicas de aglutinacion de latex. Aqui el consumible contendria latex que esta recubierto con un anticuerpo, de forma que las particulas se agruparian entre si en la presencia de un analito apropiado. Esta mezcla de latex se analizaria a traves del canal optico descrito en la Figura 4, y los datos serian evaluados para
10 buscar agrupamientos de particulas dobletes o t ripletes. C uanto m ayor se a l a co ncentracion de estos agrupamientos, mayor sera la concentracion del analito de interes.
La presente invencion no pretende tener limitado su ambito por las formas de realizacion especificas descritas en este documento, sino que esta limitada por el ambito de las presentes reivindicaciones.
Claims (19)
- REIVINDICACIONES1. Un procedimiento para analizar una muestra sanguinea o una muestra de un derivado sanguineo usando un sistema hematologico basado en citometria de flujo que comprende un sistema de deteccion optico, comprendiendo el procedimiento:proporcionar un tubo consumible cerrado (60) teniendo en un extremo del mismo un septo que es perforable por una aguja, conteniendo dicho tubo:un numero conocido de particulas de referencia, teniendo cada una de dichas particulas de referencia un diametro predeterminado y siendo distinguibles de las celulas objetivo de la muestra sanguinea o de la muestra del derivado sanguineo basandose en al menos una medicion optica de una medicion de extincion, una medicion de dispersion anterograda de la luz de angulo pequeno, una medicion de la dispersion de angulo recto, una medicion de la dispersion de la luz de angulo elevado y una medicion de la duracion de vuelo; yal menos un reactivo para permitir la determinacion de la composicion celular de la muestra sanguinea o muestra de derivado sanguineo, comprendiendo el al menos un reactivo al menos un colorante;perforar el septo con una aguja (11) y alicuotar una primera porcion de sangre completa y un volumen conocido de disolucion envolvente en el tubo consumible cerrado (60) a traves de la aguja (11), formando la primera porcion de sangre completa, el volumen conocido de disolucion envolvente, las particulas de referencia y el al menos un reactivo, una primera disolucion;succionar un volumen conocido de la primera disolucion desde el tubo consumible cerrado (60) en el sistema de deteccion optico a traves de la aguja (11);usar el sistema de deteccion optico para medir la dispersion de la luz y la absorcion de la luz por parte de eritrocitos, p laquetas y particulas de r eferencia i ndividuales dentro del vo lumen co nocido d e l a primera disolucion, y para medir la absorcion de luz del al menos un colorante dentro del volumen conocido de la primera disolucion;alicuotar una segunda porcion de sangre y un volumen de disolucion envolvente en el tubo consumible cerrado (60) a traves de la aguja (11);alicuotar una alicuota de lisado en el tubo consumible (60) a traves de la aguja (11), formando el contenido del tubo consumible cerrado (60) y el lisado, una segunda disolucion;succionar un volumen conocido de la segunda disolucion en el sistema de deteccionoptico a traves de la aguja (11):usar el sistema de deteccion optico para medir la dispersion de la luz y la absorcion de la luz por parte de los leucocitos, las particulas de referencia y el al menos un colorante individuales dentro del volumen conocido de la segunda disolucion.
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- 2.
- El procedimiento segun la reivindicacion 1, en el que dicho diametro de cada una de dichas particulas de referencia esta entre 1 micrometro y 10 micrometros.
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- 3.
- El procedimiento segun cualquiera de las reivindicaciones precedentes, en el que, cuando la muestra sanguinea o la muestra del derivado sanguineo esta en dicho tubo consumible cerrado (60), dicho numero conocido de particulas de referencia esta entre aproximadamente 103 y aproximadamente 105 por !l de una disolucion formada por dicho reactivo y dicha muestra sanguinea o muestra de derivado sanguineo.
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- 4.
- El procedimiento segun cualquiera de las reivindicaciones precedentes, en el que dichas particulas de referencia se eligen del grupo formado por particulas de latex, celulas fijadas, polen, vidrio y coloides grandes.
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- 5.
- El procedimiento segun cualquiera de las reivindicaciones precedentes, en el que dicho reactivo es eficaz para permitir q ue dicho si stema hematologico basado e n ci tometria de f lujo cu ente a l menos uno de eritrocitos y reticulocitos en una muestra sanguinea o muestra de derivados sanguineo.
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- 6.
- El procedimiento segun cualquiera de las reivindicaciones precedentes, en el que dicho reactivo incluye un reactante capaz de tenir el acido ribonucleico [ARN] en reticulocitos.
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- 7.
- El procedimiento segun la reivindicacion 6, en el que dicho reactante capaz de tenir el acido ribonucleico [ARN] en reticulocitos es azul de metileno nuevo.
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- 8.
- El procedimiento segun lareivindicacion 7, en el que, cuando la muestra sanguinea o la muestra del derivado sanguineo est a en dicho t ubo co nsumible ce rrado ( 60), di cho az ul d e m etileno nu evo est a pr esente a un a concentracion de ent re a proximadamente 0,1 hast a apr oximadamente 0, 5 gr amos por l itro de u na di solucion formada por dicho reactivo y dicha muestra sanguinea o muestra del derivado sanguineo.
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- 9.
- El procedimiento segun cualquiera de las reivindicaciones precedentes, en el que dicho reactivo incluye un reactante capaz de modificar la forma de los eritrocitos, pero que por lo demas deja los eritrocitos practicamente intactos.
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- 10.
- El procedimiento segun la reivindicacion 9, en el que dicho reactante capaz de modificar la forma de l os eritrocitos, pero que por lo demas deja los eritrocitos practicamente intactos, es Plurafac-A-39-Pric.
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- 11.
- El procedimiento segun la reivindicacion 10, en el que, cuando la muestra sanguinea o la muestra de derivado sanguineo esta en dicho tubo consumible cerrado (60), dicho Plurafac-A-39-Pric esta presente a una concentracion de entre 0,1 y 0,6 gramos por litro de una disolucion formada por dicho reactivo y dicha muestra sanguinea o muestra de derivado sanguineo.
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- 12.
- El procedimiento segun cualquiera de las reivindicaciones precedentes, en el que dicho reactivo incluye azul de metileno nuevo y dicho Plurafac-A-39-Pric.
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- 13.
- El procedimiento segun la reivindicacion 12, en el que, cuando la muestra sanguinea o la muestra de derivado sanguineo est a en dicho t ubo co nsumible ce rrado ( 60), di cho az ul d e m etileno nu evo est a pr esente a un a concentracion de entre 0,1 y 0,5 gramos por litro de una disolucion formada por dicho reactivo y dicha muestra sanguinea o muestra del derivado sanguineo, y dicho Plurafac-A-39-Pric esta presente a una concentracion de entre 0,1 y 0,6 gramos por litro de una disolucionformada por dicho reactivoy dicha muestra sanguinea o muestra de derivado sanguineo.
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- 14.
- El procedimiento segun cualquiera de las reivindicaciones precedentes, en el que dicho reactivo incluye:
a) azul de metileno nuevo, a una concentracion de entre aproximadamente 0,1 y aproximadamente 0,5 gramos por litro;b) Plurafac-A-39-Pric, a una concentracion de entre aproximadamente 0,1 y aproximadamente 0,6 gramos por litro;c) bicarbonato sodico, a una concentracion de entre aproximadamente 6,0 y aproximadamente 10,0 gramos por litro;d) cloruro sodico, a una concentracion de entre aproximadamente 1,0 y aproximadamente 5,0 gramos por litro;e) Tricina, a una concentracion de entre aproximadamente 1,0 y aproximadamente 5,0 gramos por litro;f) EDTA disodico, a una concentracion de entre aproximadamente 0,5 y aproximadamente 3,0 gramos por litro;g) etilparabeno a una concentracion de entre aproximadamente 0,1 y aproximadamente 0,5 gramos por litro; yh) metilparabeno a una concentracion de entre aproximadamente 0,1 y aproximadamente 0,3 gramos por litro,en el que cada una de dichas concentraciones es la concentracion por litro de una disolucion formada por dicha muestra sanguinea o muestra de derivado sanguineo y dicho reactivo, cuando dicha muestra sanguinea o muestra de derivado sanguineo esta en dicho tubo consumible cerrado (60). -
- 15.
- El procedimiento segun cualquiera de las reivindicaciones precedentes, en el que dicho reactivo es eficaz para permitir la medicion de al menos uno de recuento de leucocitos, diferencial de leucocitos en cinco partes y niveles de hemoglobina.
-
- 16.
- E l pr ocedimiento s egun cu alquiera de l as reivindicaciones precedentes, en e l que dicho r eactivo i ncluye saponina, a una concentracion de entre 6,0y 20,0 gramospor litro de la disolucion formada por dicho reactivo y dicha muestra sanguinea o muestra del derivado sanguineo cuando dicha muestra sanguinea o muestra de derivado sanguineo esta en dicho tubo consumible cerrado (60).
-
- 17.
- El procedimiento segun cualquiera de las reivindicaciones precedentes, que comprende adicionalmente:
- a)
- sulfato sodico, a una concentracion de entre 10,0 y 16,0 gramos por litro;
- b)
- EDTA disodico, a una concentracion de entre 0,5 y 3,0 gramos por litro;
- 5
- c)
- un conservante ProClin 300, a una concentracion de entre 0,1 y 1,0 gramos por litro; y
- d)
- un conservante germabox II, a una concentracion de entre 0,5 y 3,0 ml por litro,
10 en el que cada una de dichas concentraciones es la concentracion por litro de una disolucion formada por dicha muestra sanguinea o muestra de derivado sanguineo y dicho reactivo, cuando dicha muestra sanguinea o muestra de derivado sanguineo esta en dicho tubo consumible cerrado (60). - 18. E l pr ocedimiento se gun cu alquiera d e l as reivindicaciones precedentes, e n el que d ichas particulas son 15 particulas de latex.
- 19. El procedimiento segun cualquiera de las reivindicaciones precedentes, en el que dicho diametro de cada una de dichas particulas es de 4,0 � 0,5 micrometros.20 20. El procedimiento segun cualquiera de las reivindicaciones precedentes, en el que, cuando dicha muestra sanguinea o muestra de derivado sanguineo esta en dicho tubo consumible cerrado (60), dicho numero conocido de particulas es de 10.000 � 1.000 por !l de una disolucion formada por dicho reactivo y dicha muestra sanguinea o muestra de derivado sanguineo.
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