WO2017209079A1 - 観察装置および観察方法 - Google Patents

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福武　直樹
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Definitions

  • the present invention relates to an observation apparatus and an observation method.
  • the microscope is made a reflection type instead of a transmission type, and has a sectioning ability which is an ability to obtain a cross-sectional image at an arbitrary Z position in a plane perpendicular to the optical axis direction. It is necessary to use a staining imaging technique.
  • Patent Document 1 JP-A-2005-62155
  • the observation device includes a light source that irradiates light to the observation target, and a processing unit that generates an image based on light derived from ⁇ (3) included in the light obtained from the observation target. Is provided.
  • the observation device includes a light source that irradiates light to the observation target, and light derived from ⁇ (3) and light derived from ⁇ (1) included in the light obtained from the observation target. , ⁇ (1) -derived light is limited, and ⁇ (3) -derived light is detected.
  • the observation method includes a step of generating an image based on light derived from ⁇ (3) included in light obtained from an observation target irradiated with light from a light source.
  • observation method chi contained in the light obtained from the observation target irradiated with light from the light source (3) from the light and chi (1) out from the light, chi ( 1) limiting light derived from and detecting light derived from ⁇ (3) .
  • the observation device includes a light source that irradiates the observation target with excitation light, at least one light branching unit that is disposed on the optical path of light obtained from the observation target, and branches the light.
  • the light branching unit includes at least two mirrors that can adjust the optical path length difference of the light branched by the light branching unit, and a detector that detects the light reflected by the at least two mirrors. After being reflected by the two mirrors, they are combined, and the detector detects the combined light.
  • FIG. 1 is a schematic diagram of an observation apparatus 100.
  • FIG. It is explanatory drawing which compared the wavelength spectrum. It is a diagram showing the process in which the light of the frequency of (omega) 1 injects, and the light of (omega) 2 is emitted after that. It is a graph which shows the optical path difference length dependence of the theoretical signal intensity of light. It is a graph which shows the optical path difference length dependence of the measured signal strength of light.
  • 2 is a schematic diagram of an observation apparatus 200.
  • FIG. 1 is a schematic diagram of the observation apparatus 100.
  • the observation apparatus 100 includes a confocal optical system 101, a detection unit 102, and a control unit 104.
  • the confocal optical system 101 includes a laser light source 110, lenses 121, 123, 125, and 127, pinholes 131 and 133, a half mirror 140, a band pass filter 145, an XY scanning mirror pair 150, and a scanning drive unit. 156 and an objective lens 160.
  • the confocal optical system 101 is an epi-illumination optical system. When the observation target 10 is observed, the objective lens 160 of the confocal optical system 101 is adjacent to the observation target 10.
  • the laser light source 110 emits narrow band CW laser light as excitation light.
  • the laser light source 110 is preferably a light source usually used in a Raman microscope, and the wavelength of the laser light is preferably as short as about 488 nm in the visible range.
  • the lens 121 is disposed at a position for receiving the excitation light emitted from the laser light source 110 on the optical path of the observation apparatus 100, and condenses the excitation light at the circular opening of the pinhole 131 disposed adjacently.
  • the lens 123 is disposed at a position adjacent to the pinhole 131 on the optical path of the observation apparatus 100 and collimates the excitation light from the laser light source 110 that has passed through the circular opening of the pinhole 131.
  • the half mirror 140 is disposed at a predetermined angle on the optical path of the observation apparatus 100 and transmits at least a part of the collimated excitation light from the lens 123.
  • the half mirror 140 also reflects to change the optical path of at least part of the collimated return light from the XY scanning mirror pair 150.
  • the XY scanning mirror pair 150 is disposed on the optical path of the observation apparatus 100 and reflects so as to change the optical path of the collimated excitation light from the half mirror 140.
  • the XY scanning mirror pair 150 also reflects the collimated return light from the observation target 10 that has passed through the objective lens 160 so as to reverse along the optical path of the excitation light from the half mirror 140.
  • the XY scanning mirror pair 150 is, for example, a resonant galvanometer mirror, and includes XY scanning mirrors 151 and 153 that swing around two axes whose directions are different from each other.
  • the scanning drive unit 156 drives the pair of XY scanning mirrors 151 and 153 to displace the optical path of light incident on the XY scanning mirror pair 150 in a two-dimensional manner in a direction intersecting the optical axis.
  • the objective lens 160 is arranged at a position where the collimated excitation light from the XY scanning mirror pair 150 is received on the optical path of the observation apparatus 100, and condenses the excitation light at a certain point of the observation object 10 arranged adjacently. .
  • the objective lens 160 also collimates the return light from the observation object 10.
  • the band-pass filter 145 is disposed on the optical path of the observation device 100 and transmits light in a predetermined wavelength band out of the return light from the observation target 10 reflected by the half mirror 140, and other light.
  • Limit Specifically, although details will be described later, among the light from the observation object 10, the light derived from ⁇ (1) is transmitted, and the light derived from ⁇ (3) is transmitted through Rayleigh scattered light. Limiting light other than Rayleigh scattered light. This prevents Raman scattered light or autofluorescence from entering the detection unit 102 out of the light from the observation target 10.
  • the lens 125 is disposed on the optical path of the observation apparatus 100, and condenses the light from the observation target 10 that has passed through the bandpass filter 145 to the circular opening of the pinhole 133 that is disposed adjacently.
  • the lens 127 is disposed at a position adjacent to the pinhole 133 on the optical path of the observation apparatus 100, and the light from the observation target 10 that has passed through the circular opening of the pinhole 133 is detected in the detection unit 102 disposed adjacently. Collect light.
  • the position of the circular opening of the pinhole 131 and a certain point of the observation target 10 that is the focal position of the objective lens 160 are in a conjugate relationship.
  • a certain point of the observation target 10 that is the focal position of the objective lens 160 and the position of the circular opening of the pinhole 133 are also in a conjugate relationship.
  • the detection unit 102 includes a restriction unit 103, a pinhole 135, a detector 190, and an output unit 191.
  • the detection unit 102 is adjacent to the confocal optical system 101 so as to receive collimated light from the observation target 10 that has passed through the lens 127 of the confocal optical system 101.
  • the limiting unit 103 has the same configuration as, for example, a Michelson interferometer, and includes a beam splitter 170, a pair of mirrors 180, and a vibration driving unit 186.
  • the restricting unit 103 restricts some of the light components included in the light from the observation target 10.
  • the limiting unit 103 may have a configuration that is partially different from the illustrated configuration, for example, a configuration similar to a Mach-Zehnder interferometer, that is, a configuration having two beam splitters 170.
  • the beam splitter 170 is arranged on the optical path of the observation apparatus 100, and branches the collimated light from the confocal optical system 101 into two with equal signal intensity.
  • the beam splitter 170 also multiplexes two collimated lights reflected by the pair of mirrors 180.
  • the beam splitter 170 is an example of an optical branching unit.
  • the pair of mirrors 180 is a mirror pair that is arranged on the optical path of the observation apparatus 100 and that can adjust the optical path length difference between the two lights branched by the beam splitter 170.
  • the pair of mirrors 180 includes a movable mirror 181 and a fixed mirror 183.
  • the vibration driving unit 186 is, for example, a piezoelectric element that converts a voltage applied to the piezoelectric body into force, and displaces the movable mirror 181 along the optical path.
  • the vibration driving unit 186 also vibrates the movable mirror 181 along a light path around a predetermined center.
  • the pinhole 135 is disposed on the optical path of the observation apparatus 100 and is positioned so that collimated light that is not restricted by the restriction unit 103 is condensed on the circular opening of the pinhole 135.
  • the detector 190 is, for example, a photomultiplier tube, and is arranged adjacent to the pinhole 135 on the optical path of the observation apparatus 100, and is collimated light collected by the circular opening of the pinhole 135 without being restricted by the restriction unit 103. Is detected.
  • the detector 190 is an example of a detector.
  • the output unit 191 is, for example, a processing device having a display, and is electrically connected to the detector 190 and displays an observation image of the observation target 10 generated from the light detected by the detector 190 toward the observer.
  • the output unit 191 is an example of a processing unit.
  • the position of the circular opening of the pinhole 133 in the confocal optical system 101 and the position of the circular opening of the pinhole 135 in the detection unit 102 are in a conjugate relationship. Accordingly, in the entire observation apparatus 100, a certain point of the observation target 10 that is the focal position of the objective lens 160 and the position of the circular opening of the pinhole 135 disposed in front of the detector 190 are in a conjugate relationship. With this configuration, unnecessary scattered light from the periphery can be eliminated by a plurality of pinholes, and light only at a focused position in the observation object 10 can be detected with high contrast and high resolution.
  • the control unit 104 is electrically connected to the confocal optical system 101 and the detection unit 102 and controls driving of the scanning drive unit 156 in the confocal optical system 101 and driving of the vibration drive unit 186 in the detection unit 102. .
  • FIG. 2A and 2B are explanatory diagrams comparing wavelength spectra.
  • FIG. 2A is a wavelength spectrum of excitation light emitted from the laser light source 110
  • FIG. 2B is obtained from an observation object 10 irradiated with excitation light.
  • FIG. 2C are incoherent light derived from ⁇ (3) contained in the light obtained from the observation object 10 irradiated with the excitation light.
  • the wavelength spectrum of light is typically shown.
  • the light obtained from the observation object 10 irradiated with the excitation light includes light derived from ⁇ (3) and light derived from ⁇ (1) .
  • ⁇ (1) means linear susceptibility.
  • the light derived from ⁇ (1) means light generated from a term proportional to ⁇ (1) when the polarization induced by the excitation photoelectric field is expanded to the power.
  • ⁇ (3) means a third-order nonlinear susceptibility.
  • the chi (3) from the light when the polarization induced by the excitation light field and power development refers to a light generated from a term proportional to ⁇ (3).
  • the light derived from ⁇ (1) has coherence between scattered lights, and the center wavelength, phase, and line width are all the same as the excitation light. As understood by comparing FIG. 2A and FIG. 2B, the spectral width of the light derived from ⁇ (1) is the same as the line width of the excitation light from the laser light source 110.
  • the light derived from ⁇ (1) is coherent light.
  • the generated light derived from ⁇ (1) has a clear phase, and when light having a clear phase mutually interferes, it causes incremental interference in which the waves are strengthened only in a fixed direction, and in other directions Make destructive interference that cancel each other. Therefore, it has the characteristic of propagating only in a fixed direction. A typical example is reflection at the interface.
  • Reflected light at the side wall of the cell parallel to the incident light causes incremental interference only in the forward direction and destructive interference in the other direction, for example, backward. Disappear from the statue.
  • the signal intensity of light derived from ⁇ (1) is greater than the signal intensity of light derived from ⁇ (3) .
  • a typical microscope for visualizing the ⁇ (1) distribution is a bright field microscope, and a cutoff frequency as an index of resolution is 2 NA / ⁇ . Since the confocal fluorescence microscope has a cutoff frequency of 4 NA / ⁇ , when the light derived from ⁇ (1) is observed with the confocal microscope, the resolution is lower than that of the confocal fluorescence microscope.
  • the light derived from ⁇ (3) has no coherence between the scattered lights, and the phase and line width are different from those of the excitation light.
  • the light derived from ⁇ (3) has a spectral width determined by the phase relaxation time T 2 , and as understood by comparing FIG. 2A and FIG. It is wider than the line width of the excitation light from. Since the light generated by the spontaneous process derived from ⁇ (3) is not coherent, it is incoherent light that does not interfere with each other. Typical examples include Rayleigh scattered light and fluorescence. The same imaging characteristics are exhibited regardless of which optical process of Rayleigh scattered light or fluorescence is used for a microscope. Rayleigh scattered light is radiated in all directions regardless of the incident direction of excitation light, similarly to fluorescence.
  • the side wall of a cell parallel to the incident light Rayleigh scattered light generated therefrom is incoherent, and is emitted in all directions. Since the light also returns to the back, the side wall of the cell can be observed even with a reflection microscope.
  • the light derived from ⁇ (3) is observed with a confocal microscope, it has sectioning ability. Further, since the theoretical limit value of the cutoff frequency serving as an index of resolution is 4 NA / ⁇ , the resolution is equivalent to that of the confocal fluorescence microscope.
  • the light derived from ⁇ (3) includes Rayleigh scattered light.
  • light generated by a spontaneous process for example, Rayleigh wing scattered light, Brillouin scattered light, Raman scattered light, fluorescence, and the like are also included in the light derived from ⁇ (3). Stronger than scattered light and Brillouin scattered light.
  • the Rayleigh scattered light contained in the light derived from ⁇ (3) is not different from the excitation light, but the light generated by other spontaneous processes contained in the light derived from ⁇ (3) is different from the excitation light.
  • Rayleigh scattered light is light derived from ⁇ (3) and has a finite spectral width even if the excitation laser line width is infinitely narrow.
  • Limiting unit 103 observed chi (3) included in the light from the object 10 Rayleigh scattered light and chi (1) from among the derived light, limiting the light from chi (1).
  • interference is used when two beams reflected by the pair of mirrors 180 are combined by the beam splitter 170.
  • FIGS. 4 and 5 details of the limiting method will be described with reference to FIGS. 4 and 5.
  • FIG. 4 shows the optical path of the theoretical signal intensity for each of the Rayleigh scattered light derived from ⁇ (3) and the light derived from ⁇ (1) obtained while changing the optical path length difference using a pair of mirrors 180. It is a graph which shows difference length dependence.
  • FIG. 5 is a graph showing the dependence on the optical path difference length of the signal intensity of light actually measured in the same manner.
  • the horizontal axis represents the optical path difference length in terms of time, and the vertical axis represents the optical signal intensity.
  • chi (3) Rayleigh scattering light from is indicated by chi (3)
  • the light from chi (1) is indicated by chi (1).
  • the light derived from ⁇ (1) is coherent light, as shown in FIG. 4, as the optical path difference length increases, the signal intensity periodically changes due to the interference effect. Since the spectral width of the light derived from ⁇ (1) is equal to the laser line width from the laser light source 110, if a narrow-band CW laser is used as excitation light, the optical path length difference is changed to reflect the long coherent length. Interfering forever and changing periodically.
  • the optical path length difference is set to be longer than 2T 2 that is at least twice the phase relaxation time T 2 when converted to time.
  • the signal intensity of light derived from ⁇ (1) changes periodically, but the signal intensity of Rayleigh scattered light derived from ⁇ (3) is constant. Therefore, by setting the optical path length difference so that the measured signal intensity of light is minimized within the range of the optical path length difference, specifically, the movable mirror 181 of the pair of mirrors 180 is measured.
  • the signal intensity of the light derived from ⁇ (1) is limited to such an extent that Rayleigh scattered light derived from ⁇ (3) can be detected by measuring the signal intensity of the light at a position where the signal intensity of the emitted light is minimized. it can.
  • the same resolution as that of the confocal fluorescence microscope can be obtained without staining.
  • limiting portion 103 by adjusting the optical path length difference by using a pair of mirrors 180, interference by chi (1) were combined to weaken the light from, chi (3) derived from the Rayleigh scattered light and chi ( 1) Limit the light derived from ⁇ (1) among the derived light.
  • light weakening means that light derived from ⁇ (1) having coherence is [n + (1/2)] ⁇ (n is an integer) when the wavelength of light is ⁇ . ) Branching into optical path length differences that are out of phase with each other, and canceling each other when the two branched lights are combined.
  • the observation apparatus 100 having the epi-focal confocal optical system 101 in this embodiment Rayleigh scattered light derived from ⁇ (3) included in the light obtained from the observation target irradiated with the excitation light. and chi (1) out from the light by limiting light from chi (1), detects a chi (3) derived from the Rayleigh scattered light, chi and (3) the observation image based on the Rayleigh scattering light from the Output.
  • the signal is sufficiently strong while having an incoherent interaction, has sectioning capability, and a resolution equivalent to that of a confocal fluorescence microscope can be obtained.
  • the observation apparatus 100 is realized by slightly changing a signal detection unit of a normal confocal microscope using a CW laser as the laser light source 110, can perform high-speed drawing, and is suitable for rapid pathological diagnosis. Note that the configuration of the observation apparatus 100 may be an option of the confocal fluorescence microscope.
  • FIG. 6 is a schematic diagram of the observation apparatus 200.
  • the restriction unit 103 has a lock-in detection unit 193 and the output unit 191 of the detection unit 102 is electrically connected to the detector 190 via the lock-in detection unit 193. Since it has the same configuration as the observation apparatus 100, a duplicate description is omitted.
  • the lock-in detection unit 193 in the limiting unit 103 is a circuit that detects lock-in of a specific optical signal, and is electrically connected to the detector 190.
  • the limiting unit 103 uses the lock-in detection unit 193 to detect lock-in of the light from the observation target 10 detected by the detector 190, and detects and calculates the dc component and the ac component of the light, thereby calculating ⁇ ( 3) Of the Rayleigh scattered light derived from ⁇ (1) and the light derived from ⁇ (1) , the light derived from ⁇ (1) is limited, and the Rayleigh scattered light derived from ⁇ (3) is detected.
  • the vibration drive unit 186 causes the movable mirror 181 to vibrate at high speed around a predetermined point, and performs synchronous detection with the vibration frequency of the light derived from ⁇ (1) , thereby observing the object 10 to be observed.
  • the light derived from ⁇ (1) is extracted from the light obtained from
  • the Rayleigh scattered light derived from ⁇ (3) is detected by subtracting half of the extracted signal strength of the light derived from ⁇ (1) from the average signal intensity of the light obtained from the observation object 10.
  • lock-in detection is used to limit the light derived from ⁇ (1) to such an extent that Rayleigh scattered light derived from ⁇ (3) can be detected.
  • the same resolution as that of the confocal fluorescence microscope can be obtained without staining.
  • the observation apparatus is not a transmission type but a reflection type, so that the tissue can be cut out and observed, or can be observed without cutting the tissue.
  • the scanning is performed using the XY scanning mirror without displacing the position of the observation target. Instead, the stage on which the observation target is placed is displaced in the XY direction for scanning. It is good also as composition to do.
  • the sectioned high resolution images may be joined in the depth direction, and the observation target may be measured three-dimensionally.
  • the arrangement of the bandpass filter in the observation apparatus is on the optical path in the confocal optical system, not in the detection unit.
  • the band-pass filter may be arranged on the optical path in the detection unit instead of in the confocal optical system, for example, in front of the detector. This configuration can also prevent Raman scattered light and autofluorescence from entering the detector.
  • the observation apparatus detects Rayleigh scattered light derived from ⁇ (3) among the light obtained from the observation target irradiated with excitation light, and converts the Rayleigh scattered light derived from ⁇ (3) to It has been described as a configuration for outputting an observation image based thereon.
  • the observation device can obtain light generated by other spontaneous processes derived from ⁇ (3) , for example, Rayleigh wing scattered light, Brillouin scattered light, Raman scattered light obtained from the observation object.
  • light derived from at least one ⁇ (3) of fluorescence may be detected, and an observation image based on the light derived from ⁇ (3) may be output.
  • the bandpass filter may not be provided on the optical path, or another bandpass filter that transmits only desired light and restricts other light may be provided on the optical path.
  • a configuration of a stationary microscope that additionally holds an observation target with a cover glass interposed therebetween may be employed.
  • the cover glass is pressed against the observation target to make it flat.
  • 10 observation object 100 observation device, 101 confocal optical system, 102 detection unit, 103 limiting unit, 104 control unit, 110 laser light source, 121, 123, 125, 127 lens, 131, 133, 135 pinhole, 140 half mirror 145 band pass filter, 150 XY scanning mirror pair, 151, 153 XY scanning mirror, 156 scanning drive unit, 160 objective lens, 170 beam splitter, 180 pair of mirrors, 181 movable mirror, 183 fixed mirror, 186 vibration drive unit, 190 detector, 191 output section, 193 lock-in detection section

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Abstract

本実施形態における観察装置は、観察対象に光を照射する光源と、観察対象から得られる光に含まれるχ（３）由来の光に基づいて画像を生成する処理部とを備える。

Description

観察装置および観察方法
　本発明は、観察装置および観察方法に関する。
　従来、病理医が癌診断等を行う病理診断では、組織切片を作成し染色したのち明視野顕微鏡で観察診断していたが、この手法では試料作製に時間がかかることが問題視されており、切片を作成することなく、患者から切り取った組織の観察、又は、例えば開腹手術中若しくは内視鏡手術中における組織の術中診断において、例えば癌化しているか否かを迅速に判断するツールが求められている。この目的のためには、顕微鏡を透過型ではなく反射型にし、且つ、光軸方向に対して垂直な面において任意のＺ位置の断面像を得ることができる能力であるセクショニング能力をもった非染色イメージング技術を用いる必要がある。非染色イメージング技術として、コヒーレント相互作用を利用した顕微鏡が知られている（例えば、特許文献１参照）。しかしながら、コヒーレント相互作用を利用した顕微鏡では、反射型にすると、十分な信号強度が取得できない可能性があり、また、例えば細胞の側壁が観測できなかった。
［先行技術文献］
［特許文献］
　　［特許文献１］特開２００５－６２１５５号公報
　本発明の第１の態様においては、観察装置は、観察対象に光を照射する光源と、観察対象から得られる光に含まれるχ（３）由来の光に基づいて画像を生成する処理部とを備える。
　本発明の第２の態様においては、観察装置は、観察対象に光を照射する光源と、観察対象から得られる光に含まれるχ（３）由来の光およびχ（１）由来の光のうち、χ（１）由来の光を制限して、χ（３）由来の光を検出する検出部とを備える。
　本発明の第３の態様においては、観察方法は、光源から光を照射された観察対象から得られる光に含まれるχ（３）由来の光に基づいて画像を生成する段階を含む。
　本発明の第４の態様においては、観察方法は、光源から光を照射された観察対象から得られる光に含まれるχ（３）由来の光およびχ（１）由来の光のうち、χ（１）由来の光を制限して、χ（３）由来の光を検出する段階を含む。
　本発明の第５の態様においては、観察装置は、観察対象に励起光を照射する光源と、観察対象から得られる光の光路上に配置され、光を分岐する少なくとも１つの光分岐部と、光分岐部で分岐された光の光路長差を調整可能な少なくとも２つのミラーと、少なくとも２つのミラーで反射した光を検出する検出器とを備え、光分岐部で分岐された光は、少なくとも２つのミラーで反射した後に合波され、検出器は、合波された光を検出する。
観察装置１００の模式図である。 波長スペクトルを比較した説明図である。 ω１の周波数の光が入射し、その後ω２の光が放出されるという過程を表すダイアグラムである。 理論上の光の信号強度の光路差長依存性を示すグラフである。 実測される光の信号強度の光路差長依存性を示すグラフである。 観察装置２００の模式図である。
　以下、発明の実施の形態を通じて本発明を説明するが、以下の実施形態は請求の範囲にかかる発明を限定するものではない。また、実施形態の中で説明されている特徴の組み合わせの全てが発明の解決手段に必須であるとは限らない。
　図１は、観察装置１００の模式図である。観察装置１００は、共焦点光学系１０１と、検出部１０２と、制御部１０４とを備える。
　共焦点光学系１０１は、レーザー光源１１０と、レンズ１２１、１２３、１２５、１２７と、ピンホール１３１、１３３と、ハーフミラー１４０と、バンドパスフィルタ１４５と、ＸＹスキャニングミラー対１５０と、スキャニング駆動部１５６と、対物レンズ１６０とを備える。共焦点光学系１０１は落射照明光学系であり、観察対象１０を観察する際に、共焦点光学系１０１の対物レンズ１６０を観察対象１０に隣接させる。
　レーザー光源１１０は、励起光として狭帯域のＣＷレーザー光を射出する。レーザー光源１１０としてラマン顕微鏡に通常用いられる光源を用い、レーザー光の波長は、例えば可視域の４８８ｎｍ程度と、短いことが好ましい。
　レンズ１２１は、観察装置１００の光路上でレーザー光源１１０から射出された励起光を受光する位置に配置され、隣接して配置されたピンホール１３１の円形開口に励起光を集光させる。レンズ１２３は、観察装置１００の光路上でピンホール１３１に隣接する位置に配置され、ピンホール１３１の円形開口を通過したレーザー光源１１０からの励起光をコリメートする。
　ハーフミラー１４０は、観察装置１００の光路上に予め定められた角度で配置され、レンズ１２３からのコリメートな励起光の少なくとも一部を透過させる。ハーフミラー１４０はまた、ＸＹスキャニングミラー対１５０からのコリメートな戻り光の少なくとも一部の光路を変更するように反射する。
　ＸＹスキャニングミラー対１５０は、観察装置１００の光路上に配置され、ハーフミラー１４０からのコリメートな励起光の光路を変更するように反射する。ＸＹスキャニングミラー対１５０はまた、対物レンズ１６０を通過した観察対象１０からのコリメートな戻り光を、ハーフミラー１４０からの励起光の光路に沿って逆行させるように反射する。ＸＹスキャニングミラー対１５０は、例えば共振型ガルバノミラーであり、互いに向きが異なる２軸の周りを搖動するＸＹスキャニングミラー１５１、１５３を有する。スキャニング駆動部１５６は、一対のＸＹスキャニングミラー１５１、１５３を駆動して、ＸＹスキャニングミラー対１５０に入射する光の光路を、光軸と交差する方向に二次元的に変位させる。
　対物レンズ１６０は、観察装置１００の光路上でＸＹスキャニングミラー対１５０からのコリメートな励起光を受光する位置に配置され、隣接して配置された観察対象１０のある一点に励起光を集光させる。対物レンズ１６０はまた、観察対象１０からの戻り光をコリメートする。
　バンドパスフィルタ１４５は、観察装置１００の光路上に配置され、ハーフミラー１４０で反射された観察対象１０からの戻り光のうち、予め定められた波長帯の光を透過して、それ以外の光を制限する。具体的には、詳細については後述するが、観察対象１０からの光のうち、χ（１）由来の光を透過し、且つ、χ（３）由来の光のうち、レイリー散乱光を透過して、レイリー散乱光以外の光を制限する。これにより、観察対象１０からの光のうち、ラマン散乱光や自家蛍光が検出部１０２に入射することを防止する。
　レンズ１２５は、観察装置１００の光路上に配置され、バンドパスフィルタ１４５を透過した観察対象１０からの光を、隣接して配置されたピンホール１３３の円形開口に集光させる。レンズ１２７は、観察装置１００の光路上でピンホール１３３に隣接する位置に配置され、ピンホール１３３の円形開口を通過した観察対象１０からの光を、隣接して配置された検出部１０２内で集光させる。
　上記の通り、共焦点光学系１０１において、ピンホール１３１の円形開口の位置と対物レンズ１６０の焦点位置である観察対象１０のある一点とは共役関係にある。同様に、対物レンズ１６０の焦点位置である観察対象１０のある一点とピンホール１３３の円形開口の位置とも共役関係にある。
　検出部１０２は、制限部１０３と、ピンホール１３５と、ディテクタ１９０と、出力部１９１とを備える。検出部１０２は、共焦点光学系１０１のレンズ１２７を通過した観察対象１０からのコリメートな光を受光するように、共焦点光学系１０１に隣接する。
　制限部１０３は、例えばマイケルソン干渉計と同様の構成であり、ビームスプリッター１７０と、一対のミラー１８０と、振動駆動部１８６とを有する。制限部１０３は、観察対象１０からの光に含まれる複数の光成分のうち、一部の光成分を制限する。なお、制限部１０３は、図示される構成と一部が異なる例えばマッハツェンダー干渉計と同様の構成、すなわち、ビームスプリッター１７０を２つ有する構成であってもよい。
　ビームスプリッター１７０は、観察装置１００の光路上に配置され、共焦点光学系１０１からのコリメートな光を、信号強度を等分にして２つに分岐する。ビームスプリッター１７０はまた、一対のミラー１８０で反射された２つのコリメートな光を合波する。なお、ビームスプリッター１７０は、光分岐部の一例である。
　一対のミラー１８０は、観察装置１００の光路上に配置され、ビームスプリッター１７０で分岐された２つの光の光路長差を調整可能なミラー対である。一対のミラー１８０は、可動ミラー１８１と固定ミラー１８３とを有する。振動駆動部１８６は、例えば圧電体に印加された電圧を力に変換する圧電素子であり、可動ミラー１８１を光路に沿って変位させる。振動駆動部１８６はまた、可動ミラー１８１を予め定められた中心周りで光路に沿って振動させる。
　ピンホール１３５は、観察装置１００の光路上に配置され、制限部１０３で制限されなかったコリメートな光がピンホール１３５の円形開口に集光するように位置する。ディテクタ１９０は、例えば光電子倍増管であり、観察装置１００の光路上でピンホール１３５に隣接して配置され、制限部１０３で制限されずにピンホール１３５の円形開口で集光されたコリメートな光を検出する。なお、ディテクタ１９０は、検出器の一例である。
　出力部１９１は、例えばディスプレイを有する処理装置であり、ディテクタ１９０に電気的に接続され、ディテクタ１９０で検出された光から生成した観察対象１０の観察画像を観察者に向かって表示する。なお、出力部１９１は、処理部の一例である。
　上記の通り、共焦点光学系１０１におけるピンホール１３３の円形開口の位置と検出部１０２におけるピンホール１３５の円形開口の位置とは共役関係にある。従って、観察装置１００全体において、対物レンズ１６０の焦点位置である観察対象１０のある一点とディテクタ１９０の手前に配置されたピンホール１３５の円形開口の位置とは共役関係にある。当該構成によって、周辺からの不要な散乱光を複数のピンホールで排除し、観察対象１０における焦点の合った位置のみの光を高コントラスト且つ高解像度で検出することが可能となる。
　制御部１０４は、共焦点光学系１０１と検出部１０２とに電気的に接続され、共焦点光学系１０１におけるスキャニング駆動部１５６の駆動と、検出部１０２における振動駆動部１８６の駆動とを制御する。
　以上の通り、観察装置１００の全体構成について説明した。ここで、観察対象１０から得られる光の詳細について、図２を用いて説明する。
　図２は波長スペクトルを比較した説明図であり、図２（Ａ）はレーザー光源１１０から射出される励起光の波長スペクトル、図２（Ｂ）は励起光を照射された観察対象１０から得られる光に含まれるχ（１）由来のコヒーレントな光の波長スペクトル、及び、図２（Ｃ）は励起光を照射された観察対象１０から得られる光に含まれるχ（３）由来のインコヒーレントな光の波長スペクトルを各々模式的に示している。
　励起光を照射された観察対象１０から得られる光には、χ（３）由来の光と、χ（１）由来の光とが含まれている。χ（１）とは、線形感受率を意味する。χ（１）由来の光とは、励起光電場により誘起される分極をべき乗展開したときに、χ（１）に比例する項から生じる光をいう。一方で、χ（３）とは、３次の非線形感受率を意味する。χ（３）由来の光とは、励起光電場により誘起される分極をべき乗展開したときに、χ（３）に比例する項から生じる光をいう。
　χ（１）由来の光は、散乱光間に可干渉性があり、中心波長、位相および線幅の何れも励起光と変わらない。図２（Ａ）と図２（Ｂ）とを比較して理解される通り、χ（１）由来の光のスペクトル幅は、レーザー光源１１０からの励起光の線幅と同一である。χ（１）由来の光はコヒーレントな光である。発生したχ（１）由来の光は明確な位相を持ち、明確な位相を持った光同士が相互干渉すると、決まった方向にだけ波が強め合う増加的干渉をし、その他の方向には波が打ち消し合う減殺的干渉をする。そのため、決まった方向にのみ伝搬するという特徴を有する。代表的なものとして、界面での反射があげられる。入射光に平行な例えば細胞の側壁での反射光は、前方にのみ増加的干渉を行い、その他の方向、例えば後方へは減殺的干渉を行うので、反射型顕微鏡で細胞を観察すると、側壁は像から消失する。χ（１）由来の光の信号強度は、χ（３）由来の光の信号強度より大きい。χ（１）分布を可視化する代表的な顕微鏡は明視野顕微鏡であり、分解能の指標となる遮断周波数は２ＮＡ／λである。共焦点蛍光顕微鏡の遮断周波数は４ＮＡ／λであるので、χ（１）由来の光を共焦点顕微鏡で観察する構成とした場合、その分解能は共焦点蛍光顕微鏡と比較して低い。
　これに対して、χ（３）由来の光は、散乱光間に可干渉性がなく、位相および線幅は励起光と異なる。χ（３）由来の光は、位相緩和時間Ｔ２で決まるスペクトル幅を有し、図２（Ａ）と図２（Ｃ）とを比較して理解される通り、当該スペクトル幅はレーザー光源１１０からの励起光の線幅よりも広い。χ（３）由来の自発過程により発生する光は可干渉性がないので、相互干渉しないインコヒーレントな光である。代表的なものとして、レイリー散乱光・蛍光があげられる。レイリー散乱光・蛍光のどちらの光学過程を顕微鏡に用いても、同様の結像特性を示す。レイリー散乱光は、蛍光と同様に、励起光の入射方向にかかわらず全方向に放射される。入射光に平行な例えば細胞の側壁であっても、そこから発生するレイリー散乱光はインコヒーレントであるので、全方向に放射される。後方にも光は戻るので、反射型顕微鏡であっても細胞の側壁を観察することができる。χ（３）由来の光を共焦点顕微鏡で観察する構成とした場合、セクショニング能力を有する。また、分解能の指標となる遮断周波数の理論限界値は４ＮＡ／λとなるので、分解能は共焦点蛍光顕微鏡と同等である。
　χ（３）由来の光には、レイリー散乱光が含まれる。レイリー散乱光の他に、自発過程により発生する光、例えば、レーリーウィング散乱光、ブリルアン散乱光、ラマン散乱光、蛍光などもχ（３）由来の光に含まれるが、レイリー散乱光は、ラマン散乱光やブリルアン散乱光に比べて強い。中心波長について、χ（３）由来の光に含まれるレイリー散乱光は励起光と変わらないが、χ（３）由来の光に含まれる他の自発過程により発生する光は励起光と異なる。レイリー散乱光がχ（３）由来の光であることについて、例えば公知文献である物性研究（１９９７），６７（４）内の松田康平による「Ｊ会合体におけるハイトラー実験」における第２章に、以下の通り示されている。すなわち、一般に光と相互作用する物質の３次の非線形感受率χ（３）は、複数の項の和で形成されるが、レイリー散乱に対応する項は、図３に示されたダイアグラムに対応する１つの項だけであり、その項の虚部がレイリー散乱スペクトルになる。
　また、Ｒｏｂｅｒｔ　Ｗ．Ｂｏｙｄ によって書かれたＮｏｎｌｉｎｅａｒ　Ｏｐｔｉｃｓ（３ｒｄ ｅｄｉｔｉｏｎ）（ＡＣＡＤＥＭＩＣ　ＰＲＥＳＳ）における第９章に、レイリー散乱の原因となる物質の密度分布のかく乱（音波のゼロ点振動に対応）の緩和時間によって、レイリー散乱のスペクトル幅は決まることが示されている。
　以上により、レイリー散乱光はχ（３）由来の光であり、かつ励起レーザー線幅が無限に狭かったとしても有限のスペクトル幅を有することが分かる。
　図１に戻り、検出部１０２における制限部１０３について、具体的に説明する。制限部１０３は、観察対象１０からの光に含まれるχ（３）由来のレイリー散乱光およびχ（１）由来の光のうち、χ（１）由来の光を制限する。この制限には、一対のミラー１８０で反射された２つの光をビームスプリッター１７０で合波したときの干渉を利用する。ここで、制限方法の詳細について、図４および図５を用いて説明する。
　図４は、一対のミラー１８０を用いて光路長差を変化させながら取得した、χ（３）由来のレイリー散乱光およびχ（１）由来の光のそれぞれについての、理論上の信号強度の光路差長依存性を示すグラフである。図５は、同様にして実測される光の信号強度の光路差長依存性を示すグラフである。
　図４および図５のいずれのグラフも、横軸は時間換算した光路差長であり、縦軸は光信号強度である。また、図４および図５において、χ（３）由来のレイリー散乱光はχ（３）で示され、χ（１）由来の光はχ（１）で示されている。
　χ（１）由来の光はコヒーレント光であるため、図４に示されるように、光路差長が長くなるに連れて、干渉効果で信号強度は周期的に変化する。χ（１）由来の光のスペクトル幅はレーザー光源１１０からのレーザー線幅に等しいため、狭帯域のＣＷレーザーを励起光として用いれば、その長いコヒーレント長を反映して、光路長差を変化させてもいつまでも干渉し、周期的に変化する。
　これに対して、χ（３）由来のレイリー散乱光はインコヒーレント光であり、図４に示されるように、光路差長が長くなるに連れて、多少の干渉効果で信号強度は周期的に変化するが、物質固有の位相緩和時間Ｔ２で周期的変化の振幅は小さくなり、最終的には一定値を示すようになる。Ｔ２はスペクトル幅の逆数に比例し、およそ時間換算で～１０ｎｓ程度と予想される。これは距離にして～３ｍであり、この程度の光路差長は干渉計として現実的である。
　図５に示される、実測される光の信号強度の光路差長依存性を示すグラフを用いて、χ（３）由来のレイリー散乱光およびχ（１）由来の光のうち、χ（１）由来の光を制限する方法を説明する。先ず、光路長差が、時間換算した場合に少なくとも位相緩和時間Ｔ２の２倍である２Ｔ２よりも長くなるように設定する。この光路長差の範囲においては、上記の通り、χ（１）由来の光の信号強度は周期的に変化するが、χ（３）由来のレイリー散乱光の信号強度は一定となっている。そこで、この光路長差の範囲において、実測される光の信号強度が最小となるように光路長差を設定することによって、具体的には、一対のミラー１８０のうちの可動ミラー１８１を、実測される光の信号強度が最小となる位置に止めて光の信号強度を実測することによって、χ（３）由来のレイリー散乱光を検出できる程度にχ（１）由来の光の信号強度を制限できる。当該手法により、非染色で共焦点蛍光顕微鏡と同等の分解能を得ることができる。
　このように、制限部１０３は、一対のミラー１８０を用いて光路長差を調整することで、干渉によりχ（１）由来の光を弱め合わせ、χ（３）由来のレイリー散乱光およびχ（１）由来の光のうち、χ（１）由来の光を制限する。なお、ここで言う「光を弱め合わせる」とは、可干渉性を有するχ（１）由来の光を、光の波長をλとした場合に［ｎ＋（１／２）］λ（ｎは整数）だけ互いに位相がずれるような光路長差に分岐して、分岐した２つの光を合波させた際に互いに打ち消し合わせることを含む。
　以上の通り、本実施形態における、落射型の共焦点光学系１０１を有する観察装置１００によれば、励起光を照射された観察対象から得られる光に含まれるχ（３）由来のレイリー散乱光およびχ（１）由来の光のうち、χ（１）由来の光を制限して、χ（３）由来のレイリー散乱光を検出し、χ（３）由来のレイリー散乱光に基づく観察画像を出力する。これによって、観察対象１０を染色することなく、インコヒーレント相互作用でありながら信号が十分強く、セクショニング能力を持ち、共焦点蛍光顕微鏡と同等の分解能を得ることができる。観察装置１００は、レーザー光源１１０にＣＷレーザーを用いた通常の共焦点顕微鏡の信号検出部を僅かに変更することで実現され、高速描画が可能であり迅速病理診断に適している。なお、観察装置１００における構成を、共焦点蛍光顕微鏡のオプションとしてもよい。
　図６は、観察装置２００の模式図である。観察装置２００は、制限部１０３がロックイン検出部１９３を有し、検出部１０２の出力部１９１が、ロックイン検出部１９３を介してディテクタ１９０に電気的に接続されている点を除いては、観察装置１００と同じ構成を有するので、重複する説明は省略する。
　制限部１０３におけるロックイン検出部１９３は、特定の光信号をロックイン検出する回路であり、ディテクタ１９０に電気的に接続されている。制限部１０３は、ロックイン検出部１９３を用いて、ディテクタ１９０で検出された観察対象１０からの光をロックイン検出し、光のｄｃ成分とａｃ成分とを検出し演算することで、χ（３）由来のレイリー散乱光およびχ（１）由来の光のうち、χ（１）由来の光を制限し、χ（３）由来のレイリー散乱光を検出する。具体的には、先ず、振動駆動部１８６が可動ミラー１８１を予め定められた点を中心に高速微小振動させ、χ（１）由来の光の振動の周波数と同期検波することで、観察対象１０から得られる光からχ（１）由来の光を抽出する。そして、観察対象１０から得られる光の平均信号強度から、抽出したχ（１）由来の光の信号強度の半分を引くことで、χ（３）由来のレイリー散乱光を検出する。すなわち、ロックイン検出を用いて、χ（３）由来のレイリー散乱光を検出できる程度にχ（１）由来の光を制限する。当該手法によっても、非染色で共焦点蛍光顕微鏡と同等の分解能を得ることができる。
　以上の複数の実施形態において、観察装置は、透過型ではなく反射型なので、組織を切り取って観察することもでき、また、組織を切り取らずに観察することもできる。
　以上の複数の実施形態においては、観察対象の位置を変位させずにＸＹスキャニングミラーを用いてスキャニングする構成としたが、これに代えて、観察対象を載せたステージをＸＹ方向に変位させてスキャニングする構成としてもよい。また、これに加えて、Ｚスキャニングを行うことで、セクショニングした高解像画像を奥行き方向へ繋ぎ合わせ、観察対象を３次元計測してもよい。
　以上の複数の実施形態においては、観察装置におけるバンドパスフィルタの配置を、検出部内ではなく共焦点光学系内の光路上とした。これに代えて、バンドパスフィルタの配置を、共焦点光学系内ではなく検出部内の光路上にしてもよく、例えばディテクタの手前に配置されてもよい。当該構成によっても、ディテクタにラマン散乱光や自家蛍光が入射することを防止できる。
　以上の複数の実施形態において、観察装置は、励起光を照射された観察対象から得られる光のうちのχ（３）由来のレイリー散乱光を検出し、χ（３）由来のレイリー散乱光に基づく観察画像を出力する構成として説明した。これに加えて、またはこれに代えて、観察装置は、観察対象から得られる、χ（３）由来の他の自発過程により発生する光、例えば、レーリーウィング散乱光、ブリルアン散乱光、ラマン散乱光、蛍光の少なくとも１つのχ（３）由来の光を検出し、このχ（３）由来の光に基づく観察画像を出力してもよい。この場合、上記のバンドパスフィルタを光路上に設けなくてもよく、または、所望の光のみを透過してそれ以外の光を制限する他のバンドパスフィルタを光路上に設けてもよい。
　また、以上の複数の実施形態において、追加的に、観察対象をカバーガラスで挟んで保持する設置型顕微鏡の構成としてもよい。この場合、観察対象にカバーガラスを押し付けて平坦にする構成にすることが好ましい。これにより、観察対象の周囲における空気との屈折率変化を抑制することができる。
　また、以上の複数の実施形態において、追加的に、制限部における一対のミラーのうちの可動ミラーをシフトさせ、χ（３）由来の光と比較して圧倒的に信号強度が強いχ（１）由来の光による画像をビデオレートで取得してもよい。
　以上、本発明を実施の形態を用いて説明したが、本発明の技術的範囲は上記実施の形態に記載の範囲には限定されない。上記実施の形態に、多様な変更または改良を加えることが可能であることが当業者に明らかである。その様な変更または改良を加えた形態も本発明の技術的範囲に含まれ得ることが、請求の範囲の記載から明らかである。
　請求の範囲、明細書、および図面中において示した装置、システム、プログラム、および方法における動作、手順、ステップ、および段階等の各処理の実行順序は、特段「より前に」、「先立って」等と明示しておらず、また、前の処理の出力を後の処理で用いるのでない限り、任意の順序で実現しうることに留意すべきである。請求の範囲、明細書、および図面中の動作フローに関して、便宜上「まず、」、「次に、」等を用いて説明したとしても、この順で実施することが必須であることを意味するものではない。
１０　観察対象、１００　観察装置、１０１　共焦点光学系、１０２　検出部、１０３　制限部、１０４　制御部、１１０　レーザー光源、１２１、１２３、１２５、１２７　レンズ、１３１、１３３、１３５　ピンホール、１４０　ハーフミラー、１４５　バンドパスフィルタ、１５０　ＸＹスキャニングミラー対、１５１、１５３　ＸＹスキャニングミラー、１５６　スキャニング駆動部、１６０　対物レンズ、１７０　ビームスプリッター、１８０　一対のミラー、１８１　可動ミラー、１８３　固定ミラー、１８６　振動駆動部、１９０　ディテクタ、１９１　出力部、１９３　ロックイン検出部

Claims (40)

  1. 　観察対象に光を照射する光源と、
    　前記観察対象から得られる光に含まれるχ（３）由来の光に基づいて画像を生成する処理部と
    　を備える観察装置。
  2. 　前記観察対象から得られる前記光に含まれる前記χ（３）由来の光およびχ（１）由来の光のうち、前記χ（１）由来の光を制限して、前記χ（３）由来の光を検出する検出部を更に備え、
    　前記処理部は、前記検出部が検出した前記χ（３）由来の光に基づいて画像を生成する、
    　請求項１に記載の観察装置。
  3. 　観察対象に光を照射する光源と、
    　前記観察対象から得られる光に含まれるχ（３）由来の光およびχ（１）由来の光のうち、前記χ（１）由来の光を制限して、前記χ（３）由来の光を検出する検出部と
    　を備える観察装置。
  4. 　前記検出部は、前記χ（１）由来の光の強度を小さくすることにより、前記χ（１）由来の光を制限する、
    　請求項２または３に記載の観察装置。
  5. 　前記検出部は、
    　前記観察対象から得られる前記光の光路上に配置され、前記光を分岐する少なくとも１つの光分岐部と、
    　前記光分岐部で分岐された光の光路長差を調整可能な少なくとも２つのミラーと
    を有し、
    　前記少なくとも２つのミラーで反射された光が合波したときの干渉を利用して、前記χ（１）由来の光を制限する、
    　請求項２から４の何れか一項に記載の観察装置。
  6. 　前記光分岐部は、光を２つに分岐する、請求項５に記載の観察装置。
  7. 　前記光分岐部は、ビームスプリッターである、請求項５または６に記載の観察装置。
  8. 　前記少なくとも２つのミラーで反射された前記光は、前記光分岐部で合波される、請求項５から７の何れか一項に記載の観察装置。
  9. 　前記検出部は、前記少なくとも２つのミラーを用いて前記光路長差を調整することで、前記干渉により前記χ（１）由来の光を弱め合わせ、前記χ（１）由来の光を制限する、
    　請求項５から８の何れか一項に記載の観察装置。
  10. 　前記検出部は、
    　前記観察対象から得られる前記光のｄｃ成分とａｃ成分とを検出し演算することで、前記χ（１）由来の光を制限するロックイン検出部を更に有する、
    　請求項５から８の何れか一項に記載の観察装置。
  11. 　前記少なくとも２つのミラーのうち少なくとも１つは、予め定められた方向に沿って移動可能である、
    　請求項５から１０の何れか一項に記載の観察装置。
  12. 　前記光路長差は、時間換算した場合に、位相緩和時間Ｔ２の２倍である２Ｔ２よりも長い、請求項５から１１の何れか一項に記載の観察装置。
  13. 　前記χ（３）由来の光は、レイリー散乱光、レーリーウィング散乱光、ブリルアン散乱光、ラマン散乱光、蛍光の少なくとも１つを含む、請求項１から１２の何れか一項に記載の観察装置。
  14. 　前記観察対象から得られる前記光の光路上に配置され、前記χ（１）由来の光を透過し、且つ、前記χ（３）由来の光のうち、レイリー散乱光を透過して、前記レイリー散乱光以外の光を制限するバンドパスフィルタを更に備える、請求項２から１３の何れか一項に記載の観察装置。
  15. 　前記光源から照射される前記光は、ＣＷレーザー光である、請求項１から１４の何れか一項に記載の観察装置。
  16. 　落射型の共焦点光学系を有する、請求項１から１５の何れか一項に記載の観察装置。
  17. 　請求項１から１６の何れか一項に記載の観察装置を用いて前記観察対象を観察する、観察方法。
  18. 　光源から光を照射された観察対象から得られる光に含まれるχ（３）由来の光に基づいて画像を生成する段階を含む、観察方法。
  19. 　前記観察対象から得られる前記光に含まれる前記χ（３）由来の光およびχ（１）由来の光のうち、前記χ（１）由来の光を制限して、前記χ（３）由来の光を検出する段階を含む、請求項１８に記載の観察方法。
  20. 　光源から光を照射された観察対象から得られる光に含まれるχ（３）由来の光およびχ（１）由来の光のうち、前記χ（１）由来の光を制限して、前記χ（３）由来の光を検出する段階を含む観察方法。
  21. 　前記検出する段階は、
    　光分岐部を用いて前記観察対象から得られる前記光を分岐する段階と、
    　分岐された光の光路長差を少なくとも２つのミラーにより調整する段階と、
    　前記少なくとも２つのミラーで反射された光を前記光分岐部で合波したときの干渉を利用して、前記χ（３）由来の光および前記χ（１）由来の光のうち、前記χ（１）由来の光を制限する段階と
    を含む、請求項１９または２０に記載の観察方法。
  22. 　前記検出する段階は、前記少なくとも２つのミラーを用いて前記光路長差を調整することで、前記干渉により前記χ（１）由来の光を弱め合わせ、前記χ（１）由来の光を制限する段階を含む、請求項２１に記載の観察方法。
  23. 　前記検出する段階は、
    　前記少なくとも２つのミラーのうち少なくとも１つを予め定められた方向で振動させる段階と、
    　前記観察対象から得られる前記光をロックイン検出し、前記光のｄｃ成分とａｃ成分とを検出し演算することで、前記χ（１）由来の光を制限する段階と
    を含む、請求項２１に記載の観察方法。
  24. 　前記検出する段階は、前記光路長差を、時間換算した場合に、位相緩和時間Ｔ２の２倍である２Ｔ２よりも長く設定する段階を更に含む、請求項２１から２３の何れか一項に記載の観察方法。
  25. 　前記χ（３）由来の光は、レイリー散乱光、レーリーウィング散乱光、ブリルアン散乱光、ラマン散乱光、蛍光の少なくとも１つを含む、請求項１８から２４の何れか一項に記載の観察方法。
  26. 　前記観察対象から得られる前記光の光路上にバンドパスフィルタを配置して、前記χ（１）由来の光を透過し、且つ、前記χ（３）由来の光のうち、レイリー散乱光を透過して、前記レイリー散乱光以外の光を制限する段階を更に含む、請求項１９から２５の何れか一項に記載の観察方法。
  27. 　前記光源から照射される光としてＣＷレーザー光を前記観察対象に照射する段階を更に含む、請求項１８から２６の何れか一項に記載の観察方法。
  28. 　落射型の共焦点光学系を用いる、請求項１８から２７の何れか一項に記載の観察方法。
  29. 　観察対象に励起光を照射する光源と、
    　前記観察対象から得られる光の光路上に配置され、前記光を分岐する少なくとも１つの光分岐部と、
    　前記光分岐部で分岐された光の光路長差を調整可能な少なくとも２つのミラーと、
    　前記少なくとも２つのミラーで反射した光を検出する検出器と
    　を備え、
    　前記光分岐部で分岐された光は、前記少なくとも２つのミラーで反射した後に合波され、
    　前記検出器は、合波された光を検出する、
    　観察装置。
  30. 　前記少なくとも２つのミラーは、前記光分岐部で分岐された前記光を前記光分岐部が位置する方向に反射する、
    　請求項２９に記載の観察装置。
  31. 　前記光分岐部で分岐された前記光は、前記少なくとも２つのミラーで反射した後、前記光分岐部で合波される、
    　請求項２９または３０に記載の観察装置。
  32. 　前記少なくとも２つのミラーのうち少なくとも１つは、予め定められた方向に沿って移動可能である、
    　請求項２９から３１の何れか一項に記載の観察装置。
  33. 　前記光分岐部は、ビームスプリッターである、請求項２９から３２のいずれか一項に記載の観察装置。
  34. 　前記光分岐部は、光を２つに分岐する、請求項２９から３３のいずれか一項に記載の観察装置。
  35. 　前記観察対象から得られる前記光をロックイン検出し、前記光のｄｃ成分とａｃ成分とを検出し演算するロックイン検出部を更に備える、
    　請求項２９から３４の何れか一項に記載の観察装置。
  36. 　前記光路上で、前記光のうち、レイリー散乱光を透過して、前記レイリー散乱光以外の光を制限するバンドパスフィルタを更に備える、
    　請求項２９から３５の何れか一項に記載の観察装置。
  37. 　前記バンドパスフィルタは、前記観察対象と前記光分岐部との間の光路上に配置される、
    　請求項３６に記載の観察装置。
  38. 　前記バンドパスフィルタは、前記光分岐部と前記検出器との間の光路上に配置される、
    　請求項３６に記載の観察装置。
  39. 　前記光源から照射される光は、ＣＷレーザー光である、
    　請求項２９から３８の何れか一項に記載の観察装置。
  40. 　落射型の共焦点光学系を有する、
    　請求項２９から３９の何れか一項に記載の観察装置。
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