JP2016515703A - 誘導ラマン検出のための装置および方法 - Google Patents

Abstract

【解決手段】１つの態様によれば、本発明は、サンプルにおいて誘導された誘導ラマン散乱（ＳＲＳ）型の共鳴非線形光学信号を検出する装置に関する。装置は、サンプルにおいて、角周波数ω１およびω２での一連の光パルスを第１の変調周波数で、また角周波数ω２およびω３での一連の光パルスを第２の変調周波数で、ΩＲがサンプルの分子振動共鳴角周波数であるときにω２−ω１＝ω３−ω２＝ΩＲとなるように、干渉させる電気光学手段を含んでいる。さらに、装置はサンプルにおける光パルスの干渉に起因する非線形光学信号の第１および第２の変調周波数での同期検波手段と、サンプルの分子振動共鳴を特徴付ける信号を同期検波に起因する電子信号から取得することを可能にする電子処理手段と、を含んでいる。【選択図】図７Ａ

Description

本発明は、サンプルにおいて誘導ラマン散乱（ＳＲＳ）型の共鳴非線形光学信号の検出のための装置および方法に関する。本発明は、特に、生体媒質などの散乱媒質中の、顕微鏡画像化、分光法、そしてハイパースペクトル画像化に適用できる。

あらゆる化学結合は、それらに特有の振動周波数を有する。これらの分子振動に関する情報を得るために、光と物質との間の干渉を用いることを意図する方法は、振動光学技術と呼ばれる。これらの技術の中で最も良く知られている技術は赤外（ＩＲ）分光法であり、ここでは、サンプル中に存在する化学結合の特定の吸収線が観察される。１９２８年に発見されたラマン散乱（その効果を発見した物理学者であるチャンドラシェカール・ヴェンカタ・ラマンに因んで名付けられた）は、光線と干渉する分子の振動スペクトルを得るために可視光を用いることを許可する。ラマン散乱プロセスにおいて、分子に入射する角周波数ω_Ｐのポンピング波は、角周波数ω_Ｓのストークス波と呼ばれるもの、および、角周波数ω_ＡＳの反ストークス波と呼ばれるものの中へ非弾性的に散乱される。発生波とポンピング波との間の周波数差は、ω_Ｐ−ω_Ｓ＝ω_ＡＳ−ω_Ｐ＝Ω_Ｒなどの（角周波数Ω_Ｒの）分子ラマン遷移に依存する。この過程のフォトニックの観点から、ストークス波および反ストークス波は、それぞれ、基本または励起振動準位からの吸収に対応する。励起振動準位から反ストークス波を発生させるプロセスは、自発ラマン分光法の実践において観察される唯一の波であるストークス波を作り出すプロセスよりも、はるかに蓋然性が低い。ストークス波のスペクトル分布の綿密な研究は、サンプル中に存在する化学結合の密度に関する情報を提供する。この自発的な非弾性散乱プロセスは、蛍光発光と比較して非常に効果がない（１０^−１６ｃｍ^２／分子に到達する蛍光色素分子の１光子実効吸収断面積と比べて、ラマン実効断面積は、約１０^−３０ｃｍ^２／分子である）。

可干渉性の反ストークスラマン散乱（ＣＡＲＳ）および誘導ラマン散乱（ＳＲＳ）と呼ばれる誘導ラマン技術は、自発ラマン散乱プロセスに関連して、約１０^７の増幅を提供する可干渉性のラマン散乱プロセスである。これらの技術（図１Ａ参照）において、精査することを要求される振動準位の角周波数Ω_Ｒと等しくなるように角周波数差が設定される、角周波数ω_Ｐおよびω_Ｓの（または周波数ν_ｐおよびν_ｓの）２つのレーザパルスは、解析対象の媒体に注入される。ポンプおよびストークスパルスを意味するこれらのパルスは、それぞれ、角周波数Ω_Ｒの振動モードを共鳴させる周波数拍動を引き起こす。ＣＡＲＳプロセスにおいて、この共鳴は、ポンプ光によって精査され、角周波数ω_ＡＳで反ストークス散乱を誘導する。誘導ラマン散乱（ＳＲＳ）は、励起（ポンプ）領域とともにポンプおよびストークス領域によって誘導された非線形領域の干渉に起因する非線形応答を利用するプロセスであり、それ故、ＣＡＲＳプロセスとは対照的に、ポンプおよびストークスパルスと同一周波数で観察される。それは、ポンプ光からストークス光へのエネルギーの伝達を引き起こす。このように、誘導ラマン散乱は、ＳＲＬ（誘導ラマン損失）プロセスおよびＳＲＧ（誘導ラマン利得）プロセスの２つのプロセスを対象とし、これらはそれぞれポンプ光における強度損失ΔＩ_ＳＲＬおよびストークス光における強度利得ΔＩ_ＳＲＧを誘導する（図１Ｂ参照）。ＳＲＳプロセスは、例えば、N. Bloembergenによる総説に記載されている（“The stimulated Raman Effect”，American Journal of Physics，35巻：989-1023ページ，1967年）。ポンプ光の強度における低下ΔＩ_ＳＲＬおよびストークス光の強度における利得ΔＩ_ＳＲＧは、３次非線形感受率（Ｉｍ（χ_Ｒ ^（３）））の虚数部に比例するということが示されている。それ故、これらの量の計測は、ラマンスペクトルの正確な計算を可能にする。最近では、振動光学技術はＳＲＳ技術により専心しており、ＣＡＲＳ技術とは対照的に、ＣＡＲＳにおいて常時存在する非共鳴のバックグラウンドに依存せず、化学種濃度とともに線形である。

ＳＲＳ顕微鏡法は、フェムト秒ＳＲＳ分光法の分野において最近の進歩を活用する新しい技術である。２００７年に、Ploetz他（“Femtosecond Stimulated Raman Microscopy”，Applied Physics B，87巻（3）号：389-393ページ，2007年）は、フェムト秒およびピコ秒パルスを供給する増幅レーザシステムに基づいて、最初のＳＲＳ顕微鏡を開発した。この型のシステムは、強いＳＲＳ信号を誘導するが、生体撮像に対しては適さない。具体的には、使用される高ピーク出力（ｎＪ程度）はサンプルにダメージを与え、低反復率（１ｋＨｚ）は高速走査顕微鏡と互換性がない。

高反復率（８０ＭＨｚ）のピコ秒レーザシステムの使用に基づくＳＲＳ顕微鏡は、生体サンプルの画像の形成と互換性があって提案されていた（例えば、C.W.Freudiger他の“Label-free biomedical imaging with high sensitivity by stimulated Raman scattering microscopy”，Science，322巻5909号1857-1861ページ，2008年、P. Nandakumar他の“Vibrational imaging based on stimulated Raman scattering microscopy”，New Journal of Physics，11巻3号：033026（9ページ），2009年、Y. Ozeki他の“Analysis and experimental assessment of the sensitivity of stimulated Raman scattering microscopy”，Optics Express，17巻5号3651-3658ページ，2009年3月 による論説を参照）。ＣＡＲＳ顕微鏡法において、有益な信号、すなわち反ストークス信号は、励起光とは異なる周波数で発生させられる。反ストークス信号は、アバランシェフォトダイオードまたは光電子増倍管などの超高感度検出器によって検出され得る。ＳＲＳ顕微鏡法において、有益な信号は励起光と同一周波数で発生するため、検出は別の問題を引き起こす。それは、ポンプ光からエネルギーΔＩ_ＳＲＬ損失を検出するか、または、ストークス光のエネルギーΔＩ_ＳＲＧ利得を検出するかという問題である。実際には、ポンプ光からのエネルギー損失は、約ΔＩ_ＳＲＬ／Ｉ_Ｐ≒１０^−５−１０^−８である。上記で引用された論説において、検出感度を向上させるために、同期検波によって、周波数ｆ_ｍでストークス信号を変調し、周波数ｆ_ｍにおけるポンプ信号からその損失を抽出することが提案されている。

それ故、図２は、ＳＲＧ構成すなわちストークス光から利得を抽出するために適した構成における、先行技術のＳＲＳ顕微鏡の概略図を示している。図２において１０２および１０４で言及されている、それぞれ角周波数ω_Ｐおよびω_Ｓでの一連のポンプおよびストークスパルスは、顕微鏡１２０の本体内に配置された顕微鏡対物１２２の焦点に位置されたサンプルＳに注入される。角周波数ω_Ｐおよびω_Ｓは、角周波数差がサンプルにおいて精査することを要求される振動準位の角周波数Ω_Ｒと等しくなるように選択される。ポンプおよびストークスパルス列は、結合器１１４を用いて空間的に重畳され、可変遅延線（図示せず）は、サンプル中の各パルスの時間的な重畳を確実にするために提供される。
ポンプパルス列１０２は、変調されたパルス列１０６を形成するために、変調装置１１２を用いて変調周波数ｆ_ｍで振幅変調される。電子ノイズおよびレーザノイズを減らすために、変調周波数は１ＭＨｚより上となるように選択される。このように、図２において、曲線１０１および１０３は、それぞれ、変調されたパルス列１０６および（非変調の）ストークスパルス列１０４の光強度Ｉ_ＰおよびＩ_Ｓの時間波形を示している。集光対物１２４は、サンプル中のポンプおよびストークスパルスの干渉に起因する光信号を集光させる。選択された構成において、フィルタ１２６は、角周波数ω_Ｓでのパルス列１０８を選択させ、その後、この列は、例えばフォトダイオードのような光検出器１２８に送信される。時間の関数として計測される光強度は、曲線１０７によって概略的に示されている。変調周波数ｆ_ｍでの同期検波１３０は、角周波数Ω_Ｒでの分子振動を特徴付けている所望の信号ΔＩ_ＳＲＧを抽出させる。例えば二つのガルバノメーターミラーを含む走査システム１１６を用いて、サンプル上を励起光１０４、１０６が走査すると、サンプルの対象としている領域の画像が形成される。

しかしながら、ＳＲＳ顕微鏡法は化学的特異性を制限する多くのアーティファクトに依存し、なぜならば、それらはＳＲＳ信号として解釈されうる信号を伝えるからである。とりわけ、ＳＲＳ顕微鏡法は、対象の化学結合に特有ではなく且つＳＲＳ信号の正または負のオフセットとして現れるクロスカー効果（または“交差位相変調”のためのＸＰＭ）に敏感である。ＳＲＳ顕微鏡法は、また、ＳＲＳ信号の（ＳＲＬ構成の）正または（ＳＲＧ構成の）負のオフセットとして現れる２光子吸収（または“２光子吸収”のためのＴＰＡ）にも敏感である。

２光子吸収は、（図２に示されるようなＳＲＧ構成において）ポンプ光線が存在するときのみ、ストークス光の減少を誘導する瞬間的な非線形プロセスである。ストークス光において誘導される変調は、このようにして検出され、ＳＲＳ信号として解釈される。ＳＲＧ検出モードにおいて、ＴＰＡによるストークス光の減少は、ＳＲＧの利得計測に関して負のオフセットとして現れる。ＳＲＬ検出モードにおいて、ＴＰＡによるポンプ光の減少は、ＳＲＬの損失計測に関して正のオフセットとして現れる。

光学カー効果は、それを発生させる波の強度に比例する屈折率の変化を誘導し、それを発生させている光線をフォーカスまたはデフォーカスするように導くレンズ効果を引き起こす（瞬間的な）非線形プロセスである。ＳＲＳ顕微鏡法において、カー効果は、それがポンプ光子のみまたはストークス光子のみに影響を与えるときは問題ではない。具体的には、例えば（図２に示されるような）ＳＲＧ構成において、ポンプ光子のみが影響を与えられるとき、カー効果は、ポンプ光によってのみ見られる変化を誘導する。しかしながら、後者は検出されないが故に、そのフォーカスは計測に影響を与えない。ストークス光子のみが影響を与えられるとき、カー効果は、ストークス光によってのみ見られる変化を誘導する。後者は変調されていないから、そのフォーカスおよび検出器で誘導されるエネルギーの変化は、時間を通して一定のままであって、それ故に変調周波数ｆ_ｍでのＳＲＳの計測に影響を与えない。しかしながら、例えばＳＲＧ構成において、ストークス光の角周波数ω_Ｓでの屈折率において、角周波数ω_Ｐのポンプ光によって誘導される変化が観察される。これはクロスカー効果であって、この場合、計測されたＳＲＳ信号のそれと同一の変調を有するストークス光をフォーカスまたはデフォーカスさせる。計測オフセットは生じる。クロスカー効果の影響を減らすために、サンプルとの干渉後の計測光（ＳＲＬにおけるポンプ、ＳＲＧにおけるストークス）を集光する際に、絞りを導入しないことが重要である。このため、開口数が励起対物の開口数よりも大きい集光対物を使用することが知られている。

これらのアーティファクトは、散乱媒質とりわけ生体組織によって悪影響を及ぼされ、小さな実効ラマン断面積を有する振動結合を観察するＳＲＳ顕微鏡法の利用を妨げる。具体的には、励起対物の開口数よりも大きい開口数を有する集光対物が使用されるときでさえ、散乱は、アーティファクトの効果とりわけクロスカー効果に悪影響を及ぼす集光対物によって絞りをもたらす。

このように、図３Ｂないし３Ｄは、ヒトの皮膚から形成された組織の中の多様なスペクトル領域において、ＣＡＲＳ、ＳＲＳおよびラマン顕微分光法により得られたスペクトルを図示しており、図３Ａにはラマンスペクトルが示されている。図３Ａに示されるスペクトルは、Huang他による論説（Optics Express, 19巻，23号（2011年））から複写されたものであって、ラマン画像化のための対象となる３つのスペクトル領域からなる。２７５０ｃｍ^−１と３０５０ｃｍ^−１との間の角周波数に対応するとともに高強度の分子振動を含む“脂質およびタンパク質”領域と呼ばれる領域と、１３５０ｃｍ^−１と１７５０ｃｍ^−１との間の角周波数に対応する“アミド”領域と呼ばれる領域と、８５０ｃｍ^−１と１１５０ｃｍ^−１との間の角周波数に対応する“指紋”領域と呼ばれる領域である。図３Ｂないし３Ｄは、それぞれ、これらの領域のそれぞれにおいて、ＣＡＲＳ、ＳＲＳおよびラマン顕微分光法によって実行された行われたスペクトル計測結果を示している。分子振動強度が高い領域（図３Ｂ）において、ＳＲＳ計測値２０３がラマンスペクトル２０１とよく対応しているように見られる一方で、ＣＡＲＳ計測値２０２は、連続的な非共鳴のバックグラウンドと関連するオフセットを提示している。ＣＡＲＳ計測値における連続的な非共鳴のバックグラウンドの効果は、２つの他の領域（図３Ｃおよび３Ｄにおける曲線２１２および２２２）においても見ることができる。さらに、オフセット（連続的なバックグラウンド）は、分子振動の強度がより低い領域におけるＳＲＳ計測値に現れることも観察されている。このように、ＳＲＳ計測値に起因する曲線（図３Ｃおよび３Ｄにおける曲線２１３および２２３）は、もはやラマンスペクトル（２１１および２２１）上に重畳しない。これらの実験曲線は、分子振動の強度が低い領域におけるＳＲＳ計測値のアーティファクトの効果を説明している。

本発明は、サンプルにおいて誘導されたＳＲＳ型の共鳴非線形光学信号を検出するための独創的な方法を提供し、求められている有益なＳＲＳ信号を増加させるとともに、散乱生体媒質から形成されたサンプルに含まれるアーティファクト、とりわけクロスカー効果に起因するアーティファクトを除去させる。

第１の態様によれば、本発明は、サンプルにおいて誘導された誘導ラマン散乱（ＳＲＳ）型の共鳴非線形光学信号を検出するための装置に関する。前記装置は、
Ω_Ｒが前記サンプルの分子振動共鳴角周波数である場合にω_２−ω_１＝ω_３−ω_２＝Ω_Ｒとなるように、角周波数ω_１およびω_２の一連の光パルスを第１の変調周波数で、角周波数ω_２およびω_３の一連の光パルスを第２の変調周波数で、前記サンプルにおいて干渉させるための電気光学手段と、
前記サンプルにおいて前記光パルスの干渉に起因する非線形光学信号の前記第１および第２の変調周波数での同期検波のための手段と、
前記サンプルの分子振動共鳴を特徴付ける信号を、前記同期検波に起因する電子信号から取得することを可能にする電子処理手段と、を含む。

このように、この新規な装置は、３つの予め設定された波長での３つの励起光を使用し、サンプルにおける第１および第２の変調周波数での対相互作用は、ＳＲＬプロセスとＳＲＧプロセスとの両方を同時に発生させ、中短波長の光線は、それぞれのプロセスにおいてポンプ光またはストークス光としての役割を果たしている。変調周波数は、実施例にもよるが、同一であってもよいし、異なっていてもよい。両ケースにおいて、変調周波数または２つのプロセスの干渉に起因する非線形光学信号の周波数での同期検波は、アーティファクトを抑制させ、有益なＳＲＳ信号を２倍にさせる。

サンプルにおいてパルス列を干渉させるための手段は、共通の焦点ボリューム上にパルス列の焦点を合わせるための手段を有利に含み、サンプルにおいて非線形光学効果を生じさせるために十分高いエネルギー密度を得ることを可能にする。

記載された装置は、少なくとも一部分は繊維質であってもよい。出願人は、実施される検出方法が、さらに繊維において生じる非線形効果に起因するアーティファクトを抑制させることを示している。

そのような装置の１つの応用例は、振動ラマン画像化、特に顕微鏡画像化である。それから、装置は、画像化を実行するためにサンプルに対してこの焦点ボリュームを移動させるための手段を含んでいてもよい。

記載された装置の別の応用例は、ラマン分光法である。装置は、例えば、サンプルにおいて干渉するパルス列の角周波数ω_１およびω_３を変化させるための手段と、観察することが要求されるサンプルの分子振動共鳴角周波数Ω_Ｒを変化させるための手段と、を含んでいてもよい。

記載された装置の１つの応用例は、ハイパースペクトルラマン画像化であって、様々な分子振動共鳴角周波数ΩでのサンプルのＳＲＳ画像を生成させる。

画像化または分光法に関わらず、同期検波手段は、サンプル中のパルス列の干渉に起因する非線形光学信号を検出するための光学手段を含み、光学的な検出は、場合によって、
前方検出モード、後方（または落射）検出モード、または、特に生体サンプルの深層における分子振動の観察のための内視鏡的検出モードで実行される。

記載された装置の第１の変形例としては、少なくとも１つのパルス列が振幅変調されている。

第１の実施例において、電気光学手段は、角周波数ω_１，ω_２およびω_３での一連のパルスを放射する源と、第１および第２の変調周波数で角周波数ω_１およびω_３での一連のパルスをそれぞれ振幅変調するための手段と、を含む。

角周波数ω_１およびω_３での一連のパルスは、例えば、同一の変調周波数であるが逆位相の変調周波数で変調される。この場合、一方における角周波数ω_１およびω_２の一連の光パルスと、他方における角周波数ω_２およびω_３での一連の光パルスとは、サンプルにおいて変調周波数で交互に干渉し合う。同期検波手段は、例えば、角周波数ω_２でサンプルから生じるパルスの光検出器を含み、電気信号の同期、アナログまたはデジタルの検出は、変調周波数で光検出器から生じる。同期検波から生じる信号は、サンプルの分子振動共鳴を特徴付ける。電気処理手段は、この信号を抽出させてから利用させる。

また、角周波数ω_１およびω_３での一連のパルスは、互いの倍数ではない２つの異なる変調周波数で振幅変調される。この場合、角周波数ω_２でサンプルから生じるパルスの同期検波は、各変調周波数で実行される。同期検波によって生成される信号は、サンプルの分子振動共鳴を特徴付ける信号を抽出するために処理される。

第２の実施例において、第１および第２の変調周波数は同一であって、電気光学手段は、角周波数ω_１，ω_２およびω_３での一連のパルスを放射するための源と、変調周波数で角周波数ω_２での一連のパルスの振幅変調するための手段と、を含む。この場合、変調周波数での同期検波は、一方において角周波数ω_１でサンプルから生じるパルスと、他方において角周波数ω_３でサンプルから生じるパルスと、に対して実行される。各同期検波によって生成される信号は、サンプルの分子振動共鳴を特徴付ける信号を抽出するために処理される。

記載された装置の第２の変形例として、遅延線が少なくとも１つのパルス列の経路に導入され、パルス列の間における時間遅延の変調が実行される。

より正確には、第１および第２の変調周波数は同一であって、電気光学手段は、角周波数ω_１，ω_２およびω_３での一連のパルスを放射するための源と、角周波数ω_１およびω_３での一連のパルスと角周波数ω_２での一連のパルスとの間において、変調周波数で変調された時間遅延を生成することを可能にする少なくとも１つの遅延線と、を含むことができる。この場合、逆位相で振幅変調された一連のパルスの場合と同様に、一方において角周波数ω_１およびω_２の一連の光パルスと、他方において角周波数ω_２およびω_３の一連の光パルスとは、サンプルにおいて変調周波数で交互に干渉し合う。

第１の変形例（振幅変調）または第２の変形例（時間遅延変調）に関わらず、パルスは、例えば、角周波数ω_１，ω_２およびω_３を中心とした角周波数を有するスペクトル的に狭いピコ秒パルス、または、角周波数ω_１，ω_２およびω_３を中心とした角周波数を有する変異頻度チャープパルスであってもよい。

ピコ秒パルスの場合、パルス列は、例えば、角周波数ω_２の一連のパルスを放射するマスタレーザと、角周波数ω_１（アイドラ）およびω_３（信号）の一連のパルスを放射するＯＰＯレーザと、を含むピコ秒レーザ光源によって放射される。

周波数チャープパルスの場合、パルス列は、例えば、マスタレーザおよびＯＰＯを含むフェムト秒レーザ光源によって得られ、パルスは、時間伸張器によって広げられる。

周波数チャープパルスの場合、放射源は、一方における角周波数ω_１およびω_２でのパルスと、他方における角周波数ω_２およびω_３でのパルスと、の間に同一の時間シフトを生成させる遅延線をさらに含むこともでき、時間シフトの変化によって、サンプルの分子振動共鳴周波数を精査することが可能になる。

記載された装置（時間遅延変調）の第２の変形例において、放射源は、角周波数ω_２を中心とした一連の周波数チャープパルスの発生器と、一方における角周波数ω_２を中心としたパルスと他方における角周波数ω_１およびω_３のそれぞれを中心としたパルスと、を分離することを可能にするダイクロイックビームスプリッタと、を含むこともできる。変調周波数で変調された時間遅延を、その後上記のように、角周波数ω_１およびω_３での一連のパルスと角周波数ω_２での一連のパルスとの間に導入することもできる。

第２の態様によれば、本発明は、第１の態様およびその変形例または実施例の全てに従って記載された装置によって実行される、サンプルにおいて誘導される誘導ラマン散乱（ＳＲＳ）型の共鳴非線形光学信号を検出するための方法に関する。

本発明の他の利点および特徴は、以下の図に例示される説明を読むことにより明らかになる。

図１Ａ（既述）は、誘導ラマン散乱（ＳＲＳ）の原理を示す。 図１Ｂ（既述）は、誘導ラマン散乱（ＳＲＳ）の原理を示す。 図２（既述）は、従来技術におけるＳＲＳ顕微鏡の概略図である。 図３Ａ（既述）は、対象となる３つのスペクトル領域におけるヒト（皮膚）組織のサンプルに対するラマンスペクトルの例を示す。 図３Ｂ（既述）は、対象となる１つのスペクトル領域において従来技術のＣＡＲＳによって得られた比較スペクトル計測値を示す。 図３Ｃ（既述）は、対象となる１つのスペクトル領域において従来技術のＳＲＳによって得られた比較スペクトル計測値を示す。 図３Ｄ（既述）は、対象となる１つのスペクトル領域において従来技術のラマン顕微分光法によって得られた比較スペクトル計測値を示す。 図４は、本発明の第１の変形例の第１の例に従ってＳＲＳ検出装置の実施例（振幅変調）を示す。 図５Ａは、第１の変形例によるサンプル中の干渉を示す概略図である。 図５Ｂは、第１の変形例によるサンプル中の干渉を示す概略図である。 図５Ｃは、第１の変形例によるサンプル中の干渉を示す概略図である。 図６は、図４に示される装置の実施例において検出された信号（ＳＲＳ信号およびアーティファクト）を示すテーブルである。 図７Ａは、前方検出モードのための図４に示される装置の変形例を示す概略図である。 図７Ｂは、後方（または落射）検出モードのための図４に示される装置の変形例を示す概略図である。 図７Ｃは、前方繊維質検出モードのための図４に示される装置の変形例を示す概略図である。 図７Ｄは、内視鏡的検出モードのための図４に示される装置の変形例を示す概略図である。 図８Ａは、図４に示されるような装置を使用して、非散乱サンプルで得られる第１の実験結果を示す概略図である。 図８Ｂは、図４に示されるような装置を使用して、非散乱サンプルで得られる第１の実験結果を示す概略図である。 図８Ｃは、図４に示されるような装置を使用して、非散乱サンプルで得られる第１の実験結果を示す概略図である。 図９Ａおよび９Ｂは、図４に示されるような装置を使用して、散乱サンプルで得られる第２の実験結果を示す概略図である。 図９Ｃは、図４に示されるような装置を使用して、散乱サンプルで得られる第２の実験結果を示す概略図である。 図９Ｄは、図４に示されるような装置を使用して、散乱サンプルで得られる第２の実験結果を示す概略図である。 図９Ｅおよび９Ｆは、図４に示されるような装置を使用して、散乱サンプルで得られる第２の実験結果を示す概略図である。 図１０Ａは、図４に示されるような装置を使用して、生体組織から形成されたサンプルで得られる第３の実験結果を示す概略図である。 図１０Ｂは、図４に示されるような装置を使用して、生体組織から形成されたサンプルで得られる第３の実験結果を示す概略図である。 図１０Ｃは、図４に示されるような装置を使用して、生体組織から形成されたサンプルで得られる第３の実験結果を示す概略図である。 図１１Ａは、本発明の変形例を示す他の装置例である。 図１１Ｂは、本発明の変形例を示す他の装置例である。 図１２Ａは、図１１Ａに示される装置の実施例において検出された信号（ＳＲＳ信号およびアーティファクト）を示すテーブルである。 図１２Ｂは、図１１Ｂに示される装置の実施例において検出された信号（ＳＲＳ信号およびアーティファクト）を示すテーブルである。 図１３は、本発明の別の変形例（時間遅延変調）によるＳＲＳ検出装置の１つの実施例である。 図１４Ａは、図１３に示される変形例によるサンプル中の干渉を示す概略図である。 図１４Ｂは、図１３に示される変形例によるサンプル中の干渉を示す概略図である。 図１４Ｃは、図１３に示される変形例によるサンプル中の干渉を示す概略図である。 図１５は、図１３に示される装置の実施例において検出された信号（ＳＲＳ信号およびアーティファクト）を示すテーブルである。 図１６Ａは、一連のスペクトラム拡散パルスの源の１つの実施例を示す概略図である。 図１６Ｂは、一連のスペクトラム拡散パルスの源の１つの実施例を示す概略図である。 図１７Ａは、スペクトラム拡散パルスを有し、第１の変形例（振幅変調）によるサンプル中の干渉を示す概略図である。 図１７Ｂは、スペクトラム拡散パルスを有し、第１の変形例（振幅変調）によるサンプル中の干渉を示す概略図である。 図１７Ｃは、スペクトラム拡散パルスを有し、第１の変形例（振幅変調）によるサンプル中の干渉を示す概略図である。 図１８Ａは、スペクトラム拡散パルスを有し、第２の変形例（時間遅延変調）によるサンプル中の干渉を示す概略図である。 図１８Ｂは、スペクトラム拡散パルスを有し、第２の変形例（時間遅延変調）によるサンプル中の干渉を示す概略図である。 図１８Ｃは、スペクトラム拡散パルスを有し、第２の変形例（時間遅延変調）によるサンプル中の干渉を示す概略図である。 図１９Ａは、スペクトラム拡散パルスおよび時間遅延の変化を有し、第２の変形例（時間遅延変調）によるサンプル中の干渉を示す概略図である。 図１９Ｂは、スペクトラム拡散パルスおよび時間遅延の変化を有し、第２の変形例（時間遅延変調）によるサンプル中の干渉を示す概略図である。 図１９Ｃは、スペクトラム拡散パルスおよび時間遅延の変化を有し、第２の変形例（時間遅延変調）によるサンプル中の干渉を示す概略図である。 図２０は、スペクトル拡散パルスを有し、本発明（時間遅延変調）の１つの変形例によるＳＲＳ検出装置の別の実施例である。 図２１Ａは、図２０の例においてサンプル中の干渉を示す概略図である。 図２１Ｂは、図２０の例においてサンプル中の干渉を示す概略図である。 図２１Ｃは、図２０の例においてサンプル中の干渉を示す概略図である。

図において、同一の要素は同一の参照記号によって示される。
図４は、振幅変調を実行し、本発明の１つの変形例による非線形共鳴ＳＲＳ光学信号を検出するための装置の例を示している。

検出装置１０は、Ω_ＲがサンプルＳにおいて解析しようとする分子振動共鳴周波数である場合にω_２ - ω_１ = ω_３ - ω_２ = Ω_Ｒとなるように、角周波数ω_１，ω_２およびω_３を中心とした一連のパルスを放射するための源２０を含んでいる。パルスは、例えば、スペクトル幅が数ｃｍ^−１のピコ秒パルスであるか、または以下に詳細に説明する周波数チャープパルスとすることもできる。通常、一連のパルスは、例えば数ピコ秒のパルスを含み、約1マイクロ秒の間に数十ＭＨｚの速度で、例えば８０ＭＨｚの速度で放射される。

１つの変形例によれば、放射源２０は、角周波数ω_２でのパルス列１２を放射するマスタレーザ２４と、ＯＰＯ内の信号およびアイドラのパラメトリック発振に適した周波数逓倍パルス１１をマスタレーザから受け取るＯＰＯ（光パラメトリック発振器）レーザ２２と、からなるレーザシステムを含んでいる。これは、アイドラおよび信号のそれぞれに対応する調整可能な角周波数ω_１およびω_３でのパルス列１４および１６を結果的にもたらす。本説明によれば、マスタレーザ２４によって直接放射された“レーザ”光１２およびＯＰＯレーザ２２によって放射された“アイドラ”１４および“信号”１６の光は、ＳＲＳ画像化において直接利用可能である。具体的に、ＯＰＯのパラメトリック発振メカニズムは、ＯＰＯのパラメータを変更することによってΩが対象となる角周波数Ω_Ｒに設定される場合に、レーザ（ω_２）、信号（ω_３）およびアイドラ（ω_１）パルスの角周波数がω_２ - ω_１ = ω_３ - ω_２ = Ωの条件を順守するということである。このため、パルス１２の波長は約１０６４ｎｍであり、周波数逓倍パルス１３の波長は約５３２ｎｍであり、アイドラおよび信号パルスの波長は、それぞれ、約１１５０〜２４５０ｎｍの間と約６９０〜９９０ｎｍの間とで調整可能である。角周波数ω_１，ω_２およびω_３での３つのパルス列１４，１２，１６がサンプル内で干渉するとき、レーザ光がストークスの役割を果たす一方で、レーザ／信号パルスの干渉において信号光がポンプの役割を果たし、レーザ光がポンプの役割を果たす一方で、レーザ／アイドラパルスの干渉においてアイドラ光がストークスの役割を果たす。

図４の例において、信号およびアイドラの各チャネルでは、遅延線（それぞれ５６および５４）は、サンプルにおいて３つのパルス列を一時的に確実に重ねるために、３つのパルス列を一時的に同期させる。

図４の例において、振幅変調は、同一の変調周波数であるが逆位相で信号およびアイドラのパルス列のそれぞれに実行され、サンプルにおいて、角周波数ω_１およびω_２での一連の光パルスと、角周波数ω_２およびω_３での一連の光パルスと、が変調周波数で交互に干渉することを可能にする。換言すれば、一定時間Ｔの間では角周波数ω_１およびω_２でのパルスのみが干渉し、続く一定時間の間では角周波数ω_２およびω_３でのパルスのみが干渉する。但し、ここで期間Ｔは変調周波数の逆数である。信号およびアイドラパルス列は、例えば、いずれも音響光学変調器（それぞれ３６，３４）で変調される。１ＭＨｚより好都合に高く、通常は１と４０ＭＨｚとの間の周波数ｆ_１の音響光学変調器３６の変調信号は、低周波数発生器３０から送られる。同じ周波数ｆ_１の音響光学変調器３４の変調信号は、同じ源から来るが信号およびアイドラパルス列が逆位相で変調されるように、電子遅延発生器３２を用いて位相がオフセットされる。

逆位相で（それぞれ角周波数ω_１およびω_３で）変調されたパルス列１５および１７を、例えば、ダイクロイックミラー６４，６６を用いて角周波数ω_２でのレーザパルス列と合成して、その後、例えば、近赤外線（〜７００−１３００ｎｍ）において無彩色である顕微鏡対物４２、例えば、開口数ＮＡ＝０．４５の顕微鏡対物を用いてサンプルＳ内の共通集束体に焦点を合わせる。より大きな開口数、例えば、ＮＡ＝０．６０の対物４４は、サンプルから生じたパルス列を絞り込むことなく集束できる。サンプルから生じた角周波数ω_２のパルス列１８は、次に光学干渉フィルタ４８でフィルタ処理され、その後、例えば、１０６４ｎｍで反応するフォトダイオード７０で検出する。その後、変調信号を、同期検波８０によって検出し、同期検波から生じた信号を処理手段９０で成形する。同期検波手段は、例えば、変調周波数ｆ_１でのアナログ同期検波を含むこともできる。あるいは、信号の同期検波を、光検出器から直接生じた信号のデジタル処理により、デジタル式に行ってもよい。好都合に、各信号およびアイドラチャネルにおいて、倍率が１の望遠鏡（図示せず）で信号およびアイドラ光の分散を調整することを可能にし、これにより対物の焦点での空間的な重なりを最適化する。例えば、倍率が３の望遠鏡６９は、対物の背面の瞳を完全に埋めるために励起ビームの直径を拡大させることを可能にする。この場合、励起開口数は対物の製造者によって決められたものである。信号およびアイドラ光は、例えば、基本ＴＥＭ００モードで励起され、これにより電界および磁界がいずれもこれらの信号の伝搬方向に対して垂直に延在し、３つのレーザ、信号およびアイドラ光は例えば、同一偏向方向で線形偏向されて、一様な媒体での信号の最適化を可能にする。

１つの変形例によれば、モータ付台４６は、装置をＳＲＳ画像化に適用するサンプル画像を形成するために、パルス列の共通焦点対物と相対してサンプルを移動させることを可能にする。集束および集光対物レンズ、また台４６は、例えば、顕微鏡４０の本体内に配置されている。集束対物レンズをサンプルを通って移動させるために、代わりに、励起ビームをスキャンするシステムを使用してもよい。ＳＲＳ画像化の適用例において、処理手段９０は、画像生成のために、さらに求められた特有信号をサンプル内での位置の関数として抽出することを可能にする。

装置を分光法またはハイパースペクトル画像化に適用するために、アイドラおよび信号の角周波数ω_１およびω_３を変えることも可能であり、これによりＳＲＳ信号を分子振動周波数Ωの関数として精密に調査可能となる。処理手段９０は、続いて求められた特徴付け信号をスペクトルを形成するための分子振動周波数Ωの関数として抽出することを可能にする。

図５Ａ〜５Ｃおよび図６は、本説明の変形例による検出方法の原理を図示しており、例えば、図４に示す装置を手段にして実現され、以下の記載では誘導ラマン・ゲイン対ロス検出（ＳＲＧＯＬＤ）方法と呼んでいる。

図５Ａは、“状態ａ”として表示する状態を示し、期間Ｔの間角周波数ω_２でのパルスと角周波数ω_１でのパルスとが重なる。この例におけるパルスは短パルス、例えば、ピコ秒パルスであり、一般に長さが１００ｐｓより短い。図５Ｂは、“状態ｂ”として表示する状態を示し、同じ期間Ｔの間角周波数ω_２でのパルスと角周波数ω_３でのパルスとが重なるが、状態ａと交互に起きる。この例において、角周波数ω_２−ω_１とω_３−ω_２との差はΩ_Ｒと等しいと見なされ、ここでΩ_Ｒは、サンプルの分子振動モードの共鳴角周波数である。図４に示す装置で実施される方法のおかげで、図５Ｃに示すように、状態ａおよびｂはサンプル内で変調周波数ｆ_１で交互に起きる。

図６は、サンプルにおいて角周波数ω_３およびω_２でのパルス列が干渉している間（“状態ｂ”、列３０１：“ＳＲＧ”）、角周波数ω_１およびω_２でのパルス列が干渉している間（列３０２：“ＳＲＬ”）、状態ｂに対して１８０度位相シフトした角周波数ω_１およびω_２でのパルス列が干渉している間（“状態ａ”、列３０３：“ＳＲＯＬ”）および実際に検出されたもの（列３０４：“ＳＲＧＯＬＤ”）で進行している物理機構を示している。

まず（列３０１）、強度を時間の関数として曲線３１０で簡略して示す変調されていないレーザパルス列（１２、図４）の干渉状態と、強度を時間の関数として曲線３１２で簡略して示す変調周波数ｆ_１で列が振幅変調された（１７、図４）角周波数ω_３でのパルス列、について検討する。これらの略図では、パルス列の包絡線のみを示す。この干渉において角周波数ω_３（信号）でのパルスがポンプとしての役割を果たし、角周波数ω_２でのレーザパルスがストークスとしての役割を果たしている。後者では、サンプル内での干渉の後に、ストークスパルスを減らしてエネルギー利得（ＳＲＧ）が得られ、この利得は曲線３１４における強度変化ΔＩ_ＳＲＧとして簡略して示す。曲線３１６および３１８は、それぞれクロスカー効果および２−光子吸収によるアーティファクトの影響を図示している。この例において、クロスカー効果がレーザパルスの強度の増加をもたらす焦点効果として現れるものと想定し、この増加が変調周波数ｆ_１で変調されている。２−光子吸収は、変調周波数ｆ_１でのレーザパルスの強度の減少として現れる。

次に、（列３０２）、強度を時間の関数として曲線３２０で簡略して示す変調されていないレーザパルス列の干渉状態と、強度を時間の関数として曲線３２２で簡略して示す変調周波数ｆ_１で列が振幅変調された角周波数ω_１でのパルス列、について検討する。この干渉において角周波数ω_１（アイドラ）でのパルスがストークスとしての役割を果たし、角周波数ω_２でのレーザパルスがポンプとしての役割を果たしている。後者では、サンプル内での干渉の後に、曲線３２４における強度変化ΔＩ_ＳＲＬとして簡略して示す、エネルギー損失（ＳＲＬ）が見られる。曲線３２６および３２８は、それぞれクロスカー効果および２−光子吸収によるアーティファクトの影響を図示している。角周波数ω_３でのパルスがレーザパルスに集束させる（曲線３１６）クロスカー効果を生じさせると、角周波数ω_１でのパルスもレーザパルスに集束させ、これにより後者の強度の増加を導き、この増加は変調周波数ｆ_１（曲線３２６）で変調される。上記のように、２−光子吸収は、変調周波数ｆ_１（曲線３２８）でのレーザパルスの強度の低下として現れる。このため、角周波数ω_１およびω_３でのパルス列が同相で振幅変調されると、誘導アーティファクトも同相となり、ＳＲＬおよびＳＲＧ変調は逆位相（曲線３１４と３２４を比較）となることが観察される。

ここで、角周波数ω_２でのレーザパルス列（曲線３３０、列３０３）が、その列が角周波数ω_３でのパルス列（曲線３３２、列３０３）の変調に対して逆位相で振幅変調される、角周波数ω_１でのパルス列と干渉するものと仮定する。この場合、レーザパルス列（曲線３３４）のＳＲＬ変調は、ＳＲＧ変調（曲線３１４）と同相となるが、角周波数ω_１（曲線３３６，３３８）でのパルス列に誘導されたアーティファクトは、角周波数ω_３（曲線３１６，３１８）でのパルス列に誘導されたアーティファクトと逆位相となっている。“誘導ラマン・ゲイン対ロス検出”をＳＲＧＯＬＤとして命名した、本変形例による記載の方法は、角周波数ω_１およびω_３でのパルス列（曲線３４２、列３０４）を逆位相で振幅変調することと、変調周波数での同期検波により無変調レーザパルス列（曲線３４０）に誘導した変調を検出することを含んでいる。このような状況において、逆位相のアーティファクトは釣り合って（曲線３４６，３４８および列３０４参照）同期検波の際に消える。さらに、ＳＲＬおよびＳＲＧ信号は同相であり、以下の式に従って、同期検波（曲線３４４）の際に付加される。
ΔＩ_{ＳＲＧＯＬＤ} ＝ ΔＩ_ＳＲＧ ＋ ΔＩ_ＳＲＯＬ
＝ ΔＩ_ＳＲＧ ＋ ΔＩ_ＳＲＬ x cos(180°)

波長を無視して励起強度が同一であると仮定すると（サンプルに入射される角周波数ω_１でのパルス強度は角周波数ω_３でのパルス強度と同一である）、以下のように導くことができる。
ΔＩ_{ＳＲＧＯＬＤ} ≒ ２ΔＩ_ＳＲＧ

図４に示す検出装置１０は、前方光学検出手段を含み、励起ビームは装置の空き空間を伝わる。図７Ａから図７Ｄは、図４に示す検出手段の変形例をいくつか簡略して示す。各簡略図は部分的であり、理解に役立つ要素のみを示す。

図７Ａには、図４に示すものと類似した検出装置を示す。しかしながら、便宜上全ての要素を図示していない。具体的に、ブロック３６は角周波数ω_１でのパルス列が変調周波数ｆ_１で振幅変調されることを可能にするモジュールを表し、ブロック３４は角周波数ω_３でのパルス列が、角周波数ω_１でのパルス列の変調とは逆位相で、変調周波数ｆ_１で振幅変調されることを可能にするモジュールを表す。以下の説明において、周波数ｆ_１と逆位相での変調を“−ｆ_１”として表す。

図７Ｂには、図７Ａに示す装置の変形例の一部を簡略して示し、この装置での光学検波は後方（または“落射”）モードにて行われる。この構成において、焦点化対物４２は集束対物としての役割も果たし、検出する信号はサンプルによって後方散乱された信号である。この変形例における光学検出手段は、高速検出器７０に加えて、角周波数ω_２でのパルス列の反射を可能にする半透ダイクロイック板６５を含むことができる。本記載による検出方法に基づいて、特に２−光子吸収および、ＳＲＳ信号の集束対物としての機能を果たす対物４２における変調絞り効果を誘導する、光学クロスカー効果から結果として生じるアーティファクトの効果は、上記に記載のように抑制されるが、有用なＳＲＳ信号は逓倍される。

図７Ｃは、図７Ａに示す装置の変形例の一部を簡略して示し、この装置では励起ビーム１２，１５，１７の伝搬の少なくとも一部が繊維質モードで行われる。光学顕微鏡法の応用例において、特に光学部品が大きいため、また、光学部品の調整を容易にするために、例えば、光学繊維を介して装置内の光線を拡散させることが求められる。図７Ｃに示す例において、励起ビームの拡散は、焦点化対物４２の上流に配置されている光学繊維６０を用いて行われる。光学繊維は、例えば、単一モードの繊維である。対物６１および６３は、それぞれ、繊維の入口と出口で励起ビームを結合させることを可能にする。よって、本記載にて説明している検出方法は、上記にて説明したようにサンプル内での励起ビームの干渉から結果として生じるアーティファクトの影響を制限できるだけでなく、光学繊維６０内での非線形作用から結果として生じる得る計測アーティファクトをも制限することを可能にする。具体的には、繊維内において拡散された光強度により、縮退４光波混合またはクロスカー効果等の非線形作用が繊維自体に現れることもあり、また、上記にて説明した同じ理由により変調周波数ｆ_１でのレーザパルスの減少を引き起し、これにより計測アーティファクトを生じる。角周波数ω_１およびω_３でのパルス列を同一周波数であるが逆位相で変調することにより、また、角周波数ω_２での信号を検出するために同期検波を用いることにより、繊維内における非線形作用により生じるアーティファクトも抑制する。

図７Ｄは、図７Ａに示す装置の変形例の一部を簡略して示し、この装置では励起ビーム１２，１５，１７の伝搬の少なくとも一部が繊維質モードで行われ、光学検出は内視鏡的検出モードで行われる。ここでは、例えば、サンプルＳは生体媒質の深層部に対応する。検出は、後方または落射）検出モードで行われる。対象となる、サンプルによって後方散乱された角周波数ω_２における非線形光学信号は、光学繊維６０を通過した後にダイクロイックミラーを用いて高速検出器７０へ搬送される。この検出モードでは、ＳＲＳ信号の集束対物として機能する対物４２による絞りに加えて、信号を光学繊維６０で絞ってもよい。本記載による方法は、光学繊維による絞りの結果として生じるアーティファクトを含む、これら全てのアーティファクトを克服することを可能にする。

図８Ａ〜図８Ｃは、図４に示すような装置で、非散乱サンプルについて実施した検出方法の正当性を確認することを目的とした第１の実験結果を示す。

図８Ａには、クロロベンゼンのレセプタクルで取得した、９６０と１１２０ｃｍ^−１の間で生成された、３つのスペクトルを示す。クロスカー効果によるアーティファクト効果を確実に観察するために、角周波数ω_２におけるレーザパルスの強度の５０％を削減するように閉じられたダイヤフラムが検出器の上流に配置された。曲線５０１，５０２，５０３は、それぞれ、図６に示すような、ＳＲＧ，ＳＲＯＬおよびＳＲＧＯＬＤモードを使用して生成したスペクトルを示す。より具体的に、ＳＲＧモードの曲線は角周波数ω_１でのパルス列を削減して得られ、ＳＲＯＬモードの曲線は角周波数ω_３でのパルス列を削減して得られ、ＳＲＧＯＬＤモードの曲線は、角周波数ω_１，ω_３でのパルス列は逆位相で振幅変調された、角周波数ω_１，ω_２およびω_３でのパルス列を液体のレセプタクル内で干渉させて得られた。これらの実験には、結合器６６（図４）の後で計測したレーザパルス列の平均光強度を９０ｍＷに設定して、角周波数ω_１およびω_３でのパルス列の平均光強度は５０ｍＷに設定され、これにより、アーティファクトの主な要素としてみなされる、角周波数ω_１での各パルスで生成したクロスカー効果が、角周波数ω_３でのパルスによって生じたクロスカー効果を正確に相殺した。この調整は、共鳴していないＳＲＧＯＬＤ信号を、例えば、Ω＝９６０^−１で、ゼロ化することにより行うことができる。曲線５０１からわかるように、周波数ｆ_１における同期検波によって得た、レーザパルス列（ω_２）と信号パルス列（ω_３）、後者は周波数ｆ_１で振幅変調されている、とが干渉して生じたＳＲＳ信号のＳＲＧスペクトルは、クロスカー効果と対応する負の寄生オフセットを含む。ここでカー効果は、レーザ光線にデフォーカスさせる効果として現れる。予想通り、レーザパルス列（ω_２）とアイドラパルス列（ω_１）、後者は逆位相の周波数ｆ_１で振幅変調されている、とが干渉して生じるＳＲＳ信号の、周波数ｆ_１における同期検波によって得たＳＲＯＬスペクトル（曲線５０２）は、クロスカー効果に起因したＳＲＧ構成で見られたものと反対符号のオフセットを含む。ＳＲＧＯＬＤモード（曲線５０３）において、レーザ信号の周波数ｆ_１での同期検波により、反対の符号を有して全スペクトル領域で相殺する、クロスカー効果に起因したアーティファクトの効果を抑制することを可能とする。これらの実験により、記載のＳＲＧＯＬＤ方法を用いることにより、均一な媒体におけるクロスカー効果を完全に抑制できることを確認できた。

図８Ｃは、上記のＳＲＧＯＬＤ方法を確認する写真を示す。これらの実験では、図８Ｂに示すようなサンプルの共鳴時（Ω＝１００３ｃｍ^−１）および非共鳴時（Ω＝９３０ｃｍ^−１）の一連の画像を撮像した。ここでサンプルは、２枚のスライドガラス４１０，４１２の間に配置された屈折率が１．５４の指標液体４１１に浸水させた直径２０μｍのポリスチレンビーズ４１３を含んでいる。この実験は上記と同様に、検出器の上流に配置され、クロスカー効果を最大限検出できるように部分的に閉じたダイヤフラムを用いて行われた。レーザパルス列の平均光強度は、約１６０ｍＷであり、（角周波数ω_３での）信号パルス列の平均光強度は約７０ｍＷであった。（角周波数ω_１での）アイドラパルス列の平均光強度を約３０ｍＷに調整することにより、アーティファクトを液体上で最小とした。図８Ｃには、ＳＲＧ（５１１），ＳＲＯＬ（５１２）およびＳＲＧＯＬＤ（５１３）モードにおけるそれぞれ、変調されていないレーザ光線（５１４）と共に撮像して比較している、共鳴時のポリスチレンビーズの画像を示す。図８Ｃには、これらと同じ画像の非共鳴時のもの（それぞれ、画像５２１から５２４）を示す。“レーザ”画像は、ノイズの評価を可能にする参照画像であり、この画像は角周波数ω_１，ω_３でのパルス列を切断することによって得られる。アーティファクトは、共鳴、非共鳴時のいずれにおいてもＳＲＧおよびＳＲＯＬ計測値にはっきりと存在しており、これらのアーティファクトは反対符号を有している。共鳴時のＳＲＧＯＬＤ画像では、液体の寄与度はなくなり、ビーズからのＳＲＳ信号は、ＳＲＧおよびＳＲＯＬ画像（２つの寄与度は加算される）におけるものよりも強い。非共鳴時では、アーティファクトがＳＲＧおよびＳＲＯＬ画像と比較して相当減少していることがわかる。液体の寄与度は全く消えている。ビーズのわずかな残存アーティファクト（ＳＲＧ画像のアーティファクトと比較して１０％より少ない）だけが計測された。

図９Ａ〜９Ｄは、生体組織の特徴により近い特徴を有する散乱サンプルで得た実験結果を示す。

図９Ａに示すサンプルは、図８Ｂに示すものと同一であるが、例えば、指標液体に浸水させたポリスチレンビーズを含んでいる容器の上に粘着テープを配置して、散乱４１４が施されている。今回は、装置にダイヤフラムを設けずに集束対物４４の開口数が焦点対物４２のそれよりも高くなるように選択された。画像５０５および５０６（図９Ｂ）には、それぞれ散乱体を有した状態と散乱体を有しない状態の集束対物の背面の瞳で得られたレーザ光線の画像を示す。破線の白円は対物の瞳の大きさを示す。散乱体が無いと、励起開口数よりも集束開口数の方が大きいためレーザ光線は絞り込まれることなかった。逆に、散乱体があると、サンプルから励起されたレーザ光線の角スペクトルを拡大させた。よって、集束対物の瞳は、ダイヤフラムの役割を果たした。このため、エネルギーの一部（約１２．５％）が遮られた。図９Ｃおよび９Ｄは、ＳＲＧ，ＳＲＯＬ，ＳＲＧＯＬＤおよびレーザ構成について、共鳴時（５３１〜５３４）と非共鳴時（５４１〜５４４）のポリスチレンビーズの画像を示す。これらの画像を得るために、電力を約５０ｍＷ（レーザ）、５０ｍＷ（アイドラ）および６０ｍＷ（信号）とした。カラースケールは、アーティファクトを強調するように選択した。ＳＲＧ（５３１，５４２）およびＳＲＯＬ（５３２，５４２）画像は、サンプルによる散乱に起因したクロスカー効果が検出されたことを示している。上記の実験でのように、ＳＲＧＯＬＤ画像（５３３，５４３）において液体の寄与度が消失して非共鳴時のビーズの寄与度が大幅に減少したことがわかる。

ここで検討したラマン線（Ω＝１００３ｃｍ^−１）がアーティファクトと比べて非常に強いことに注意されたい。図９Ｆには、上記と同一の、Ω＝１０３４ｃｍ^−１（画像５５１〜５５４）およびΩ＝１０４１ｃｍ^−１（画像５６１〜５６４）における散乱サンプルについて撮像した一連の５０μｍｘ５０μｍ画像を示す。後者の周波数は１０３４ｃｍ^−１でのラマン線の最大値に対してわずかにシフトしており（図９Ｅに示すポリスチレンのラマンスペクトル５１０を参照）、これにより、アーティファクトと同等の場合のラマン線のケースをシミュレートするのを可能にする。この周波数については、計測値がクロスカー効果に支配されるためＳＲＧおよびＳＲＯＬ画像（５６１，５６２）におけるポリスチレンビーズのコントラストは低い。これに対し、ＳＲＧＯＬＤ画像（５６３）におけるビーズのコントラストは、アーティファクトを減らして、ＳＲＳ信号はＳＲＧおよびＳＲＯＬ画像に対するものの２倍の強度としているため、はっきりしている。種々の画像は、レーザ光線および電子雑音に起因するノイズと同量のノイズの悪影響を受けていることに気づかれたい。

図１０Ａ〜１０Ｃには、本変形例によるＳＲＧＯＬＤ方法に基づく、生物組織から取得した第１の結果を示す。生物組織は、マウス皮膚（厚さ２０μｍのサンプル）であった。図１０Ａには、観察領域の白色光画像を示す。アーティファクトの補償は、白色光画像において０として示す点において非共鳴状態（１５５０ｃｍ^−１）で実施された。この点は、任意に選択された。平均光強度は約３３ｍＷ（レーザ）、４０ｍＷ（アイドラ）および８６ｍＷ（信号）であった。図１０Ｂには、アミドスペクトル領域（１３５０〜１７００ｃｍ^−１）でのＳＲＧ（９１１，９１２）、ＳＲＯＬ（９１２，９２２）、ＳＲＧＯＬＤ（９１３，９２３）スペクトルおよび参照レーザ（９１４，９２４）を示し、各スペクトルはそれぞれ、白色光画像に示す第１の点および第２の点で計測している。いずれの場合も、ＳＲＧおよびＳＲＯＬ計測値は非共鳴周波数（約１５５０ｃｍ^−１）において符号が逆となり、これによりアーティファクトの存在を確認した。ＳＲＧＯＬＤスペクトルにおけるアーティファクトの影響は低減された。

図１０Ｃには、種々の構成の：ＳＲＧ，ＳＲＯＬ，ＳＲＧＯＬＤおよびレーザ（それぞれ、共鳴状態において５７１〜５７４と非共鳴状態において５８１〜５８４として表示した曲線）について、ＩＩアミドと共鳴時（１４５０ｃｍ^−１）と非共鳴時（１５５０ｃｍ^−１）で撮った画像を示す。撮像領域は、図１０Ａにおける白色光画像にて破線で示している。共鳴時の場合、ＳＲＧ（５７１）およびＳＲＯＬ（５７２）画像において組織を認識するのは難しく、ＳＲＧＯＬＤ画像（５７３）において白色光画像に似た組織が見られる。非共鳴時の場合、全体としてＳＲＧＯＬＤ画像（５８３）はＳＲＧおよびＳＲＯＬ画像よりも良好なゼロ信号を有する。これらの実験は、生物組織における散乱のＳＲＳ計測値への影響を示している。ＳＲＧＯＬＤ技術は、より良い空間的およびスペクトル的コントラストと、より良い特定性を得ることを可能にする。

図４または７Ａの装置を用いた記載の方法は、光信号（角周波数ω_２でのパルス列）について変調周波数での同期検波を、簡単に実施することができるという利点があり、この実施には通常の市販部品を使用している。

図１１Ａおよび１１Ｂには、図４および７Ａに示す装置の２つの変形例を示す。図１２Ａおよび１２Ｂは、ぞれぞれ、図１１Ａおよび１１Ｂに示す装置の実施例において検出した信号（ＳＲＳ信号およびアーティファクト）を図示している表を示す。

図１１Ａにおける例では、角周波数ω_１（アイドラ）およびω_３（信号）でのパルス列１４および１６は、互いに倍数ではない異なる変調周波数ｆ_２およびｆ_１で振幅変調されて、これにより変調パルス列１５，１７を形成している。角周波数ω_２（レーザ）でのパルス列１２は変調されていない。このため、一方の角周波数ω_２および（変調された）ω_１でのパルス列と、他方の角周波数ω_２および（変調された）ω_３でのパルス列とがサンプル内で干渉する。上記の通り、サンプルから生じた角周波数ω_２でのパルスは検出される。レーザ／信号パルスが干渉している間に関係している過程は、図１２Ａの列６０１に示すようにＳＲＧ過程である。曲線６１０は、変調されていないレーザパルス列を示し、曲線６１２は、角周波数ω_３での、周波数ｆ_１にて変調されたパルス列を示す。これらの曲線において、各パルス列の包絡線のみを示している。これらの２つのパルス列の干渉によって生じるＳＲＳ信号は、変調周波数ｆ_１（曲線６１４）で変調される、正の強度変化ΔＩ_ＳＲＧを示す。アーティファクト（カー効果から結果として生じる寄与度が優位であると仮定される）は、同じ変調周波数ｆ_１（曲線６１６）で変調されて正数であると仮定される、強度変化ΔＩ_Artifactsを示す。このため、変調周波数ｆ_１における同期検波により以下を満たす信号ΔＩ（ｆ_１）が得られる。
ΔＩ（ｆ_１） ＝ ΔＩ_ＳＲＧ ＋ ΔＩ_Artifacts

さらに、レーザ／アイドラパルスが干渉している間に関係している過程は、図１２Ａの列６０２に示すようにＳＲＬ過程である。曲線６２０は、変調されていないレーザパルス列を示し、曲線６２２は、角周波数ω_１での、周波数ｆ_２にて変調されたパルス列を示す。これらの２つのパルス列の干渉によって生じるＳＲＬ信号は、変調周波数ｆ_２（曲線６２４）で変調される、負の強度変化−ΔＩ_ＳＲＬを示す。アーティファクトは、同じ変調周波数ｆ_２（曲線６２６）で変調されて、ＳＲＧ過程でのアーティファクトに起因した強度変化と同じ符号を有する、強度変化ΔＩ_Artifactsを示す。サンプルに入射されるパルス列の平均光強度を調整することにより、両ＳＲＧおよびＳＲＬ過程において同じ値の強度変化ΔＩ_Artifactsを得ることができる。このため、変調周波数ｆ_２における同期検波により以下を満たす信号ΔＩ（ｆ_２）が得られる。
ΔＩ（ｆ_２） ＝ −ΔＩ_ＳＲＬ ＋ ΔＩ_Artifacts

変調周波数ｆ_１での同期検波および変調周波数ｆ_２での同期検波から生じた各信号の電子処理は、次に減算により有用な増幅ＳＲＳ信号の取得を可能にするが、アーティファクトによる信号を相殺する。この方法は、同期検波から生じた各信号を加算することにより、全ての信号へのアーティファクトの寄与度を確定するためにも使用でき、別のコントラスト情報を得ることを可能にする。

図１１Ｂには、別の変形例を示し、ここでは角周波数ω_１（アイドラ）およびω_３（信号）におけるパルス列１４および１６は変調されず、代わりに角周波数ω_２（レーザ）におけるパルス列１２が周波数ｆにおいて振幅変調される。このため、一方の角周波数ω_１および（変調された）ω_２におけるパルス列と、他方の角周波数ω_３および（変調された）ω_２は、サンプル内で干渉する。上述の方法と異なり、このサンプルでは、一方の角周波数ω_１においてサンプルから生じた各パルスと他方の角周波数ω_２においてサンプルから生じた各パルスが検出される。このため、検出手段は、ダイクロイックミラー６８で分離された２つの経路を有する。第１の経路におけるフィルタ４７は、角周波数ω_１における、高速光検出器７１を用いて検出される、パルスのみを伝搬可能にする。第２の経路におけるフィルタ４９は、角周波数ω_３における、ここでも高速光検出器７２を用いて検出される、パルスを伝搬可能にする。各経路では、各光検出器から生じた信号の同期検波を、変調周波数ｆにおいて行う。サンプル内におけるレーザ／信号パルスの干渉中に関係する過程はＳＲＬ過程であり、図１２Ｂの列７０１に示す通りである。曲線７１０は、角周波数ω_３における変調されていないパルス列を示し、曲線７１２はレーザパルス列を示し、後者の列は周波数ｆで変調されている。角周波数ω_３（ポンプ）において計測されてこれらの２つのパルス列の干渉によって生じたＳＲＬ信号は、変調周波数ｆ（曲線７１４）で変調される負の強度変化−ΔＩ_ＳＲＬを現す。上述の通り、各アーティファクトは同一変調周波数ｆ（曲線７１６）で変調される強度変化ΔＩ_Artifactsを現す。このため、変調周波数ｆにおける同期検波により以下の通り、信号ΔＩ（Ａ）を得る。
ΔＩ（Ａ） ＝ -ΔＩ_ＳＲＬ ＋ ΔＩ_Artifacts

さらに、各レーザ／信号パルスの干渉中に関係する過程はＳＲＧ過程であり、図１２Ｂの列７０２に示す通りである。曲線７２０は、角周波数ω_１における変調されていないパルス列を示し、曲線７２２は、角周波数にω_２おける周波数ｆで変調されているレーザパルス列を示す。今回、これらの２つのパルス列の干渉から生じる、角周波数ω_１における（ストークス）パルスから計測されるＳＲＧ信号は、変調周波数ｆ（曲線７２４）で変調される正の強度変化ΔＩ_ＳＲＧを現す。各アーティファクトは、ＳＲＬ過程におけるアーティファクトによる強度変化と同じ符号の、同一変調周波数ｆ（曲線７２６）で変調される強度変化ΔＩ_Artifactsを現す。上述の通り、サンプルへ入射している各パルス列の平均光強度を調整することにより、ＳＲＧおよびＳＲＬ過程のいずれにおいても同一値の強度変化ΔＩ_Artifactsを得ることができる。このため、変調周波数ｆにおける同期検波により以下の通り、信号ΔＩ（Ｂ）を得る。
ΔＩ（Ｂ） ＝ ΔＩ_ＳＲＧ ＋ ΔＩ_Artifacts

変調周波数ｆでの、各経路における同期検波から生じた信号の電子処理は、次に減算により有用な増幅ＳＲＳ信号の取得を可能にするが、アーティファクトによる信号を相殺する。この方法は、同期検波から生じた各信号を加算して、全ての信号へのアーティファクトの寄与度を確定するために使用することもできる。

これまで記載した各例は、１つまたは２つのパルス列の振幅変調を実施している。本記載による方法は、また、角周波数ω_２におけるレーザパルスと角周波数ω_１およびω_３におけるパルス列との間に導入した時間遅延の変調を用いて実施してもよい。

よって、図１３には、時間遅延変調を実施しているＳＲＳ検出装置に実施例を示す。図１４Ａ〜１４Ｃには、この例におけるサンプルでの干渉を簡略して示し、図１５には、図１３における装置の実施例で検出した信号（ＳＲＳ信号およびアーティファクト）を図示している表を示す。

図１３の装置において、角周波数ω_１およびω_３におけるパルス列に共通した経路に遅延線５８が配置されている。代わりに、遅延線を（角周波数ω_２の）レーザパルスの経路に配置することもできる。この遅延線は、図１４Ａおよび１４Ｂを用いて説明しているように、変調周波数ｆ_１で変調された時間遅延を、角周波数ω_１およびω_３におけるパルスと角周波数ω_２におけるパルスとの間に導入することを可能にする。遅延線は、光学経路に変化を導入することを可能にする。光学経路における変化は、２つの位置の間で機械的に得ることもできる。代わりに、遅延線は２つの光路長を生成するために２つの角度の間で交互に入れ替わる音響光学偏向器を含むこともできる。各アイドラおよび信号経路（例えば、図４における遅延線５４，５６参照）に固有の遅延線を調整することにより、角周波数ω_１およびω_３における各パルスの間に一組の遅延２τを導入する。遅延線５８（図１３）の変調は、状態ａおよびｂが変調周波数ｆ_１（図１４Ｃ）で交互に入れ替わるときに、時間Ｔ（図１４Ａ、状態ａ）の間、角周波数ω_２およびω_３における各パルスがサンプル内で重なるように、また、続く時間Ｔの間に角周波数ω_１およびω_２（図１４Ｂ、状態ｂ）における各パルスが重なるように、変調周波数ｆ_１で＋/−Δｔで変動する時間遅延の導入を可能にする。角周波数ω_２におけるレーザパルスの同期検波により、次にサンプルの分子振動共鳴を特徴付ける信号の確認を可能にする。状態ａ（図１５、列８０１）において、角周波数ω_２（曲線８１０）およびω_３（曲線８１４）における各パルスは、一時的に重なるが、角周波数ω_１（曲線８１２）におけるパルスは一時的にシフトし、この結果、曲線８１６に図示するレーザパルスはＳＲＧ過程の対象となる。再び、この例において、アーティファクトは主にクロスカー効果に起因して、正の信号（曲線８１８）として現れるものと仮定する。状態ｂ（図１５、列８０２）において、角周波数ω_２（曲線８２０）およびω_１（曲線８２２）における各パルスは重なるが、角周波数ω_３（曲線８２４）におけるパルスは一時的にシフトし、この結果、曲線８２６に図示するレーザパルスはＳＲＬ過程の対象となる。再びアーティファクトは、正の信号（曲線８２８）として現れる。上述の通り、サンプルへ入射するパルス列の平均光強度を調整することにより、ＳＲＧおよびＳＲＬ過程におけるアーティファクトに起因する各信号を同等にすることを可能にし、これは例えば、上記にて説明しているように共鳴していないＳＲＧＯＬＤ信号をゼロ化することにより行われる。このため、変調周波数ｆ_１における同期検波が行われている間、角周波数にω_２（図１５、列８０３）でサンプルから生じたパルスについて、アーティファクトは相殺される（曲線８３８）が、有用なＳＲＳ信号は増幅される（曲線８３６）。図１５において、曲線８３０，８３２および８３４は、上述のＳＲＧＯＬＤ過程の変化を簡略して示す。角周波数ω_２におけるパルス列は連続的（曲線８３０）に放射されるが、角周波数ω_１およびω_３におけるパルス列は変調された時間遅延の対象（曲線８３２，８３４）となる。遅延線の調整は変更可能であることに注意されたい。図１３の例のように、ω_１およびω_３パルスに共通した経路において遅延線を設けること、または、角周波数ω_２におけるパルスの経路に遅延線を設けることができる。この場合、各アイドラ／信号経路に固有の遅延線により、角周波数ω_１およびω_３における各パルスの間の遅れ２τを調整可能とする。あるいは、遅延線を専ら各アイドラ／信号経路に配置することもでき、ここでは各経路のうち一方の経路ではτ−Δｔとτ＋Δｔとの間で、他方の経路では−τ−Δｔと−τ＋Δｔとの間で一時的に遅延が変調される。

図１１Ａ，１１Ｂおよび１３の例において採用した光学検出は、前方モード、後方（または落射）検出モードまたは内視鏡的検出モードで行われたが、上述の図７Ｂおよび７Ｄのような手段も使用できる。これらの装置でも、少なくとも一部を繊維化できる。

図１６〜２０は、各パルスを周波数チャープとした場合の本記載方法の変形例を実施したものをより詳細に示す。

図１６Ａおよび１６Ｂは、スペクトラム拡散パルス列の源の実施例を簡略して示す。この源は、例えば、１０６４ｎｍのパルス１２を放射するＮｄ：ＹＶＯ等のマスタレーザ２４および、約５３２ｎｍの周波数倍増パルス１１をマスタレーザから受け取るＯＰＯレーザ２２を有する、一般的に長さが２００ｆｓより短いパルスを生成する超短パルスＯＰＯ源２０を含んでいる。ＯＰＯレーザは、光パラメトリック発振により角周波数ω_１におけるアイドラパルス１４と角周波数ω_３における信号パルス１６を放射する。各レーザ、信号およびアイドラ経路において、時間分散線（それぞれ、５２，５３，５１）により、超短パルスが、通常は長さが１００ピコ秒より短く、例えば、長さが数ピコ秒でありその角周波数が時間とともに中心角周波数のまわりを線形的に変化する時間的により長いパルス、に拡散されることを可能にする。このため、図１６Ｂは、ＯＰＯから出力されるパルスを図示している。周知のように、時間分散線は拡散材料を含むことができ、例えば、ガラス製の棒またはプリズム、あるいはグレーティングコンプレッサである。

図１７Ａ〜１７Ｃには、各パルスが拡散スペクトルパルスの場合の、振幅変調に基づく本記載による方法の実施例におけるサンプル内での干渉を図示している。図５Ａから５Ｃと比べて、各パルスは時間の関数としての傾斜した線形角周波数として現れる。しかしながら、ＳＲＧＯＬＤ方法の実施例は変更されていない。具体的に、各パルス列は所定の変調周波数で交互に干渉する。各時間において、Ω_Ｒをサンプルの分子振動共鳴周波数としたとき、状態ω_２−ω_１＝ω_３−ω_２＝Ω_Ｒとなることが考慮されて本記載による方法を実施可能にすることが観察される。この例において、分子振動共鳴周波数を厳密に調査可能とするように、一方の角周波数ω_１およびω_２におけるパルスと他方の角周波数ω_２およびω_３におけるパルスとの間に同一の時間シフトを、各パルス間における角周波数の変化と同等なパルス間にわずかな時間シフト、を導入することもできる。

図１８Ａ〜１８Ｃには、各パルスが拡散スペクトルパルスの場合の、時間遅延変調に基づく本記載による方法の実施例におけるサンプル内での干渉を図示している。ここでもまた、図１３〜１５に関連して特に記載している方法は周波数チャープパルスに適用される。特に分光法またはハイパースペクトル画像化への応用において、周波数チャープパルスを使用した場合、時間遅延を調整することで対象となる振動共鳴周波数を修正することも可能である。図１８Ａおよび１８Ｂにおいては、２つの値、−Δｔ_１と＋Δｔ_１との間で時間遅延を変調している。これは、一方の角周波数ω_１とω_２、また他方の角周波数ω_２およびω_３の間の差Ω_１に対応する。図１９Ａ〜１９Ｃにおいては、同様のパルスを示すが、２つの値、−Δｔ_２と＋Δｔ_２との間で時間遅延を変調し、これは一方の角周波数ω_１とω_２、また他方の角周波数ω_２およびω_３の間の差Ω_２に対応する。このため、時間遅延を変化させることにより振動共鳴スペクトルを探ることを可能にする。

図２０には、本発明の別の例によるＳＲＳ検出装置の実施例を示し、時間遅延変調と拡散スペクトルパルスを実施している。この例において、パルス列放射源２０は伸張器５２を用いて時間に関して拡散した超短パルス列を放射し、これにより角周波数ω_２を中心とした周波数チャープパルスを形成する。この装置はさらに、ダイクロイックビームスプリッタ６７をさらに含み、これにより一方では角周波数ω_２を中心としたパルスと、他方では各角周波数ω_１およびω_３を中心としたパルスを分離可能とする。そうして、角周波数ω_２におけるパルス列と角周波数ω_１およびにω_３おけるパルス列との間の時間遅延変調が、図１３等を参照して記載しているように、例えば、遅延線５８を用いて可能となる。同様の同期検波方法はＳＲＳ信号の検出についても実施できる。

図２１Ａ〜２１Ｃには、図２０の例におけるサンプル内での干渉を示している。図１８Ａから１８Ｃに示すように、変調は、角周波数ω_２におけるパルスと角周波数ω_１およびω_３におけるパルスとの間の時間遅延＋/−Δｔに対応する、状態ａと状態ｂとの間で行われる。再び、この例では時間遅延Δｔを変化させることにより対象となる振動共鳴Ωの角周波数を非常に容易に変更可能とすることが観察された。

複数の詳細な実施例について記載しているが、本発明による検出装置および方法は種々の変更、改良および改善を含んでおり、これらの種々の変更、改良および改善は以下に定義した請求項等の記載の発明の範囲に含まれることは当業者に明らかであることを理解されたい。

Claims (19)

1. サンプルにおいて誘導された誘導ラマン散乱（ＳＲＳ）型の共鳴非線形光学信号を検出するための装置であって、
   Ω_Ｒが前記サンプルの分子振動共鳴角周波数である場合にω_２−ω_１＝ω_３−ω_２＝Ω_Ｒとなるように、角周波数ω_１およびω_２の一連の光パルス（１４，１２）を第１の変調周波数で、角周波数ω_２およびω_３の一連の光パルス（１２，１６）を第２の変調周波数で、前記サンプルにおいて干渉させるための電気光学手段と、
   前記サンプルにおいて前記光パルスの干渉に起因する非線形光学信号の前記第１および第２の変調周波数での同期検波のための手段（７０，８０）と、
   前記サンプルの分子振動共鳴を特徴付ける信号を、前記同期検波に起因する電子信号から取得することを可能にする電子処理手段（８０）と、
   を含む装置。
2. 前記電気光学手段は、
   前記角周波数ω_１，ω_２およびω_３で一連のパルスを放射するための光源（２０）と、
   前記角周波数ω_１およびω_３での前記一連のパルスを、それぞれ、前記第１および第２の変調周波数で振幅変調するための手段と、を含む
   請求項１に記載の装置。
3. 前記電気光学手段は、
   前記角周波数ω_１およびω_３での前記一連のパルスを、前記変調周波数と同じであるが逆位相の変調周波数で振幅変調するための手段（３２，３４，３６）を含む
   請求項２に記載の装置。
4. 前記電気光学手段は、
   前記角周波数ω_１およびω_３での前記一連のパルスを、互いの倍数ではない２つの異なる変調周波数で振幅変調するための手段（３４，３６）を含む
   請求項２に記載の装置。
5. 前記第１および第２の変調周波数は同一であり、
   前記電気光学手段は、
   前記角周波数ω_１，ω_２およびω_３での一連のパルスを放射するための光源（２０）と、
   前記角周波数ω_２での前記一連のパルスを前記変調周波数で振幅変調するための手段（３８）と、を含む
   請求項１に記載の装置。
6. 前記第１および第２の変調周波数は同一であり、
   前記電気光学手段は、
   前記角周波数ω_１，ω_２およびω_３での一連のパルスを放射するための光源（２０）と、
   前記角周波数ω_１およびω_３での前記一連のパルスと前記角周波数ω_２での前記一連のパルスとの間に、前記変調周波数で変調された時間遅延を生成することを可能にする少なくとも１つの遅延線（５８）と、を含む
   請求項１に記載の装置。
7. 前記電気光学手段は、前記角周波数ω_１，ω_２およびω_３をそれぞれ中心とした一連の周波数チャープパルスを放射するための光源（２０，５１−５３）を含む
   上位の請求項のいずれか一項に記載の装置。
8. 前記放射する光源は、
   前記非線形光学信号が検知されたときの前記サンプルの前記分子振動共鳴周波数を変化させるように、一方における前記角周波数ω_１およびω_２での前記パルスと、他方における前記角周波数ω_２およびω_３での前記パルスと、の間に、
   同一の時間シフトを生成させる遅延線をさらに含む
   請求項７に記載の装置。
9. 前記放射する光源は、
   前記角周波数ω_２を中心とした一連の周波数チャープパルスの発生器（２０，５０）と、
   一方における前記角周波数ω_２を中心としたパルスと、他方における前記角周波数ω_１およびω_３をそれぞれ中心としたパルスと、に分離することを可能にするダイクロイックビームスプリッター（６７）と、を含む
   請求項６に従属する請求項７に記載の装置。
10. 少なくとも一部において繊維質であることを特徴とする
    上位の請求項のいずれか一項に記載の装置。
11. サンプルにおいて誘導された誘導ラマン散乱（ＳＲＳ）型の共鳴非線形光学信号を検出するための方法であって、
    Ω_Ｒが前記サンプルの分子振動共鳴角周波数である場合にω_２−ω_１＝ω_３−ω_２＝Ω_Ｒとなるように、角周波数ω_１およびω_２の一連の光パルスを第１の変調周波数で、角周波数ω_２およびω_３の一連の光パルスを第２の変調周波数で、前記サンプルにおいて干渉させることと、
    前記サンプルにおいて前記光パルスの干渉に起因する非線形光学信号の前記第１および第２の変調周波数での同期検波と、
    前記サンプルの分子振動共鳴を特徴付ける信号を、前記同期検波に起因する電子信号から取得することを可能にする電子処理と、
    を含む方法。
12. 前記角周波数ω_１，ω_２およびω_３で一連のパルスを放射することと、
    前記角周波数ω_１およびω_３での前記一連のパルスを、それぞれ、前記第１および第２の変調周波数で振幅変調すること
    を含む請求項１１に記載の方法。
13. 前記角周波数ω_１およびω_３での前記一連のパルスは、前記変調周波数と同じであるが逆位相の変調周波数で振幅変調される
    請求項１２に記載の方法。
14. 前記角周波数ω_１およびω_３での前記一連のパルスは、互いの倍数ではない２つの異なる変調周波数で振幅変調される
    請求項１２に記載の方法。
15. 前記第１および第２の変調周波数は同一であり、
    前記角周波数ω_１，ω_２およびω_３での一連のパルスを放射することと、前記角周波数ω_２での前記一連のパルスを前記変調周波数で振幅変調すること、を含む
    請求項１１に記載の方法。
16. 前記第１および第２の変調周波数は同一であり、
    前記角周波数ω_１，ω_２およびω_３での一連のパルスを放射することと、
    前記角周波数ω_１およびω_３での前記一連のパルスと前記角周波数ω_２での前記一連のパルスとの間に、前記変調周波数で変調された時間遅延を生成すること、を含む
    請求項１１に記載の方法。
17. 前記パルスは、前記角周波数ω_１，ω_２およびω_３をそれぞれ中心とした周波数チャープパルスである
    請求項１１ないし請求項１６のいずれかに記載の方法。
18. 前記サンプルの別の分子振動共鳴周波数を特徴付ける非線形光学信号を検出するように、一方における前記角周波数ω_１およびω_２での前記パルスと、他方における前記角周波数ω_２およびω_３での前記パルスとの間に、同一の時間シフトを生成すること、をさらに含む
    請求項１７に記載の方法。
19. 前記角周波数ω_２を中心とした一連の周波数チャープパルスを生成することと、
    一方における前記角周波数ω_２を中心としたパルスと、他方における前記角周波数ω_１およびω_３をそれぞれ中心としたパルスとに、前記パルスを分離すること、を含む
    請求項１６に従属する請求項１７に記載の方法。