JP2004506876A - フローサイトメトリーに基づく血液学装置 - Google Patents

Abstract

本発明の装置は、レーザ光源（３０）から放出された光の通路を制御するためのレンズレス光学装置を含むフローサイトメータである。このレーザ光源は、狭いビームを放射する標準的なダイオードレーザ光源である。このレーザ光ビームの形状は散乱した光の検出に良く適している。さらに、本装置の信頼性は、いずれの動作部分をも含まない光検出器アレイ（４８）の使用によって高揚される。この光検出器アレイは前記散乱した光が検出可能なようにされ、収集されたデータは完全な血液学的分析を提供する。最後に、本装置は、血液サンプル分析のための反応チャンバ、混合チャンバ、および廃棄物チャンバとして作用する消耗試薬管（６０）の独自システムを使用する。

Description

【０００１】
本発明は、一般的には生物粒子の分析に関し、より詳細には、従来にないフローサイトメトリー光散乱技術と、試薬の無駄を最小化する試薬送液およびサンプル処理についての独自の方法とを結合することによって自動血球分析を実行する方法および装置に関する。さらに特に、本発明はフローサイトメトリー血液サンプル分析装置を対象とし、この装置は、小さな臨床研究室、医院、獣医院などにおける使用に適合するのに十分に小さく、信頼性が高く、かつ安価な装置において、少なくとも全血球計数、白血球５分画、および網赤血球計数を共に行わせるという、選ばれた特徴の集合を用いる。この装置はまた、標準的なフローサイトメトリー技術によって分析可能な、血液以外のいずれの生体サンプル（たとえば、尿）の分析にも使用され得る。本発明はまた、フローサイトメトリーに基づく血液サンプル分析装置の使用方法にも関する。
【０００２】
哺乳類の抹消血は、通常、血球類型の三大分類である、赤血球（「ＲＢＣｓ」）と、白血球（「ＷＢＣｓ」）と、血小板（「ＰＬＴ」）とを含む。これらの血球は血漿と呼ばれる溶液において浮遊し、血漿は多くの異なるたんぱく質、酵素およびイオンを含む。血漿の成分の機能は、血液凝固、浸透圧維持、免疫監視、その他多数の機能を包含する。
【０００３】
哺乳類は、通常、１ｌにつき、２〜１０×１０^１２個の赤血球を有する。赤血球は、血液循環のシステムにおいて、酸素および二酸化炭素の運搬を担う。人間を含む多くの哺乳類において、標準的な成熟赤血球は、両凹断面形状であり、核を欠いている。赤血球は種によっては４〜９μｍの間の直径を有し、一般には２μｍ未満の厚さを有する。この赤血球にはヘモグロビンとして知られるたんぱく質が存在し、これは酸素および二酸化炭素運搬の２つの役割を果たし、かつ非常に高い濃度で存在する。ヘモグロビンは、分子中の鉄の存在に起因して、血液の全体的な赤色の原因となっている。において、用語「赤血球（ｅｒｙｔｈｒｏｃｙｔｅｓ）」、「赤血球（ｒｅｄ ｂｌｏｏｄ ｃｅｌｌｓ）」、「赤血球（ｒｅｄ ｃｅｌｌｓ）」および「ＲＢＣｓ」は、上記のような血液循環中に存在するヘモグロビンを含む血球を称するために交互に使用される。
【０００４】
この標準的なＲＢＣｓの他に、より未熟な形態の赤血球が、末梢血サンプルにおいてしばしば発見され得る。わずかに未熟な形態のＲＢＣｓは網赤血球と呼ばれ、非常に未熟な形態は有核赤血球（ＮＲＢＣｓ）として広く分類される。ほとんど全ての非哺乳類動物は、血液中に専らＮＲＢＣｓのみを有する。
【０００５】
網赤血球は、骨髄における正常な細胞発育段階の大半を完了し、かつその核を排出した、赤血球前駆物質である。真に成熟したＲＢＣになる前のこの網赤血球を除いた残りの部分はトランスファーＲＮＡである。網赤血球の検出は、新たな赤血球を生み出す患者の能力の臨床評価において重要である。網赤血球計数はまた、貧血の種々の類型を識別するために利用され得る。貧血において、赤血球の生成は、赤血球の除去にもはや追いつくことができない程度まで減少され、結果として全体的な赤血球数および赤血球容積率が低下する。これらの患者において大量に増加した網赤血球の存在は、骨髄が機能しており、かつ赤血球不足を補おうとしているという証明を提供する。もしこれらの患者において網赤血球が少量しか存在しないなら、または全く検出できないなら、骨髄は、赤血球不足に対して、十分に対応していない。
【０００６】
白血球（ＷＢＣｓ）は、赤血球と比べて非常に低い濃度で末梢血に存在する。この白血球の標準濃度は、１ｌあたり５〜１５×１０^９個の範囲であり、赤血球よりおよそ３オーダ少ない。これらの血球は、一般的にはＲＢＣｓよりも大きく、白血球の類型や種によっては６〜１３μｍの直径である。ＲＢＣｓとは異なり、体内には種々の機能を実行する様々な白血球の類型が存在する。本願において、用語「白血球（ｗｈｉｔｅ ｂｌｏｏｄ ｃｅｌｌｓ）」、「白血球（ｗｈｉｔｅ ｃｅｌｌｓ）」および「ＷＢＣｓ」は、上記のような血液循環中に存在するヘモグロビンを含まない有核血球を称するために交互に使用される。
【０００７】
白血球数の測定は、様々な生理学的な不調の検出および監視に重要である。白血球数の異常な上昇は白血病の兆候であり、白血病は、骨髄性またはリンパ性血球の抑制されない急増をいう。好中球増加、または好中球数の甚大な増加は、いずれの原因によっても、体内における炎症または組織破壊の兆候である。
【０００８】
白血球は、顆粒または無顆粒のいずれかとして広く分類され得る。顆粒血球または顆粒球は、好中球、好酸球、および好塩基球にさらに再分類される。無顆粒白血球は、単核白血球と時々呼ばれ、リンパ球と単球とに下位に分類される。これらの白血球の二大下位分類（顆粒球および単核白血球）の測定は、白血球２分画（または２分画）と呼ばれるものを構成する。これらの下位分類（好中球、好酸球、好塩基球、リンパ球および単球）の成分の測定は、白血球５分画（または５分画）を形成する。
【０００９】
好中球は、白血球の五大分類のうち最も優勢であり、通常白血球の全数の半分強を構成する。好中球は、細胞質内に顆粒を含むので、そのように命名されており、これらは中性染色液によって染色され得る。これらの血球の寿命は比較的短く、およそ１日以下である。好中球は、身体の免疫反応機構の一環として、侵入するバクテリア、および組織または血液循環におけるその他の外的物質を攻撃しかつ破壊する。
【００１０】
好酸球は、顆粒球のうち好中球の次に優勢であるけれども、一般的に白血球の全数のうち５％未満を占める。好酸球も、細胞質内に顆粒を含み、エオシン染色液によって染色され得る。好中球のように、この好酸球は末梢血において長期間存在しない。好酸球は、アレルギーまたは寄生生物による感染症に通常関連する身体の免疫反応機構において、役割を果たす。
【００１１】
好塩基球は、顆粒球のうち最も稀であり、白血球の五大分類の全てのうち最も稀である。これは顆粒球であるので、細胞質内に顆粒を含み、この場合塩基性（高ｐＨ）染色液を使用することで染色され得る。これらの血球もまた、身体の免疫反応機構における役割を果たすことで知られているけれども、この詳細は確かではない。
【００１２】
リンパ球は、単核白血球の類型のうち最も優勢であり、一般的には白血球の全数の２０〜３０％の間を構成する。リンパ球は細胞質に顆粒を持たず、これらの核は細胞容積の大きい割合を占める。リンパ球の細胞質の薄い領域はＲＮＡを含むように染色され得る。リンパ球は、末梢血において循環し、身体の免疫反応機構の一環としてこの循環から離れ、結局はこの末梢血に戻る。多くのリンパ球は、比較的長命の血球である。
【００１３】
単球は、それ自体、循環する血液中の病原菌と戦う能力をほとんど有していないという未熟な形態のマクロファージである。しかしながら、血管を囲む組織に感染症が存在するとき、これらの血球はこの循環する血液から離れ、この囲んでいる組織に入る。このとき、単球はマクロファージを形成するために、劇的な変化を受け、直径が５倍に増加し、細胞質において大量のミトコンドリアおよびリソソームを生成する。このマクロファージはその後、食細胞活動およびＴ細胞のようなその他の免疫細胞の活性化によって、侵入する外的物質を攻撃する。マクロファージ数の増加は、炎症が体内で発生しているという表れである。
【００１４】
血小板は、全ての哺乳類の種で発見され、ホメオスタシスに関連を持っている。標準的な動物は一般的に１ｌあたり１〜５×１０^１１個の間の血小板を有する。これらの細胞粒子は通常、ＲＢＣｓよりもかなり小さく、１〜３μｍｍの間の直径を有する。血小板は、巨核球の表面から出芽するように形成され、非常に大きい細胞が骨髄において発見され、これらの細胞自身が血液循環に入るためにこの骨髄を離れる。むしろ、これらの芽は摘み取られ、血小板としてこの循環に入る。ＲＢＣｓのように、血小板は核を欠き、したがって再生することができない。機能上、血小板は、血管の小さい穴を塞ぐ、または修復するために、凝集作用をする。より大きい穴の場合、血小板の凝集は血栓形成における初期段階として作用する。結果として、血小板の数および機能は臨床上非常に重要である。異常に低い血小板数は、凝集障害の原因となり得る。
【００１５】
赤血球の数および大きさ、白血球の数、ならびに血小板の数は、総合して全血球数（ＣＢＣ）と呼ばれる。成分割合と表現される、五大分類への白血球の分類は、５分画と呼ばれる。成分割合における二大分類、成熟赤血球および網赤血球への赤血球の分類は、網赤血球計数と呼ばれる。
【００１６】
５分画および網赤血球計数を含むＣＢＣの測定は、多くの病気の診断、探知および治療のために実行される一般的な診断手法である。これらの検査は、世界中の人間および動物臨床研究室で実行される血液分析の大部分を構成する。これらの３つの検査は全て、顕微鏡、遠心分離機、カウントチャンバ、スライド、および適切な試薬を使用することによって実行され得る。しかしながら、これらの検査の手動による実行に必要な技術は稀であり、その訓練に何年も費やす。さらに、これらの各検査の手動による実行に要求される時間は非常に長い。結果として、計測器を介する重要な自動化が、第１Ｃｏｕｌｔｅｒインピーダンス血球カウンタが現れた１９５０年代前半から、この分野において推進されてきた。
【００１７】
インピーダンスカウンタは、食塩水で満たされ、かつ小さな開口部を介して接続された２つのチャンバからなる。この開口部を横断する定電圧のもとで、この開口部を個別に通過する血球が、大量の食塩水を移動させ、したがってこの開口部のインピーダンスを上昇させる。血球の大きさは、この開口部を血球が通過することによって生成される電圧パルスに関係し得る。結果として、血球がこの開口部を通過するとき、その存在と大きさとが、結果として生じる電圧パルスから測定され得る。
【００１８】
インピーダンス技術が発達するにつれて、自動血球カウンタが、ＲＢＣｓ、ＷＢＣｓおよび血小板を、これらの血球分類の異なる大きさを踏まえて、同時に同一の計器で計数することが可能となるように開発された。この自動化は、病院の研究室にとって労働の多大な節約になることを証明した。しかしながら、これらの装置は、白血球の種々の類型の全てを識別することができず、したがって５分画の計数を提供することができなかった。さらに、これらの計器はまた、網赤血球と標準の赤血球とを識別することができず、したがって網赤血球数を提供することができなかった。
【００１９】
フローサイトメトリーは、各種のサンプル、特に生細胞を含むサンプルの細胞内容物を測定する強力な分析方法である。臨床応用において、フローサイトメータは、リンパ球計数および分類、白血病およびリンパ腫の免疫学的特性、ならびに移植組織の交差試験に有用である。ほとんどのフローサイトメトリー技術において、流体溶液中の血球は、通常レーザ光源によって生成される光線を個別に貫流する。光がそれぞれの血球に衝突するので、この光は散乱され、この結果生じる散乱光は、血球の類型を決定するために分析される。この血球にはまた、任意に、蛍光分子に関連した標識を付すことができ、この分子は光が衝突するときに蛍光を発し、これによって血球上の標識の存在を示す。この方法において、血球の表面成分についての情報を得ることができる。このような蛍光の分子の例として、ＦＩＴＣ（フルオレセインイソチオシアネート）、ＴＲＩＴＣ（テトラメチルローダミンイソチオシアネート）、テキサスレッド（スルホローダミン１０１）、およびＰＥ（フィコエリトリン）が含まれる。また、核酸などの血球の細胞内成分を染色することができ、その後蛍光発光によって検出される。このような化合物の例としては、エチジウムブロマイド、ヨウ化プロピジウム、ＹＯＹＯ−１、ＹＯＹＯ−３、ＴＯＴＯ−１、ＴＯＴＯ−３、ＢＯ−ＰＲＯ−１、ＹＯ−ＰＲＯ−１、およびＴＯ−ＰＲＯ−１を含む。
【００２０】
フローサイトメトリーを利用する血球測定は、しばしば２つの別々の測定を用い、一方はＲＢＣｓおよび血小板を測定し、他方はそれほど多くはないＷＢＣｓを測定する。別々に測定する理由は、赤血球が他の血球類型よりも数多く存在するからであり、したがって赤血球が存在する中での他の血球の検出は、赤血球が除去されるか、大量のサンプルが測定されるかのいずれかを要求する。代替的に、これらの血球は、特定細胞の表面抗原の免疫化学的染色、および／または血球類型分画の染色に基づいて識別され得る。したがって、米国特許第５０４７３２１号（Ｌｏｋｅｎ等）において、血球分析の単一ステップ方法は、少なくとも２つの蛍光色素およびこれらの血球を識別するために付された標識を用いる。しかしながら、同一サンプルについて２つの別々の希釈が実行されなければ、この方法は、より数多く存在しない血液成分に関する十分な統計情報を供給するために、大量のサンプルを未だ要求する。
【００２１】
光散乱測定は、血球の大きさを測定し、かついろんな類型の血球を識別するために、フローサイトメトリーにおいて広く使用される。入射光は、血球にインタロゲートする（ｉｎｔｅｒｒｏｇａｔｅ）この入射光の進行線から小さい角度（約０．５°〜２０°）で、血球によって散乱されること、およびこの散乱光の強度は、血球容積に比例していること、が知られている。小さい角度で散乱するこの光は、前方散乱光と呼ばれる。前方散乱光（前方光散乱、または０．５°〜２０°の散乱角度の小角散乱とも呼ばれる。）は、血球の大きさを測定するのに有用である。血球の大きさを測定する能力は、用いられる波長、および光が集められる角度の正確な範囲によって影響を受ける。たとえば、照射波長での強い吸収作用を有する、これらの血球中物質は、この物質を含む血球が期待よりも小さい前方散乱信号を生成して、血球の大きさの過小評価に至らせるので、寸法測定を妨害し得る。また、血球と周囲媒体との間の屈折率の差異もまた、小角散乱測定に影響し得る。
【００２２】
異なる血球の類型は、これらが生成する直角光散乱（または直角側方散乱）の量に基づいて識別される。顆粒球などの高い粒度を有する血球は、リンパ球などの低粒度の血球よりもかなり高い度合いで入射光を散乱する。結果として、前方散乱および直角側方散乱の測定は、赤血球、リンパ球、単球および顆粒球などの血球の異なる類型を識別するために広く使用される。また、好酸球は、直角側方散乱の偏光測定に基づいて、好中球およびその他のリンパ球、ならびにその他の顆粒球から識別され得る。本来、入射偏光した光は、直角に散乱され、偏光したままである。しかしながら、好酸球は、直角に散乱した入射偏光した光に、他の血球よりも大きい度合で偏光を解消させる。この高い偏光解消度は、血液サンプル中の好酸球群の詳細な識別を可能とする。２０００年２月１８日に出願された同時係属中の米国特許出願第０９／５０７５１５号は、血液サンプル中の好酸球を検出するために高角度側方散乱光検出器を用いる、高開口数の改良されたフローサイトメータを開示する。高角度側方散乱光検出器（約１３０°の角度）の使用は、血球群中の好酸球の高い識別能を可能とする。しかしながら、従来の装置と対照的に、同時係属中の米国特許出願第０９／５０７５１５号に記載されたこの装置は、偏光されない入射光を要求しない。米国特許出願第０９／５０７５１５号の全内容は参照によって組込まれる。
【００２３】
米国特許第５４９２８３３号（Ｒｏｄｒｉｇｕｅｚ ｅｔ ａｌ．）は、血球にゴースト試薬を施し、続いて光散乱を測定することによって、赤血球と網赤血球とを識別する方法を開示する。米国特許第５５５９０３７号（Ｋｉｍ ｅｔ ａｌ．）は、有核赤血球（ＮＲＢＣｓ）を計数する方法を開示し、この方法は、まず赤血球を置き、その後有核赤血球を核染色液にさらし、かつ蛍光発光および光散乱を測定することによる。米国特許第５７３３７８４号（Ｓｔｕｄｈｏｌｍｅ ｅｔ ａｌ．）は、光散乱測定が行われる前に１５分から４時間までの間培養された網赤血球染色試薬を用いるという、血液サンプル中の網赤血球濃度測定方法を教示する。米国特許第５８７９９００号（Ｋｉｍ ｅｔ ａｌ．）は、多次元光散乱および蛍光発光測定を用いる、損傷を受けた白血球、有核赤血球および白血球小集団の同時定量分析方法を開示する。米国特許第５８９１７３４号（Ｇｉｌｌ ｅｔ ａｌ．）は、血液の一部を吸引し、かつこれと蛍光試薬とを混合し、その後自動的にこの染色したサンプルをフローサイトメータに通過させ、かつ多角光散乱および蛍光発光を測定する血液サンプル中の血球識別装置を開示する。
【００２４】
サンプル中の血球の数および類型、または血球表面上の標識の濃度に関する有意義な情報を得るため、サンプルは、標準化された血球の群に関連した光散乱、蛍光発光またはインピーダンスの量に標準化されなければならない。また、フローサイトメトリー計器はそれ自身、適切な性能を確保するために校正されなければならない。この計器の校正は、標準的な粒子がこの計器を通過し、かつ結果として生じる散乱、蛍光発光またはインピーダンスを測定することによって、一般的に達成される。フローサイトメータは、標準的な合成物質（たとえば、ポリスチレンビーズ）か、血球またはその他の生物学的物質（たとえば、花粉または染色された核）のいずれかをもって校正され得る。これらの標準化物質は、大きさを極めて均一にされ、かつ蛍光プローブの検出に使用される光電子増倍管の校正に役立つように正確な量の蛍光分子を含むようにされる。しかしながら、この校正手続は、冗長かつ複雑であり、また、正確に実行するために甚大な訓練を要求する。さらに、これらの校正手続は一般的に、分析の初期に一度実行される。計器の変更、すなわちドリフト、またはサンプルの変更は、計器の性能を変更させる。したがって、熟練の手動校正要求を除去する、フローサイトメトリーの自動機械校正を実行する手段の必要性が存在し、この手段は、時間、およびサンプルの相違に伴う、計器の変化を明らかにするために、校正を必要に応じて調整することができ、ゆえに計器の最良の性能が測定サンプルのそれぞれについて達成され得る。
【００２５】
米国特許第５６２７０３７号（Ｗａｒｄ ｅｔ ａｌ．）は、フローサイトメトリーを使用することによって全血サンプルにおける網赤血球および／または白血球の１つ以上の群の絶対数を測定する単一ステップ方法を開示する。この方法は、血液サンプルおよび希釈剤の混合と、その後のフローサイトメトリーによるこのサンプルの分析とを含み、前記希釈剤は、単位容積あたり、固定剤、１つ以上の蛍光血球標識、および既知数の蛍光微粒子を含有する。これらの微粒子に起因する蛍光発光は、これらの血球標識に起因する蛍光発光と識別可能でなければならない。このフローサイトメータは、全ての血球および前記微粒子がトリガーレベルを越えるような蛍光トリガー設定によって運転される。この結果は、これらの微粒子が前記血球標識と識別可能な条件のもとで再分析される。微粒子数および血球数（血球標識数によって測定されるもの）は、その後計数される。血球数および微粒子数は、全血サンプル中の血球の絶対数を算定するために、単位容積あたりの微粒子数およびサンプルの全容積を知って、使用され得る割合を供給する。しかしながら、米国特許第５６２７０３７号に記載された方法は、サンプル毎の血球の絶対数を供給するための２つの分析ステップに基づき、フローサイトメータがサンプルに含まれる微粒子を使用して同時に標準化され得ることを教示も示唆もしていない。
【００２６】
米国特許第５３８０６６３号（Ｓｃｈｗａｒｔｚ ｅｔ ａｌ．）は、フローサイトメータの校正方法を開示し、この方法は蛍光マイクロビーズの複合集団と、マイクロビーズの複合集団のそれぞれに適合したソフトウェアプログラムとを用いる。各マイクロビーズ集団は、少なくとも２つの異なる蛍光マイクロビーズの群を含み、各群は異なる蛍光強度を有する。前記ソフトウェアプログラムは、前記集団内の各マイクロビーズ群の蛍光強度情報を含む。このソフトウェアプログラムは、蛍光劣化に関して蛍光マイクロビーズを監視し、蛍光強度が許容レベル未満に下がるときに操作者に警告する。この方法は、フローサイトメータ間の差異に起因する測定上の変動性を低減または除去するために、サンプルを自動的に標準化する手段を提供しない。
【００２７】
米国特許第５４５１５２５号（Ｓｈｅｎｋｉｎ等）は、サンプル中の血球の全数を検出する方法を開示し、この方法はサンプル容積の既知を要求しない。この方法は、血液試料がフローサイトメータにおいて検査される前に、血液試料に加えられる既知数の分離した粒子を用いる。この加えられた粒子と血球とを計数し、かつ計数された粒子数を加えられた粒子数と比較することによって、血液サンプル全体の血球数が、測定サンプルの容積を測定する必要なく測定され得る。この測定サンプルの容積が未知であるので、この開示された方法は、適切なサンプルの希釈がなされたかどうかを測定することができない。さらに、この方法は、フローサイトメータの差異に起因する測定上の変動性が低減または除去されることを確保するために、前記計器を校正する自動手段を開示していない。
【００２８】
血球の光散乱特性を利用するフローサイトメトリー技術は、ＣＢＣ測定と一緒に白血球分画分析を実行するために、１９７０年代前半に始めたＴｅｃｈｎｉｃｏｎによって応用された。自動化された網赤血球分析は、１９８０年代にＢｅｃｔｏｎ−ＤｉｃｋｉｎｓｏｎおよびＣｏｕｌｔｅｒ蛍光フローサイトメトリー装置において開発された。しかしながら、これらの初期の装置は、ＣＢＣまたは白血球分画を実行していなかった。結局、Ｔｅｃｈｎｉｃｏｎ（Ｂａｙｅｒ）、Ｃｏｕｌｔｅｒ（Ｂｅｃｋｍａｎ−Ｃｏｕｌｔｅｒ）およびＡｂｂｏｔｔのような製造者は、Ｔｅｃｈｎｉｃｏｎ（Ｂａｙｅｒ）Ｈ^＊３、Ｂａｙｅｒ Ａｄｖｉａ１２０、Ｃｏｕｌｔｅｒ ＳＴＫＳ、Ｃｏｕｌｔｅｒ Ｇｅｎｅｓｉｓ、ならびにＡｂｂｏｔｔ ＣｅｌｌＤｙｎ３５００およびＣｅｌｌＤｙｎ４０００などの高性能血液学装置において、網赤血球数と自動化されたＣＢＣまたは白血球分画装置とを合体させた。これらの計測装置は、患者の評価にとって臨床学的に重要な完全血液学的分析のための全ての数値、すなわちＣＢＣ、白血球５分画および網赤血球数を測定する能力があった。しかしながら、これらの計器は一般的に、複雑かつ高価な光学装置を用いる。さらに、高性能血液学装置は高処理能力機械であるよう設計され、したがって複数の種々の試料サンプルがしばしば同時に処理され、処理および分析の種々の組合せを要求する。赤血球および白血球の分析は、異なる試薬装置を要求し、かつ完全に異なる液圧路を要求する方法でたいてい最適化される。結果として、赤血球および白血球の分析を両方同時に実行するために、完全に分離かつ識別した液圧路が、サンプルの類型それぞれに関して作成される。この複数の同時サンプル液圧路の組合せは、多数のバルブ、真空ライン、反応チャンバ、注射器などの使用に起因して、望ましくない高い複雑性を生み出す。
【００２９】
加えて、相当量の訓練がこれらの計器の正確な使用方法を学ぶために要求され、かつこれらの計測装置は少なくとも１年に数回の修理を要求する。結果として、これらの高性能計器の購入、使用および維持に関連する高いコストが、小さい診療所および医院にこれらの計器を財政的に利用困難にしている。医師は商業研究室を利用することでこれらの計器を利用することができ、これらの研究室は診療所または医院から血液サンプルを受取り、このサンプルを高性能血液学装置による分析のためにこの研究室まで返送する。その後、この結果は医師に送付される。この工程は、とても時間を費やし、少なからず、医師は少なくとも翌日までにこの結果を得ることはないであろう。
【００３０】
したがって、もし医師が完全な血液学的評価（ＣＢＣ、白血球５分画および網赤血球数）を望むならば、医院内の研究室は手動の方法のある組合せを使用しなければならない。限定された白血球分画と全血球数とを実行するインピーダンスカウンタのような計測器は、これらの医院内研究室で利用可能であるけれども、白血球５分画および網赤血球計数を行う装置は無い。したがって、これらの数値を得るために、手動の方法が用いられる。しかしながら、これらの手動の方法は、遅く、多大な労働力を要し、かつ操作者がミスしがちである。
【００３１】
診療所および医院に利用可能な低性能インピーダンスカウンタは、Ａｂｂｏｔｔ １２００、ＡＢＸ Ｍｉｃｒｏｓ、およびＳｙｓｍｅｘ Ｋ−２１のような装置を含む。高性能血液学装置がフローサイトメトリー技術とその他の進歩とを合体することで改良された一方で、これらの低性能装置に使用されるこの技術はわずかに変化した。これらの低性能装置は、適切な半導体マイクロエレクトロニクスの組込みによって、よりコンパクトかつ効果的にされた。しかしながら、結局これらの装置は１９７０年代後半および１９８０年代前半に臨床研究室によって使用された前記Ｃｏｕｌｔｅｒの計器と機能的に差はない。特に、これらの計器は、白血球５分画をいまだ実行することも、網赤血球計数を実現することもできない。
【００３２】
小さい診療所および医院において使用される低性能インピーダンスカウンタは一般的に、より大きい研究室を意図した大量の試薬パックを使用する。これらの計器で実施されるサンプル数は、これらの計器に対応した研究室と比較して少ないので、大量の試薬が起動および停止サイクルの実行、ならびにサンプル間の装置洗浄において無駄となる。したがって、どれだけの患者のサンプルを使用者が試薬パックから入手するかを予測することが不可能である。結果として、この使用者は手元に過剰な量の試薬を維持しなければならず、相当の度合いの試薬の無駄を不可避的に招く。また、これらの計器の液圧技術は、一般に高性能実験装置よりは複雑でないけれども、チュービング、多数のバルブ、真空ポンプ、および血球計数に使用される小さい寸法の装置に関連した信頼性を同じく問題とする傾向がある。したがって、診療所および医院における適用に関して、低性能インピーダンス計器は、完全な血液学的分析に必要な結果を実現するのにひどく不十分であり、試薬を非常に無駄に使用し、かつ高性能生物学的流動体分析装置に関連した同一の信頼性の問題を継承する。
【００３３】
小さな研究室および医院の臨床血液サンプル分析の要求に対処するために、いくらかの試みがなされたけれども、これらの努力は限定的な成功にしか遭遇しなかった。たとえば、Ｂｅｃｔｏｎ−Ｄｉｃｋｉｎｓｏｎによって開発されたＱＢＣ（登録商標）技術は、フローサイトメトリーもその他の高価な技術も要求しない。要求される唯一の可動部は、特大かつ精密に孔あけされた毛細管において、層に対して血液の細胞成分を強制するための遠心分離機である。この毛細管の内部には、寸法および濃度の特徴に関して精密に製造されたプラスチックの「フロート」が白血球および血小板の層内部の濃度均衡を確立し、これによってこれらの層を１０の層に拡大する。このことは、血小板数、白血球数、および白血球２分画（顆粒および無顆粒）の完全に正確な試算、ならびに赤血球容積率の非常に正確な測定を可能とする。このＱＢＣ装置は、いずれの液体試薬も利用せず、したがって非常に信頼できる。この方法はまた、単位投与量方法でもあり、単一の毛細管およびフロートがそれぞれの分析に使用される。結果として、無駄な試薬は存在しない。
【００３４】
ＱＢＣ（登録商標）技術は、診療所内の使用者のために信頼性および試薬の無駄の問題を対処する一方で、ＣＢＣに関して要求される数値の供給がかなり不十分であり、完全な分画を実現せず、網赤血球を数量化しない。また、ＱＢＣ装置によって出された数値の精度および正確度は、赤血球容積率を除いては、低性能インピーダンス装置よりも悪い。したがって、高割合の患者の治療に影響する判断にあたって臨床医および医師に信頼される数値を出す能力を有する、高価でない生物学的流動体分析装置の重大な必要性は残ったままである。
【００３５】
診療所内の設置条件において低性能インピーダンス計器の能力を超える血液学的数値の要求に対処するために、いくつかの主要な要因が対処されなければならない。高性能血液学装置に関連する寸法、コスト、複雑性が低減されなければならず、同時に多数の完全な血液分析を実現する能力が維持されなければならない。高性能血液学装置のコストおよび複雑性に寄与する主要な副装置は、光学設計および流体処理装置、ならびに試薬装置である。
【００３６】
レーザ光学装置の寸法を縮小するために、ガスレーザより優れたレーザダイオードの組込みが全体のパッケージ寸法を相当縮小する。さらに、レーザダイオードはレーザ装置のコストを軽減する。しかしながら、レーザダイオードは、ガスレーザの光学特性を有しない。このレーザダイオードは非点収差であり、「モードホッピング」と呼ばれる、温度に依存したノイズ領域を有する。このモードホッピングノイズは、血小板のような小さい粒子の検出を非常に困難にさせる。穏やかな熱領域に、レーザダイオードの温度を制御することは、このモードホッピングの問題を緩和し得る。これは、熱電冷却器などの種々の温度フィードバック装置によって達成されることができ、この熱電冷却器は非常に狭い温度範囲でダイオードレーザの温度を保つ。しかしながら、いずれの類型の温度制御も、特にレーザダイオード自体が熱源であるので、コストがかかる。したがって、ダイオードレーザの作動活動は、熱均衡が達成されるまでモードホッピング効果を生じさせ、この熱均衡には５〜１０分かかる。
【００３７】
前記レーザ光源以外に、フローサイトメトリー型計器のためのビーム整形および集光光学素子に関連して、かなりのコストおよび複雑性が存在する。
【００３８】
ビーム整形光学素子は一般的に、円形のガウスレーザビームを取り込み、出力分布が所定の領域より強くかつ均一に分布される楕円を創出することを目的としている。多くの血液学装置は、ガウス曲線の末端を開口によって遮断することで平行の通路を使用する。これはトップハット効果を生み出し、この効果は、所定の領域を越える均一性を与え、かつ流体の制御およびレーザポインティングの安定性の要求を軽減するけれども、血球における出力密度を犠牲にする。さらに、飛行時間測定に有用な、寸法上、下位の細胞（４μｍ未満）の非常に細いビームを生じさせるために、従来の方法は、最初のレーザビームをまず拡張し、その後小さな点サイズに集中される。この拡張ステップおよび集中ステップの両方は、レンズ、ビームスプリッタおよびミラーなど、様々な光学素子を使用して達成される。これらの場合において、相当のコストが多くの光学素子を備えることで課せられる。これらの素子それぞれを製造する高いコストに加え、それぞれの光学素子が各自空間にしっかりと保持され、かつ丁寧に揃えられる必要があるという点で、さらなるコストが課される。
【００３９】
フローサイトメトリー装置における集光光学素子は、ビーム整形光学素子よりも一層複雑である。これは、ほとんど全ての応用例において、２つ以上の光測定がなされるからである。これを達成するために、２つ以上の検出源が必要とされる。それぞれの検出器は、所定の領域からこの検出器に対して光を案内するいくつかの光学素子を必要とする。前記ビーム整形の場合のように、相当のコストが多数の光学素子の必要性によって課され、これらの素子のそれぞれは空間に保持され、かつ丁寧に揃えられる必要がある。
【００４０】
本装置は、フローサイトメトリーに基づく高レベルの信頼性を有する血液学装置であり、少なくとも全血球数（ＣＢＣ）、白血球５分画、および網赤血球を測定するために、非常に少量の方法試薬を利用する。
【００４１】
本発明の装置は、完全な血液学分析を実現可能である一方で、先行技術の欠点を有しない装置をともに生み出すという選ばれた特徴の集合を用いる。この装置は、血球または粒子と相互に作用した後、レーザ光源から放射された光の収集に関するレンズレス光学検出装置を含むフローサイトメータである。レーザ光源は、同時係属中の米国特許出願第０９／＊＊＊＊＊＊＊＊号において開示されているような、細い線を生じさせるよう形成された標準的なダイオードレーザ光源である。このレーザ光線の形状は、散乱光の検出に良く適している。さらに、この装置の信頼性は、可動部を全く含まず、レンズを全く要求しない光検出器アレイの使用によってさらに高められる。この光検出器アレイは、前記散乱光が検出可能であり、かつこの収集されたデータが完全な血液学分析を提供するようにされ、この場合、高開口数の技術とともに使用される。最後に、この装置は、血液サンプル分析のために反応チャンバ、混合チャンバ、および廃棄物チャンバとして作用する消耗試薬管の独自の装置を使用する。この消耗管はラテックス粒子またはその類似物（固定血球）を組入れ、これはサンプルの処理の間になされる希釈が正確に実行されたことを保証するための内部標準として作用する。これらの消耗管の使用は、より少ない無駄、ならびに大きく改良された結果の正確性および妥当性を生じさせる。
【００４２】
したがって、本発明の１つの目的は、フローサイトメータに関するレンズレス集光装置を提供することである。
【００４３】
本発明の別の目的は、フローサイトメトリー用多目的血液サンプル反応槽を提供することであって、この反応槽は、閉じられた管と、この閉じられた管中の既知数の粒子であって、前記粒子のそれぞれが、複数の既知の光散乱チャネルの１つに該当するようないくつかの直径のうち１つを有する粒子と、少なくとも１つの試薬とを含む。
【００４４】
本発明の別の目的は、血液サンプルまたは血液由来のサンプルを分析する方法を提供することであって、この方法は、前記血液サンプルまたは血液由来のサンプル、および閉じられた反応槽において既知数の粒子であって、複数の既知の光散乱チャネルの１つに入るようないくつかの直径のうち１つを有する粒子を含むこの閉じられた反応槽中の試薬を混合するステップと、前方光散乱および側方光散乱を測定して、かつこれらの測定を前記粒子に関して得られた値と比較することによって、前記粒子を使用して前記サンプルを標準化するステップと、前記サンプルから血球を計数しかつ分粒するステップと、前方光散乱および側方光散乱をこのサンプル中の各血球から測定するステップと、光散乱信号に基づいて血球を分類するために前記散乱光を分析するステップとを含む。
【００４５】
本発明の別の目的は、サンプル中の生物細胞を分類かつ計数するためのフローサイトメトリー装置を提供することであり、この装置は、消耗管であって水溶性の検査液における、複数の既知の光散乱チャネルの１つに該当するようないくつかの直径のうち１つを有する既知数の粒子と、少なくとも１つの試薬とを含む消耗管と、溶血剤管であって、前記サンプル中の白血球を実質的に無傷のままにする一方で、前記サンプル中の赤血球を溶解する能力を有する少なくとも１つの溶血試薬を含む溶血剤管と、シース管であって、サンプル希釈試薬とフローサイトメトリー用シース試薬と前記フローサイトメトリー装置の液圧路用洗浄試薬とを含むシース管と、フローセルと、液圧装置であって、前記サンプル、前記消耗管、前記溶血剤管および前記シース管の内容物を混合し、かつ結果として生じる１つ以上の混合物を前記フローセルに通過移動させる能力を有する液圧装置と、ダイオードレーザであって、前記フローセル中の血球を照射する光を生じさせるダイオードレーザと、レンズレス光モジュールであって、２つ以上の前方散乱角度範囲で散乱した光を収集する能力を有する第１の部分、および高開口数で散乱した光を収集する能力を有する第２の部分を有するレンズレス光モジュールと、信号処理装置であって、前記レンズレス光モジュールの第１の部分および第２の部分から生成された１つ以上の信号を分析し、かつそこからのデータを生成する能力を有する信号処理装置と、前記データを分析するためのデータ処理装置とを含む。
【００４６】
本発明の上記およびその他の目的、特徴ならびに利点は、添付図面と併せて読まれる以下の記載から明らかになるであろう。
【００４７】
図１は、本装置の液圧技術の概略図であり、装置バルブ（１，２，３，４，５）、注射器（６，７）、大量試薬瓶（８，９）およびその他の本装置の主要構成部分を示す。
【００４８】
図２は、光検出装置において使用されるフローセルアセンブリの図面である。これは、レーザが血球と相互に作用する石英流路（２２）を層流が通過することを可能とする、３つの管口（２０，２１，２３）を含む。
【００４９】
図３Ａおよび図３Ｂは、レーザビーム整形光学素子の概略図である。図３Ａは平面図であり、図３Ｂは側面図である。剥き出しのレーザダイオード３０は、２つの別々の軸に発散する光を放射する。コリメータレンズ３１は両方の軸における発散を除去し、レンズ３２を照射する。レンズ３２は、レーザビームからのほぼ全ての光が前記流路２２の幅を通過し得るように、１つの軸に前記ビームを集中するために作用する。Ｗはこの幅を表す。第３レンズ３３は、Ｗにおいて鋭い集中を形成するように、３２とＷとの間に導入される。レンズ３３の焦点は、レーザ光と、所定の粒子または血球との所望の交点である。レンズ３２の焦点は、散乱数値を測定する光検出器の所望の配置面であり、これはレーザが軸上で最小の点に集光した位置である。
【００５０】
図４は、血球検出装置の説明図であり、２２を通って流れる血球または粒子を示し、この２２は、いずれの集光または結像レンズもなしに、少なくとも２つ、好ましくは４つのフォトダイオード検出器の周囲空間に保持される。これらの検出器は、直角散乱４２、低角度前方散乱４５、軸方向光損失または消光４４、および高角度前方散乱４３を収集する。レーザ光は、４１を介して２２に照射され、この４１は図３のビーム整形光学素子を含む。
【００５１】
図５は、レーザの前方における３つの独立した光測定に対応するフォトダイオードマスクの図面である。低角度前方散乱は５１によって、軸方向光損失は５２によって、および高角度前方散乱は５３によって遮蔽される。好ましい実施形態において、これらの３つの領域は、所望の形態のみが半導体物質の作用部分である、半導体物質からなる単一の製造物５０に存在する。その他の方法は、３つの別々のフォトダイオードの上に設置され得る金属製マスクである５０を含む。
【００５２】
図６は、システムサイクルにおいて前記消耗管内で起こっていることを概略的に示す図である。消耗管６０は少量の方法試薬で始まり、これに対して６を経由する正確に計量された全血、またはその他の未知の物質が、８から７を経由する装置シース流体とともに液圧針１１を通して加えられる。これは６０を作り、この６０は、その後図４の光学素子を通って分析される。６２を作るために、より多くの全血、またはその他の未知の物質が、この消耗管に加えられる。白血球を分析するために、細胞溶解物質およびシース流体が、６３を作るために加えられ、この６３はその後図４の光学素子を通って分析される。最後に、この液圧ラインは、６４を作るために前記消耗管に逆流させることによって洗浄され、このときこの６４は廃棄管となる。
【００５３】
図７は、図６において示された管を移動させる管配置アセンブリの図である。４つの試験管が同時に保持され得る。スロットＡは、全血の患者サンプルまたはその他の種類の適切な試料のために用いられる。スロットＢは、図６に描かれた前記消耗管のために用いられる。スロットＣは、溶血剤を含む管用であり、この管は、消耗管の大量の実施（一式あたり２０よりも多い消耗管、理想的には５０の消耗管）のために、スロットＣにおいて本装置上に止まる。スロットＤは、搭載洗浄剤管用であり、これはまた、正確に装置起動時の流体の状態にするために、起動管として作用することをも目的としている。
【００５４】
図８は、混合および貫通アセンブリの図面である。図６に描写された希釈を達成するために、図７の管スロットは、前記針１１および１２が停止された試験管の中にモータ８１によって同時挿入される貫通位置の間に、移動される。流体が注射器６または７によって針１１を通って管に注入されるとき、針１２は、大気圧で存在する空気フィルタ１３に対して圧力変化を発散する。一旦この新しい溶液が前記消耗管において作られると、図７の搬送体は、８０の下にこの消耗管を移動させ、これによって８２を含むいくつかのモータの使用を通じて、この消耗管は混合され、溶液の内部を均質にする。
【００５５】
図９は、図１の好ましい実施形態の図面である。種々のブロックは、適切な液圧路を備えたバルブを保持し、かつ前記注射器および前記モータ駆動機構を結合する。
【００５６】
図１０は、本装置の実施形態から得られた赤血球（Ｃ）、血小板（Ｐ）、およびラテックス（Ｂ）のヒストグラムデータを表示している。図１０Ａは、ｘ軸（０〜１０２３、または８ビット）上のデジタル化された高角度前方散乱チャネル４３に対する、個別のチャネルそれぞれに関して収集されたイベント数（または発生数）のヒストグラムデータを表示している。図１０Ｂは、消光または軸方向光損失チャネル４４の表示であることを除いては、同一のデータランを示す。図１０Ｃは、直角散乱チャネル４２の表示であることを除いては、同一のデータランを示す。図１０Ｄは、飛行時間またはパルス幅測定を示すことを除いては同一のデータランを示す。パルス幅測定は、光検出器を利用するその他のいずれのチャネルからもなされ得るけれども、消光４４または低角度前方散乱４５のいずれかを使用することが好ましい。
【００５７】
図１１は、散布図形式であることを除いては、図１０と同一の赤血球、血小板およびラテックスのデータを表示している。散布図は、ｘ軸上に示された１つの測定から、ｙ軸上に示された他の測定に対して、血球または粒子から同時に収集されたデータ表現を容易にするものである。ラテックス粒子は、図１１Ａ中のＡおよび図１１Ｂ中のＢにおいて識別可能である。
【００５８】
図１２Ａは、３つの群を明確に示す前記消光チャネルに関する白血球のヒストグラムデータを表示しており、Ａはリンパ球、Ｂは単球、Ｃは顆粒球である。図１２Ｂは、ラテックス粒子を組み込んだデータランであることを除いては、同一の患者サンプルを示す。先と同様に、Ａはリンパ球、Ｂは単球、Ｃは顆粒球である。このラテックス粒子はＤで示され、白血球と容易に識別可能である。図１２Ｃおよび図１２Ｅは、ラテックス粒子を加えることなく、低角度前方散乱（１２Ｃ）および直角散乱（１２Ｅ）の数値に関して、同一の患者サンプルを示す。図１２Ｄおよび図１２Ｆは、ラテックス粒子を加えて、低角度前方散乱（１２Ｄ）および直角散乱（１２Ｆ）の数値に関して、同一の患者サンプルを示す。
【００５９】
図１３Ａおよび図１３Ｂは、散乱図形式であることを除いては、図１２Ｂ、図１２Ｄおよび図１２Ｆと同一の白血球およびラテックスのデータを表示している。
【００６０】
図１４は、本装置の実施形態から得られた直角散乱（図１４Ａ）および消光（図１４Ｂ）に関する赤血球および網赤血球のヒストグラムデータを表示している。
【００６１】
図１５は、図１４Ａおよび図１４Ｂにおいて示されたような同一のサンプルから得られた赤血球および網赤血球の散乱図データを表示している。ここにおいて、相互に対して表示する場合、前記消光（ｙ軸）および前記直角散乱（ｘ軸）が、成熟赤血球の主要な群に関して、網赤血球の分離を示している。１．７２％の網赤血球の値は、１．６０％の手動の基準方法と見事に一致している。
【００６２】
図１６は、直角散乱（図１６Ａ）および飛行時間またはパルス幅（図１６Ｂ）に関して、本装置の実施形態から得られた白血球分画のヒストグラムデータを表示している。
【００６３】
図１７は、図１６Ａおよび図１６Ｂにおいて示されたような同一のサンプルから得られた白血球分画の散布図データを表示している。ここで、相互に対して表示すると、前記消光（ｙ軸）および前記直角散乱（ｘ軸）は、白血球分画のうちいくつかの部分の分離を示している。Ａで示された領域はリンパ球を示し、Ｂで示された領域は単球を示し、Ｃで示された領域は好中球（顆粒球の下位集合）を示し、Ｄで示された領域は好酸球（顆粒球の別の下位集合）を示す。Ｄの中に存在する好酸球は全体の２０．６３％を占め、これは２１．７０％の好酸球の基準方法と見事に一致する。
【００６４】
図１８は、血液の存在なしに、６１に代表される網赤血球色素溶液の分光光度計走査を表示している。
【００６５】
図１９Ａは、溶解した全血溶液の分光光度計の走査を表示し、ヘモグロビンの基準方法（シアンヘモグロビン）に関して５４０ｎｍにおいて読取られる。図１９Ｂは、溶解した全血溶液の分光光度計の走査を表示し、ヘモグロビンに関して５４０ｎｍにおいて読取られる場合、オキシヘモグロビンを示し、５８０ｎｍにおいてはデオキシヘモグロビンを表す。
【００６６】
図２０は、希釈された全血溶液の分光光度計の走査を表示している。
図２１は、溶解した全血および網赤血球色素溶液の分光光度計の走査を表示している。
【００６７】
図２２は、希釈された全血および網赤血球色素溶液の分光光度計の走査を表示している。
【００６８】
図２３は、単一モードで動作するダイオードレーザ（図２３Ａ）および高周波数で動作する同一のレーザ（図２３Ｂ）のスペクトラムアナライザの出力を表示している。図２３Ａにおけるピークは、多くの異なる周波数において高レベルのノイズを示す。これに関する基準線が優れている一方で、高周波数ノイズピークは消光測定およびレンズレス散乱光集光装置を実行しようとするときに重大な問題を生じさせる。この正味の効果は、誤ったイベント数の計数、およびパルス高または領域の不正確な数量化である。図２３Ｂにおいて高周波数変調されたレーザの帯域は、基準線のレベルは低くないけれども、高いスパイクがない。これは正確な消光の数量化の可能性、およびその他のチャネルに関するレンズレス集光装置の実行に役立つ。
【００６９】
図２４は、定力駆動されたレーザダイオードまたは単一モード、および高周波数変調によって駆動された同一の装置に関する温度に対する、ノイズのプロットを表示している。これは、定力で駆動される単一モードレーザが、ある温度範囲において、高周波数変調されたレーザのノイズレベルまたはそれ未満のレベルを達成し得ることを示す。したがって、高周波数変調または温度制御されたレーザは、正確な消光の数量化およびその他のチャネルに関するレンズレス集光装置の実行を可能にする能力がある。温度を制御するコストがレーザを振動（変調）するコストよりもかなり高いので、好ましい実施形態は高周波数変調である。
【００７０】
図２５は、システムエレクトロニクスのブロック図である。
図２６は、信号処理エレクトロニクスのブロック図である。
【００７１】
本発明は、少なくとも全血球数（ＣＢＣ）、白血球５分画および網赤血球数を測定する能力を有するフローサイトメトリーに基づく血液学装置を開示する。本装置は、高レベルの信頼性を有し、かつ非常に少量の方法試薬を利用する。本装置は、構成が非常に安価であり、さらに重大なレベルの操作者の訓練を必要とせずに使用可能である。本装置は、特に、迅速にかつ安価に大量の血液サンプルを分析することができ、それぞれのサンプルに関して完全な血液分析を提供することができる計器を必要とする環境における使用に良く適している。このような環境は、たとえば診療所、医院および獣医院を含む。
【００７２】
本発明のフローサイトメトリーに基づく血液学装置は、光学的標準化のために、かつ前記計器が正確に希釈を実行しているかどうかを検査するために使用される基準粒子を含む消耗管を用いて、独自のレンズレス光検出装置を組合せる。本装置はまた、本装置の動作の成功に重要である特定のビーム形状を備えたダイオードレーザを用いる。フローサイトメトリーに基づく装置における生物粒子分析のためのダイオードレーザの使用は、定期的にノイズ現象を示すこれらの装置の傾向に起因して、従来は概ね敬遠されてきた。本願発明者は、このような問題が以下により詳細に検討される高周波数変調技術の使用によって克服され得ることを発見した。これらの要素の組合せは、フローサイトメトリーに基づく既存の血液学装置よりもコストがかなり低く、かつ信頼性がかなり高い装置を創出し、この装置は、蛍光発光または光吸収測定の必要なしに、少なくとも全血球数（ＣＢＣ）、白血球５分画および網赤血球数を測定し得る。しかしながら、本発明の装置は、ここにおいて記載したような１つ以上の所望の数値を測定するために蛍光発光または光吸収測定を組込むことを除外しない。
【００７３】
（消耗管）
本発明のフローサイトメトリーに基づく血液学装置の部品として考慮される第１の品目は、消耗管である。それぞれの消耗管は、計器に配置された他の全ての管に適するように、独自のコード化されたラベルを備える。好ましくは、このコード化されたラベルは、バーコードラベルである。この消耗管は、計数量化検査および光学標準化に使用される１つ以上の識別可能な類型の粒子を含む。試薬のそれぞれのロットが、定数の基準粒子とともに消耗管に等分される。このような基準粒子は、本技術分野において知られており、たとえば花粉粒子、固定血球、またはラテックス粒子になり得る。
【００７４】
本装置に適切な粒子を選択する手掛かりは、その粒子が光学的測定軸のうち少なくとも１つにおいてサンプルの対象血球を識別可能でなければならないということである。ラテックス粒子は細胞成分と異なる屈折率を有し、多くの寸法のラテックス粒子は商業的に利用可能である。４．１μｍの粒子の場合、これらの粒子は、消光（ＥＸＴ）、低角度前方光散乱（ＦＳＬ）および直角散乱（ＲＡＳ）のチャネルにおいて赤血球および血小板と識別される一方、高角度前方光散乱（ＦＳＨ）および飛行時間（ＴＯＦ）のチャネルにおいて赤血球と重複する。機能的には、軸において基準粒子がこの上なく分離していることは問わない。前記５つのチャネルのうち少なくとも１つが分離を示す限りは、粒子の群全体は、いずれのサンプルの細胞成分からも完全に分離してゲーティングかつ分析され得る。
【００７５】
種々の異なる種から固定された赤血球は、しばしば基準粒子として用いられる。これらの血球は、赤血球分析中に全てのチャネルで完全に隠され、したがって赤血球の検出および計数における使用に適切ではない可能性がある。しかしながら、これらの血球は、白血球の検出および計数にさらに使用可能であり、固定工程が組織の溶解を免除するので、白血球分析中に全てのチャネルで容易に識別されるであろう。鳥類の種から固定された赤血球は有核という追加的な特徴を提供するが、この特徴は直角散乱光によって排他的に哺乳類の赤血球とこれらを識別することに役立つ。
【００７６】
内部基準粒子は既知の濃度で使用され、かつ細胞代用物として作用するものである。この代用物は、少なくとも１つの測定技術における計器がサンプルの細胞構成物質からこれを独自に識別し得るような特性を有しなければならない。この細胞代用物は、品質管理目的のために内部サンプルの内部標準として作用する。これは、計器の測定が正確に実行されていること、および全ての希釈が正確になされたことを保証する。この代用物の好ましい実施形態は、ポリスチレン粒子である。しかしながら、花粉、ガラス、固定血球または大きいコロイドのようなその他の粒子が、上記の条件が満たされる限り使用され得るであろう。粒子寸法範囲は、好ましくは約１μｍ〜約１０μｍであり、計器の少なくとも１つの測定軸において血小板、白血球および赤血球とこれらの粒子とを独自に分離するという光学特性を有する。
【００７７】
ポリスチレン粒子は、ＳｅｒａｄｙｎおよびＤｕｋｅなどのいくつかの製造者を通して商業的に利用可能である。好ましい寸法は４．０μｍであり、これは計器におけるデータ収集のいくつかの軸に沿って血液の細胞成分から容易に識別される。この粒子に関する寸法の選択は、粒子濃度を容易に測定することを可能にする。前記消耗管中の試薬システムは、固体割合の測定値（粒子濃度×粒子体積）に敏感であり、したがって、選択される体積が小さいほど、粒子の濃度は高くなり、実施され得る範囲はより広くなる。好ましい実施形態は、１μｌあたり１０，０００個の消耗管中の粒子濃度を有することである。このレベルで、計数される基準粒子のイベント数は、計数される白血球数と同一の範囲内になるであろう。
【００７８】
これらの粒子濃度およびこれらの粒子の光学特性は、基準方法によって測定される。それぞれの粒子類型に関する１μｌあたりの数、それぞれの粒子類型に関する光学的測定のための平均信号、およびそれぞれの粒子類型に関する光学的測定変動係数などの、これらの粒子の特性が得られる。当業者は、要望どおりに、それぞれの粒子類型に関連するその他の数値が本発明の装置において有利に測定され、かつ使用され得ること、および本発明が先に挙げた特定の数値に決して限定されることを意図するものではないことを十分理解するであろう。
【００７９】
この情報から、コード化されたバーコードラベルが、少なくとも以下の数値のうち、いずれか１つ、またはいずれの組合せをも基準にして生成される。
１．検査類型
２．ロット番号
３．使用期限日
４．シリアル番号
５．粒子１の濃度（粒子数×１０^３／μｌと表現される）
６．粒子２の濃度（粒子数×１０^３／μｌと表現される）
７．粒子１のＥＸＴ平均値
８．粒子２のＥＸＴ平均値
９．粒子１のＦＳＬ平均値
１０．粒子２のＦＳＬ平均値
１１．粒子１のＦＳＨ平均値
１２．粒子２のＦＳＨ平均値
１３．粒子１のＲＡＳ平均値
１４．粒子２のＲＡＳ平均値
１５．粒子１のＴＯＦ平均値
１６．粒子２のＴＯＦ平均値
１７．粒子１のＥＸＴＣＶ値
１８．粒子２のＥＸＴＣＶ値
１９．粒子１のＦＳＬＣＶ値
２０．粒子２のＦＳＬＣＶ値
２１．粒子１のＦＳＨＣＶ値
２２．粒子２のＦＳＨＣＶ値
２３．粒子１のＲＡＳＣＶ値
２４．粒子２のＲＡＳＣＶ値
２５．粒子１のＴＯＦＣＶ値
２６．粒子２のＴＯＦＣＶ値
２７．４８８ｎｍでの流体の光学密度
２８．５４０ｎｍでの流体の光学密度
２９．５８０ｎｍでの流体の光学密度
３０．６３５ｎｍでの流体の光学密度
【００８０】
本装置において使用されるそれぞれの粒子類型に関して、基準値の表が生成され、計器に連結されるＰＣに記憶される。この基準値の表は、以下のうち１つ以上の数値を含み得る。
１．粒子数
２．ＥＸＴ平均値
３．ＦＳＬ平均値
４．ＦＳＨ平均値
５．ＲＡＳ平均値
６．ＴＯＦ平均値
７．ＥＸＴＣＶ値
８．ＦＳＬＣＶ値
９．ＦＳＨＣＶ値
１０．ＲＡＳＣＶ値
１１．ＴＯＦＣＶ値
【００８１】
一例として、仮定の４．１μｍのラテックス粒子が粒子７と示される。これらの基準粒子に関連する以下の基準値は、前記ＰＣに記憶され得る。
１．粒子＝７
２．ＥＸＴ平均値＝５２０
３．ＦＳＬ平均値＝４３０
４．ＦＳＨ平均値＝８２４
５．ＲＡＳ平均値＝９４１
６．ＴＯＦ平均値＝２５２
７．ＥＸＴＣＶ値＝３．１
８．ＦＳＬＣＶ値＝２．９
９．ＦＳＨＣＶ値＝４．２
１０．ＲＡＳＣＶ値＝７．９
１１．ＴＯＦＣＶ値＝２．１
【００８２】
また、本装置において使用されるそれぞれの色素に関して、本装置に連結される前記ＰＣの表にも記憶される、関連した特徴を有する光吸収スペクトルが存在する。１ロットあたり、この色素流体は、これらのスペクトル特性の１つ以上の波長、すなわちこの色素の吸収が最大または最小の点である波長、またはこの色素と独自に一致する波長での吸収に関して検査される。一例として、色素を含む試薬が、以下の波長での吸収に関して検査される。
１．４８８ｎｍでの流体の光学密度
２．５４０ｎｍでの流体の光学密度
３．５８０ｎｍでの流体の光学密度
４．６３５ｎｍでの流体の光学密度
【００８３】
６３５ｎｍでの測定は青色色素を検出するのに有用であり、この色素はこの波長での光を吸収する。ヘモグロビンは強力に緑色光を吸収し、したがって５４０ｎｍでの測定はヘモグロビン濃度を測定するために使用される。５８０ｎｍでの測定は、臨床化学検査の生成物を検出するのに有用であり、これらの生成物は黄色光を吸収する。最後に、４８８ｎｍでの測定は、ヘモグロビンも、いずれの広く使用される網赤血球色素も、この波長で吸収し、したがってこの測定の干渉を最小限にするので、真実の校正波長として有用である。
【００８４】
一例として、仮定の新メチレンブルーが、色素３と示され、前記基準表において以下の吸収値を有する。
１．４８８ｎｍでの流体の光学密度＝０．８５
２．５４０ｎｍでの流体の光学密度＝０．６２
３．５８０ｎｍでの流体の光学密度＝０．７３
４．６３５ｎｍでの流体の光学密度＝０．２０
【００８５】
２００１年３月（４ｃ０１）に製造された、２年で期限が切れる（２）ＣＢＣ検査用の第４ロットの管が基準粒子の２つの異なる組を含むと仮定する。この基準粒子の第１の組は表項目７に掲載され、これは１μｌあたり１，２００の粒子濃度での４．１μｍ粒子に当たる（０７１２）。基準粒子の第２の組は表項目２５に掲載され、これは新メチレンブルー溶液における１μｌあたり３２，５００個の粒子濃度での固定血球粒子に当たり（２５３２５）、この溶液は表項目Ｄである（ｄ）。上記の溶液を含む前記消耗管は０〜５０，０００まで順番に並べられる。したがって、以下のバーコードが作成される。
４ｃ０１２０７１２２５３２５ｄ０００００〜４ｃ０１２０７１２２５３２５ｄ５００００
【００８６】
この基準バーコード例はデモ用である。桁数が情報の損失なく著しく減少され得ることは、当業者に明らかであろう。
【００８７】
前記消耗管にこれらのバーコードを付すことは、希釈が正確になされたこと、および全ての光学測定が正確であったことを示すための、個別サンプルにおける品質管理測定の実行に必要な情報を、本装置に供給するであろう。
【００８８】
品質管理測定におけるバーコードデータの使用の一例として、赤血球希釈がなされるとき、前記消耗管の試薬容積は半分に希釈されると仮定する。したがって上記の例において、赤血球の計数部分の間に固定された血球数は１６，２５０個（３２，５００個／２）でなければならない。もしこの固定血球数が１６，２５０個周辺の許容帯域内でなければ、この計数結果は報告されないであろう。同様に、本装置は前記消耗管内に存在する４．１μｍラテックス粒子を予定しているので、６００個の計数（１，２００個／２）が正確な希釈を確証するであろう。しかしながら、もし不正確な希釈が検出されれば、本装置は、固定血球粒子に関して得られた値を前記ラテックス粒子に関して得られた値と比較し得る。もし、期待値からの相対偏差が、それぞれの粒子測定に関して同一であれば、その後に希釈エラーが疑われる。
【００８９】
本装置はまた、前記表に期待光学値を掲載させることができ、これらは希釈と無関係である。粒子の前記平均値と前記変動係数（ＣＶ値）とのデータ比較は、これらが前記基準表と比較するように、希釈エラーが生じたかどうかの決定を可能にし、かつ光学的配列、レーザ出力安定度および流れ特性に関する洞察力を与える。前記希釈例と同様に、もし、回収された光散乱データが予め定められた許容範囲内で期待データと適合しないならば、いくつか、または全ての血球分類の分析が報告されないであろう。この方法で、正確なエラーメッセージが、正確な修正策を支援するであろう操作者に表示され得る。さらに、本装置は時間にわたるその性能を記録することができ、かつ本装置に傾向を記録するための時間にわたる装置の性能のデータベースを維持することができる。この入手データおよび最近の傾向に基づいて、修理、再校正またはトラブルシューティング技術に関する推奨が、自動的に生成される。
【００９０】
（レーザおよびレンズレス光検出装置）
いずれのフローサイトメトリーに基づく血液学装置からも合理的に正確なデータを得るために、個別の血球または粒子がフローセルの検出領域を個別に通過しなければならない。標準的なインピーダンス血球カウンタを使用してこれを達成するために、前記フローセルの開口の検出領域が大容量（すなわち幅６０μｍ、長さ１００μｍ）なので、全血は通常、およそ１対１０，０００の程度で希釈される。しかしながら、フローサイトメトリーに基づく血液学装置は、典型的な計器の検出領域が通常、幅（中心流）１０μｍ、長さ（レーザビーム高）２０μｍあたりなので、より高い全血濃度で動作し得る。したがって、およそ１対５００〜１対１，０００の程度の全血希釈が使用され得る。
【００９１】
上記の消耗管に関して、理想的な全血希釈は、赤血球の分析に関して１対１００であり、この分析は前記消耗管の容積の２０％未満を利用する。これは、白血球希釈および本装置からの最終の洗浄処理を実行するために、前記管の容積の８０％以上を残す。これを達成するために、前記検出領域は、現在利用可能な方法からさらに圧縮されなければならない。これは２つの方法で達成され得る。第１は、中心流をおよそ幅７μｍで維持するために、質量流量を非常に低く、しかし一定量（１秒あたり０．０５μｌ）に制御する方法である。第２は、レーザビーム高を３μｍあたりに制限する方法である。
【００９２】
これは、係属中の米国特許出願第０９／＊＊＊＊＊＊＊号に記載されているように、ダイオードレーザライン放射装置の使用によって達成された。この装置は、光伝達方向に対して両者垂直である第１および第２の相互に垂直な軸上に方向付けられた光出力を生じる半導体レーザを含む。この装置はまた、前記レーザ光伝搬方向に間隔を置いた第１および第２の焦点部分で前記第１および第２の軸上の前記レーザ出力を集中するような方法で配列される光学装置を含む。前記焦点のそれぞれに交差する面において、その光は、一方の軸の幅および他方の軸の長さを備えた線の中に形成される。
【００９３】
伝統的なフローサイトメータおよびフローサイトメトリーに基づく血液学装置は種々の角度で血球から散乱した光を集める。これらの従来の装置は、前記中心流を投影し、サンプルの細胞成分からの全ての散乱光を集め、その後、集光角度を測定する開口にこの光を通過させる集光レンズを利用する。この濾過された光は、その後光検出器に集中され、この検出器は所望の角度で散乱した光錘全体を集光する。もし、２つ以上の前方集光角度が要求されるならば、ビームスプリッタおよび鏡が別個の光錘を分離するために使用される。直角散乱の集光に関して、従来のレンズは、バックライトのレベルを低く維持する目的で、流れを投影するために使用される。
【００９４】
前記レンズレス設計方法において、検出器は、いずれの付随レンズまたはその他の光学素子もなしに、前記レーザビームを通過する血球によって生じる適切な信号を収集するために空間に固定される。これらの信号は、消光（ＥＸＴ）（０°〜０．５°）、低角度前方散乱（ＦＳＬ）（１°〜３°）、高角度前方散乱（ＦＳＨ）（４°〜９°）、および直角散乱（ＲＡＳ）（５０°〜１３０°）を含む。前記レーザビームの通路から低角度で３つの異なる測定値を集めるために、前記ビーム整形光学素子は、ダイオードレーザ光の２つの焦点を形成する。同時係属中の米国特許出願第０９／＊＊＊＊＊＊＊号を参照されたい。この出願全体が参照によって本明細書に組込まれる。第１の焦点は、前記レーザ光が血球または粒子の前記中心流と交差する面である。この焦点は血球の飛行面に垂直であり、光は、広いビームの細い中心（焦点面）を直角にこれらの血球が通過することに起因して散乱する。
【００９５】
最低の高さ（すなわち前記フローセルを通る粒子の流れ方向の最小寸法）のビームを備えた結果、大量の血球が高濃度で、同時発生からの干渉なしに分析され得る。これは、液体の容積、および大量の液体を処理する必要性を最小限にする。さらに、この配列は前記第１焦点の血球において高い光出力分布を形成し、ゆえに直角散乱（ＲＡＳ）は従来の装置で用いられるものよりも相当安価な検出器を使用して測定されることができる。特に、フォトダイオードは光電子増倍管の使用と交換し得る。この水平の出力分布は、感知可能なドリフトなしに流れがその軸上で遊動することを可能にし、さらに前記フローセル通路と平行に前記光出力分布を維持することによって前記フローセルの端から散乱する光を最小限にする。
【００９６】
前記第２焦点は前記検出器が配置される面に存在する。ここで、前記フローセルからの広いビーム部分は最小に減少され（すなわち集中され）、前記第１焦点を通過した光が拡張し、一定の高さを備えた長い光線を形成する。この長い光線の中で、フォトダイオード検出器は、光レベルが最も大きい点に配置される。これは、消光（ＥＸＴ）検出器であり、血球がレーザビームと交差することで失われる全ての軸方向の光（若干の吸収光および散乱光）を測定する。この測定は、多くの情報を保持するけれども、この情報は高い信号対雑音（Ｓ／Ｎ）比が存在するときに抽出され得るのみである。フローサイトメトリーに基づく血液学装置において従来用いられた前記ガスレーザは強い信号を形成するけれども、これらのレーザに関連した高レベルのノイズが、ＥＸＴ測定の有用性を最小化した。これは、プラズマ管が長いほど前記ノイズレベルは低くなり、したがって前記Ｓ／Ｎ比が大きくなるので、より長いプラズマ管を利用することによって、相殺することができる。ダイオードレーザは、ガスレーザより本質的に低いノイズレベルを有するけれども、定期的な高レベルのノイズを示す。これらのノイズの断続的なバーストは、「モードホッピング」と呼ばれる。わずかな温度または電流変化は、レーザダイオードに、一方の単一モード状態から他方の単一モード状態への急な変化を生じさせる。モードホッピングが生じているとき、消光測定の前記Ｓ／Ｎ比は非常に低く、小さい粒子を測定するために、またはより大きい粒子のわずかな相違を識別するために有用でない。
【００９７】
モードホッピングを排除するために、慎重な温度制御および正確な電流制御が実行され得る。もしこれがなされるなら、それぞれのレーザダイオードが、モードホッピングが生じない平穏な温度または電流の領域を発見するために、個別に特徴付けられなければならない。根気のいる努力が、個別のレーザダイオードそれぞれを理想の温度および電流設定に特徴付けるために課せられなければならない。また、レーザが経年変化するにつれ、前記平穏な温度または電流領域は変化し、かつ前記温度および電流制御を再設定する。さらに、たとえ特定の温度が決定されても、ダイオードレーザは、まず作動されると、自身の熱を生成する。前記ダイオードレーザの温度の温度均衡は、確立するために最大３０分かかり得る。この均衡時間はレーザの耐用年数を減少させる。最後に、温度制御の実行は、装置が使用され得る動作温度を大幅に制限し、重大なコストおよび寸法を比較的安価かつ小さいレーザダイオードに加える。
【００９８】
フォトダイオードレーザを使用して正確な消光測定を達成するために、高周波数変調が用いられ得る。高周波数変調はマルチモード状態で存在するレーザを備えることによって、モードホップを除去する。温度または電流が変化すると、ダイオードの一次モードが変化するけれども、ダイオードレーザが開始のために多くのモードで作動するので、これらの変化はノイズスパイクを全く生じさせない。さらに、この変調周波数は、血球イベントに関する所定の周波数よりも相当大きくなるように選択可能であり、その結果この変調は本装置で読取れない。
【００９９】
高周波数変調は、モードホッピングの対処における温度および電流制御の使用に関連する問題を解決する。高周波数変調装置は、数秒以内に安定し、したがって起動中のダイオードレーザによって生成された温度を制御する必要性はない。したがって、前記レーザ耐用年数は延長される。さらに、温度冷却装置とは異なり、高周波数変調装置は広い動作温度範囲にわたって安定する。高周波数変調によって、穏やかな温度または電流領域を発見する必要性はなく、レーザが経年変化につれて装置を再設定する必要性もない。したがって、ダイオードレーザに関する穏やかな温度または電流領域の発見および維持で被る人件費は回避される。
【０１００】
高周波数変調が、以下の方法でダイオードレーザに課せられる。連続波（ＣＷ）モードで作動するダイオードレーザは、フィードバックに使用される内蔵フォトダイオードを備え、ゆえにこの出力は温度と共に変化しない。この回路は、光出力が一定に維持されるように、レーザのダイオードに対する電流入力を変化させる。１つの実施形態において、このレーザドライバのＣＷ設定値は、レーザの定格出力の２分の１を生じさせるように設定される。次に、正弦波の出力で電流を生じさせるように水晶発振子を使用する変調回路が、ＣＷ電流と「合計」される。結果として、このレーザ出力は、正弦波形状を帯び、この正弦波は、正弦波のピークにおいてはレーザの最高定格出力レベルに近い最高の出力を、および正弦波の最低においてはほぼゼロの出力を備える。
【０１０１】
前記レーザビームが前記検出面における焦点に集光するので、低角度光散乱（ＦＳＬ）は、従来の装置で要求されるようなレンズの必要性なしに、集光するビームの軸から狭い直線距離で拾われ得る。ＦＳＬは、粒子寸法を測定するために使用される。ＦＳＬは、物理的に可能な限り前記ＥＸＴ光検出器に近付けてＦＳＬ検出器を配置することによって測定される。これは別々のフォトダイオードによって、または２つの独立した測定（ＥＸＴおよびＦＳＬ）に関して適切な寸法にされたフォトダイオードアレイによってなされることができる。
【０１０２】
屈折率および粒子の内部複雑性に関する情報は、より高角度の前方光散乱（ＦＳＨ）を使用することによって得られる。この散乱測定は、レーザの軸から測定して、一般に約４°〜９°の辺りでなされる。この測定は、その領域の散乱光を集めるために別々にフォトダイオードを配置するか、または特定の構造に対応する動的要素を備えたフォトダイオードアレイを使用するかのいずれかによって、レンズの使用なしに行われることができる。１つの実施形態において、フォトダイオードアレイは、ＥＸＴ、ＦＳＬ、およびＦＳＨを、全て同一のアレイにおいて測定する能力を有するように構成される。
【０１０３】
本発明の装置において、前記光検出器は単一のチップにおける光アレイの形式が好ましく、前記検出器は適切な角度で散乱光を集めるために間隔をあけて配向される。この構成は、いずれの集光または結像レンズの要求なしに、３つ以上の独立した測定がなされることを可能とする。前記光検出器アレイはＥＸＴ、ＦＳＬおよびＦＳＨの収集に関して記載されたけれども、このような配列は収集の角度を４０°までの高さにまで拡張されることができた。この値より上では、四角形の流路が、測定を妨害するであろう。
【０１０４】
特定の角度について全てのダイオードの配列を確実にするために、かつ所定の純粋な角度のみを収集するために、光フィルタとして作用するマスクが、別々のダイオードまたは前記フォトダイオードアレイを覆って配置され得る。このマスクは、好ましくは、使用されるいずれの正方形または長方形のフォトダイオードのコーナーを覆うことによって光散乱の真の角度を維持するために、湾曲した形状を有する開口部を備える。前記フォトダイオード上に取付けられた、正確に作られた適切な系所のマスクは、複数のダイオードの組の光学的配列に関する要求を、ＥＸＴ検出器ダイオードの配列のみに削減し、したがって構造および校正を単純化する。このマスクされたフォトダイオードの組は、好ましくは前記消光センサが最高レベルの入射光を有するように、すなわちレーザ光ビームの前記第２焦点に配置される。
【０１０５】
直角散乱（ＲＡＳ）フォトダイオードの位置は、高い開口数を維持するために極めて重要であり、これはレンズの使用なしでのみ達成され得うる。したがって、フォトダイオードは前記フローセルの近くでレーザの面と平行に取付けられる。前記フローセルの一側面に向かって血球または粒子によって直角に散乱したすべての光は、前記ＲＡＳフォトダイオードを交差する。これは、５０°〜１３０°の直角受光角度、または０．９のの開口数（ＮＡ）を示す。
【０１０６】
この高開口数のＲＡＳフォトダイオードは前記フローセルの側面全体を占め、したがって、その他の測定は前記フローセルのこの側面では行われ得ない。しかしながら、前記ＲＡＳ検出器の反対の面はまだ利用可能であり、その他の測定を達成するために使用され得る。前記フローセルのこの側面は、たとえば、蛍光を放射して検出する能力を有する検出器を用いることによって、標準的な蛍光フローサイトメータデータを生成するために使用され得る。この側面はまた、前記フローセルの中央に流れを投影する集光レンズ（低開口数）、蛍光情報のいくらかの軸を分離するためのビームスプリッタおよび干渉フィルタ、検出器に集光するための結像レンズ、ならびに低レベルの蛍光放射を検出するための光電管のうち１つ以上を含む。
【０１０７】
レンズレス光検出装置の使用は、関連する光学素子、たとえばレンズ、絞り、鏡などの必要性を除去する。この結果として生じる光検出装置は、計器内でビームを導くために、このような光学素子に依存する従来の光検出装置よりも、著しく小さく、軽く、安価で、かつ信頼性が高い。
【０１０８】
レンズレス集光装置を使用する欠点は、迷光が検出器に容易に入り込むことである。レンズは、従来は中心流を投影する光を導くために使用され、ゆえに中心流から発散する光のみ検出器に達する。レンズはまた、完全円錐角から集められた光を、小さい光検出器が配置された点に集中するために使用される。相対的に小さな光検出器の使用は、暗電流ノイズを最小にし、このノイズはフォトダイオードの領域に比例している。しかしながら、レンズレス装置は、この装置の全ての検出器における背景光の光レベルを一定に維持するので、暗電流ノイズの基準線は達成不可能である。このフォトダイオードにおける一定の背景光は、信号処理エレクトロニクスにおいて一定の光電流を生成する。この電子的に一定の光電流は、直流、すなわちＤＣに類似し、したがってこのレンズレス装置はそれぞれのフォトダイオードにおいてＤＣ光レベルを生成する。したがって、このようなレンズレス装置によってＤＣ光レベルの寄与を排除することはより難しく、光検出器の暗電流ノイズを最小にすることは不可能である。しかしながら、ＤＣ光が血球または粒子によって生成された信号を妨害しないようにすることが不可欠である。これはサーボフィードバック回路の使用によって電子的に達成され、その結果所望の信号部分（交流、すなわちＡＣ成分）が、ＤＣ光レベルに影響し得る温度変化、レーザ出力変化、またはその他の環境上のもしくは電子的な変化と無関係に、正確かつ再現可能に測定され得る。
【０１０９】
信号が存在しないときに前記出力を基準線の値で保つために、光チャネル（ＥＸＴ，ＦＳＬ，ＦＳＨ，ＲＡＳ）に関連するプリアンプ回路のそれぞれについて局部的なサーボループが存在する。フォトダイオード暗電流、入力バイアス電流、またはオフセット電圧は、プリアンプ回路の出力にオフセットまたはドリフトを生じさせ得る。このプリアンプ回路において使用される２つのフィードバック方法が存在する。第１の方法は、第２段の出力に接続されたゲートを有するＰチャネルＦＥＴからなる。前記ＥＸＴセンサのより大きい暗電流に起因して、電流変換器に対するＦＥＴフィードバック電圧は、第１段のオペアンプの加算接続部において高いインピーダンスを維持するために使用される。このフィードバックレジスタは、第２段の出力において電圧に比例した電流を生じさせる。フィードバックの第２の方法は、前記第１および第２段のオペアンプによってオフセットレベルを低減するために、ある割合の前記信号を第１段のオペアンプに戻すように、積分器として構成されるオペアンプを使用する。前記局部的なサーボループは、低周波数信号を減少させる。式（１）は、前記サーボループが（−３ｄＢ）減衰を行わせるコーナ周波数を測定するために使用され得る。
【０１１０】
式（１）　ｆ_−３ｄＢ＝Ｒ_{ｄｉｏｄｅ} ^＊Ｇ２／（２πＲ_ｔＲ_ｆＣ_ｆ）
ここで、
Ｒ_{ｄｉｏｄｅ}＝第１段の演算増幅器を横断するフィードバックレジスタ
Ｇ２＝第２段の利得
Ｒ_ｔ＝電圧変換レジスタに対する電流
Ｒ_ｆ＝サーボ入力レジスタ
Ｃ_ｆ＝サーボ積分コンデンサ
である。
【０１１１】
（ＨＧＢモジュール）
ヘモグロビン濃度は、５４０ｎｍでの光吸収によって通常測定される非常に一般的な血液学的数値である。この測定を達成するために、赤血球は、通常、溶液２５０部に対して全血１部を含む溶液に溶解される。この溶液はまた、低レベルのシアン化塩（すなわちＫＣＮ）を通常含む。このシアン化物は、全てのヘモグロビン（オキシおよびデオキシ）をシアンヘモグロビンに変化させ、これは５４０ｎｍで最大に吸収する。この吸収測定は従来１．０ｃｍ平方のキュベット（ＮＣＣＬＳ）において行われたけれども、標準からのその他の変形が、基準方法と高い相関性をもって働く。
【０１１２】
従来の血液学的計器において、ヘモグロビン濃度は一般的に別の透明な溶液において測定され、透明な流体を常に基準にされる。赤血球の溶解は、ヘモグロビンが白血球と同じ流路で測定されることを可能にする。代替的に、いくらかの装置においては、ヘモグロビン含有量が別々の通路で測定される。
【０１１３】
本発明の計器において、ヘモグロビン（ＨＧＢ）含有量は従来にない方法で測定される。本発明の方法は２つの別々の測定を伴い、これらは正確なＨＧＢ値を与えるために組合せるだけでなく、本装置が行った希釈の正確性をも証明する。第１ＨＧＢ測定は１部の全血が網赤血球染色液の１００倍に希釈された後に生じる。これは「赤血球溶液」と呼ばれる。この網赤血球染色液は、これと関連する特定の吸収スペクトルを有する。前記赤血球溶液は、マニホールドブロックに吸引される。このブロックは、円筒穴を照らすように構成された少なくとも３つの光放射源を含み、この穴において赤血球溶液が保持される。光検出器は、干渉フィルタを備えるとともに、光源および円筒穴に一直線に配置される。この構成は測定に関して少なくとも３つの異なる吸収波長を可能にする。網赤血球染色液における色素の存在のため、３つの異なる吸収波長が使用される。
【０１１４】
赤血球溶液の最初の吸収測定は、その他の従来の技術ほど正確なＨＧＢ濃度測定を提供しない。しかしながら、この測定値は、全血希釈の正確性の測定に関するデータポイントとして使用される。計器は最初の溶解されなかったヘモグロビン測定を行った後もそのサイクルを継続するので、全ＲＢＣおよび平均血球の容積測定が、この計器のサイトメータ部分でなされる。これは以下の計算を可能にする。
・赤血球容積率（ＨＣＴ）＝ＲＢＣ^＊ＭＣＶ／１０
・平均赤血球ヘモグロビン濃度（ＭＣＨＣ）＝１００^＊（ＨＧＢ／ＨＣＴ）
・平均赤血球へモグロビン量（ＭＣＨ）＝ＨＧＢ／ＲＢＣ
【０１１５】
計器のサイクルが継続するとき、より多くの全血が、細胞溶解試薬とともに当初の溶液に加えられる。この細胞溶解試薬は、赤血球膜を破壊（溶解）し、ＨＧＢを溶液中に開放する。これは１５〜５０部の溶液に対して１部の全血を適切に生じさせ、これは「白血球希釈」と呼ばれる。この白血球溶液は、以前測定された赤血球溶液からの全ての色素を含む。この色素溶液の当初の濃度は、視覚的に透明な流体と、１：１〜１：４の割合で希釈された。
【０１１６】
白血球溶液は、複数の吸収測定がなされる前記マニホールドブロックに吸引され、ＨＧＢ値が算定される。この第２ＨＧＢ値から、前記ＨＣＴ、ＨＣＨＣおよびＭＣＨが再度算定される。このＨＧＢ値に加えて、色素濃度が測定されることができ、前記赤血球溶液から得られた値と比較される。もし、所定の許容範囲内で、前記２つの独立したＨＧＢ（ＨＣＴ，ＭＣＨＣ，ＭＣＨ）測定が適合し、かつこれら２つの溶液間の色素割合が適合すれば、計器は、測定によって、正確に全ての希釈が実行されたことを証明したこととなる。
【０１１７】
白血球ＨＧＢ算定は、ＲＢＣの溶解に起因して、ＨＧＢ濃度の正確な測定をもたらす。赤血球ＨＧＢ算定は、無傷の赤血球膜が光を散乱するので白血球ＨＧＢ算定ほど正確ではない。しかしながら、それぞれの測定における網赤血球染色色素に起因する吸収度の差異の比較は、希釈の正確性の検査を可能にする。換言すれば、溶解されていないＲＢＣを含むサンプル（赤血球溶液）は、前記消耗管中の色素の濃度に基づいた特定の光吸収レベルを有する。サイクルの後半において、溶解した赤血球を含むサンプル（白血球溶液）は、前記色素に起因する光吸収に関して測定される。ＲＢＣおよびＷＢＣ分析に関する液圧通路が共通なので、希釈の正確性が基準溶液を別々にする必要性なしに測定され得る。ＨＧＢ測定の割合の許容範囲は、前記消耗管のバーコードラベル上に印刷されるか、またはＰＣに記憶された割合の表中の値を参照する前記消耗管バーコードラベル上のコードのいずれかから知られる。希釈正確性の第２の検査として、前記２つのＨＧＢ測定はまた、特定の許容範囲内で適合しなければならない。さもなければ、希釈エラーが疑われなければならない。希釈エラーが検出されない唯一の場合は、同一の希釈エラーが両方のサンプルにおいて起こるという極めて実現し難い状況である。
【０１１８】
上記の方法の好ましい実施形態において、前記消耗管上のバーコードは、希釈されていないサンプルに関する色素吸収の期待値での基準情報（ＣＡＬ）を含む。計器は使用時に、それぞれのロット番号に関して、この情報を証明する。前記第１の希釈の後、赤血球溶液は、第１組の期待範囲内に入る色素吸収値およびＨＧＢ濃度値を有しなければならない。これらの範囲は、ＣＡＬと第１の希釈係数（Ｄ１）との積でなければならない。前記第２の希釈の後、白血球溶液は、第２組の期待範囲内に入る色素吸収値およびＨＧＢ濃度を有しなければならない。これらの範囲は、ＣＡＬ、Ｄ１および第２の希釈係数（Ｄ２）の積でなければならない。測定の両組が前記許容範囲内である限り、これらの測定結果は関連するエラーメッセージなしに報告される。
【０１１９】
（試薬）
血液サンプルの細胞組成を測定するとき、本発明の計器は、第１に少なくとも２つの方法試薬と、第３の装置試薬とを用いる。これらの３つの試薬は第１に血小板および赤血球を計数しかつ分類するために一緒に使用され、それからさらなる試薬操作の後、白血球を計数しかつ分類する。この計数および分類は２つの別々の段階で行われ、これら２つの段階それぞれにおいて血液と試薬との混合物がフローサイトメータを通過し、サンプル中の血球が識別されかつ計数される。
【０１２０】
ＲＢＣまたは網赤血球方法試薬と示される１つの方法試薬が、「消耗管」と称される標準的な蓋付き試験管の中に配置される。この消耗管は以下のものを含む。
・１ｌあたり０．１〜０．５ｇの濃度範囲の新メチレンブルー。この成分は、網赤血球中の残余のＲＮＡを青色に染色するのに役立つ。好ましい濃度は、１ｌあたり０．３ｇ。
・１ｌあたり０．１〜０．６ｇの濃度範囲のＰｌｕｒａｆａｃ−Ａ−３９−Ｐｒｉｃ。この成分は、球状の血球を形成するために、血球膜と内部のヘモグロビンとに相互に作用することによって、赤血球の標準両凹形状を変更するように作用する。好ましい濃度は１ｌあたり０．３ｇ。
・既知の濃度を有する内部基準粒子。これは名目上１μｌあたり１０^４個の粒子であるけれども、１μｌあたり１０^３〜１０^５個の範囲内で使用され得る。
・緩衝液および防腐剤。これらの緩衝剤および防腐剤は、重炭酸ナトリウム（１ｌあたり好ましくは８．０ｇ、１ｌあたり６．０〜１０．０ｇの範囲で可能）、塩化ナトリウム（好ましくは１ｌあたり３．１ｇ）、Ｔｒｉｃｉｎｅ（好ましくは１ｌあたり１．８ｇ、１ｌあたり１．０〜５．０ｇの範囲）、ＥＤＴＡ２ナトリウム（好ましくは１ｌあたり１．０ｇ、１ｌあたり０．５〜３．０ｇの範囲）、エチルパラベン（１ｌあたり０．３ｇ）、メチルパラベン（１ｌあたり０．２ｇ）からなる。この溶液のｐＨは、２７５〜２９４ｍＯｓｍの浸透圧、および１１．０〜１３．０の導電率で、７．２〜８．９のやや塩基性の範囲内でなければならない。
【０１２１】
内部基準粒子は既知の濃度で使用され、かつ細胞代用物として作用するものである。この代用物は、少なくとも１つの測定技術における計器がサンプルの細胞構成物質からこれを独自に識別し得るような特性を有しなければならない。この細胞代用物は、品質管理目的のために内部サンプルの内部標準として作用する。これは計器の測定が正確に実行されていること、および全ての希釈が正確になされたことを保証する。この代用物の好ましい実施形態は、ポリスチレン粒子である。しかしながら、固定血球、花粉、ガラス、または大きいコロイドなどのその他の粒子が、上記の条件が満たされる限り使用され得るであろう。粒子寸法範囲は、好ましくは約１μｍ〜約１０μｍであり、計器の少なくとも１つの測定軸において血小板、白血球および赤血球とこれらの粒子とを独自に分離するという光学特性を有する。
【０１２２】
ポリスチレン粒子は、ＳｅｒａｄｙｎおよびＤｕｋｅなどのいくつかの製造者を通して商業的に利用可能である。好ましい寸法は４．０μｍであり、これは計器のデータ収集のいくつかの軸に沿って血液の血球成分と容易に識別される。計器において、これらの粒子の寸法を選択することは、粒子濃度が容易に測定されることを可能にする。前記消耗管中の試薬システムは、固体割合の測定値（粒子濃度×粒子体積）に敏感であり、したがって、選択された体積が小さいほど、粒子濃度はより高くなり、実施され得る粒子濃度の範囲は広くなる。好ましい実施形態は、前記消耗管中に１μｌあたり１０，０００個の粒子濃度を有するものである。このレベルで、計数されるポリスチレンのイベント数は、計数される白血球数と同一範囲内であろう。
【０１２３】
第２の方法試薬は「溶血剤」と表される。この溶血剤は、白血球を無傷のままにすると同時に、赤血球を破壊するよう作用する。この方法で、白血球は大多数の赤血球からの干渉なしに分析される。この試薬は、好ましくはこの試薬が５０以下の別々の消耗試験管について使用可能な構成で、標準的な蓋付き試験管の中に納められ得る。
【０１２４】
この溶血剤は、好ましくは以下を含む。
・１ｌあたり６．０〜２０．０ｇの濃度で使用され得るサポニン。好ましい濃度は、１ｌあたり１８ｇである。
・重炭酸ナトリウム（好ましくは１ｌあたり１２．０ｇ、１ｌあたり１０．０〜１６．０ｇの範囲内で有効。）、ＥＤＴＡ２ナトリウム（好ましくは１ｌあたり１．０ｇ、１ｌ０．５〜３．０ｇで有効。）、Ｐｒｏ−ｃｌｉｎ３００（好ましくは１ｌあたり０．５ｍｌの濃度。）、およびｇｅｒｍａｂｏｘＩＩ（好ましくは１ｌあたり１．０ｍｌ。）からなる、緩衝液および防腐剤。この試薬のｐＨは、２３５〜２８５ｍＯｓｍの浸透圧、および１４〜１６の導電率で、４．２〜５．２の範囲内でなければならない。
【０１２５】
前記装置試薬は、第１に全血希釈剤、シース溶液、および洗浄試薬として作用する。この装置試薬はまた、「シース溶液」と呼ばれる。このシース溶液は、全血希釈用試薬、フローサイトメトリー分析用シース試薬、計器の液圧通路用洗浄試薬、赤血球を除去するための溶血試薬用細胞溶解補助などの、いくつかの機能を実行する。このシースは、好ましくは５０の別個の消耗試薬を実施するのに十分保持するであろう容器の中に納められる。
【０１２６】
このシースは以下のものを含む。
・リン酸緩衝食塩水（好ましくは２５ｍＯｓｍの浸透圧を有し、５〜５０ｍＯｓｍの範囲で使用可能。）。
・両方の内部組織成分の洗浄に役立ち、かつ内部接液面に気泡が付着するのを防止するための界面活性剤。好ましい界面活性剤は、Ｐｌｕｒａｆａｃ−Ａ−３９であり、これは１ｌあたり０．１〜０．３ｇの範囲内で使用可能であり、好ましくは１ｌあたり約０．１ｇの濃度。Ｐｌｕｒａｆａｃの他に、その他の非イオン界面活性剤などが使用され得る。
・防腐剤。
【０１２７】
記載された前記方法試薬によって全血希釈を自動的に生じさせるために、流体装置および様々な機構が使用される。使用者は、計器に、バーコードラベルを付した消耗管と、正確に凝集されない全血サンプルとを提供する。計器は、このバーコードから必要な情報を読取り、その後少量の全血を、多量のシース溶液とともにこの消耗管に自動的に等分する。これは、理想的には、１００部の溶液（ＲＢＣまたは網赤血球試薬およびシース）に１部の血液で全体的な希釈を生じさせる一方、この希釈は１：５０〜１：５，０００の範囲で可能である。
【０１２８】
既知量のこの溶液は、その後前記消耗管から計器に吸引され、光学的フローセルへの入口近くの位置まで移動される。この溶液はその後、流体力学的強制によって、１秒あたり０．２５μｌ未満の遅い質量流量で光検出装置を通過し、ここで個別の赤血球、血小板および微粒子に関する光散乱ならびに光吸収と、前記溶液中の色素による光吸収とが測定される。
【０１２９】
赤血球または血小板分析が完了した後、計器は、好ましくは２０部の溶液に１部の血液の希釈を形成するために、第２の大量の全血を、等分した溶血剤および適量のシース溶液とともに前記消耗管に等分する。この希釈は１：１０〜１：１００の範囲で可能である。この目的は、赤血球を溶解し得る一方で、少なくとも１分間全血サンプルの白血球を無傷で維持し得る溶液を供給することである。
【０１３０】
既知量のこの第２溶液は、その後前記消耗管から計器に吸引され、光学的フローセルへの入口近くの位置まで移動される。この溶液はその後、流体力学的強制を使用して、１秒あたり約１μｌ以下の中程度の質量流量で、光検出装置を通過し、ここで個別の白血球、微粒子および色素に関する光散乱ならびに光吸収が測定される。
【０１３１】
以下の記載は、本発明の装置を添付図面に関連して説明する。いくらかの変更が、添付される請求項の範囲または精神から逸脱することなく、以下に記載される本発明においてなされ得ることが当業者によって理解されるであろう。
【０１３２】
準備状態において、使用者は本装置のドアを開け、２つの空の管スロット（図７のスロットＡおよび図７のスロットＢ）を露出させる。これらの空のスロットに、使用者は消耗管（６０）と、非凝固剤（ＥＤＴＡ、シトレートおよびヘパリン）を含む全血サンプルとを配置する。使用者はその後ドアを閉める。本装置は、これらの２つの追加した管の存在および同一性を証明し、前記消耗管がミキサ（８０）の下に配置されるように、ガラス瓶を保持する搬送体（７０）を移動させる。モータ８２は、前記消耗管（６０）の上端と接するように、前記ミキサを配置する。一方向にこのミキサを回転させ、その後その方向を逆転して前記管を混ぜる。この回転工程中、ロット校正情報を含む前記バーコードラベルが読取られる。粒子を均質化させるために前記消耗管を十分に混ぜた後、前記搬送体７０は前記ミキサの下に前記全血サンプルを配置し、サンプルの均質性を確保するために前記全血管を類似の方法で混ぜる。
【０１３３】
前記搬送体はその後、液圧針１１および空気圧針１２の下に前記全血管を配置する。モータ８１を動作させることによって、これらの針はその後この全血管の隔膜を貫通し、これら両方の針が血液の表面に接触するまでこの管を進入し続ける。これは、液圧針１１の開口部が完全に浸かっている一方で、空気排出針１２の開口部が浸かっていないことを確実にする。
【０１３４】
バルブ３を開き、かつ注射器６を動作させることで、針１１の先端に吸込まれた血液を吸う。理想的には、５ｍｌの全血がこの部分に関して吸引されるであろう。バルブ３はその後閉じられる。これらの針は、その後全血患者サンプルから引込められる。これらの針が前記隔膜から離脱するとき、これらの針はこの隔膜によってほぼ完全にきれいに拭き取られる。前記搬送体７０は、このときこれらの針の下に前記消耗管６０を配置する。上述と同様に、モータ８１を動作させることによって、これらの針１１および１２は消耗管６０の前記隔膜を貫通し、これら両方の針が試薬の表面と接触するまでこの管を進入する。
【０１３５】
バルブ５および３がその後開かれ、その上前記装置希釈剤で満たされた注射器７が供給を開始する。この注射器は、６１で示される前記消耗管の中に、前記針１１の先端からの血液および大量のシース流体を押込む。供給と同時に、モータ８１は、前記針１２の開口部が溶液と接触することを回避するために、前記針１１および１２を上方移動させる。この時この溶液は、適正に均質的であるけれども、均質性を確実にするために、バルブ３および５が閉じられ、かつこれらの針が６１から離脱され、この６１はその後８０の下の混合位置まで移動され、上記のように回転によって混合される。この工程中、バルブ３および５は開かれ、注射器７は前記針の先端において空隙を作る。
【０１３６】
消耗管６１は、次に針１１および針１２の下に配置される。モータ８１を動作させることによって、これらの針１１および１２は前記消耗管の隔膜を貫通し、これら両方の針が前記溶液の表面に接触するまでこの管を進入する。注射器７はその後、前記針の先端に既知量の溶液を吸引する。これらの針１１および１２はその後、この溶液から離脱される一方で、消耗管６１からモータ８１によって除去されない。これは、針１１において、希釈された全血のスラグを作る。注射器７は、ＨＧＢモジュール１０を通してこのスラグを吸い、このモジュールにおいて４つの別々の光波長での吸収値が求められる。このようなスペクトルデータは図２２において表される。前記スラグの容積はまた、前記検出器チャネルの吸収値を求めることにより、ここで数値を求められることができ、この吸収値は前記スラグの各側面における空隙が通過するにつれて変化する。
【０１３７】
注射器７は、バルブ３を通過した前記スラグを吸い続け、これをバルブ５の近くまで配置する。バルブ３はバルブ２が開くと同時に閉じ、この時点において注射器７はその方向を逆にして、前記スラグを、バルブ２を通して、フローセルアセンブリ２０の先端まで押す。
【０１３８】
バルブ２はその後閉じ、バルブ４が開き、これは満たされた注射器６および７が装置希釈剤リザーバ８を構成することを可能にする。バルブ５はその後閉じ、バルブ１が開き、注射器６および７は非常にゆっくりと供給を行う。注射器７の前記シース溶液は、２１を通って供給され、希釈された全血の前記スラグは、２０を通って注射器６によって押される。これは２５において、希釈された全血の中心流を閉じ込めるシースを形成し、この２５はフローセル２２の漏斗に対しこの流れを運搬し、この２２においてこれらの血球は、光学アセンブリ４１から放射する光源によってインタロゲートされる（ｉｎｔｅｒｒｏｇａｔｅｄ）。この流体の流れは、フローセル２２を通って、フローセルキャップ２４によってフローセル２２に取付けられた２３の管の中に完全に通過する。これは、装置廃棄物９に通じる通路を通す。
【０１３９】
前記流体の流れがフローセル２２を通過する一方で、光学アセンブリ４１は希釈された全血の血球を個別に照射する。これらの血球はレーザ３０の光学焦点３４を通過し、このレーザはこれらの血球において入射出力を最大化する。この狭い焦点はレンズ３３によって生成される。焦点３４を通過する血球によってもたらされる光は、フォトダイオード４２、４３、４４および４５に入射する光の量を変化させる。これらの変化は、図２６の前記信号処理エレクトロニクスによって捕らえられ、図２５の前記システムエレクトロニクスを介して記憶される。この方法で収集されたデータの例は、図１０Ａ〜図１０Ｄに示される。
【０１４０】
図１０Ａは、低角度前方散乱（ＦＳＬ）信号に関して検出器４５から収集されたデータを示す。図１０Ｂは、消光または軸方向光損失（ＥＸＴ）信号に関して検出器４４から収集されたデータを示す。図１０Ｃは、直角散乱（ＲＡＳ）信号、すなわち検出器４２に関して収集されたデータを示す。図１０Ｄは、低角度前方散乱（ＦＳＬ）信号、すなわち検出器４５から収集されたパルス幅データを示し、飛行時間または血球がレーザビームの前にいる時間を測定する。図１０Ａ、１０Ｂ、１０Ｃおよび１０Ｄに関して、Ａによって示されるピークは、血小板イベントを示し、Ｂによって示されるピークはラテックス粒子イベントを示し、Ｃによって示されるピークは赤血球イベントを示す。同一のデータが、図１１Ａおよび図１１Ｂにおいて散布図の形式で示される。図１１Ａに関し、ボックスＡ中の点はラテックス粒子イベントを示し、図１１Ｂにおいては、円Ｂがラテックスイベントを示す。散布図データは、４つ以下の検出器および飛行時間のいずれの組によっても表されることができる。
【０１４１】
この希釈の生成に使用される試薬は、新メチレンブルーなどのＲＮＡ染色色素を使用するべきであり、前記データは、網赤血球を評価するために、図１０Ａ〜１０Ｄにおいて、赤血球部分Ｃでのみ見ることによってさらに分析され得る。このような分析のヒストグラムは、図１４Ａおよび１４Ｂにおいて示され、散布図が図１５において示される。図１５は、算定された１．７２％の群を示し、これらは網赤血球である。これは１．６０％の網赤血球数の手動基準方法と比べても遜色ない。
【０１４２】
赤血球、網赤血球、血小板およびラテックスを首尾よく計数しかつ分類した後、前記針１１および１２は前記消耗管６１から離脱される。搬送体７０は、これらの針１１および１２の下に配置するように、前記全血サンプルを移動させる。モータ８１を動作させると、これらの針は前記全血管の隔膜を貫通し、これら両方の針１１および１２が血液の表面に接触するまで、この管に進入し続ける。これは、液圧針１１の開口部が完全に沈められる一方で、空気排出針１２の開口部が沈められないことを保証する。バルブ３を開け、注射器６を動作させることで、血液が針１１の先端に吸い込まれる。理想的には、１００μｌがこの部分に関して吸引されるであろう。バルブ３は、その後閉じられる。針１１および１２は、その後全血患者サンプルから引込められる。これらの針１１および１２が前記隔膜を通って離脱するとき、これらの針はこの角膜によってほぼ完全にきれいに拭き取られる。前記搬送体７０はこのとき前記消耗管６１をこれらの針１１および１２の下に配置する。モータ８１を動作させることによって、針１１および１２は消耗管６１の前記隔膜を貫通し、これら両方の針１１および１２が前記溶液表面に接触するまでこの管に進入する。
【０１４３】
バルブ５およびバルブ３は開かれ、同時に装置希釈剤で満たされた注射器７が供給を開始する。この注射器は前記針１１の先端を通って１００μｌの血液を押す。大量のシース流体が全血を、６２で示される前記消耗管中に送る。供給と同時に、モータ８１が、針１２の開口部が溶液と接触することを回避するために、これらの針を上方移動させる。針１１および１２はこのとき消耗管６２から引抜かれ、搬送体７０は、溶血試薬の管を含む図７のスロットＣの位置を、針１１および１２の下に移動させる。モータ８１を動作させることで、これらの針１１および１２はこの溶血剤管の隔膜を貫通し、これら両方の針１１および１２がこの溶血剤の表面に接触するまで、この管に進入し続ける。バルブ３を開け、注射器６を動作させることで、溶血剤を針１１の先端に吸い込む。理想的には、１００μｌの溶血剤がこの部分に関して吸引され、その後これに空隙が続く。この溶液から針１１を除去すると、その後動作する注射器６は、この空隙を作る。バルブ３は、その後閉じられる。針１１および１２はその後この溶血剤管から引込められる。これらの針が前記隔膜を通って離脱するとき、これらの針はこの隔膜によってほぼ完全にきれいに拭き取られる。搬送体７０は、前記消耗管６２を針１１および１２の下に配置する。バルブ５および３はその後開かれ、同時に装置希釈剤で満たされた注射器７は、供給を開始する。これは１００μｌの溶血剤を前記針１１の先端を通って押す。大量のシース流体がこの溶血剤を、６３で示される前記消耗管の中に送る。供給と同時に、モータ８１は、針１２の開口部が溶液と接触することを回避するために、これらの針を上方移動させる。
【０１４４】
消耗管６３中の溶液は、適正に均質化されるけれども、均質性を確実にするために、バルブ３および５が閉じられ、前記２つの針は６３から離脱され、この６３はその後８０の下の混合位置まで移動され、上記のように回転によって混合される。これらの工程中、バルブ３および５は開き、注射器７は前記針の先端に空隙を作る。
【０１４５】
消耗管６３は針１１および１２の下に配置される。モータ８１を動作させることによって、針１１および１２は、この消耗管６３の隔膜を貫通し、これら両方の針１１および１２が前記溶液と接触するまでこの管を進入する。注射器７は、その後既知量の溶液を前記針１１の先端に吸引する。針１１および１２はその後この溶液から離脱される一方、消耗管からはモータ８１によって完全に離脱されない。これは針１１において溶解した全血のスラグを作る。注射器７は、ＨＧＢモジュール１０を通して溶解した全血の前記スラグを吸い、このモジュールにおいて４つの別々の光波長での吸収値が求められる。赤血球がこの場合において溶解され、血球からヘモグロビンが開放される。吸収データは、シアン化塩が溶解物質に使用された場合は図１９Ａによって、細胞溶解物質のみが使用された場合は図１９Ｂによって、血球溶解が網赤血球染色の存在するところで生じた場合は図２１によって示され得る。前記スラグの容積はまた、前記検出器チャネルの吸収値を評価することによって、ここで数値が求められ得る。これらの吸収値は、前記スラグの各側面における空隙が通過するにつれて変化する。
【０１４６】
注射器７は、バルブ３を通過してバルブ５の近くまで、前記スラグを吸い続ける。バルブ３は閉じられ、バルブ２が開き、この時点で注射器７がその方向を逆にし、このスラグを、バルブ２を通ってフローセルアセンブリ２０の先端まで押す。
【０１４７】
バルブ２はその後閉じ、バルブ４が開き、これは、満たされた注射器６および７が前記装置希釈リザーバ８を構成することを可能にする。バルブ５はその後閉じ、バルブ１が開き、注射器６および７は非常にゆっくりと供給を行う。注射器７のシース溶液は２１を通って供給され、溶解された全血のスラグは注射器６によって２０を通って押される。これは２５の中に溶解された全血の中心流を閉じ込めたシースを形成し、この２５はフローセル２２の漏斗に対してこの流れを運搬し、この２２においてこれらの血球は、光学アセンブリ４１から放射する光源によってインタロゲートされる。この流体の流れは、フローセル２２を通って、フローセルキャップ２４によってフローセル２２に取付けられた２３の管の中に完全に通過する。これは、装置廃棄物９に通じる通路を通す。
【０１４８】
前記流体の流れがフローセル２２を通過する一方で、光学アセンブリ４１は希釈された全血の血球を個別に照射する。これらの血球はレーザ３０の光学焦点３４を通過し、このレーザはこれらの血球において入射出力を最大化する。この狭い焦点はレンズ３３によって生成される。焦点３４を通過する血球によってもたらされる光は、フォトダイオード４２、４３、４４および４５に入射する光の量を変化させる。これらの変化は、図２６の前記信号処理エレクトロニクスによって捕らえられ、図２５の前記システムエレクトロニクスを介して記録される。この方法によって収集されたデータの例は、図１２Ａ〜１２Ｆにおいて示される。
【０１４９】
図１２Ａは、ラテックスの存在なしに検出器４４から消光または軸方向光損失（ＥＸＴ）信号に関して収集されたデータを示し、図１２Ｂは、ラテックスが存在する同一のサンプルを示す。図１２Ｃは、ラテックスの存在なしに、検出器４５から低角度前方散乱信号に関して収集されたデータを示し、図１２Ｄは、ラテックスが存在する同一のサンプルを示す。図１２Ｅは、ラテックスの存在なしに、直角散乱光（ＲＡＳ）信号または検出器４２に関して収集されたデータを示し、図１２Ｆは、ラテックスが存在する同一のサンプルを示す。
【０１５０】
図１２Ａ、図１２Ｂ、図１２Ｃ、図１２Ｄ、図１２Ｅおよび図１２Ｆに関し、Ａについて示されるピークはリンパ球イベントを表し、Ｂについて示されるピークは単球イベントを表し、Ｃについて示されるピークは顆粒球イベントを表し、Ｄについて示されるピークはラテックス粒子イベントを表す。この同一のデータが図１３Ａおよび１３Ｂにおいて散布図の形式で示される。図１１Ａに関して、円Ｄ中の点はラテックス粒子イベントを表し、図１１Ｂにおいては、円Ｄはまたラテックス粒子イベントを表す。散布図データは４つ以下の検出器および飛行時間のいずれの組によっても表され得る。
【０１５１】
顆粒球の群中の好酸球を含むサンプルに関して、この下位群の分離は検出器４２の直角散乱チャネルにおいて達成される。図１６Ａは、Ａがリンパ球、Ｂが単球、Ｃが好中球、Ｄが好酸球を表したデータのヒストグラムを示す。図１７は、図１６と同一のデータを散布図の形式で示す。Ａで包囲した群はリンパ球を、Ｂは単球を、Ｃは好中球を、Ｄは好酸球を表す。４つ以下の検出器および飛行時間のいずれの組も散布図データによって表し得るけれども、好酸球を識別するために直角散乱が必要である。
【０１５２】
白血球が計数されかつ分類された後、注射器７には、バルブ４を開けることによって、試薬リザーバ８から流体が充填される。バルブ４は閉じ、３および５が開き、これは注射器７が針１１を通って消耗管６３の中に流体を逆流させることによって、サンプルラインを洗浄することを可能とする。針１２は、フィルタ１３を通って大気中に対して、この管を空気抜きするために作用する。これは６４において示される構成の消耗管をもたらす。搬送体７０はこのとき定位置に移動し、この位置において使用者は前記装置ドアを開くことができ、図７のスロットＡおよびＢからこれらの管を除去し得る。この消耗管はこのとき廃棄管となり、廃棄される。
【０１５３】
上記と同一のラインに沿ったその他の動作モードは、免疫学的検定がラテックス凝集技術によって実行されることを可能にするであろう。ここで、前記消耗管は、抗体で覆われたラテックスを含み、これらの粒子は特定の検体の存在するところで一緒に凝集するであろう。このラテックス混合物は、図４に記載された光学通路を通り抜け、このデータは、２重、または３重の粒子群に関して値を求められるであろう。これらの群の濃度が高くなればなるほど、所定の検体の濃度も高くなる。
【０１５４】
様々な特許および刊行物がここにおいて引用され、これらの開示はそのまま参照によって組込まれる。本発明は、ここにおいて記載された特定の実施形態によって範囲限定されることを意図していない。本発明は、図解目的で詳細に記載されたけれども、開示されたような本発明の様々な変形は、ここにおいて記載されたものに加えて、先の記載から当業者に明確に理解されるであろう。このような変形は、本発明の範囲内に包含されるために意図される。
【図面の簡単な説明】
【図１】
本装置の液圧技術の概略図である。
【図２】
光検出装置において使用されるフローセルアセンブリの図面である。
【図３】
図３Ａは、レーザビーム整形光学素子の概略的な平面図である。
図３Ｂは、レーザビーム整形光学素子の概略的な側面図である。
【図４】
血球検出装置の説明図である。
【図５】
レーザの前方における３つの独立した光測定に対応するフォトダイオードマスクの図面である。
【図６】
システムサイクルにおいて前記消耗管内で起こっていることを概略的に示す図である。
【図７】
図６において示された管を移動させる管配置アセンブリの図である。
【図８】
混合および貫通アセンブリの図面である。
【図９】
図１の好ましい実施形態の図面である。
【図１０】
本装置の実施形態から得られた赤血球（Ｃ）、血小板（Ｐ）、およびラテックス（Ｂ）のヒストグラムデータを表示している。
図１０Ａは、ｘ軸（０〜１０２３、または８ビット）上のデジタル化された高角度前方散乱チャネル４３に対する、個別のチャネルそれぞれに関して収集されたイベント数（または発生数）のヒストグラムデータを表示している。
図１０Ｂは、同一のデータランについて、消光または軸方向光損失チャネル４４の表示である。
図１０Ｃは、同一のデータランについて、直角散乱チャネル４２の表示である。
図１０Ｄは、同一のデータランについて、飛行時間またはパルス幅測定を示す。
【図１１】
図１０と同一の赤血球、血小板およびラテックスのデータを散布図形式で表示している。
【図１２】
図１２Ａは、３つの群を明確に示す前記消光チャネルに関する白血球のヒストグラムデータを表示しており、Ａはリンパ球、Ｂは単球、Ｃは顆粒球である。
図１２Ｂは、同一の患者サンプルについて、ラテックス粒子を組み込んだデータランを示す。
図１２Ｃおよび図１２Ｅは、同一の患者サンプルについて、ラテックス粒子を加えることなく、低角度前方散乱（１２Ｃ）および直角散乱（１２Ｅ）の数値を示す。
図１２Ｄおよび図１２Ｆは、同一の患者サンプルについて、ラテックス粒子を加えて、低角度前方散乱（１２Ｄ）および直角散乱（１２Ｆ）の数値を示す。
【図１３】
図１３Ａおよび図１３Ｂは、図１２Ｂ、図１２Ｄおよび図１２Ｆと同一の白血球およびラテックスのデータを散乱図形式で表示している。
【図１４】
本装置の実施形態から得られた直角散乱（図１４Ａ）および消光（図１４Ｂ）に関する赤血球および網赤血球のヒストグラムデータを表示している。
【図１５】
図１４Ａおよび図１４Ｂにおいて示されたような同一のサンプルから得られた赤血球および網赤血球の散乱図データを表示している。
【図１６】
直角散乱（図１６Ａ）および飛行時間またはパルス幅（図１６Ｂ）に関して、本装置の実施形態から得られた白血球分画のヒストグラムデータを表示している。
【図１７】
図１６Ａおよび図１６Ｂにおいて示されたような同一のサンプルから得られた白血球分画の散布図データを表示している。
【図１８】
血液の存在なしに、６１に代表される網赤血球色素溶液の分光光度計走査を表示している。
【図１９】
図１９Ａは、溶解した全血溶液の分光光度計の走査を表示し、ヘモグロビンの基準方法（シアンヘモグロビン）に関して５４０ｎｍにおいて読取られる。
図１９Ｂは、溶解した全血溶液の分光光度計の走査を表示し、ヘモグロビンに関して５４０ｎｍにおいて読取られる場合、オキシヘモグロビンを示し、５８０ｎｍにおいてはデオキシヘモグロビンを表す。
【図２０】
希釈された全血溶液の分光光度計の走査を表示している。
【図２１】
溶解した全血および網赤血球色素溶液の分光光度計の走査を表示している。
【図２２】
希釈された全血および網赤血球色素溶液の分光光度計の走査を表示している。
【図２３】
単一モードで動作するダイオードレーザ（図２３Ａ）および高周波数で動作する同一のレーザ（図２３Ｂ）のスペクトラムアナライザの出力を表示している。
【図２４】
定力駆動されたレーザダイオードまたは単一モード、および高周波数変調によって駆動された同一の装置に関する温度に対する、ノイズのプロットを表示している。
【図２５】
システムエレクトロニクスのブロック図である。
【図２６】
信号処理エレクトロニクスのブロック図である。

Claims (92)

1. フローサイトメータのためのレンズレス集光装置。
2. 単一の集積回路チップ上の光検出器アレイであって、複数の角度での散乱光を収集する能力を有する光検出器アレイを含むことを特徴とする請求項１記載のレンズレス集光装置。
3. 前記光検出器アレイは、軸方向の光損失を測定する能力をさらに有することを特徴とする請求項２記載のレンズレス集光装置。
4. ５０°〜１３０°の間の角度で散乱した光を収集する能力を有する高開口数の光検出器をさらに含むことを特徴とする請求項２記載のレンズレス集光装置。
5. 少なくとも暗電流ノイズと前記レンズレス集光装置に入射する非散乱光とが及ぼす影響を修正する能力を有するサーボ回路をさらに含むことを特徴とする請求項２記載のレンズレス集光装置。
6. 前記光検出器アレイは、非円形状を有することを特徴とする請求項２記載のレンズレス集光装置。
7. 前記光検出器アレイは、少なくとも３つの別個の光検出部分を有することを特徴とする請求項６記載のレンズレス集光装置。
8. 前記別個の光検出部分のうち第１の部分は、軸方向の光損失を検出可能であり、
   前記別個の光検出部分のうち第２の部分は、１°〜３°の間の角度で散乱される光を検出可能であり、
   前記別個の光検出部分のうち第３の部分は、４°〜９°の間の角度で散乱される光を検出可能であることを特徴とする請求項７記載のレンズレス集光装置。
9. ５０°〜１３０°の間の角度で散乱される光を収集する能力を有する高開口数の光検出器をさらに含むことを特徴とする請求項６記載のレンズレス集光装置。
10. ５０°〜１３０°の間の角度で散乱される光を収集する能力を有する高開口数の光検出器をさらに含むことを特徴とする請求項８記載のレンズレス集光装置。
11. 前記別個の光検出装置の前記第１、第２および第３の装置は、前記フローサイトメータのフローセルを通る血球の進行線に対して原則的に垂直に、さらにこのフローセル中の前記血球に入射するレーザ光の進行線に対して原則的に垂直に、一列に並べられ、
    前記フローセルを通る血球の前記進行線およびレーザ光の前記進行線が互いに垂直であることを特徴とする請求項８記載のレンズレス集光装置。
12. 前記別個の光検出装置の前記第１、第２および第３の装置は、前記フローサイトメータのフローセルを通る血球の進行線に対して原則的に垂直に、さらにこのフローセル中の前記血球に入射するレーザ光の進行線に対して原則的に垂直に、一列に並べられ、
    前記フローセルを通る血球の前記進行線およびレーザ光の前記進行線が互いに垂直であることを特徴とする請求項１０記載のレンズレス集光装置。
13. フローサイトメトリーに使用する多目的血液サンプル反応槽であって、
    閉じられた管と、
    この閉じられた管中の既知数の粒子であって、前記粒子のそれぞれは、前記粒子が複数の既知の光散乱チャネルのうち１つに入るようないくつかの直径のうち１つを有する粒子と、
    少なくとも１つの試薬とを含むことを特徴とする反応槽。
14. 前記粒子それぞれの前記直径は、１〜１０μｍであることを特徴とする請求項１３記載の反応槽。
15. 前記粒子それぞれの前記直径は、４．０±０．５μｍであることを特徴とする請求項１３記載の反応槽。
16. 前記粒子の既知数は、１μｌあたり１０^３〜１０^５個の間であることを特徴とする請求項１３記載の反応槽。
17. 前記粒子の既知数は、１μｌあたり１０，０００±１，０００個であることを特徴とする請求項１３記載の反応槽。
18. 前記粒子は、ラテックス粒子、固定血球、花粉、ガラスまたは大きいコロイドからなる群から選択されることを特徴とする請求項１３記載の反応槽。
19. 前記粒子は、ラテックス粒子からなることを特徴とする請求項１３記載の反応槽。
20. 前記粒子それぞれの前記直径は、４．０±０．５μｍであることを特徴とする請求項１９記載の反応槽。
21. 前記粒子の既知数は、１μｌあたり１０，０００±１，０００個であることを特徴とする請求項１９記載の反応槽。
22. 前記粒子それぞれの前記直径は、４．０±０．５μｍであり、
    前記粒子の既知数は、１μｌあたり１０，０００±１，０００個であることを特徴とする請求項１９記載の反応槽。
23. 前記試薬は、赤血球および網赤血球のうち１つを測定する能力を有することを特徴とする請求項１３記載の反応槽。
24. 前記試薬は、網赤血球中のリボ核酸（ＲＮＡ）を染色する能力を有する反応物質を含むことを特徴とする請求項２３記載の反応槽。
25. 網赤血球中のリボ核酸（ＲＮＡ）を染色する能力を有する前記試薬は、新メチレンブルーであることを特徴とする請求項２４記載の反応槽。
26. 前記新メチレンブルーは、１ｌあたり０．１〜０．５ｇの間の濃度で存在することを特徴とする請求項２５記載の反応槽。
27. 前記試薬は、赤血球の前記形状を修正する一方で、この赤血球を実質的に無傷のままにする能力を有する反応物質を含むことを特徴とする請求項２３記載の反応槽。
28. 赤血球の前記形状を修正する一方で、この赤血球を実質的に無傷のままにする能力を有する前記反応物質は、Ｐｌｕｒａｆａｃ−Ａ−３９−Ｐｒｉｃであることを特徴とする請求項２７記載の反応槽。
29. 前記Ｐｌｕｒａｆａｃ−Ａ−３９−Ｐｒｉｃは、１ｌあたり０．１〜０．６ｇの間の濃度で存在することを特徴とする請求項２８記載の反応槽。
30. 前記試薬は、新メチレンブルーおよびＰｌｕｒａｆａｃ−Ａ−３９−Ｐｒｉｃを含むことを特徴とする請求項２３記載の反応槽。
31. 前記新メチレンブルーは、１ｌあたり０．１〜０．５ｇの間の濃度で存在し、かつ前記Ｐｌｕｒａｆａｃ−Ａ−３９−Ｐｒｉｃは、１ｌあたり０．１〜０．６ｇの間の濃度で存在することを特徴とする請求項３０記載の反応槽。
32. 前記試薬は、
    ａ）１ｌあたり０．１〜０．５ｇの間の濃度の新メチレンブルーと、
    ｂ）１ｌあたり０．１〜０．６ｇの間の濃度のＰｌｕｒａｆａｃ−Ａ−３９−Ｐｒｉｃと、
    ｃ）１ｌあたり６．０〜１０．０ｇの間の濃度の重炭酸ナトリウムと、
    ｄ）１ｌあたり１．０〜５．０ｇの間の濃度の塩化ナトリウムと、
    ｅ）１ｌあたり１．０〜５．０ｇの間の濃度のＴｒｉｃｉｎｅと、
    ｆ）１ｌあたり０．５〜３．０ｇの間の濃度のＥＤＴＡ２ナトリウムと、
    ｇ）１ｌあたり０．１〜０．５ｇの間の濃度のエチルパラベンと、
    ｈ）１ｌあたり０．１〜０．３ｇの間の濃度のメチルパラベンとを含むことを特徴とする請求項２３記載の反応槽。
33. 前記粒子の既知数は、１μｌあたり１０，０００±１，０００個であることを特徴とする請求項３２記載の反応槽。
34. 前記粒子は、ラテックス粒子であることを特徴とする請求項３２記載の反応槽。
35. 前記粒子それぞれの前記直径は、４．０±０．５μｍであることを特徴とする請求項３４記載の反応槽。
36. 前記粒子の既知数は、１μｌあたり１０，０００±１，０００個であることを特徴とする請求項３４記載の反応槽。
37. 前記粒子それぞれの前記直径は、４．０±０．５μｍであり、かつ前記粒子の既知数は、１μｌあたり１０，０００±１，０００個であることを特徴とする請求項３４記載の反応槽。
38. 前記試薬は、白血球数、白血球５分画およびヘモグロビンレベルのうち少なくとも１つの測定を可能とする能力を有することを特徴とする請求項１３記載の反応槽。
39. 前記試薬は、１ｌあたり６．０〜２０．０ｇの間の濃度でのサポニンを含むことを特徴とする請求項３８記載の反応槽。
40. ａ）１ｌあたり１０．０〜１６．０ｇの間の濃度の硫酸ナトリウムと、
    ｂ）１ｌあたり０．５〜３．０ｇの間の濃度のＥＤＴＡ２ナトリウムと、
    ｃ）１ｌあたり０．１〜１．０ｇの間の濃度のＰｒｏ−ｃｌｉｎ３００と、
    ｄ）１ｌあたり０．５〜３．０ｍｌの間の濃度のｇｅｒｍａｂｏｘＩＩとをさらに含むことを特徴とする請求項３９記載の反応槽。
41. 前記粒子の既知数は、１μｌあたり１０，０００±１，０００個であることを特徴とする請求項４０記載の反応槽。
42. 前記粒子は、ラテックス粒子であることを特徴とする請求項４０記載の反応槽。
43. 前記粒子それぞれの前記直径は、４．０±０．５μｍであることを特徴とする請求項４２記載の反応槽。
44. 前記粒子の既知数は、１μｌあたり１０，０００±１，０００個であることを特徴とする請求項４２記載の反応槽。
45. 前記粒子それぞれの前記直径は、４．０±０．５μｍであり、かつ前記粒子の既知数は、１μｌあたり１０，０００±１，０００個であることを特徴とする請求項４２記載の反応槽。
46. 血液サンプルまたは血液由来のサンプルを分析する方法であって、
    前記血液サンプルまたは血液由来のサンプル、および閉じられた反応槽において既知数の粒子であって、複数の既知の光散乱チャネルの１つに入るようないくつかの直径のうち１つを有する粒子を含むこの閉じられた反応槽中の試薬を混合するステップと、
    前方光散乱および側方光散乱を測定して、これらの測定を前記粒子に関して得られた値と比較することによって、前記粒子を使用して前記サンプルを標準化するステップと、
    前記サンプルから血球を計数しかつ分粒するステップと、
    前記サンプル中の各血球から前方光散乱および側方光散乱を測定するステップと、
    光散乱信号に基づいて血球を分類するために前記散乱光を分析するステップとを含むことを特徴とする方法。
47. 前記前方光散乱の一部は、１°〜３°の間の角度で散乱した光であることを特徴とする請求項４６記載の方法。
48. 前記前方光散乱の一部は、４°〜９°の間の角度で散乱した光であることを特徴とする請求項４６記載の方法。
49. 前記側方光散乱の一部は、５０°〜１３０°の間の角度で散乱することを特徴とする請求項４６記載の方法。
50. 前記前方光散乱の第１の部分は、１°〜３°の間の角度で散乱した光であり、この光散乱の第２の部分は、４°〜９°の間の角度で散乱した光であり、前記側方光散乱の一部は、５０°〜１３０°の間の角度で散乱することを特徴とする請求項４６記載の方法。
51. 前記サンプルを標準化する前記ステップより前に、前記サンプル中の白血球を実質的に無傷のままにすると同時に前記サンプル中の赤血球を溶解することによって、前記血液サンプルまたは血液由来のサンプル中の前記血球を処理するステップをさらに含むことを特徴とする請求項４６記載の方法。
52. 前記血液サンプルまたは前記血液由来のサンプルのヘモグロビン含有量を測定するステップをさらに含むことを特徴とする請求項４６記載の方法。
53. 前記サンプル中の蛍光化合物から放射された光を収集するステップをさらに含むことを特徴とする請求項４６記載の方法。
54. サンプル中の生物細胞を分類かつ計数するためのフローサイトメトリー装置であって、
    （ａ）消耗管であって、水溶性の検査液における、複数の既知の光散乱チャネルの１つに入るようないくつかの直径のうち１つを有する、既知数の粒子と、少なくとも１つの試薬とを含む消耗管と、
    （ｂ）溶血剤管であって、前記サンプル中の白血球を実質的に無傷のままにする一方で、前記サンプル中の赤血球を溶解する能力を有する少なくとも１つの溶血試薬を含む溶血剤管と、
    （ｃ）シース管であって、サンプル希釈試薬とフローサイトメトリー用シース試薬と前記フローサイトメトリー装置の液圧路用洗浄試薬とを含むシース管と、
    （ｄ）フローセルと、
    （ｅ）液圧装置であって、前記サンプル、前記消耗管、前記溶血剤管および前記シース管の内容物を混合し、結果として生じる１つ以上の混合物を前記フローセルに通過移動させる能力を有する液圧装置と、
    （ｆ）ダイオードレーザであって、前記フローセル中の血球を照射する光を生じさせるダイオードレーザと、
    （ｇ）レンズレス光モジュールであって、２つ以上の前方散乱角度範囲で散乱した光を収集する能力を有する第１の部分、および高開口数で散乱した光を収集する能力を有する第２の部分を有するレンズレス光モジュールと、
    （ｈ）信号処理装置であって、前記レンズレス光モジュールの前記第１の部分および前記第２の部分から生成された１つ以上の信号を分析し、そこからのデータを生成する能力を有する信号処理装置と、
    （ｉ）前記データを分析するためのデータ処理装置とを含むことを特徴とするフローサイトメトリー装置。
55. 前記粒子それぞれの前記直径は、１μｍ〜１０μｍの間であることを特徴とする請求項５４記載のフローサイトメトリー装置。
56. 前記粒子それぞれの前記直径は、４．０±０．５μｍであることを特徴とする請求項５４記載のフローサイトメトリー装置。
57. 前記粒子の既知数は、１μｌあたり１０^３〜１０^５個の間であることを特徴とする請求項５４記載のフローサイトメトリー装置。
58. 前記粒子の既知数は、１μｌあたり１０，０００±１，０００個であることを特徴とする請求項５４記載のフローサイトメトリー装置。
59. 前記粒子は、ラテックス粒子、固定血球、花粉、ガラスまたは大きいコロイドからなる群から選択されることを特徴とする請求項５４記載のフローサイトメトリー装置。
60. 前記粒子は、ラテックス粒子であることを特徴とする請求項５４記載のフローサイトメトリー装置。
61. 前記粒子の前記直径は、４．０±０．５μｍであることを特徴とする請求項６０記載のフローサイトメトリー装置。
62. 前記粒子の前記既知数は、１μｌあたり１０，０００±１，０００個であることを特徴とする請求項６０記載のフローサイトメトリー装置。
63. 前記粒子の前記直径は、４．０±０．５μｍであり、
    かつ前記粒子の前記既知数が１μｌあたり１０，０００±１，０００個であることを特徴とする請求項６０記載のフローサイトメトリー装置。
64. 前記試薬は、赤血球および網赤血球のうち少なくとも１つの測定を可能にすることを特徴とする請求項５４記載のフローサイトメトリー装置。
65. 前記少なくとも１つの試薬は、網赤血球中のリボ核酸（ＲＮＡ）を染色する能力を有する反応物質を含むことを特徴とする請求項６４記載のフローサイトメトリー装置。
66. 網赤血球中のリボ核酸（ＲＮＡ）を染色する能力を有する前記反応物質は、新メチレンブルーであることを特徴とする請求項６５記載のフローサイトメトリー装置。
67. 前記新メチレンブルーは、１ｌあたり０．１〜０．５ｇの間の濃度で存在することを特徴とする請求項６６記載のフローサイトメトリー装置。
68. 前記試薬は、赤血球の形状を修正する一方で、前記赤血球を実質的に無傷のままにする能力を有する反応物質を含むことを特徴とする請求項６４記載のフローサイトメトリー装置。
69. 赤血球の形状を修正する一方で、前記赤血球を実質的に無傷のままにする能力を有する前記反応物質は、Ｐｌｕｒａｆａｃ−Ａ−３９−Ｐｒｉｃであることを特徴とする請求項６８記載のフローサイトメトリー装置。
70. 前記Ｐｌｕｒａｆａｃ−Ａ−３９−Ｐｒｉｃは、１ｌあたり０．１〜０．６ｇの間の濃度で存在することを特徴とする請求項６９記載のフローサイトメトリー装置。
71. 前記試薬は、新メチレンブルーおよびＰｌｕｒａｆａｃ−Ａ−３９−Ｐｒｉｃを含むことを特徴とする請求項６４記載のフローサイトメトリー装置。
72. 前記新メチレンブルーは、１ｌあたり０．１〜０．５ｇの間の濃度で存在し、かつ前記Ｐｌｕｒａｆａｃ−Ａ−３９−Ｐｒｉｃは、１ｌあたり０．１〜０．６ｇの間の濃度で存在することを特徴とする請求項７１記載のフローサイトメトリー装置。
73. 前記試薬は、
    ａ）１ｌあたり０．１〜０．５ｇの間の濃度の新メチレンブルーと、
    ｂ）１ｌあたり０．１〜０．６ｇの間の濃度のＰｌｕｒａｆａｃ−Ａ−３９−Ｐｒｉｃと、
    ｃ）１ｌあたり６．０〜１０．０ｇの間の濃度の重炭酸ナトリウムと、
    ｄ）１ｌあたり１．０〜５．０ｇの間の濃度の塩化ナトリウムと、
    ｅ）１ｌあたり１．０〜５．０ｇの間の濃度のＴｒｉｃｉｎｅと、
    ｆ）１ｌあたり０．５〜３．０ｇの間の濃度のＥＤＴＡ２ナトリウムと、
    ｇ）１ｌあたり０．１〜０．５ｇの間の濃度のエチルパラベンと、
    ｈ）１ｌあたり０．１〜０．３ｇの間の濃度のメチルパラベンとを含むことを特徴とする請求項６４記載のフローサイトメトリー装置。
74. 前記粒子の既知数は、１μｌあたり１０，０００±１，０００個であることを特徴とする請求項７３記載のフローサイトメトリー装置。
75. 前記試薬は、白血球数、白血球５分画およびヘモグロビンレベルのうち少なくとも１つの測定を可能とする能力を有することを特徴とする請求項５４記載のフローサイトメトリー装置。
76. 前記試薬は、１ｌあたり６．０〜２０．０ｇの間の濃度でのサポニンを含むことを特徴とする請求項７５記載のフローサイトメトリー装置。
77. ａ）１ｌあたり１０．０〜１６．０ｇの間の濃度の硫酸ナトリウムと、
    ｂ）１ｌあたり０．５〜３．０ｇの間の濃度のＥＤＴＡ２ナトリウムと、
    ｃ）１ｌあたり０．１〜１．０ｇの間の濃度のＰｒｏ−ｃｌｉｎ３００と、
    ｄ）１ｌあたり０．５〜３．０ｍｌの間の濃度のｇｅｒｍａｂｏｘＩＩとをさらに含むことを特徴とする請求項７６記載のフローサイトメトリー装置。
78. 前記粒子の既知数は、１μｌあたり１０，０００±１，０００個であることを特徴とする請求項７７記載のフローサイトメトリー装置。
79. 前記レンズレス光モジュールは、単一の集積回路チップ上の光検出器アレイを含むことを特徴とする請求項５４記載のフローサイトメトリー装置。
80. 前記光検出器アレイは、軸方向の光損失を測定する能力を有することを特徴とする請求項７９記載のフローサイトメトリー装置。
81. 前記第２の部分は、５０°〜１３０°の間の角度で散乱した光を収集する能力を有する高開口数の光検出器であることを特徴とする請求項７９記載のフローサイトメトリー装置。
82. 前記レンズレス光モジュールは、少なくとも暗電流ノイズとこのレンズレス光モジュールに入射する非散乱光とが及ぼす影響を修正する能力を有するサーボ回路をさらに含むことを特徴とする請求項７９記載のフローサイトメトリー装置。
83. 前記光検出器アレイは、非円形状を備えることを特徴とする請求項７９記載のフローサイトメトリー装置。
84. 前記光検出器アレイは、少なくとも３つに別個の光検出部分を備えることを特徴とする請求項８３記載のフローサイトメトリー装置。
85. 前記別個の光検出部分のうち第１の部分は、軸方向の光損失を検出する能力を有し、
    前記別個の光検出部分のうち第２の部分は、１°〜３°の間の角度で散乱した光を検出する能力を有し、
    前記別個の光検出部分のうち第３の部分は、４°〜９°の間の角度で散乱した光を検出する能力を有することを特徴とする請求項８４記載のフローサイトメトリー装置。
86. ５０°〜１３０°の間の角度で散乱した光を収集する能力を有する高開口数の光検出器をさらに含むことを特徴とする請求項７９記載のフローサイトメトリー装置。
87. ５０°〜１３０°の間の角度で散乱した光を収集する能力を有する高開口数の光検出器をさらに含むことを特徴とする請求項７９記載のフローサイトメトリー装置。
88. 前記別個の光検出装置の前記第１、第２および第３の装置は、前記フローサイトメータのフローセルを通る血球の進行線に対して原則的に垂直に、さらにこのフローセル中の前記血球に入射するレーザ光の進行線に対して原則的に垂直に、一列に並べられ、
    前記フローセルを通る血球の前記進行線およびレーザ光の前記進行線が互いに垂直であることを特徴とする請求項７９記載のフローサイトメトリー装置。
89. 前記別個の光検出装置の前記第１、第２および第３の装置は、前記フローサイトメータのフローセルを通る血球の進行線に対して原則的に垂直に、さらにこのフローセル中の前記血球に入射するレーザ光の進行線に対して原則的に垂直に、一列に並べられ、
    前記フローセルを通る血球の前記進行線およびレーザ光の前記進行線が互いに垂直であることを特徴とする請求項８７記載のフローサイトメトリー装置。
90. 前記ダイオードレーザは、このダイオードレーザの出力を０．１〜１０μｍｍの間の高さ、０．１〜２００．０μｍｍの間の幅を有する線の中に放射するための装置を含むことを特徴とする請求項５４のフローサイトメトリー装置。
91. 前記ダイオードレーザは、６５０ｎｍ未満の波長で少なくとも１０ｍＷの出力を有することを特徴とする請求項５４記載のフローサイトメトリー装置。
92. 前記ダイオードレーザによる前記サンプルへのインタロゲーション（ｉｎｔｅｒｒｏｇａｔｉｏｎ）によって前記サンプル中の蛍光化合物から放射される光を収集する能力を有する装置をさらに含むことを特徴とする請求項５４記載のフローサイトメトリー装置。

Images