CN110945403A - 试样观察装置和试样观察方法 - Google Patents
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Abstract
试样观察装置(1)包括:流动池(2),其中流动含有试样(S)的流体;照射部(11),其向流动池(2)内流动的试样(S)照射面状光(L2);成像部(17),其具有相对于面状光(L2)的照射面(R)倾斜的观察轴(P2),使通过面状光(L2)的照射而在试样(S)产生的观察光(L3)成像;二维拍摄元件(20),其拍摄由成像部(17)成像的观察光(L3)的光像中的至少包含流体的截面的光像,并输出图像数据;和解析部(33),其基于图像数据,解析在流体的流动方向上的试样(S)的光强度分布。
Description
技术领域
本发明涉及试样观察装置和试样观察方法。
背景技术
作为观察细胞等的具有三维立体构造的试样的内部的装置之一,例如具有使用了专利文献1中所记载的时间延迟积分(TDI)型图像传感器的流式细胞仪。流动池基于流体力学而设计,在流动池之中形成由含有试样的样品悬浮液的流动(样品流)和鞘液的流动(鞘流)产生的层流。由于使样品流的压力略低于鞘流的压力,所以在样品流中产生流体力学性收缩。由此,被鞘流包围的样品流的流径变得非常小,可在流动池内顺序流动细小的试样。
现有技术文献
专利文献
专利文献1:美国专利申请公开第2002/0071121号说明书。
发明内容
发明所要解决的问题
在使用了流式细胞仪的细胞抗原测定等的定性的测定中,通过将样品流的压力设定得较高,提高样品流的流速,能够确保直到获得试样的解析结果的处理能力。然而,如果提高处理能力,则分解能降低或从流动池内的流体产生的自发荧光引起的本底会上升。
本发明是为了解决上述问题而完成的,其目的在于,提供即使在提高处理能力的情况下,也能够适当实施试样的观察的试样观察装置和试样观察方法。
用于解决问题的技术方案
本发明的一方面所涉及的试样观察装置包括:流动池,其中流动含有试样的流体;照射部,其向流动池内流动的试样照射面状光;成像部,其具有相对于面状光的照射面倾斜的观察轴,使通过面状光的照射而在试样产生的观察光成像;二维拍摄元件,其拍摄由成像部成像的观察光的光像中的至少包含流体的截面的光像,并输出图像数据;和解析部,其基于图像数据,解析在流体的流动方向上的试样的光强度分布。
在该试样观察装置中,向流动池内所流动的试样照射面状光,来自试样的观察光通过具有相对于面状光的照射面倾斜的观察轴的成像部而成像。另外,由成像部成像的观察光由二维拍摄元件拍摄,生成基于至少包含流体截面的光像的图像数据。因此,即使是在流体的截面内存在多个试样的情况下,也能够在解析部中分离来自各试样的观察光,来解析光强度分布。因此,即使是提高处理能力的情况下,也能够适当实施试样的观察。
另外,照射部的面状光的光轴也可以与流动池中的面状光的入射面正交。该情况下,不需要通过二维拍摄元件取得的图像数据的位置修正等,能够使光强度分布的解析处理容易化。
另外,照射部的面状光的光轴也可以与流动池中的流体的流动方向正交。该情况下,不需要通过二维拍摄元件取得的图像数据的位置修正等,能够使光强度分布的解析处理容易化。
另外,解析部也可以基于图像数据来解析试样的流速。流动池内的样品流的流速具有在样品流的中心侧和其周围不同的情况。该情况下,认为难以判别每个试样的光强度分布的差异是基于试样的大小的不同引起的,还是基于流速的不同引起的。因此,在解析试样的流速的情况下,可以容许样品流的流速不均,使流式细胞术的控制变得容易。
另外,解析部也可以基于试样的流速修正光强度分布。该情况下,通过光强度分布的修正可提高试样的解析精度。
另外,二维拍摄元件也可以通过读出子阵列来拍摄由成像部成像的观察光的光像中的至少包含流体的截面的光像。该情况下,由于能够提高二维拍摄元件的帧频率,所以能够进一步提高处理能力。
另外,成像部包括物镜和配置于流动池与物镜之间的第一光学元件,第一光学元件也可以是具有比成像部的配置空间的折射率大的折射率,且与没有配置该第一光学元件的情况相比,使从试样射出的观察光的相对于面状光的照射面的倾斜角度增大的光学元件。通过这样的第一光学元件的配置,即使是成像部的观察轴相对于面状光的照射面倾斜的情况下,也能够提高观察图像的Z方向的析像度。
另外,第一光学元件也可以是楔形棱镜。该情况下,也能够降低观察光的像散。
另外,第一光学元件也可以是组合一对楔形棱镜而成的双棱镜。该情况下,也能够降低观察光的色像差。
另外,成像部包括:配置于物镜的后段侧的成像透镜;和配置于成像透镜与二维拍摄元件之间的第二光学元件,第二光学元件也可以是使观察光的一个轴的光线弯曲,且使与一个轴正交的另一个轴的光线不弯曲的非轴对称的光学元件。通过这样的第二光学元件的配置,能够进一步降低观察光的像散。
另外,第二光学元件也可以是楔形棱镜。能够进一步降低观察光的像散。
另外,第二光学元件也可以是组合一对楔形棱镜而成的双棱镜。该情况下,能够进一步降低观察光的色像差。
另外,本发明的一方面的试样观察方法包括下述步骤:流体形成步骤,使流动池内流动包含试样的流体;照射步骤,向流动池内流动的试样照射面状光;成像步骤,通过具有相对于面状光的照射面倾斜的观察轴的成像部,使通过面状光的照射而在试样产生的观察光成像;拍摄步骤,通过二维拍摄元件拍摄由成像部成像的观察光的光像中的至少包含流体的截面的光像,并输出图像数据;和解析步骤,基于图像数据,解析在流体的流动方向上的试样的光强度分布。
在该试样观察方法中,向流动池内所流动的试样照射面状光,通过具有相对于面状光的照射面倾斜的观察轴的成像部而将来自试样的观察光成像。另外,利用二维拍摄元件拍摄由成像部成像的观察光,生成基于至少包含流体截面的光像的图像数据。因此,即使是在流体的截面内存在多个试样的情况下,也能够在解析部中分离来自各试样的观察光,来解析光强度分布。因此,即使是提高处理能力的情况下,也能够适当实施试样的观察。
另外,在照射步骤中,也可以使面状光的光轴与流动池中的面状光的入射面正交。该情况下,不需要通过二维拍摄元件取得的图像数据的位置修正等,能够使光强度分布的解析处理容易化。
另外,在照射步骤中,也可以使面状光的光轴与流动池中的流体的流动方向正交。该情况下,不需要通过二维拍摄元件取得的图像数据的位置修正等,能够使光强度分布的解析处理容易化。
另外,在解析步骤中,也可以基于图像数据来解析试样的流速。流动池内的样品流的流速具有在样品流的中心侧和其周围不同的情况。该情况下,认为难以判别每个试样的光强度分布的差异是基于试样的大小的不同引起的,还是基于流速的不同引起的。因此,在解析试样的流速的情况下,可以容许样品流的流速不均,使流式细胞术的控制变得容易。
另外,在解析步骤中,也可以基于试样的流速来修正光强度分布。该情况下,通过光强度分布的修正,可提高试样的解析精度。
另外,在拍摄步骤中,也可以通过读出二维拍摄元件的子阵列来拍摄成像步骤中成像的观察光的光像中的至少包含流体的截面的光像。该情况下,由于可以提高二维拍摄元件的帧频率,因此能够进一步提高处理能力。
另外,在成像步骤中,使用有物镜和配置于流动池与物镜之间的第一光学元件,第一光学元件也可以是具有比成像部的配置空间的折射率大的折射率,且与没有配置该第一光学元件的情况相比,使从试样射出的观察光的相对于面状光的照射面的倾斜角度增大的光学元件。通过这样的第一光学元件的配置,即使是成像部的观察轴相对于面状光的照射面倾斜的情况下,也能够提高观察图像的Z方向的析像度。
另外,第一光学元件也可以是楔形棱镜。该情况下,也能够降低观察光的像散。
另外,第一光学元件也可以是组合一对楔形棱镜而成的双棱镜。该情况下,也能够降低观察光的色像差。
另外,在成像步骤中,使用有配置于物镜的后段侧的成像透镜和配置于成像透镜与二维拍摄元件之间的第二光学元件,第二光学元件也可以是使观察光的一个轴的光线弯曲,且使与一个轴正交的另一个轴的光线不弯曲的非轴对称的光学元件。通过这样的第二光学元件的配置,能够进一步降低观察光的像散。
另外,第二光学元件也可以是楔形棱镜。能够进一步降低观察光的像散。
另外,第二光学元件也可以是组合一对楔形棱镜而成的双棱镜。该情况下,能够进一步降低观察光的色像差。
发明效果
根据本发明,即使是提高处理能力的情况,也能够适当实施试样的观察。
附图说明
图1是表示试样观察装置的一实施方式的框图。
图2是表示图1所示的试样观察装置的照射部、流动池和成像部的结构例的概略图。
图3中的(a)和(b)是表示拍摄部的结构例的图。
图4是表示构成试样观察装置的计算机的功能的结构要素的一例的框图。
图5中的(a)和(b)是表示图像处理部的观察图像的生成例的图。
图6中的(a)是表示XZ图像中出现的试样的XZ像的一例的图,(b)是在YZ图像出现的试样的YZ像的一例的图。
图7中的(a)~(c)是表示对于试样的光强度分布的取得的情况的图。
图8中的(a)~(c)是表示对于大小不同的试样的光强度分布的取得的情况的图。
图9中的(a)~(c)是表示对于流速不同的试样的光强度分布的取得的情况的图。
图10中的(a)和(b)是表示试样的流速的解析方法的一例的图。
图11是表示使用了图1所示的试样观察装置的试样观察方法的一例的流程图。
图12是表示试样观察装置的视野的计算例的图。
图13是表示观察轴的倾斜角度和析像度的关系的图。
图14是表示成像部的第一光学元件的配置例的图。
图15是表示没有配置第一光学元件的情况的观察光的光线的图。
图16是表示配置了第一光学元件的情况的观察光的光线的图。
图17是表示成像部的第二光学元件的配置例的图。
具体实施方式
以下,参照附图,对本发明的一方面的试样观察装置和试样观察方法的优选实施方式详细进行说明。
图1是表示试样观察装置的一实施方式的框图。该试样观察装置1是使由试样S产生的荧光或散射光在成像面成像,取得试样S的观察图像数据,并基于该观察图像数据进行试样S的解析和评价的装置。试样观察装置1作为具有流动含有试样S的流体的流动池2的流式细胞仪而构成。作为成为观察对象的试样S,列举例如人或动物的细胞、组织等。
使含有试样S的流体流动的流动池2基于流体力学而设计。在流动池2的管5内形成由含有试样S的样品悬浮液的流动(以下,称为样品流F1)和鞘液的流动(以下,称为鞘流F2)产生的层流。形成样品流F1和鞘流F2的流体例如为水。
样品流F1的压力和鞘流F2的压力由压缩器(未图示)控制。通过使样品流F1的压力略低于鞘流F2的压力,从而在样品流F1中产生流体力学的收缩。由此,被鞘流F2包围的样品流F1的流径变得非常小,能够使细胞等细小的试样S在流动池2内顺次流动。在试样观察装置1中,试样S也可以相对于面状光L2的照射面R(参照图2)逐个通过,多个试样S也可以在流动方向或样品流F1的径向以重叠的状态通过。另外,这些通过状态也可以混合。
构成流动池2的管5由相对于后述的面状光L2具有透明性的部件形成为例如截面圆形。作为具有透明性的部件,例如列举玻璃、石英、合成树脂等。管5的侧面部分作为面状光L2的入射面5a发挥功能。
试样观察装置1如图1所示,具有照射部11、拍摄部13、计算机14而构成。照射部11将面状光L2作为激励光朝向试样S照射。照射部11如图2所示,由光源15和面状光形成部16构成。光源15输出成为面状光L2的形成源的光L1。作为光源15,例如列举激光二极管、固态激光光源这类激光光源等。另外,光源15也可以是发光二极管、超发光二极管、灯类光源。从光源15输出的光L1被导入面状光形成部16。
面状光形成部16将从光源15输出的光L1整形为面状光L2,整形后的面状光L2沿着光轴P1向试样S照射。在本实施方式中,面状光形成部16的光轴为面状光L2的光轴P1。面状光形成部16例如包含圆柱透镜、轴锥透镜、或空间光调制器等光整形元件构成,与光源15光学性耦合。面状光形成部16也可以包含物镜、光闸等而构成。
由面状光形成部16形成的面状光L2向流动池2中流动的试样S照射。通过面状光L2的照射,在面状光L2的照射面R产生观察光L3。观察光L3中例如可以包含通过面状光L2而在试样S中被激励的荧光、在试样S的表面散射的面状光L2的散射光或扩散反射光、由流动池2内流动的样品流F1和鞘流F2产生的自身荧光等。在以下的说明中,如图2所示,将面状光L2的光轴P1方向称为Z轴,将流动池2的试样S的流动方向称为Y轴,将在与面状光L2的光轴P1正交的平面内与Y轴正交的方向称为X轴。对试样S照射的面状光L2的照射面R为XZ平面内的面。
在试样S的厚度方向进行观察的情况下,考虑分解能,面状光L2优选是厚度2mm以下的薄的面状光。另外,在试样S的厚度非常小的情况,即观察Z方向析像度以下的厚度的试样S的情况下,面状光L2的厚度不会影响分解能。该情况下,也可以使用厚度超过2mm的面状光L2。
在本实施方式中,设置有用于将通过面状光L2的照射而在试样S产生的观察光成像的成像部17。成像部17如图2所示,例如包含物镜18和未图示的成像透镜等而构成。成像部17的光轴为观察光L3的观察轴P2。该成像部17的观察轴P2相对于试样S的面状光L2的照射面R保持倾斜角度θ地倾斜。倾斜角度θ也与朝向试样S的面状光L2的光轴P1和观察轴P2所成的角一致。倾斜角度θ为10°~80°。从提高观察图像的析像度的观点来看,倾斜角度θ优选为20°~70°。另外,从提高观察图像的析像度和视野的稳定定性的观点来看,更优选倾斜角度θ为30°~65°。
拍摄部13拍摄由成像部17成像的观察光L3的光像中至少包含流体的截面的光像。拍摄部13具有二维拍摄元件20而构成。作为二维拍摄元件20,例如列举CMOS图像传感器、CCD图像传感器这种区域图像传感器。这些区域图像传感器配置于成像部17的成像面,例如由全局快门或滚动快门拍摄光像,生成二维图像数据(图像数据)。
在二维拍摄元件20中,也可以通过读出子阵列来进行部分图像数据(图像数据)的输出。例如图3中的(a)所示,在读出子阵列时,在区域图像传感器21的拍摄面设定子阵列,可以仅读出包含于被设定的子阵列中的像素列21a。该情况下,在二维拍摄元件20中通过读出子阵列,能够局部拍摄观察光L3所产生的光像。另外,如图3中的(b)所示,将区域图像传感器21的全部的像素列设为读出区域,通过之后的图像处理也可以将二维图像的一部分作为局部图像数据(图像数据)提取。
计算机14物理上具有RAM、ROM等存储器和CPU等处理器(运算电路)、通信接口、硬盘等存储部、显示器等显示部而构成。作为该计算机14,例如列举个人计算机、微型计算机、运服务器、智能设备(智能电话、平板终端等)等。计算机14通过计算机系统的CPU执行存储于存储器的程序,从而作为控制光源15和拍摄部13的动作的控制器发挥功能。另外,面状光形成部16由空间光调制器构成的情况下,计算机14也可以作为控制面状光形成部16的空间光调制器的动作的控制器发挥功能。
作为控制器的计算机14接受用户的测定开始的操作的输入,使光源15和拍摄部13同步驱动。由此,对流动池2内流动的试样S照射面状光L2,由拍摄部13拍摄来自照射面R的观察光L3中至少包含流体的截面的光像。而且,基于该光像的图像数据被输出到计算机14。计算机14也可以控制光源15,以便光源15连续输出光L1,也可以与拍摄部13进行的拍摄一致地控制光源15的光L1的输出的打开/关闭。另外,照射部11具有光闸的情况下,计算机14也可以通过该光闸的控制使光L1的照射打开/关闭。
另外,计算机14作为功能性的结构要素,如图4所示,具有拍摄结果接收部31、图像处理部32、解析部33。拍摄结果接收部31是从拍摄部13接收拍摄数据的部分。即,拍摄结果接收部31接收基于观察光L3所产生的光像中的至少含有流体的截面的光像而获得的图像数据,输出到图像处理部32。
图像处理部32基于从拍摄结果接收部31输出的图像数据生成观察图像。在试样观察装置1中,如上所述,试样S在流动池2内向Y轴方向流动,面状光L2的照射面R位于XZ平面内。因此,如图5中的(a)所示,向图像处理部32关于Y轴方向输出多个基于图像数据的XZ图像G1。图像处理部32对于各XZ图像G1确定构成试样S的XZ像(荧光像等的观察像)M1的像素,通过将未构成各XZ图像G1的试样S的XZ像M1的像素的像素值设为规定的值(例如零),生成抑制本底的XZ图像G1。图像处理部32将生成的多个XZ图像G1作为XYZ数据输出到解析部33。此外,图像处理部32如图5中的(b)所示,也可以从各XZ图像G1之中提取相当于包含试样S的XZ像M1的部分的XZ图像G2,将这些多个XZ图像G2作为XYZ数据输出到解析部33。
解析部33将从图像处理部32接收的XYZ数据的XZ图像G1、G2作为解析对象。图6中的(a)是表示XZ图像G1中出现的试样S的XZ像M1的一例的图。作为该XZ图像G1的试样S的三维方向的扩展成分,在X轴方向和Z轴方向包含在成像部17所含的透镜等的光学像差引起的光学像差。因此,如图6中的(a)所示,在XZ图像G1中出现的试样S的XZ像M1中含有观察光L3产生的光像的实像T1和在实像T1的周围产生的实像的模糊像T2。
另外,解析部33也可以根据从图像处理部32接收的XYZ数据生成多个YZ图像G3,将YZ图像G3作为解析对象。图6中的(b)是表示在YZ图像G3中出现的试样S的YZ像M2的一例的图。作为该YZ图像G3的试样S的三维方向的扩展成分,在Y轴方向包含基于向试样S照射的面状光L2的分布的虚像。因此,如图6中的(b)所示,在YZ图像出现的试样S的YZ像M2中含有观察光L3产生的光像的实像U1、基于面状光L2的分布的虚像U2、该虚像和实像的模糊像U3。
解析部33将XZ图像G1、G2或YZ图像G3作为解析对象,解析在流体的流动方向上的试样S的光强度分布。解析部33基于XYZ图像的XZ图像G1、G2生成试样S的光强度分布。图7中的(a)~(c)是表示取得试样的光强度分布的情况的图。在本实施方式中,试样S的光强度分布显示为观察光L3的光强度的时间波形。如该图所示,流动池2内流动的试样S到达面状光L2的照射面R时,光强度上升,在试样S通过照射面R的中央部分的附近光强度为最大值。试样S通过照射面R的中央部分时,光强度降低,作为整体获得大致高斯形状的光强度分布。
图8中的(a)~(c)是表示取得相对于大小不同的试样的光强度分布的情况的图。在此,例示试样S的大小与图7的情况相比较小,试样S的流速和光量与图7的情况相同的情况。该情况下,试样S通过照射面R所需要的时间缩短,另一方面,试样S的光强度的累计值与图7的情况相同。因此,光强度的时间波形与图7的情况相比,为半峰全宽小且最大值高的陡峭的波形。
然而,在流动池2内流动的样品流F1的流径与试样S的大小相比,足够大的情况下,外侧部分的流速比样品流F1的中心部分的流速慢,认为在流速上产生了差异。该情况下,如果假定为试样S的大小与图7的情况相同,如图9中的(a)~(c)所示,光强度的时间波形与图7的情况相比,为半峰全宽小且最大值高的陡峭的波形。因此,在与图8的情况之间难以判别光强度分布。
在解析部33中,为了处理简单化,也可以假定为样品流F1的流速在流径方向的任何的位置都为等速。另一方面,在解析部33中,也可以考虑样品流F1的中心部分的流速与外侧部分的流速之差,执行流速的解析和基于解析的流速的光强度分布的修正。
作为流速的解析,可以使用图6中的(b)所示的试样S的YZ像M2的虚像U2相对于Y轴方向的角度(以下,称为“虚像角度θVirtual”)。如图10中的(a)所示,在将试样S的移动速度(样品流F1的流速)设为SR,将成像部17的视野设为V,将观察轴相对于照射面的倾斜角度设为θ,将视野V的倾斜角度θ的流动方向上的距离设为YReso的情况下,以下的式成立。此外,试样S的移动速度SR也可以作为曝光期间的试样S的移动量计算。
YReso=V/cosθ…(1)
另外,在YZ像M2中,如图10中的(b)所示,在将Y轴方向的分量设为1(标准化),将Z轴方向的分量设为h的情况下,以下的式成立。视野V和倾斜角度θ是基于试样观察装置1的结构的已知的值。因此,基于式(1)和式(2),可以使用虚像角度θVirtual算出试样S的移动速度SR。解析部33基于算出的移动速度SR修正光强度的时间波形的时间轴。由此,对于仅图8和图9所示的流速相互不同的试样S,也可高精度地判断光强度分布。另外,也可以修正因流速产生的本底的不同。
h=SR/YReso=(SR/V)cosθ…(2)
此外,试样S的移动速度SR使用XZ图像G1、G2也可以求出。例如,解析部33确定基于构成XYZ数据的多个XZ图像G1、G2的面状光L2的分布的虚像U2或该虚像和实像的模糊像U3的位置求出虚像角度θVirtual,基于该虚像角度θVirtual和式(1)和式(2)可以算出试样S的移动速度SR。
接着,对于使用了上述的试样观察装置1的试样观察方法进行说明。图11是表示使用了图1所示的试样观察装置1的试样观察方法的一例的流程图。
该试样观察方法如图11所示,包括流体形成步骤(步骤S01)、照射步骤(步骤S02)、成像步骤(步骤S03)、拍摄步骤(步骤S04)、解析步骤(步骤S05)。
在流体形成步骤中,在流动池2内流动含有试样S流体。在流体形成步骤中,例如,通过压缩器所进行的压力调整,在流动池2的管5内形成由样品流F1和鞘流F2产生的层流。由此,由鞘流F2包围的样品流F1形成于流动池2内,试样S在流动池2内顺次流动。
在照射步骤中,朝向试样S照射面状光L2。在照射步骤中,通过用户输入测定开始的操作时,基于来自计算机14的控制信号,驱动光源15,从光源15输出光L1。从光源15输出的光L1由面状光形成部16整形,成为面状光L2,并照射到流动池2内流动的试样S。
在成像步骤中,利用成像部17使通过面状光L2的照射而在试样S产生的观察光L3成像。在成像步骤中,通过相对于照射面R倾斜的观察轴P2,使观察光L3相对于二维拍摄元件20的成像面成像。
在拍摄步骤中,拍摄由成像部17成像的观察光L3的光像中的至少包含流体的截面的光像。在拍摄步骤中,通过例如二维拍摄元件20的子阵列读出而拍摄该光像。通过图像处理部32处理从二维拍摄元件20输出的Y轴方向上的多个XZ图像G1,生成降低了本底的多个XZ图像G1。生成的多个XZ图像G1作为XYZ数据输出到解析部33。
在解析步骤中,解析在流体的流动方向上的试样S的光强度分布。在解析步骤中,通过XYZ数据对每个试样S解析观察光L3的光强度的时间波形。另外,在解析步骤中,也可以使用试样S的虚像角度θVirtual算出试样S的流速,基于算出的流速修正光强度分布。基于算出的流速的光强度分布的修正在如上所述的样品流F1的中心部分的流速和外侧部分的流速不同的情况或进行通过不同的观察而得的光强度分布的比较的情况中是有效的。
如以上说明,在试样观察装置1中,向流动池2内流动的试样S照射面状光L2,来自试样S的观察光L3由具有相对于面状光L2的照射面R倾斜的观察轴P2的成像部17成像。另外,由成像部17成像的观察光L3用二维拍摄元件20拍摄,生成基于至少包含流体截面的光像的图像数据。因此,即使是在流体的截面内存在多个试样S的情况下,也能够在解析部33分离来自各试样S的观察光L3从而解析光强度分布。因此,即使在提高处理能力的情况下,也能够适当实施试样S的观察。
另外,在试样观察装置1中,照射部11所产生的面状光L2的光轴P1与流动池2的面状光L2的入射面5a正交。另外,照射部11所产生的面状光L2的光轴P1与流动池2中的流体的流动方向正交。由此,不需要通过二维拍摄元件20取得的图像数据的位置修正等,能够使光强度分布的解析处理容易化。
另外,在试样观察装置1中,解析部33基于图像数据对试样S的流速进行解析,基于解析的流速修正光强度分布。流动池2内的样品流F1的流速具有在样品流F1的中心侧和其周围不同的情况。该情况下,认为难以判别每个试样S的光强度分布的差异是基于试样S的大小的不同引起的,还是基于流速的不同引起的。因此,在解析试样S的流速的情况下,能够容许样品流F1的流速不均,使流式细胞术的控制变得容易。另外,通过光强度分布的修正,能够提高试样S的解析精度。
在试样观察装置1中,也能够通过二维拍摄元件20的子阵列读出来拍摄由成像部17成像的观察光L3的光像中的至少包含流体的截面的光像。该情况下,由于能够提高二维拍摄元件20的帧频率,所以能够进一步提高处理能力。
在本实施方式,由于能够修正流动池2内的试样S流动的位置和流速双方,所以能够大致地进行流式细胞术的控制。因此,本实施方式也能够应用于不使用鞘流F2的流式细胞术。另外,在本实施方式中,能够将从试样S产生的观察光L3与从流动池2内流动的样品流F1和鞘流F2产生的自发荧光分离。
本发明不限于上述实施方式。例如,面状光L2的光轴P1和流动池2的入射面5a也可以不一定正交,面状光L2的光轴P1和试样S的流动方向也可以不一定正交。
另外,也可以配置多对成像部17和二维拍摄元件20。该情况下,除能够扩大观察范围以外,还可观察多个不同的波长的观察光L3。该情况下,也可以相对于单一成像部17配置多个二维拍摄元件20,也可以相对于多个成像部17配置单一的二维拍摄元件20。光源15也可以由输出波长不同的光的多个光源构成。该情况下,能够将波长不同的面状光L2作为激励光向试样S照射。
另外,为了缓和像散,也可以在成像部17配置棱镜。该情况下,例如,也可以在物镜18的后段侧(物镜18与二维拍摄元件20之间)配置棱镜。为了应对散焦,也可以使二维拍摄元件20的拍摄面相对于观察轴P2倾斜。另外,例如也可以为在成像部17与二维拍摄元件20之间配置分色镜或棱镜,进行观察光L3的波长分离的结构。
在成像部17配置棱镜等光学元件的情况下,可以提高观察图像的Z方向的析像度。以下,对于该点进一步进行说明。图12是表示试样观察装置的视野的计算例的图。在该图所示的例子中,假想成像部17位于折射率n1的介质A中,面状光的照射面位于折射率n2的介质B中的情况。在将成像部17的视野设为V,将照射面的视野设为V’,将观察轴相对于照射面的倾斜角度设为θ,将在介质A、B的边界面的折射角设为θ’,视野V的倾斜角度θ的在介质A和介质B的界面的距离设为L的情况下,以下的式(3)~(5)成立。
L=V/cosθ…(3)
sinθ’=(n1/n2)sinθ…(4)
V’=L/tanθ’…(5)
另外,图13是表示观察轴的倾斜角度与析像度的关系的图。在该图中,横轴设为观察轴的倾斜角度θ,纵轴设为视野的相对值V’/V。而且,在将介质A的折射率n1设为1(空气),相对于倾斜角度θ标绘使介质B的折射率n2从1.0至2.0仅以每0.1变化时的V’/V的值。表示V’/V的值越小则试样的深度方向的析像度(以下,称为“Z方向析像度”)越高,值越大则Z方向析像度越低。
从图13所示的结果可知,在介质A的折射率n1与介质B的折射率n2相等的情况下,V’/V的值与倾斜角度θ成反比例。另外,在介质A的折射率n1与介质B的折射率n2不同的情况下,可知V’/V的值相对于倾斜角度θ描绘抛物线。从该结果可知,可以通过试样S的配置空间的折射率、成像部17的配置空间的折射率和观察轴的倾斜角度θ,控制Z方向析像度。而且,可知在倾斜角度θ为10°~80°的范围,与倾斜角度θ小于10°以及超过80°的范围相比,能够获得良好的Z方向析像度。
另外,从图13所示的结果可知,Z方向析像度为最大的倾斜角度θ具有随着折射率n1与折射率n2之差变大而变小的倾向。在折射率n2为1.1~2.0的范围内,Z方向析像度为最大时的倾斜角度θ为约47°~约57°的范围。例如,折射率n2为1.33(水)的情况下,Z方向析像度为最大时的倾斜角度θ估计为约52°。另外,例如折射率n2为1.53(玻璃)的情况下,Z方向析像度为最大时的倾斜角度θ估计为约48°。
如从上述式(3)~(5)也可知的那样,决定Z方向析像度的参数为L和θ’,L根据θ决定,θ’根据θ和(n1/n2)决定。因此,在V决定了的状态下,Z方向析像度根据θ和(n1/n2)两个参数决定。(n1/n2)由于根据测定环境决定,所以为了提高Z方向析像度,可调整θ,但如图13所示,在简单的θ的调整时,在提高Z方向的析像度上存在理论上的极限值。
对此,在图14的例子中,成像部17包含物镜18和成像透镜19而构成,在该成像部17中在流动池2与物镜18之间配置有第一光学元件41。第一光学元件41是具有比成像部17的配置空间大的折射率的光学元件。与没有配置该第一光学元件41的情况相比较,第一光学元件41是能够使从试样S射出的观察光L3的相对于面状光L2的照射面R的倾斜角度θs(参照图15和图16)增大的光学元件。成像部17的配置空间例如由空气、水、油等介质填充。在图14的例子中,成像部17配置于空气中。
第一光学元件41例如由楔形棱镜构成。楔形棱镜是一个主面和另一个主面在一个方向上平行,但在与该一个方向正交的另一个方向,另一个主面相对于一个主面以一定的角度倾斜的棱镜。即,楔形棱镜是在一个方向上厚度按规律变化,在与一个方向正交的另一个方向上厚度无变化的棱镜。因此,楔形棱镜作为使观察光L3的一个轴的光线根据入射位置以规定的偏角弯曲,且使与一个轴正交的观察光L3的另一个轴的光线不弯曲的非轴对称的光学元件发挥功能。
在图14的例子中,第一光学元件41为组合一对楔形棱镜而得的双棱镜。双棱镜通过将一对楔形棱镜的倾斜面彼此抵接而构成,在流动池2与物镜18之间的观察光L3的光路上,一个楔形棱镜的平坦面以与流动池2的管5的侧面部分平行的方式配置于靠流动池2的位置。在将成像部17的观察轴P2的倾斜角度θ设为45°的情况下,不在成像部17配置第一光学元件41时,如图15所示,从试样S射出的观察光L3的倾斜角度θs约为32°。该情况下,Z方向析像度估计为2.2左右。对此,在成像部17配置第一光学元件41时,如图16所示,从试样S射出的观察光L3的倾斜角度θs约为35°。该情况下,Z方向析像度估计为提高到1.95左右。
因此,即使是通过第一光学元件41的配置,成像部17的观察轴P2相对于面状光L2的照射面R倾斜的情况下,也能够提高观察图像的Z方向的析像度。另外,由于第一光学元件41为楔形棱镜,所以也能够降低观察光L3的像散,且由于第一光学元件41是组合一对楔形棱镜而成的双棱镜,所以也能够降低观察光L3的色像差。
此外,在图14的方式中,在第一光学元件41的平坦面与流动池2的管5的侧面部分之间设置有微小的间隔,但也可以形成为第一光学元件41的平坦面与流动池2的管5的侧面部分紧贴。该情况下,可使从试样S射出的观察光L3的倾斜角度θs进一步增大数度左右,实现Z方向析像度的进一步提高。另外,观察光L3的像差的修正也变得容易。
另外,如图17所示,在成像部17也可以在成像透镜19与二维拍摄元件20之间配置第二光学元件42。第二光学元件42是使观察光L3的一个轴的光线弯曲,且使与一个轴正交的另一个轴的光线不弯曲的非轴对称的光学元件。在图17的例子中,第二光学元件42为组合一对楔形棱镜的双棱镜。双棱镜在成像透镜19与二维拍摄元件20之间的观察光L3的光路上,以一侧的平坦面与观察轴P2正交且另一侧的倾斜面相对于观察轴P2倾斜的方式配置于靠成像透镜19的位置。通过这样的第二光学元件42的配置,能够进一步实现观察光L3的像散的降低。另外,由于第二光学元件42为楔形棱镜,所以能够进一步实现观察光L3的像散的降低,且由于第二光学元件42为组合一对楔形棱镜而成的双棱镜,所以能够进一步实现观察光L3的色像差的降低。
符号说明
1…试样观察装置,2…流动池,5a…入射面,11…照射部,17…成像部,18…物镜,19…成像透镜,20…二维拍摄元件,33…解析部,41…第一光学元件,42…第二光学元件,L2…面状光,L3…观察光,S…试样,R…照射面,P1…面状光的光轴,P2…观察轴。
Claims (24)
1.一种试样观察装置,其特征在于,包括:
流动池,其中流动含有试样的流体;
照射部,其向所述流动池内流动的所述试样照射面状光;
成像部,其具有相对于所述面状光的照射面倾斜的观察轴,使通过所述面状光的照射而在所述试样产生的观察光成像;
二维拍摄元件,其拍摄由所述成像部成像的所述观察光的光像中的至少包含所述流体的截面的光像,并输出图像数据;和
解析部,其基于所述图像数据,解析在所述流体的流动方向上的所述试样的光强度分布。
2.根据权利要求1所述的试样观察装置,其特征在于:
所述照射部所产生的所述面状光的光轴与所述流动池中的所述面状光的入射面正交。
3.根据权利要求1或2所述的试样观察装置,其特征在于:
所述照射部所产生的所述面状光的光轴与所述流动池中的所述流体的流动方向正交。
4.根据权利要求1~3中任一项所述的试样观察装置,其特征在于:
所述解析部基于所述图像数据,解析所述试样的流速。
5.根据权利要求4所述的试样观察装置,其特征在于:
所述解析部基于所述试样的流速,修正所述光强度分布。
6.根据权利要求1~5中任一项所述的试样观察装置,其特征在于:
所述二维拍摄元件通过读出子阵列来拍摄由所述成像部成像的所述观察光的光像中的至少包含所述流体的截面的光像。
7.根据权利要求1~6中任一项所述的试样观察装置,其特征在于:
所述成像部包括物镜和配置于所述流动池与所述物镜之间的第一光学元件,
所述第一光学元件是具有比所述成像部的配置空间的折射率大的折射率,且与没有配置该第一光学元件的情况相比,使从所述试样射出的所述观察光的相对于所述面状光的照射面的倾斜角度增大的光学元件。
8.根据权利要求7所述的试样观察装置,其特征在于:
所述第一光学元件是楔形棱镜。
9.根据权利要求7或8所述的试样观察装置,其特征在于:
所述第一光学元件是组合一对楔形棱镜而成的双棱镜。
10.根据权利要求7~9中任一项所述的试样观察装置,其特征在于:
所述成像部包括:配置于所述物镜的后段侧的成像透镜;和配置于所述成像透镜与所述二维拍摄元件之间的第二光学元件,
所述第二光学元件是使所述观察光的一个轴的光线弯曲,且使与所述一个轴正交的另一个轴的光线不弯曲的非轴对称的光学元件。
11.根据权利要求10所述的试样观察装置,其特征在于:
所述第二光学元件是楔形棱镜。
12.根据权利要求10或11所述的试样观察装置,其特征在于:
所述第二光学元件是组合一对楔形棱镜而成的双棱镜。
13.一种试样观察方法,其特征在于,包括:
流体形成步骤,使流动池内流动包含试样的流体;
照射步骤,向所述流动池内流动的所述试样照射面状光;
成像步骤,通过具有相对于所述面状光的照射面倾斜的观察轴的成像部,使通过所述面状光的照射而在所述试样产生的观察光成像;
拍摄步骤,通过二维拍摄元件拍摄由所述成像部成像的所述观察光的光像中的至少包含所述流体的截面的光像,并输出图像数据;和
解析步骤,基于所述图像数据,解析在所述流体的流动方向上的所述试样的光强度分布。
14.根据权利要求13所述的试样观察方法,其特征在于:
在所述照射步骤中,使所述面状光的光轴与所述流动池中的所述面状光的入射面正交。
15.根据权利要求13或14所述的试样观察方法,其特征在于:
在所述照射步骤中,使所述面状光的光轴与所述流动池中的所述流体的流动方向正交。
16.根据权利要求13~15中任一项所述的试样观察方法,其特征在于:
在所述解析步骤中,基于所述图像数据,解析所述试样的流速。
17.根据权利要求16所述的试样观察方法,其特征在于:
在所述解析步骤中,基于所述试样的流速,修正所述光强度分布。
18.根据权利要求13~17中任一项所述的试样观察方法,其特征在于:
在所述拍摄步骤中,通过读出所述二维拍摄元件的子阵列来拍摄所述成像步骤中成像的所述观察光的光像中的至少包含所述流体的截面的光像。
19.根据权利要求13~18中任一项所述的试样观察方法,其特征在于:
在所述成像步骤中,使用有物镜和配置于所述流动池与所述物镜之间的第一光学元件,
所述第一光学元件是具有比所述成像部的配置空间的折射率大的折射率,且与没有配置该第一光学元件的情况相比,使从所述试样射出的所述观察光的相对于所述面状光的照射面的倾斜角度增大的光学元件。
20.根据权利要求19所述的试样观察方法,其特征在于:
所述第一光学元件是楔形棱镜。
21.根据权利要求19或20所述的试样观察方法,其特征在于:
所述第一光学元件是组合一对楔形棱镜而成的双棱镜。
22.根据权利要求19~21中任一项所述的试样观察方法,其特征在于:
在所述成像步骤中,使用有配置于所述物镜的后段侧的成像透镜和配置于所述成像透镜与所述二维拍摄元件之间的第二光学元件,
所述第二光学元件是使所述观察光的一个轴的光线弯曲,且使与所述一个轴正交的另一个轴的光线不弯曲的非轴对称的光学元件。
23.根据权利要求22所述的试样观察方法,其特征在于:
所述第二光学元件是楔形棱镜。
24.根据权利要求22或23所述的试样观察方法,其特征在于:
所述第二光学元件是组合一对楔形棱镜而成的双棱镜。
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