JP2016524703A5 - イメージフローサイトメーター、システム及び方法 - Google Patents
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Description
図3Aに示すように、デフレクタ23を通過したレーザ光Lは、対物レンズ24によりフローチャンバ1のマイクロ流路12に、例えば回折限界まで収束される。一例においては、レーザ光は、約2.0μmの半値幅のレーザスポットに収束される。以降、レーザ照射スポットは、スポット中心から光強度がスポット中心の半分となる位置までの領域として定義される。微小粒子状試料は、上述のマイクロ流路の性質により、マイクロ流路の中心付近にセルフアライメントされる。よって、レーザ光の焦点は、照射スポットにより走査される経路がマイクロ流路の中心を通過するように構成され、例えば回折限界まで収束されるレーザ光を、マイクロ流路を流動する微小粒子状試料上に照射することを容易にする。なお、この例では、レーザ光Lのデフレクタ23による偏向角は小さい。従って、レーザ光がフローチャンバ1の平板形状部材17を介して入射しても、屈折による焦点位置の変位のような影響は、無視できるほどに小さい。
図3Bは、照射光学系2の他の構成である照射光学系20の構成を模式的に示すブロック図である。照射光学系20は、図3Aに示す照射光学系2にλ/4板25が追加された構成を有する。λはレーザ光源21からの光の波長である。λ/4板25は、レーザ光Lの光路に配置される。例えば、λ/4板25は、デフレクタ23と対物レンズ24との間に挿入される。λ/4板25は、直線偏光を円偏光に変換する。円偏光をもたらす他の光学構造も用いることができる。生体細胞又はタンパク質は、一般的に偏光特性を示す。よって、偏光顕微鏡は、生物学的観察にとって有益である。微小粒子状試料中の材質の偏光特性を検出するには、入射光ビームは全方位で対称であることが望ましい。円偏光ビームは、この性質を示す点で好都合である。しかし、多くのAOD及びEODは入射ビームの直線偏光、典型的には垂直偏光を用いて動作する。直線偏光から円偏光への変換のために1/4波長板を挿入することで、AOD又はEODを用いることができるようになり、かつ、円偏光の好ましい生物学的性質を保つことができる。以下で図6を参照して説明するように、p及びs偏光成分の検出により、微小粒子状試料の偏光特性を決定できる。図4A及び4Bに、偏光成分検出のために設計される検出光学系の例を示す。
図4Bは、検出光学系3の光検出器34の構成例を示す構成図である。光検出器34は、上述の照射光学系20と共に用いられる。光検出器34は、偏光ビームスプリッタ341、s偏光検出器343及びp偏光検出器342を有する。共焦点絞り36を通過した光は、偏光ビームスプリッタ341に入射する。光L11に含まれるs偏光L_sはビームスプリッタ341で反射され、光L11に含まれるp偏光L_pは偏光ビームスプリッタ341を透過する。s偏光検出器343は、s偏光の光強度を検出し、検出信号SIG_Tsを検出結果として出力する。p偏光検出器342は、p偏光の光強度を検出し、検出信号SIG_Tpを検出結果として出力する。検出信号SIG_Ts及びSIG_Tpは、図4Aに示す検出信号SIG_Tの一部である。
様々な態様においては、流速、スポットサイズ、および、X軸偏向周波数パラメータは、(1)微小粒子状試料の望ましい領域の蛍光染料マーカーの励起強度レベルが閾値を超えるように、かつ、(2)望ましい走査イメージの解像度、ビット深さ、及び精細さをもたらすように設定される。様々な態様においては、スポットサイズが選択され、その後、流速と走査周波数とが制御される。例としては、半値全幅(FWHM)が2.0μm、偏向周波数が1MHz、流速が1m/sのスポットが挙げられる。この例では、ガウス分布のスポットの光強度の1/2よりも大きな光強度を有する1μmの走査垂直解像度をもたらす。2μmの半値全幅は、例えば血球のような10μmの粒子からのデータを有効な焦点深度にて有測定するのに好都合である。他の例においては、スポットサイズは0.5μmであり、より高い解像度をもたらす。流速は1/4m/sとすることができ、走査周波数を4MHzとすることができ、又は、これらの組み合わせとすることができる。一般に、スポットサイズを小さくするのと同じ割合で、流速を減少させ、又は、走査周波数を増加させることができ、その逆もまた成立する(スポットを大きくし、流速を増大又は走査周波数を減少させる)。流速は、望ましい解像度とスループットとを両立させるように選択される。速い流れは、高いスループットと低い垂直解像度をもたらす。遅い流れでは、スループットが低下するとともに、垂直解像度が改善される。水平解像度は、走査周波数とサンプリング周波数(例えば、1走査あたりのサンプル数)とで決定される。粒子の絶対的なサイズと形状とを有利に測定できるように、これらのパラメータを選択することができる。従来のフローサイトメーターは、このような測定を行う能力を提供しない。
大きなビームスポットで試料を照射する一般的なフローサイトメトリー装置では、ビームスポットの光強度は分布(例えば、ガウス分布)を有する。そのため、ビームスポット内での試料の位置により、検出感度にばらつきが生じる。例えば、微小粒子状試料が従来のフローサイトメーターの照射領域の中心にない場合、微小粒子状試料が照射領域の中心にある場合よりも信号強度が低くなる。一方、本構成を含む、本明細書で説明する様々な発明態様においては、ビームスポットは微小粒子状試料よりも小さい。これにより、試料の位置による検出感度の変動を大きく低減し、ほとんど排除することができる。また、これにより、直線掃引範囲でのレーザ照射スポットの光強度分布による変動を実質的に低減できる。微小粒子状試料を走査する小スポットは、一定の走査速度の領域内で均一な照明を提供できる。従来のスキームは、先端の幅が広い油性マーカーペンと幾分似ている。掃引領域の端よりも中央の方がカバレッジが大きい(光強度がより強い、又は、インクがより濃い)。微小スポットを用いることで、光強度の中心から端へのロールオフを都合よく減少させることができる。
様々な態様においては、微小粒子状試料61を観察するためのイメージフローサイトメーター100は、フローチャンバ1を有する。フローチャンバ1は、流れ方向(例えば+Y)に微小粒子状試料61を流動させるようにフローチャンバ1に形成されたマイクロ流路12を有する。少なくとも1つの照射光学系(例えば照射光学系2)は、選択された代表的サイズよりも小さな照射スポットの入射光Lで、フローチャンバ1の微小粒子状試料を照射できるように構成される。代表的サイズは、観察される微小粒子状試料61又は他の対象物の性質に応じて選択される。例えば、上述のように、血球は、〜10μmの直径を有する。代表的サイズは、2μmよりも大きなFWHM、例えばFWHMが3μmに設定され、2μmのスポット(3μmよりも小さい)を用いることができる。また、照射光学系2は、流れ方向に実質的に直交する方向(例えば、図8Aの±X)に照射スポットの照射位置を走査する。少なくとも1つの検出光学系(例えば、検出光学系3又は4)が、フローチャンバ1から生じた光(例えば、L_T−FS、L_T−SS、Lf)の光強度を検出する。検出光学系3は、フローチャンバ1を介して照射光学系2と向かい合っている。また、検出光学系4(例えば検出光学系4)は、入射光の光軸からずれた位置に配置することができる。FS検出器は、正確に入射光Lの光軸上にある必要はないが(図1)、例えば光軸の±1°、±5°、±10°又は±15°以内とすることができる。制御部5は、検出光学系3で検出された結果光の光強度の変化に応じて微小粒子状試料を検出する。
実施の形態2
次に、実施の形態2にかかるイメージフローサイトメーター200について説明する。イメージフローサイトメーター200は、走査型イメージフローサイトメーターとして構成することができる。図9は、実施の形態2にかかるイメージフローサイトメーター200の概要構成を示す構成図である。イメージフローサイトメーター200は、実施の形態1にかかるイメージフローサイトメーター100に、流速測定器6を追加した構成を有する。
次に、実施の形態2にかかるイメージフローサイトメーター200について説明する。イメージフローサイトメーター200は、走査型イメージフローサイトメーターとして構成することができる。図9は、実施の形態2にかかるイメージフローサイトメーター200の概要構成を示す構成図である。イメージフローサイトメーター200は、実施の形態1にかかるイメージフローサイトメーター100に、流速測定器6を追加した構成を有する。
実施の形態3
次に、実施の形態3にかかるイメージフローサイトメーター300について説明する。イメージフローサイトメーター300は、走査型イメージフローサイトメーターとして構成することができる。図10は、実施の形態3にかかるイメージフローサイトメーター300の概要構成を示す構成図である。イメージフローサイトメーター300は、実施の形態1にかかるイメージフローサイトメーター100の照射光学系2を、照射光学系7に置換した構成を有する。
次に、実施の形態3にかかるイメージフローサイトメーター300について説明する。イメージフローサイトメーター300は、走査型イメージフローサイトメーターとして構成することができる。図10は、実施の形態3にかかるイメージフローサイトメーター300の概要構成を示す構成図である。イメージフローサイトメーター300は、実施の形態1にかかるイメージフローサイトメーター100の照射光学系2を、照射光学系7に置換した構成を有する。
実施の形態4
次に、実施の形態4にかかるイメージフローサイトメーター400について説明する。イメージフローサイトメーター400は、走査型イメージフローサイトメーターとして構成することができる。図17は、実施の形態4にかかるイメージフローサイトメーター400の概要構成を示す構成図である。イメージフローサイトメーター400は、実施の形態1にかかるイメージフローサイトメーター100に追加的な照射光学系8及び検出光学系9を追加した構成を有する。図面の簡略化のため、図17では、検出光学系4(図1)の表示を省略している。検出光学系4は、系2、3、8、9と共に用いることも、用いないこともできる。4つの検出光学系は、入射光(例えば、光La、Lb)の2つの異なる軸に沿った前方及び側方散乱の測定を行うために用いることもできる。
次に、実施の形態4にかかるイメージフローサイトメーター400について説明する。イメージフローサイトメーター400は、走査型イメージフローサイトメーターとして構成することができる。図17は、実施の形態4にかかるイメージフローサイトメーター400の概要構成を示す構成図である。イメージフローサイトメーター400は、実施の形態1にかかるイメージフローサイトメーター100に追加的な照射光学系8及び検出光学系9を追加した構成を有する。図面の簡略化のため、図17では、検出光学系4(図1)の表示を省略している。検出光学系4は、系2、3、8、9と共に用いることも、用いないこともできる。4つの検出光学系は、入射光(例えば、光La、Lb)の2つの異なる軸に沿った前方及び側方散乱の測定を行うために用いることもできる。
照射光学系8は、照射光学系2と同様の構成を有し、フローチャンバ1を基準として照射光学系2に対して、例えば90°回転した位置に配置される。検出光学系9(配置角度又は方向性の制限なく、垂直検出光学系として参照される)は、検出光学系3(平行検出光学系)と同様の構成を有し、フローチャンバ1を介して照射光学系8と向かい合う位置に配置される。この例では、照射光学系8と検出光学系9とは、X−Z平面に配置される。照射光学系8と検出光学系9とは、X−Y平面、又は、例えばX−Y、X−Z又はY−Z平面に対して45°の他の面に配置することもできる。参照を図1に戻すと、一例においては、照射光学系2、8と検出光学系3、9とは、X−Z平面に配置され、(照射光学系2に対応する測方散乱光L_F−SSを検出するための)検出光学系4は、Z軸周りに例えば5°〜85°、具体的には15°、30°、45°又は60°の少量だけX−Z平面が回転された平面に配置することができる。
Claims (20)
- 微小粒子状試料を観察するイメージフローサイトメーターであって、
前記微小粒子状試料を流れ方向に流動させることができる流路が形成されたフローチャンバと、
2μm以下の半値全幅を有する照射スポットの入射光で前記流路内の前記微小粒子状試料を照射するように、かつ、前記流路内の前記微小粒子状試料を少なくとも部分的に横切って前記照射スポットの照射位置を走査するように構成され、前記流れ方向に対して実質的に垂直な軸に沿った第1の方向と前記第1の方向と反対の軸に沿った第2の方向に前記照射スポットの照射位置するように構成される、少なくとも1つの照射光学系と、
前記照射位置が前記第1の方向に走査されている間および前記照射位置が前記第2の方向に走査されている間に前記フローチャンバからの透過光の光強度に対応する第1の結果光データを与えるように構成される第1の光検出器と、前記照射位置が前記第1の方向に走査されている間および前記照射位置が前記第2の方向に走査されている間に前記フローチャンバからの回折光の光強度に対応する第2の結果光データを与えるように構成される第2の光検出器と、を有する少なくとも1つの検出光学系と、
前記検出光学系からの前記第1の結果光データまたは前記2の結果光データの変化に少なくとも部分的に基づいて前記微小粒子状試料を検出する制御部と、を備える、
イメージフローサイトメーター。 - 前記照射光学系は、前記入射光を回折限界まで収束させるように構成される、
請求項1に記載のイメージフローサイトメーター。 - 前記制御部は、前記微小粒子状試料の前記流れ方向に対して垂直である前記流路の断面の中心を前記入射光の焦点が通過するように、前記照射光学系に前記照射位置を走査させるように構成される、
請求項1に記載のイメージフローサイトメーター。 - 前記検出光学系は、前記照射位置が前記第1の方向に走査されている間および前記照射位置が前記第2の方向に走査されている間に前記フローチャンバからの側方散乱光の光強度に対応する第3の結果光データを与えるように構成される第3の光検出器を更に備え、
前記制御部は、更に、前記検出光学系からの第3の結果光データの変化に少なくとも部分的に基づいて前記微小粒子状試料を検出するように構成される、
請求項1に記載のイメージフローサイトメーター。 - 前記照射光学系はレーザを有し、前記入射光は前記レーザからの光を含む、
請求項1に記載のイメージフローサイトメーター。 - 前記照射光学系は、前記照射位置を走査するために、実質的に前記軸に沿って、前記入射光を偏向させる光デフレクタを有する、
請求項5に記載のイメージフローサイトメーター。 - 前記光デフレクタは、音響光学デフレクタ又は電気光学デフレクタを含む、
請求項6に記載のイメージフローサイトメーター。 - 微小粒子状試料を流れ方向に流動させることができる流路が形成されたフローチャンバと、
照射スポットの入射光で前記流路内の前記微小粒子状試料を照射するように、前記流れ方向に対して実質的に垂直に、かつ、前記流路内の前記微小粒子状試料を少なくとも部分的に横切って前記照射スポットの照射位置を走査するように構成される、少なくとも1つの照射光学系と、
前記照射位置が走査されている間に前記フローチャンバからの透過光の光強度に対応する第1の結果光データを与えるように構成される第1の光検出器と、前記照射位置が走査されている間に前記フローチャンバからの回折光の光強度に対応する第2の結果光データを与えるように構成される第2の光検出器と、を有する少なくとも1つの検出光学系と、
前記第1の結果光データまたは前記第2の結果光データの変化に少なくとも部分的に基づいて前記微小粒子状試料を検出する制御部と、を備え、
前記制御部は、
前記微小粒子状試料の流速および走査速度から決定される座標を、少なくとも前記第1の結果光データまたは前記第2の結果光データと関連付け、
少なくとも前記微小粒子状試料の前記透過光または前記回折光の2次元分布を決定する、
ように構成される、
システム。 - 前記制御部は、前記2次元分布を示す2次元画像を提供するように構成される、
請求項8に記載のシステム。 - 複数の検出光学系と複数の照射光学系とを更に備え、前記複数の検出光学系は少なくとも1つの検出光学系を有し、前記複数の照射光学系は少なくとも1つの照射光学系を有し、
前記複数の検出光学系のそれぞれは、前記複数の照射光学系のそれぞれに対して、前記フローチャンバの反対側に配置され、
前記制御部は、
前記複数の検出光学系のそれぞれについて複数の2次元分布のそれぞれを決定し、前記複数の2次元分布は前記2次元分布を含み、
前記複数の2次元分布のそれぞれを複数組み合わせることで、少なくとも前記微小粒子状試料の前記透過光または前記回折光の3次元分布を生成する、
ように構成される、
請求項8に記載のシステム。 - 前記制御部は、少なくとも前記微小粒子状試料の前記透過光または前記回折光の3次元分布を示す3次元画像を生成するように構成される、
請求項10に記載のシステム。 - 前記微小粒子状試料の前記流速を測定し、前記制御部へ測定結果を出力する流速測定部を更に備える、
請求項8に記載のシステム。 - 前記制御部は、前記流速測定部からの前記測定結果に応じて、前記微小粒子状試料の前記流速を連続的に更新するように構成される、
請求項12に記載のシステム。 - 前記流速測定部は、前記流路内に配置され、又は、前記流路に接続され、前記流路を流れる前記微小粒子状試料の前記流速を観測する、
請求項12に記載のシステム。 - 前記流速測定部は、前記照射光学系と前記制御部とを含み、
前記照射光学系は、複数の回折光ビームを含む前記入射光を提供する位相格子を有し、
前記照射光学系は、前記流路の流れの前記方向の沿った互に異なる位置に前記複数の回折光ビームを指向させ、
前記制御部は、前記複数の回折光ビームから選択された2つの回折光ビームの照射位置の間の距離と、前記微小粒子状試料が前記照射位置を通過するときに得られる時間差とから、前記微小粒子状試料の前記流速を算出するように構成される、
請求項12に記載のシステム。 - 前記照射光学系は、前記流れ方向に対して垂直な1以上の軸に実質的に沿って、前記照射位置のそれぞれを走査するように構成される、
請求項15に記載のシステム。 - 前記照射光学系は、複数の光ビームを含む前記入射光を提供するように構成され、
前記照射光学系は、互いに異なる角度で、前記複数の光ビームを前記照射スポットに指向させ、
前記検出光学系は、前記光ビームのそれぞれに対応する、互いに分離された結果光データを与えるように構成され、
前記制御部は、検出された前記分離された結果光データを用いて、前記微小粒子状試料の3次元画像を算出するように構成される、
請求項1に記載のイメージフローサイトメーター。 - 前記照射光学系は、光源と、前記複数の光ビームを含む前記入射光を提供するために前記光源からの光を回折させる位相格子と、を有する、
請求項17に記載のイメージフローサイトメーター。 - 複数の微小粒子状試料を前記流路に供給するように構成された流動誘起装置を更に備え、
前記複数の微小粒子状試料は前記微小粒子状試料を含み、
前記照射光学系は、照射体積にわたって前記照射位置を走査し、前記流路は前記複数の微小粒子状試料のうち1つのみが前記照射体積内に存在できるように形成される、
請求項1に記載のイメージフローサイトメーター。 - 微小粒子状試料を輸送する流体の流れをフローチャンバに与え、
前記フローチャンバ内の前記微小粒子状試料を少なくとも部分的に横切って前記微小粒子状試料よりも小さい照射スポットを走査し、前記走査は前記流体の流れの方向に対して実質的に垂直な軸に沿った第1の方向および前記第1の方向と反対の軸に沿った第2の方向の走査を含み、
照射位置が前記第1の方向に走査されている間および前記照射位置が前記第2の方向に走査されている間に、透過光の第1の検出信号と、前記照射スポットでの波長と実質的に同じ波長を有する回折光の第2の検出信号と、を検出し、
前記第1及び第2の検出信号と前記流体の流れの速度を用いて前記微小粒子状試料のイメージマップを決定する、
方法。
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