JP5063647B2 - 誘導ラマン分光を対比機構として利用する顕微撮像システム及び方法 - Google Patents

誘導ラマン分光を対比機構として利用する顕微撮像システム及び方法 Download PDF

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Description

本発明は顕微振動分光による撮像システム及び方法、特にラマン散乱を用いたものに関する。
顕微振動分光による撮像法としては、既に顕微赤外撮像、顕微ラマン撮像、顕微ＣＡＲＳ撮像等の手法が知られている。
顕微赤外撮像によれば、サンプル内振動励起状態吸収を直接計測することができる。反面、使用する光が長波長の赤外光であるので信号分解能を高くするのが難しい。生体サンプルの場合は、更に、そのサンプルに含まれる水分で赤外光が多量に吸収されるため侵入深さが浅くなる。
顕微ラマン撮像によれば、紫外域、可視域又は近赤外域の単一波長連続波レーザ励起光に対する非弾性的な自発的ラマン散乱を観測するので、顕微赤外撮像に比べ光学的分解能が良好で侵入深さも深くなる。反面、自発的ラマン散乱の効率がそもそも低い（ラマン散乱断面積が一般に１０-30ｃｍ2オーダである）のでその感度は貧弱である。そのため、長い時間をかけて平均化を行わないと画像が得られないことから、生体分野における顕微ラマン撮像の用途は限られている。
顕微ＣＡＲＳ(coherent anti-Stokes Raman scattering：コヒーレント反ストークスラマン散乱)撮像によれば、２本のパルスレーザビーム即ちポンプビーム(pump beam)及びストークスビーム(Stokes beam)を用いコヒーレント励起を行うため、散乱信号の絶対強度がかなり高くなる。反面、サンプル内共振外物体も励起されるので、高レベルの背景ノイズが発生する。このノイズ即ち共振外背景ノイズは、希釈サンプルから得られる共振信号（ＣＡＲＳ信号）のスペクトラムを歪ませるばかりか、レーザノイズも運んできてしまう。そのため、分光性の面でも感度の面でも顕微ＣＡＲＳ撮像の用途は非常に限られている。
顕微ＣＡＲＳ撮像に適用できる共振外背景ノイズ抑圧手法としては、まず、共振外背景ノイズの偏向特性が共振信号のそれと異なることを利用する手法が考えられる。例えば、特許文献１に記載のシステムの如く、ある特定の偏向状態を有するポンプビーム及びストークスビームを入射し、相応の偏向状態を有する出射光のみを光検知器で検知するようにすればよい。また、これとは別の手法としては、遡行配置した光検知器で反ストークス場を検知する手法が考えられる。例えば特許文献２に記載のシステムでは、ＣＡＲＳ信号のうちビーム入射方向沿いに遡行する成分（遡行成分／エピ方向成分）を捉えるようにしている。ただ、光透過性サンプルの場合、ビーム入射方向沿いに順行する成分（順行成分）に比べエピ方向成分はかなり弱いので、強い信号が必要な用途ではなかなか利用することができない。
米国特許第６７９８５０７号明細書 米国特許第６８０９８１４号明細書 米国特許第７３５２４５８号明細書 米国特許第７３８８６６８号明細書 米国特許第７４１４７２９号明細書 米国特許出願公開第２００８／００３７５９５号明細書
LEVENSON et al., "FM Spectroscopy Detection of Stimulated Raman Gain", Optics Letters, Vol.8, No.2, February 1983, pages 108-110 Proceedings of IRE, November 1962, printed from IEEE Xplore on November 3, 2008, pp.2365-2383 N. Bloembergen, "The Stimulated Raman Effect", American Journal of Physics, November 1967, pp.989-1023 A. Owyoung, "Sensitivity Limitations for CW Stimulated Raman Spectroscopy", Optics Communication, Vol.22, No.3, September 1977, pp.323-328 A. Owyoung, "Coherent Raman Gain Spectroscopy Using CW Laser Sources", IEEE Journal of Quantum Electronics, Vol.QE-14, No.3, March 1978, pp.192-203 B. Levine et al., "Surface Vibrational Spectroscopy Using Stimulated Raman Scattering", IEEE Journal of Quantum Electronics, Vol.QE-15, No.12, December 1979, pp.1418-1432 B. Levine et al., "Ultrahigh Sensitivity Stimulated Raman Gain Spectroscopy", IEEE Journal of Quantum Electronics, Vol.QE-16, No.1, January 1980, pp.85-89 E. Ploetz et al., "Femtosecond Stimulated Raman Microscopy", Applied Physics B, 87, March 2007,pp.389-393
従って、高感度振動撮像を行えるシステム及び方法を実現すること、特に、ラマンスペクトラム及びそれに係る振動シグネチャに大きな歪が発生せず、その出射光中の共振外背景ノイズから共振信号を容易に弁別できる顕微撮像システムを提供することが求められている。
ここに、本発明の一実施形態に係る顕微撮像システムは、（１）その中心周波数がω1の第１光パルス列及びその中心周波数がω2の第２光パルス列を、共通の合焦空間にて互いに時間的に同期することとなるよう、また両者の間の周波数差が合焦空間内サンプル振動と共鳴する周波数になるよう生成する１個又は複数個の光源と、（２）１００ｋＨｚ以上の速度ｆで変化するよう第２光パルス列の特性を変調する変調システムと、（３）第１及び第２光パルス列を合焦空間に送り合焦させる合焦用光学系と、（４）合焦空間から順行又は遡行出射された光のうち第２光パルス列を除く光から、ほぼ全ての周波数成分に亘る積分強度を第１光パルス列の積分強度として検知する光検知器と、（５）合焦空間における第１第２光パルス列間非線形相互作用によってその積分強度に生じた振幅、位相又はその双方の変調分を速度ｆに基づきその積分強度から検知することによって、撮像結果たる画像を画素単位で取得する信号プロセッサと、を備える。
本発明の他の実施形態に係る顕微撮像方法は、（１）その中心周波数がω1の第１光パルス列及びその中心周波数がω2の第２光パルス列を、共通の合焦空間にて互いに時間的に同期することとなるよう、また両者の間の周波数差が合焦空間内サンプル振動と共鳴する周波数になるよう生成するステップと、（２）１００ｋＨｚ以上の速度ｆで変化するよう第２光パルス列の特性を変調するステップと、（３）第１及び第２光パルス列を合焦空間に送り合焦させるステップと、（４）合焦空間から順行又は遡行出射された光のうち第２光パルス列の成分を除去し、残った第１光パルス列のほぼ全ての周波数成分に亘る積分強度を検知するステップと、（５）合焦空間における第１第２光パルス列間非線形相互作用によってその積分強度に生じた振幅、位相又はその双方の変調分を速度ｆに基づきその積分強度から検知することによって、撮像結果たる画像を画素単位で取得するステップと、を有する。
本発明の第１実施形態に係る顕微撮像システムを示す模式図である。 図１の実施形態で使用される二種類のレーザパルス列、即ちその一方が振幅変調されているパルス列を示すチャートである。 本発明の他の実施形態に係る顕微撮像システムで使用される二種類のレーザパルス列、即ちその一方が偏光変調されているパルス列を示すチャートである。 本発明の更に他の実施形態に係る顕微撮像システムで使用される二種類のレーザパルス列、即ちその一方が位相変調（時間シフト）されているパルス列を示すチャートである。 本発明の更に他の実施形態に係る顕微撮像システムで使用される二種類のレーザパルス列、即ちその一方が周波数変調されているパルス列を示すチャートである。 本発明における光パルス列間周波数差対ラマン強度の関係の一例を示すグラフである。 本発明の更に他の実施形態に係る周波数変調型顕微撮像システムを示す模式図である。 本発明の更に他の実施形態に係る周波数変調型顕微撮像システムを示す模式図である。 本発明で得られるレーザ光周波数スペクトラム、特にそのノイズ成分及び信号変調分の一例を示すグラフである。 パワーを一定値に保ちながらポンプビーム波長を走査的に変化させることで、本発明の一実施形態に係る顕微撮像システムにより計測したメタノールのラマン損失スペクトラムを、従来の共焦点ラマン分光システムにより計測したメタノールの自発的ラマンスペクトラムと併せ示すグラフである。 本発明の一実施形態に係る顕微撮像システムで検知可能なメタノール水溶液の濃度範囲即ち検知限界を示すグラフである。 直径１μｍのポリスチレンビーズが分散している２％アガロースゲル溶液を、本発明の一実施形態に係る顕微撮像システムによって撮像したとき得られる画像の例を、示す図である。 本発明における共通の合焦空間内での第１第２光パルス列間非線形相互作用の例、特にサンプルによる順行伝搬光の後方散乱及びそれを利用したエピ方向検知について説明する模式図である。 本発明の更に他の実施形態に係るエピ方向検知型顕微撮像システムの一部分を示す模式図である。 本発明の更に他の実施形態に係るエピ方向検知型顕微撮像システムの一部分を示す模式図である。 本発明の更に他の実施形態に係る光ファイバシステム経由入出射型顕微撮像システムの一部分を示す模式図である。 図１２に示した実施形態にて使用しうる光ファイバシステムの一例、特にその先端部を示す模式図である。 図１２に示した実施形態にて使用しうる光ファイバシステムの他の一例、特にその断面を示す模式図である。 図１２に示した実施形態にて使用しうる光ファイバシステムの他の一例、特にその根本部を示す模式図である。 図１２に示した実施形態にて使用しうる光ファイバシステムの他の一例、特にその根本部を示す模式図である。 図１２に示した実施形態にて使用しうる光ファイバシステムの他の一例、特にその先端部走査システムを示す模式図である。 本発明の一実施形態に係る顕微撮像システムで乳ガン細胞を調べたときに得られる撮像結果、特に共振状態で得られる画像を示す図である。 同じく共振外状態で得られる画像を示す図である。
以下、別紙図面を参照しつつ本発明の好適な実施形態について説明する。但し、それらの図面は説明のためのものであるので、その記載のみに基づき本発明の要旨を限定解釈してはならない。
これから本発明の実施形態として説明するシステム及び方法では、振動撮像を新規な手法で行っている。本願では、その手法のことを顕微誘導ラマン散乱撮像と称している。この手法では、二種類のレーザパルス列即ちポンプビーム及びストークスビームを併用して振動遷移、ひいてはポンプビームの強度低下（誘導ラマン損失）及びストークスビームの強度増大（誘導ラマン利得）を誘起させる。更に、十分高い速度ｆで変化するようポンプビーム又はストークスビームの特性を変調する一方、光検知器として位相感応型光検知器を使用することによって、ポンプビーム・ストークスビーム間相互作用に伴う誘導ラマン損失、利得又はその双方を計測するようにしている。
図１に、本発明の一実施形態に係る顕微撮像システム１０を示す。本システム１０は二周波数レーザ光源１２及び光パラメトリック発振器(optical parametric oscillator：ＯＰＯ)１４を有している。そのうち光源１２では、内蔵する広帯域光源の出射光を複数個の小帯域に分割し、中心周波数ω2（例えば波長＝１０６４ｎｍ）の成分をレーザパルス列１６として出射する一方、それとは異なる中心周波数（例えば波長＝５３２ｎｍ）の成分をレーザパルス列１８として出射している。本実施形態では前者のパルス列１６をストークスビームとして使用している。他方、後者のパルス列１８は、特許文献６記載の構成を有するＯＰＯ１４に供給されている（この参照を以て特許文献６の全内容を本願に繰り入れることとする）。ＯＰＯ１４にパルス列１８を供給すると中心周波数ω1のレーザパルス列２０が励起される。本実施形態ではこのパルス列２０をポンプビームとして使用している。それらのビームは変調後に結合器２５にて結合される。即ち、ビーム１６を変調システムにて変調し、更にトランスレーションステージ２４にて光路長等の調整を施すことで、変調が施された中心周波数ω2のレーザパルス列２３即ち変調済ストークスビームを生成した上で、ビーム２０，２３を結合器２５で結合させる。更に、本実施形態では、ポンプビーム周波数ωpとストークスビーム周波数ωSとの差ωp−ωSをサンプル振動と共鳴する関係にするため、両ビーム２０，２３間の周波数差Δωが合焦空間内サンプル２２の振動に対し共振可能な周波数となるよう、ＯＰＯ１４の発振周波数ω1を設定してある。また、ステージ２４に関しては、ビーム２３側パルスの一部がビーム２０側パルスのうちいずれかと時間軸上で重なり合うよう、その可調範囲Ａ内でその調整量例えば光路長調整量が設定されている。結合器２５でビーム２０，２３を結合させて得られるビームでは、両ビーム２０，２３の成分が互いにコリニアになり空間的にも重なり合う。
こうして結合されたビームは、そのビームによってサンプル２２が走査されるよう相直交する二方向Ｘ，Ｙ沿いに合焦空間とサンプル２２を相対移動させる走査ヘッド２６を介し、顕微鏡２８に入射される。その顕微鏡２８内にある合焦用光学系３０は、ミラー３２等を介し入射してくるビームを合焦空間に送り合焦させる。その合焦空間からの順行出射光は、例えば非結像性の集光器３３を介し、合焦空間に対し順行配置されている光検知器３６に送られる。その際、変調済ストークスビーム２３の成分（中心周波数ω2）が光フィルタ３４によって阻止・遮蔽されるので、光検知器３６たるフォトダイオードで検知されるのはポンプビーム２０の成分（中心周波数ω1）のみの強度となる。
他方、ビーム１６を変調する変調システムは変調器３８、コントローラ４０及び変調制御信号源４１から構成されている。即ち、信号源４１から供給される変調制御信号４２に従いコントローラ４０が変調器３８を制御することで、ビーム１６の特性を速度ｆで変化させている。その変調制御信号４２は信号プロセッサ４４にも供給されており、そのプロセッサ４４には、ビーム２３を組成するほぼ全ての周波数成分に亘る積分強度を示す画像信号４６が光検知器３６から供給されている。プロセッサ４４は例えば時間領域解析用ボックスカー検知器を内蔵しており、合焦空間におけるビーム２０，２３間非線形相互作用に伴い発生した信号４６から、信号４２で示される速度ｆに基づき振幅、位相又はその双方の変調分を検知することによって、撮像結果たる画像を画素単位で取得する。顕微鏡制御用コンピュータ４８は、プロセッサ４４からその画像を取得し表示する一方、ユーザからの指示に応じ指令５０を与えることで、走査ヘッド２６の動作を制御する。
また、変調器３８では中心周波数ω2のビーム１６を振幅変調する。即ち、図２Ａに示すように、ビーム１６側パルスの振幅を１個おきに抑圧することで、低振幅パルス６２が挟まった中心周波数ω2のビーム２３を発生させる。その際、変調器３８としては例えばポッケルスセル(Pockel cell)及び偏向検光器を用い、コントローラ４０としては例えばポッケルスセルドライバを用いる。更に、このビーム２３をステージ２４にて調整することで、ビーム２３側パルスのうち低振幅パルス６２以外のパルスを時間軸上でビーム２０側パルスに重ねる。パルスが低振幅（６２）だと合焦空間内で誘導ラマン散乱がほとんど生じないので、このように誘導ラマン分光を対比機構、パルス６２を対比パルスとして用いることで、誘導ラマン損失等を計測することができる。なお、図示例では変調速度がレーザパルス繰返し速度の１／２である（ビーム１６側パルスの振幅がパルス１個おきに抑圧されている）が、これとは異なる変調速度を用いることもできる。例えばレーザパルス繰返し速度と同じオーダの変調速度でビーム１６を変調するのであれば、変調されるパルスに対し変調動作が（位相）同期するよう電子回路上でカウントダウンを行うとよい。更に、変調器３８として電気−光式又は音響−光式の変調器、例えばＭＥＭＳ(micro-electromechanical system)デバイスやガルバノメトリックスキャナを用いることもできる。そうした変形例では、変調速度ｆと同じ頻度で変調器３８を切断しパルスを阻止することで、パルス６２の振幅を概ね０にすることができる。
このように、速度ｆでその変調状態が変化するようビーム１６を振幅変調し、それによって得られたビーム２３をビーム２０と結合させて合焦空間に送る構成では、ビーム２３側が低振幅パルス６２であるときに誘導ラマン散乱がほとんど発生しない。そのことに着目し、パルス６２を一種の対比パルスとして利用することで、その合焦空間から到来する光に基づきポンプビーム強度の低下即ち誘導ラマン損失を計測することができる。その変調はポッケルスセル及び偏向検光器で行うことができる。
更に、本実施形態は、誘導ラマン分光を対比機構、レーザパルス列２０をポンプビーム、振幅変調済レーザパルス列２３を変調済ストークスビームとして用い、合焦空間からのポンプビームに生じている強度低下即ち誘導ラマン損失を信号プロセッサ４４で求める仕組みであるが、誘導ラマン分光を対比機構、パルス列２０をストークスビーム、振幅変調済レーザパルス列２３を変調済ポンプビームとして用い、合焦空間からのストークスビームに生じている強度増大即ち誘導ラマン利得をプロセッサ４４で計測する仕組みに、変形することができる。
このように、本実施形態の顕微撮像システムでは、ストークスビーム（又はポンプビーム）に対する振幅変調で対比機構を機能させることで、顕微誘導ラマン散乱撮像を実現している。この顕微誘導ラマン散乱撮像は既存の諸手法と比べ多くの点で優れている。特に（１）光学的誘導プロセスであるためその分子振動遷移効率が従来の自発散乱依拠型顕微ラマン撮像に比べてかなり高く、（２）顕微鏡内対物系の合焦空間のみで信号が発生する非線形プロセスであるため三次元セクショニング能が得られ、（３）共振外背景ノイズが常在する顕微ＣＡＲＳ撮像と違い共振外背景ノイズによる干渉を受けずにサンプル振動に対する共振信号のみを得ることができ、（４）得られる信号の強度が溶質濃度に対し常に線形であるため定量分析を速やかに実行することができ、（５）得られる信号にサンプルの自発蛍光が影響することがなく、（６）顕微ＣＡＲＳ撮像と違いビームの相対方向によらずその位相整合条件が常に充足され、（７）可視域又は近赤外域のビームを使用した場合はその侵入深さ及び空間分解能を吸収型の顕微赤外撮像に比べて深く／高くすることができ、（８）誘導ラマン損失／利得を外光に影響されずに計測でき従ってシステムを開環境で使用することができる。
また、誘導ラマン散乱のプロセスは、振動遷移を励起する二光子プロセスとして捉えることができる。即ち、ポンプビーム内光子が１個消滅する代わりにストークスビーム内光子が１個増え、それによって分子振動性フォノンの発生（振動遷移）が促されるプロセスとして、捉えることができる。このプロセスでは、消滅したポンプビーム内光子のエネルギから、相互作用の結果ストークスビーム２３に加わった光子のエネルギを差し引いた分のエネルギが、まさしく分子振動性フォノンのエネルギとなっている。その振動遷移の速度は、他の様々な光学的二光子プロセスと同じく、ポンプビーム強度とストークスビーム強度との積に比例する。自明なことに、このプロセスを発生させるには分子振動準位が必要である。さもないとエネルギ保存則が成り立たないので、共振外背景ノイズが発生する余地はない。このことは、顕微ＣＡＲＳ撮像に対する大きな長所を表している。ご留意頂きたいことに、共振外背景ノイズの影響でスペクトルが歪み、更には不要なレーザノイズが持ち込まれるため、顕微ＣＡＲＳ撮像の用途は厳しく制約されている。
更に、誘導ラマン散乱プロセスは自発ラマン散乱プロセスと次の点で違っている。まず、自発ラマン散乱の場合、初期状態でストークス光子モードが空乏であるため、真空場が誘導用ストークスビームとして振る舞う。そのためその効率が極端に低くなる。遷移速度もポンプビーム強度に比例するだけである。これに対し、本実施形態の誘導ラマン散乱プロセスでは、強いレーザビームをストークスビーム２３として用いるため、ストークス光子モードが当初から多数の光子で占められており、誘導放出とよく似たプロセスで散乱が惹き起こされることとなる。そのため、その遷移速度がポンプビーム強度に比例するだけの自発ラマン散乱と違い、誘導ラマン散乱における転移速度はポンプビーム強度及びストークス光子モードの光子数に比例する。ストークス光子モードの光子数はストークスビーム強度に比例するので、誘導ラマン散乱における遷移速度はポンプビーム２０，ストークスビーム２３双方の強度に比例することとなる。
誘導ラマン散乱プロセスは、更に、ポンプビーム（又はストークスビーム）と、それと同じ周波数を有する三次の誘導放射光との間に、ヘテロダイン干渉を発生させるプロセスとして捉えることができる。また、誘導ラマン利得計測に使用される三次非線形誘導放射光と、誘導ラマン損失計測に使用される三次非線形誘導放射光は、互いに異なる偏向状態を有するものである。これらはＣＡＲＳ発生に関わるそれとも区別することができる、しかし、それと共振する電子回路がなければいずれも同一の絶対強度になる。
三次非線形誘導放射光のうち、ポンプビーム強度低下に基づく誘導ラマン損失計測に使用できるのは、その輻射周波数がポンプビーム周波数ωpで、その強度依存性がポンプビーム強度とストークスビーム強度の自乗との積に対し線形的な偏向光である。遠視野の光検知器３６に到達したときには、その偏向光の位相（最終位相）は所与のポンプビーム２３に対し１８０°遅れた位相になっているので、ポンプビーム２３はこの三次非線形誘導放射光からの干渉を受けてその強度が低下する。このヘテロダイン干渉を表す項はポンプビーム強度，ストークスビーム強度双方に対し線形な項になる。
三次非線形誘導放射光のうち、ストークスビーム強度増大に基づく誘導ラマン利得計測に使用できるのは、その輻射周波数がストークスビーム周波数ωSで、その強度依存性がポンプビーム強度の自乗とストークスビーム強度との積に対し線形的な別の偏向光である。この偏向光の場合、その最終位相は所与のストークスビームのそれと同相であるので、ストークスビーム２０はこの三次非線形誘導放射光からの干渉を受けてその強度が増大する。このヘテロダイン干渉を表す項もやはり、ポンプビーム強度，ストークスビーム強度双方に対し線形な項になる。
三次非線形誘導放射光としてはこの他に二種類の偏向光が発生する。それらは共振外背景ノイズと密接に関連するものであり、上掲の二種類のレーザビームで励起され、その輻射周波数は一方がポンプビーム周波数ωp、他方がストークスビーム周波数ωSである。ただ、その最終位相が、ポンプビーム周波数ωpと同じ周波数の方はポンプビーム２０のそれに対し９０°、ストークスビーム周波数ωSと同じ周波数の方はストークスビーム２３のそれに対し２７０°、それぞれ遅れた位相になる。即ち、対応する所与のビームに対しどちらの偏向光も位相が直交しているので、それらの三次非線形誘導放射光は対応する所与のビームと干渉しない。そのため、信号の損失や利得に対し、検知できるような影響を及ぼすことはない。
図２Ｂに、本発明の他の実施形態に係る顕微撮像システム、特にそのシステムで使用される中心周波数ω１のレーザパルス列２０及び中心周波数ω２のレーザパルス列２３’を示す。このシステムでは、例えば中心周波数ω２のレーザパルス列１６を、コントローラ４０たる偏光コントローラの制御下に変調器３８たる偏光器で偏光変調し、更にトランスレーションステージ２４にて適宜調整を施すことで、図示の通り、その偏光状態が他のパルスと異なるパルス６４が挟まったパルス列２３’を、時間軸上で個々のパルスがいずれもパルス列２０内パルスと重なるように生成している。先に示した振幅変調には、侵入深さが深いという長所がある反面、サンプル２２上でのビーム強度変調が原因でサンプル温度乃至屈折率の変調が生じ線形な背景ノイズが発生するという短所もあるが、本実施形態のように偏光変調を使用すればそうした短所を回避することができる。なお、本実施形態ではパルス６４が１個おきに挟まっている（変調速度がレーザパルス繰返し速度の１／２になっている）が、変調状態とパルス列との同期を電子回路上で確保できるのであれば、これとは別の変調速度を使用することもできる。
ここに、合焦空間における誘導ラマン散乱の発生状態は、レーザパルス列２０，２３’間の偏光状態差によって大きく変化する。従って、誘導ラマン散乱が概ね発生しないようパルス列２３’内パルスのうち幾つかを他のパルスに対し非平行な偏光状態にすること、例えば１個おきにその前後のパルスに対し非平行な偏光状態のパルス６４にすることにより、本実施形態のように偏光変調を利用する形態でも誘導ラマン損失／利得を計測することができる。例えば、任意の偏光成分を濾波・阻止できる装置（ポッケルスセルを利用したもの等）を変調器３８として用いることで、パルス列１６内不要偏光成分を阻止し、その偏光状態が１個おきに９０°ずつ変わるパルス列２３’を生成することができる。合焦空間における非線形相互作用、例えばそれによって生じる非線形感受性テンソル要素(tensor element of the nonlinear susceptibility)の振幅は、ポンプビーム・ストークスビーム間でその偏光状態が直交している場合と平行な場合とで大きく異なるので、光検知器３６では個々のパルス列２３’内パルスを弁別することができる。即ち、ストークス（又はポンプ）ビームにおける偏光状態の違いを振幅の変化として検知することができる。光検知器３６にて捉えられたその信号は例えば信号プロセッサ４４内のロックイン増幅器で検知、増幅される。この実施形態即ち偏光選別的な対比機構を使用する実施形態では、サンプル温度変調の発生を妨げることができる。
図２Ｃに、本発明の更に他の実施形態に係る顕微撮像システム、特にそのシステムで使用する中心周波数ω1のレーザパルス列２０と中心周波数ω2のレーザパルス列２３”を示す。本実施形態におけるパルス列２３”では、図示の通り、時間軸上でパルス列２０内パルスに重なるパルスと重ならない対比パルス６６が交互に出現している。このように、一方の光パルス列を位相変調（時間シフト）する形態でも、本発明を実施することができる。
図２Ｄに、本発明の更に他の実施形態に係る顕微撮像システム、特にそのシステムで使用する中心周波数ω1のレーザパルス列と中心周波数ω2のレーザパルス列を示す。本実施形態では、中心周波数ω2のレーザパルス列１６を周波数変調することによって、周波数ω2のパルスと周波数ω2’のパルス６８とが交互に現れるレーザパルス列を生成し、そのパルス６８を対比パルスとして使用している。図３に示すように、中心周波数ω1のレーザパルス列に対する周波数差がω2−ω1のパルスでは高ラマン強度の共振信号６７が得られるのに対し、その周波数差がω2’−ω1のパルス６８では背景ノイズ６９しか生じない。
このように、ポンプビーム、ストークスビーム又はその双方を周波数変調する実施形態、例えば特許文献３に記載の手法等に従いポンプビーム、ストークスビーム又はその双方の周波数をある速度ｆで周波数変調する実施形態では、ポンプビーム・ストークスビーム間の周波数差ωp−ωSが、サンプルの振動周波数に同調している状態とその同調から外れている状態との間で切り替わる（この参照を以て特許文献３の全内容を本願に繰り入れることとする）。この同調の成否によって、合焦空間内ポンプビーム・ストークスビーム間非線形相互作用の様相が変わる。従って、周波数変調方式でも誘導ラマン損失／利得を光検知器の出力から求めることができ、その結果を例えば信号プロセッサ４４内のロックイン増幅器に通すことで変調周期の時間的変化のみを取り出すことができる。この他にも、時間遅延変調、空間ビームモード変調等の変調方式で変調した信号を用いることができる。
図４Ａに、本発明のその種の実施形態に係る顕微撮像システムを示す。このシステムは、例えば特許文献６の記載に従い複数個のＯＰＯを使用し、光パルス列を周波数変調する顕微撮像システムとして構築されている（この参照を以て特許文献６の全内容を本願に繰り入れることとする）。図示の通り、このシステムは、二周波数レーザ光源９０、２個のＯＰＯ９２，９４、並びに光源９０からの出射光を分岐させて両ＯＰＯ９２，９４に供給する手段を備えている。本実施形態では、光源９０にて、ある中心周波数ω1を有するレーザパルス列９６を発生させ、それをポンプビームとして使用する一方で、その同じ光源９０で、ある中心周波数を有する別のレーザパルス列９８を発生させ、ＯＰＯ９２，９４に供給している。これにより励起されたＯＰＯ９２はレーザパルス列１００を、ＯＰＯ９４はレーザパルス列１０２をそれぞれ発生させる。パルス列１００はストークスビームとして使用されるパルス列であり、その中心周波数ω2は、周波数ω1との差Δωが図示しない合焦空間内サンプル振動に共鳴可能な周波数となるよう、即ちポンプビーム周波数ωpとストークスビーム周波数ωSとの差ωp−ωSがサンプル振動と共振するよう、設定されている。他方のパルス列１０２の中心周波数ω2’は、周波数ω1との差Δωが図示しない合焦空間内サンプル振動に共鳴しない周波数となるよう、即ちポンプビーム周波数ωpとストークスビーム周波数ωSとの差ωp−ωSがサンプル振動と共振しないよう、設定されている。
それら、中心周波数が順にω2，ω2’のレーザパルス列１００，１０２は、半波長板１０３，１０４のうち対応するものを経て互いに結合され、変調器１０６に供給される。半波長板１０３，１０４に通すのは、パルス列１００，１０２を互いに異なる偏向状態にするため、即ちビームススプリッタで一方を透過、他方を反射させうるようにするためである。従って、変調器１０６に供給されるレーザパルス列（１００と１０２を結合させたもの）は、その偏向状態が異なる二種類のパルス、例えば互いにその偏波面が直交する二種類のパルスを含んでいる。変調器１０６は、変調速度ｆを示す変調制御信号を変調制御信号源１０８から受け取り、入射してくるパルス列をその信号に基づき変調する。従って、変調器１０６から得られる信号には、その偏向状態ひいては周波数が異なる複数種類の成分が含まれている。偏向検光器１１０では、それらの成分を速度ｆでの変調動作に同期し切り替えつつ透過させることでレーザパルス列１１２を発生させる。このパルス列１１２には、周波数ω2のパルスと周波数ω2’のパルスとが交互に現れる。他方のレーザパルス列９６は、その可調範囲がＢのトランスレーションステージ１１４によって、パルス列１１２内パルスの一部がパルス列９６内パルスのうちいずれかと時間軸上で重なり合うよう調整される。こうして得られた二種類のパルス列９６，１１２は、互いにコリニアになり空間的にも重なり合うよう結合器１１６にて互いに結合される。
レーザパルス列９６，１１２を結合させることで得られたレーザパルス列は、走査ヘッド１１８を介し顕微鏡１２０に送られる。顕微鏡１２０内の合焦用光学系１２２は、サンプル１２４が存する合焦空間にそのパルス列を送って合焦させる。この点は図１を参照して先に説明した実施形態と同様である。その合焦空間からの順行出射光は集光器１２７によって光検知器１２８上に送られる。光フィルタ１２６は周波数ω1のパルスのみを透過させる。光検知器１２８たるフォトダイオードはそのパルスを検知する。
光検知器１２８は、周波数ω1のパルス（パルス列９６）を組成するほぼ全ての周波数成分に亘る積分強度を示す画像信号１３０を、信号プロセッサ１３２に供給する。そのプロセッサ４４は、合焦空間内パルス列１１２，９６間非線形相互作用に伴い生じた振幅、位相又はその双方の変調分をその信号１３０（積分強度）から変調速度ｆに基づき検知することによって、撮像結果たる画像を画素単位で取得する。顕微鏡制御用コンピュータ１３４は、プロセッサ１３２からその画像を取得し表示する一方、ユーザからの指示に応じ指令１３６を与えることで、走査ヘッド１１８の動作を制御する。なお、ＯＰＯ９４に代え電子ロック型のモードロックレーザ例えば電子ロック型チタンサファイアレーザを使用することもできる。
図４Ｂに、本発明の他の実施形態に係る顕微撮像システムを示す。このシステムは、周波数ω2のパルスと周波数ω2’のパルスを同一の光源（変調ＯＰＯや変調チタンサファイアレーザ等の変調モードロックレーザ）で発生させるタイプの実施形態である。即ち、周波数ω2のパルス及び周波数ω2’のパルスを併含する周波数変調済レーザパルス列１１２を、単一のＯＰＯ１４０によって発生させる構成を採っている。そのため、変調制御信号源１０８からＯＰＯ１４０に変調制御信号が供給されており、ＯＰＯ１４０はその信号で示される変調速度ｆに従いパルス列１１２を発生させている。他方のレーザパルス列９６は、その可調範囲がＢのトランスレーションステージ１１４によって、パルス列１１２内パルスの一部がパルス列９６内パルスのうちいずれかと時間軸上で重なり合うよう調整される。こうして得られた二種類のパルス列９６，１１２は、互いにコリニアになり空間的にも重なり合うよう結合器１１６にて互いに結合される。
レーザパルス列９６，１１２を結合させることで得られたレーザパルス列は、図示の通り走査ヘッド１１８を介し顕微鏡１２０に送られる。顕微鏡１２０内の合焦用光学系１２２は、サンプル１２４が存する合焦空間にそのレーザパルス列を送って合焦させる。この点は図１を参照して先に説明した実施形態と同様である。その合焦空間からの順行出射光は集光器１２７によって光検知器１２８上に送られる。光フィルタ１２６はその周波数がω1のパルスのみを透過させる。光検知器１２８たるフォトダイオードはそのパルスを検知する。光検知器１２８は、周波数ω1のパルス列９６を組成するほぼ全ての周波数成分に亘る積分強度を示す画像信号１３０を、信号プロセッサ１３２に供給する。そのプロセッサ４４は、合焦空間内パルス列１１２，９６間非線形相互作用に伴い生じた振幅、位相又はその双方の変調分を、その信号１３０（積分強度）から変調速度ｆに基づき検知することによって、撮像結果たる画像を画素単位で取得する。顕微鏡制御用コンピュータ１３４は、プロセッサ１３２からその画像を取得し表示する一方、ユーザからの指示に応じ指令１３６を与えることで、走査ヘッド１１８の動作を制御する。
なお、上述の諸実施形態では、変調器（３８等）を一段にしているがこれを多段にすることもできる。例えば、その多段変調器を使用し各段を個別に動作させることで、ビームに二次変調又は相互変調をかけることができるので、変調器が一段の場合よりもレーザノイズを抑えることができる。二次変調とは、第１段変調器にて高速変調を施し、第２段変調器にてそれより低速な変調を施す、といったやり方である。復調時には、第１段復調器たる第１ロックイン検波器にて、第２段変調分が通過するような時定数を以て復調を行い、その復調を経た信号即ち第２段変調分が残っている信号を、第２段復調器たる第２ロックイン検波器で復調する。また、相互変調とは、第１段，第２段どちらの変調器でもほぼ同じ速度で変調を行うやり方である。復調時には両変調速度の和又は差に相当する速度で且つ単一のロックイン増幅器により信号を検波する。例えばＳｔａｎｆｏｒｄ Ｒｅｓｅａｒｃｈ社のロックイン増幅器ＳＲ８４４ＦＭ（商品名）、ＣｏｎＯｐｔｉｃｓ社のポッケルスセル３６０−８０（商品名）等のシステムは、これを実行するのに役に立つ。
また、上述の諸実施形態では、誘導ラマン損失／利得を捉えて顕微撮像を行っている。そのため、誘導ラマン損失／利得を好適に計測できるよう、励起光を発生させる光源（１２等）、信号を検知するための位相感応型光検知器（３６等）、並びにその励起光でサンプルを走査する機構（２６等）を適切に組み合わせて使用している。第１に、例えば図１の実施形態では、その周波数差Δω＝ωp−ωSが合焦先分子の振動周波数に等しい二種類のレーザパルス列２０，２３がサンプル２２上で相互作用すると、それら周波数ωpのポンプビームと周波数ωSのストークスビームの間の周波数差Δωがサンプル内分子の振動に共鳴して信号が発生する。即ち、その相互作用によってポンプビーム２０が用尽されストークスビーム２３が増強される。こうした誘導ラマン損失／利得を計測するには、それら二種類のビーム２０，２３を重ね合わせること（例えばパルス列２０，２３間でパルスタイミングを揃えること）が必要である。ビーム２０、２３又はその双方の波長が可調であれば、検知対象分子種を選定し、その分子種に対するラマン共鳴が生じるよう撮像に先立ち周波数差Δωを変化させることができるので、更に望ましい。そのため、前掲の諸実施形態では、励起用のビームを発生させるための光源としてパルスレーザ、特にそのピーク電磁場強度が高く従って個々の画素に係るビーム照射時間が短いものを使用している。第２に、検知対象となる信号は、ポンプビーム又はストークスビームの小幅な強度低下（誘導ラマン損失）又は強度増大（誘導ラマン利得）であり、その信号にはそのビームに係る背景ノイズがかぶっている。そうした信号を背景ノイズから弁別するため、前掲の諸実施形態では、励起に使用するビームのうち一方（２３等）に振幅変調等を施しておき、位相感応型光検知器で信号を検知するようにしている。これによって、合焦空間内に存する振動共鳴性分子種の濃度を調べることができる。第３に、合焦空間及びサンプルを相対移動させること、即ち顕微鏡内でビームを走査的にステアすることによって、そのサンプル２２等を構成している分子のうち所望のものの分布を示す三次元画像を得ることができる。
同じく、上述の諸実施形態では、合焦空間にてビーム間非線形相互作用を発生させることでその誘導ラマン損失／利得を発生させているので、ビーム間非線形相互作用を好適に惹き起こせるよう、光源たるパルスレーザ（１２等）のパルス幅を設定している。これは、ビーム間非線形相互作用で生じる信号の強度が励起光強度に対し非線形であるため、即ちポンプビーム強度ＩPumpとストークスビーム強度ＩStokesの積ＩPump・ＩStokesに比例するためである。この関係から判るように、得られる信号を強くするには強度ＩPump及びＩStokesのピーク値を大きくすべきであるが、サンプル上での平均強度は抑えねばならないので、上掲の諸実施形態ではパルスレーザ特にそのパルス幅が狭いものを使用している。反面、レーザパルスのパルス幅Δｔと周波数帯域幅Δωの間にはΔｔ・Δω＝一定なる式で表される関係があるので、パルス幅Δｔを狭めるとそのパルスの周波数帯域幅Δωが広くなる。そのため、ラマン帯域のライン幅に見合った幅Δｔ及びΔω、例えば典型的なラマン帯域ライン幅たる約３０ｃｍ-1に対応する約２〜３ピコ秒のパルス幅Δｔを有するパルスを用いている。パルス幅Δｔをこれと異なる値、例えば約０．２〜１０ピコ秒の範囲に属する別の値にすることもできるが、ラマン帯域ライン幅相当値より長めの場合はピーク強度が犠牲になり非線形相互作用の結果たる信号の強度が弱まるであろう。短めの場合は、確かにより広範な周波数成分が関わってくるが、その大部分は分子振動に共鳴しないものであるので信号強度が強まるようなことはなく、それでいてサンプル上のパワーひいては光学的損傷が不必要に増加してしまうこととなりかねない。従って、典型的なラマン帯域ライン幅に相応する数ピコ秒程度のレーザパルスを使用するのが理想であるといえる。このパルス幅であれば、レーザパルス繰返し速度を約８０ＭＨｚにすることで、サンプル（２２等）の光学的損傷を好適に抑えることができる。一般には、光源を構成する光ファイバの出射光をピコ秒域のパルス幅を有する狭帯域光又はフェムト秒域のパルス幅を有する広帯域光にするとよい。更に、イメージング対象となる信号を好適に発生させるため、上掲の諸実施形態では、ポンプビームとストークスビームを互いに平行でその分散が等しいビームにし、そのサンプル上の同一個所に合焦するようにしている（空間的重複）。励起用の光源がパルスレーザであるので、更に、両ビームのパルスを互いに同時に発生させている（時間的重複）。即ち、両ビームのレーザパルス繰返し速度を互いに等しくしている。実施形態によっては、更に、両ビームのパルスが互いに重なるよう或いはそれらの間の時間差が実質的に０になるよう当該時間差を可調にしている。
更に、ポンプビーム及びストークスビームのうち少なくとも一方の波長が可調な形態で本発明を実施することもできる。典型的なラマン帯域幅が約０．５ｎｍであるので、少なくとも約０．１ｎｍ精度で波長を調整できれば、ラマン帯域走査ひいては分子種検知を分子種選別的に行うことができる。
同じく、それらのビームの波長乃至周波数は様々な帯域にすることができる。第１の例は近赤外光（７００〜１５００ｎｍ）である。この帯域の光には生体サンプルにあまり吸収されずまた散乱も生じにくいという特徴がある。これは、生体サンプルへの侵入深さが深くなり、しかもそのサンプルの光学的損傷が抑えられるということである。生体内特に人体の検査で近赤外光を使用する妨げになる事情も特にないので、近赤外光は生体イメージングに適している。第２の例は可視光や紫外光である。この帯域のレーザ光をポンプビームやストークスビームとして用いた場合、近赤外光ほどの侵入深さや光学的低損傷性は得られないが、光検知器以降の電子回路に供給される信号は強い信号になる。この帯域の光を使用する場合、例えば、励起用レーザの出力で同期励起型のＯＰＯを励起する構成にすればよい。そのＯＰＯにＳＥＡＳＡＭ（半導体可飽和吸収材ミラー）を組み込みその可飽和吸収材の機能を活かすことで、パルス幅を可調にすることもできる。例えば、図１のレーザ光源１２にて、典型的な利得媒質を用い波長＝１０６４ｎｍのビーム１６を発生させ、更にそのビーム１６を逓倍して波長＝５３２ｎｍのビーム１８を発生させて、同期励起型のＯＰＯ１４に供給する。そのＯＰＯ１４では、波長＝５３２ｎｍのビーム１８による励起を受け、波長＝７００〜１０００ｎｍの信号ビーム及び波長＝１１００〜２０００ｎｍのアイドラビームを発生させる。使用されるのは、信号ビーム、アイドラビーム又はその双方である（信号＋アイドラモード）。或いは、励起用レーザで発生させた波長＝１０６４ｎｍのビーム（逓倍前のビーム）を信号ビーム又はアイドラビームと結合させ、それによって得られたビームを使用するようにしてもよい（前者は信号＋１０６４ｎｍモードで後者はアイドラ＋１０６４ｎｍモード）。いずれにしても、これらのビームにおけるレーザパルス繰返し速度はＯＰＯ１４が同期励起型であるため自動的に同一になり、同じく時間軸上でのパルス位置にも原理的に違いが生じない。これらのビームと波長＝１０６４ｎｍのビーム２３との間には、遅延ステージにて所要の時間差を付与することができる。また、同期チタンサファイアレーザ又はファイバレーザを使用すること、例えばＨｉｇｈＱ Ｌａｓｅｒ社のポンプレーザｐｉｃｏＴＲＡＩＮ（商品名）と独国のベルリンにあるＡＰＥ社のエメラルドＯＰＯ（商品名）の組合せ等、市販システムを使用することもできる。
更に、上述の諸実施形態では信号検知用の光検知器（３６等）としてフォトダイオードを使用している。信号対雑音比がほぼ光子検知個数1/2に等しいショットノイズ限界では、その信号対雑音比を保ちながら光子検知個数を増やすことで撮像速度を高めることができるので、例えば約２００ｍＷといった強力なレーザを検知可能なフォトダイオードを用いることが重要である。また、そのフォトダイオード上でのビーム位置が多少動いても検知した信号に大きな変化が生じないようにするには、後に非被走査型光検知として述べるように、その面積が大きなフォトダイオードを使用するのが望ましい。更に、高速変調に対処するにはフォトダイオードの応答時間が十分に短くなければならない。これらの条件を満たし近赤外域内の所要域をカバーできるフォトダイオードとしてはシリコン製又はゲルマニウム製のダイオードがある。市販システムの中では、例えばＴｈｏｒｌａｂｓ社の大面積フォトダイオードＦＤＳ１０１０（商品名）を信号検知に使用することができる。
また、上述の諸実施形態では、変調されているストークスビームを抑圧してポンプビームを通すため（誘導ラマン損失を計測する場合）又は変調されているポンプビームを抑圧してストークスビームを通すため（誘導ラマン利得を計測する場合）、光検知器の面前に高光学密度遮蔽フィルタたる光フィルタ（３４等）を配置している。このフィルタとしては、例えばＣｈｒｏｍａ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ社のバンドパスフィルタ８９０／２２０（商品名）等のシステムを使用することができる。このシステムであれば、誘導ラマン損失計測に際し、波長＝１０６４ｎｍのストークスビームを阻止しポンプビームを通過させることができる。
更に、上述の諸実施形態では、合焦空間に強いレーザビームを照射することで小幅な強度増大又は低下を発生させ、それを示す信号を光検知器（３６等）及びその後段の回路にて広漠な背景ノイズから弁別することで、それぞれ誘導ラマン利得又は損失を計測している。そのもととなるビーム、即ち合焦空間を経由したストークスビーム（誘導ラマン利得計測時）又はポンプビーム（誘導ラマン損失計測時）のパワーは、次の式
（数１）
合焦空間経由後ビームパワー≒｜Ｅ0±ΔＥ｜2＝Ｅ0 2±ΔＥ・Ｅ0＋ΔＥ2
で表すことができる。この式中、Ｅ0はそのビームのサンプル入射時電場強度、ΔＥはそのビームと同じ周波数を有する非線形三次誘導偏向光の電場強度を表している。即ち、非線形三次誘導偏向光によるビーム強度の増減にはコヒーレンシがあるので、電場強度Ｅ0±ΔＥの絶対値の自乗で与えられるこのビームパワーには、原強度Ｅ0の自乗項、コヒーレント混合項ΔＥ・Ｅ0及び電場変動自乗項ΔＥ2の各成分が現れる。対象とするサンプルが特殊なものでなく、使用しているビームの原強度Ｅ0も一般的な強度である場合、原強度自乗項Ｅ0 2に対しコヒーレント混合項ΔＥ・Ｅ0は５桁以上、電場変動自乗項ΔＥ2は１０桁以上小さな値になるので、少なくとも電場変動自乗項ΔＥ2は無視することができる。そのため、光検知器及びその後段の回路に対しては、コヒーレント混合項ΔＥ・Ｅ0で表される小幅なヘテロダイン干渉分を、広漠な背景ノイズから信号として抽出することが求められる。もしこうしたバックグラウンド抑圧が不十分だと、その小幅な信号に対し、背景ノイズのレベルに連動するレーザノイズが卓越することとなりかねない。
そうしたヘテロダイン干渉分を背景ノイズから信号として抽出するため、上述の諸実施形態では、高速の変調器及び位相感応型の光検知器を使用している。即ち、ビームにより励起される信号は変調速度相当の周波数ωmodに現れ、直流成分を含めそれ以外の周波数成分は背景ノイズとなるので、変調されたビームの作用で生じる信号とその背景ノイズとの間に十分な強度差が生じるよう十分高速な（振幅）変調器でビームの強度に変調を施すと共に、周波数領域で作動する受動的なフィルタ回路によってωmod相当の周波数成分を残し他の周波数成分を除去乃至抑圧することで、背景ノイズを除去するようにしている。そのフィルタ回路としては、その通過帯域幅１／Ｔintを決める積分時定数Ｔintが１画素当たりビーム照射時間にほぼ等しいものを信号プロセッサに組み込んである。更に、その変調分を基準とした位相を、背景ノイズに対する信号の差異を表す第２の特徴として扱うこと、即ち位相感応型光検知器を用いることで、背景ノイズを更に完全に抑圧することができる。信号プロセッサにはロックイン増幅器を組み込むのはそのためである。
図５に、合焦空間を経由したレーザビームのスペクトラムについてその一例を示すこの例のように、直流１５０、１／ｆノイズ１５２及び信号１５４の各成分が現れているスペクトラムから信号１５４を取り出すため、上掲の諸実施形態では、変調速度相当の周波数ωmodを中心周波数とし、約１／Ｔintの通過帯域幅を呈するフィルタ回路を、信号プロセッサに組み込んでいる。
こうしたスペクトラムが生じるのは、励起用の光源として使用しているレーザが一定強度光源ではなく、割合に広い周波数に亘り強いノイズをもたらすためである。このノイズ即ちレーザノイズの一部成分はωmod相当の周波数に現れるので、その成分をそのままにしておくと信号検知上の感度が損なわれ又は失われることとなる。ただ、こうしたレーザノイズの強度は一般に周波数の逆数（１／ｆnoise）に依存している。即ち、変調速度ωmodを高くするにつれレーザノイズ成分が低レベルになる。従って、ロックイン増幅器の検知可能帯域で好適に検知できるよう変調速度ｆを定めればよい。上述の諸実施形態即ちＯＰＯを使用するシステム構成では、変調速度を最低１００ｋＨｚ以上、好ましくは１ＭＨｚ以上にすることで、そのレーザノイズ成分をほぼ完全に、即ち信号に比して無視可能なレベルまで抑え込むことができる。
上述の諸実施形態では、更なる感度向上及び背景ノイズ抑圧のため、伝搬中のビームをサンプル・フォトダイオード間でどのような開口にも通さないようにしている。これは、サンプル・フォトダイオード間の開口でビームの縁が“刈り取られ”る分、背景ノイズが増えるからである。即ち、振幅又は偏光変調を施したポンプ／ストークスビームを合焦空間に送り込むと、“直交位相変調”であるため合焦空間内サンプルの屈折率が変調され一時的な“マイクロレンズ”が発生する。ストークス／ポンプビームは、合焦空間にてこのマイクロレンズの作用で僅かに発散された後、フォトダイオードにて検知される。このとき、サンプル・フォトダイオード間に開口があると、それを通るときにビームが空間的にフィルタリング、即ちその断面形状（プロファイル）が変調されてしまう。このプロファイル変調はωｍｏｄ相当周波数に関しては強度変調であるので、それを経たビームをフォトダイオードで検知して信号プロセッサに送ると、その強度変調分がロックイン増幅器を通過してしまい、媒質の種類によらず一種の共振外背景ノイズとして働いてしまう。合焦空間内検知対象分子種との振動共振で生じる信号が弱いときには、この不要な共振外背景ノイズの方が勝ってしまい、信号が共振外背景ノイズに埋もれてしまうこととなる。
伝搬中のビームに対するこうした空間フィルタリングは、かなりの程度回避することができる。例えば、集光器（３３等）の開口率を、対物系たる合焦用光学系と同等かより高い開口率にすればよい。この集光器で広い角度範囲から集光することができるので、そうした開口フィルタリングを防ぐことができる。特に、対物系を合焦用光学系兼集光器として使用する実施形態（後述）では、その対物系をその開口率が最大限に高い光学系（好ましくは非結像性の光学系）にする必要がある。上述の諸実施形態では、更に、ビームが辿る光路上にビーム径より小さな開口を設けない、フォトダイオード上の活性領域に比しビーム径を細くする等して、開口の影響を排している。
上述の諸実施形態では、こうした顕微撮像で検知される信号、即ち誘導ラマン利得又は損失を表す信号に基づき、合焦空間内分子種の濃度を示す画像を顕微鏡制御用コンピュータ４８等の画面上に表示させている。より具体的には、サンプルを横切るよう合焦空間を走査しつつ画素単位でそうした信号を検知することにより、その分子種の合焦空間内分布を示す三次元画像を表示させている。その走査に当たっては、ビーム走査、ステージ走査又はその双方を実行する。ビーム走査とは、対物系の後方開口（合焦用光学系の出射開口）から出射していくビームがその開口面の垂線に対してなす角度を変化させることで、固定されているサンプルを横切るようそのビームで合焦空間を走査する動作である。ステージ走査とは、合焦空間に対してサンプルを動かす動作である。サンプルを動かす必要のないビーム走査であれば、その機構上比較的安定的に実行することができ且つサンプルがあまり攪乱されないので、走査レートを７０００ライン／秒以上にも高めることができる。そのため、市販されている多くの共焦点顕微鏡で、ｘｙ平面上ではビーム走査、ｚ軸沿いにはステージ走査とという併用形態が採られている。この形態で稼働するシステムとしては、オリンパス株式会社のＦＶ−３００やＦＶ−１０００、ＬｅｉｃａＭｉｃｒｏｓｙｓｔｅｍｓ社のＳＰ５、ＣａｒｌＺｅｉｓｓ社のＬＳＭ５１０やＬＳＭ７１０等がある（いずれも商品名）。
また、上述の諸実施形態では、励起に使用したビームの強度増大又は低下を、合焦空間へのビーム入射方向沿いに前方に向かう出射光（順行出射光）から検知し、それに基づきサンプルによる誘導ラマン利得又は損失を計測している。これは、そのサンプルが光透過性に富む場合に適している。これに対して、生体組織のように光散乱性に富むサンプルである場合は、図９に示すように順行伝搬光が後方散乱されるので、ビーム入射方向沿いに後方に向かう出射光（遡行出射光／エピ方向出射光）から検知することが可能であり自然でもある。従って、顕微誘導ラマン散乱撮像は、誘導ラマン利得又は損失をエピ方向計測する内視鏡撮像システムでも実行できる。
更に、上述の諸実施形態では、ポンプビーム・ストークスビーム間非線形相互作用に伴い信号が発生するので、信号が発生する場所は合焦空間内だけである。即ち、誘導ラマン利得／損失の計測による顕微誘導ラマン散乱撮像は、本質的に三次元セクショニングによる撮像であるのでピンホールが必要ない。そのため、上述の諸実施形態では、非被走査型検知器を極力サンプルのすぐ近くに配置し強い信号を得ることができる。特に、非被走査型検知器たる光検知器（フォトダイオード）を、順行出射光を捉えるように配置（順行配置）してあるので、いわゆる４ｆ幾何配置のレンズ２枚を用い対物系（合焦用光学系）の後方開口をその光検知器で捉えること、即ち走査ヘッド内のミラーをその光検知器で捉えることができる。従って、その光検知器上でビームが多少動いても問題はない。
図６〜図８に、本発明の一実施形態に係る顕微撮像システムにて誘導ラマン損失を計測した結果を示す。この計測に使用したのは、オリンパス株式会社の顕微鏡ＦＶ−３００（商品名）に改変を加えたものに、独国のベルリンにあるＡＰＥ社のエメラルドＯＰＯ（商品名）で発生させた可調波長のレーザパルス列をポンプビームとして、またＨｉｇｈＱ Ｌａｓｅｒ社のポンプレーザで発生させた波長＝１０６４ｎｍのレーザパルス列をストークスビームとして入力する構成のシステムである。信号は、Ｔｈｏｒｌａｂ社の大面積フォトダイオードＦＤＳ１０１０（商品名）を順行配置して検知するようにした。波長＝１０６４ｎｍのストークスビームは、サンプルが存する合焦空間とそのフォトダイオードとの間にて、Ｃｈｒｏｍａ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ社のバンドパスフィルタ８９０／２２０（商品名）によって阻止されるようにした。更に、ＣｏｎＯｐｔｉｃｓ社のポッケルスセル３６０−８０（商品名）で、１ＭＨｚの速度でストークスビームを偏光変調することによって、検知される信号中に振幅変調分を発生させた。その変調分の抽出には、ＳｔａｎｆｏｒｄＲｅｓｅａｒｃｈ社のロックイン増幅器ＳＲ８４４ＲＦ（商品名）を使用した。そして、ポッケルスセルの高電圧駆動部で発生する高周波雑音の侵入を妨げるため、相応の高周波シールドを施した。
図６に、この顕微撮像システムで得られたラマン損失スペクトラム１６０を示す。このスペクトラム１６０は、サンプル上でのパワーを一定に保ちながらポンプビームの波長を走査的に変化させることにより、純粋なメタノールについて誘導ラマン損失のスペクトラムを計測した結果である。図示の通り、このスペクトラム１６０は２個の特徴的なピーク１６２及び１６４を有している。対するに、この図の左肩に差し込んである通り、従来の共焦点ラマン分光システムで計測したメタノールのラマン損失スペクトラム１７０にも、２個の特徴的なピーク１７２及び１７４がある。この点、スペクトラム６０はこのスペクトラム１７０とよく一致している。即ち、自発ラマン散乱を利用し計測した自発ラマン損失のスペクトラムと同様のダブルピーク構造が、本システムでも再現されることが判った。
更に、このシステムを用いメタノール水溶液の濃度を計測したところ、図７に示す如き結果１８０が得られた。このグラフから読み取れるように、本システムで検知可能なメタノール濃度は約０．５％であり、通常の顕微ＣＡＲＳ撮像における検知限界よりも低くなっている。従って、二次変調や相互変調を用いることや、より長波長へのスイッチングを行うことで、これよりも感度を高めることができよう。更に、誘導ラマン損失の計測結果がメタノール濃度に対し線形的に依存する性質も確認することができた。
図８に、直径１μｍのポリスチレンビーズを分散させた２％アガロースゲル溶液について、このシステムによる０．５％撮像で得られた画像１８２を示す。ＣＡＲＳの場合と違いこの画像１８２に共振外背景ノイズが現れていないことから、共振外背景ノイズが検知可能水準を下回っていると判断することができる。なお、このイメージングは１画素当たりビーム照射時間を１００μ秒として行ったが、１画素当たりビーム照射時間はより短い又は長い時間にすることもできる。
図９に、ストークスビームたる変調済のレーザパルス列１８１と、ポンプビームたる別のレーザパルス列１８３との間の非線形相互作用について示す。図示の通り、合焦用光学系１８４を介し合焦空間に入射したパルス列１８１，１８３は、その光学系１８４によって合焦空間内で合焦され、更に入射方向１８６に沿って順行伝搬していく。前掲の諸実施形態では光検知器がサンプルに対し順行配置されているので、その光検知器を用い、順行伝搬していくストークスビーム等から両ビーム間の非線形相互作用による誘導ラマン損失等を検知することができる。
また、合焦用光学系１８４を介し合焦空間に入射したパルス列１８１，１８３の一部は、その光学系１８４によって合焦された後、そのサンプル内の分子１８８によって反射され、サンプルから見て逆方向１９０に存する光学系１８４に戻っていく。従って、ポンプビームたるレーザパルス列及びストークスビームたるレーザパルス列が合焦空間内に入射してくる方向に沿って後方に光検知器を配置（遡行配置）する形態でも、本発明を実施することもできる。光検知器が遡行配置されているシステムでは、反射されたビーム例えばポンプビームから、両ビーム間の非線形相互作用による誘導ラマン利得等を検知することとなる。
図１０に、本発明のその種の実施形態に係る顕微撮像システムの一部分を示す。図中、図１に示した実施形態のそれと共通する部材には同一の符号を付してある。また、図示していないシステム構成部分は図１のそれと同様の構成でよい。変調方式としては、振幅変調に限らず、上述の通り偏光変調、位相変調、周波数変調等も使用することができる。
この図のシステムでは、合焦空間にて反射されたストークスビームの諸周波数成分に亘る積分強度を求めることができるよう、ポンプビームを除去する光フィルタ２０２及びそれを介しストークスビームを受光する光検知器２００を設けている。即ち、合焦用光学系２０４によって合焦空間に送られた二種類のレーザパルス列は、その空間に存するサンプル２０６上に合焦する。そのパルス列の一部は、ラマン散乱に続きサンプル２０６内の他の分子によって反射され、エピ方向に進んでいく。そのパルス列は光学系２０４を遡行しフィルタ２０２を介して光検知器２００に到達する。光検知器２００はその結果を示す画像信号２０８を信号プロセッサ４４に供給する。そのプロセッサ４４は、その接続先の顕微鏡制御用コンピュータ４８と共に、図１を参照して説明した要領で稼働する。
また、信号と励起用のレーザビームとが同一周波数であることに鑑み、このシステムには、顕微鏡に入射してくるビームの一部を反射させて合焦用光学系２０４に送り、残りを透過させて放熱器２１２に送るよう、ビームスプリッタ２１０が設けられている。このスプリッタ２１０として５０／５０ビームスプリッタを用いた場合は、５０％が反射、５０％が透過されるので、顕微鏡に入射してきたストークスビームのうち２５％が、合焦空間を経て光検知器２００に達することとなる。また、２０／８０ビームスプリッタを用いた場合は、２０％が反射、８０％が透過されるので、顕微鏡に入射してきたストークスビームのうち４％が、合焦空間を経て光検知器２００に達することとなる。前掲の諸実施形態と同じく、このシステムでも、ビームに対し振幅、偏向、位相又は周波数の変調が速度ｆで施されているので、信号プロセッサ４４では、合焦空間内でのストークスビーム・ポンプビーム間非線形相互作用に伴い生じた信号、即ちストークスビームたるパルス列を組成するほぼ全ての周波数成分に亘る積分強度を示す信号から、振幅、位相又はその双方の変調分を検知することができる。
図１１に、本発明の他の実施形態に係る顕微撮像システムの一部分を示す。図中、図１に示した実施形態のそれと共通する部材には同一の符号を付してある。また、図示していないシステム構成部分は図１のそれと同様の構成でよい。変調方式としては、振幅変調に限らず、上述の通り偏光変調、位相変調、周波数変調等も使用することができる。
この図のシステムでは、合焦空間にて反射されたレーザパルス列即ちポンプ又はストークスビームの諸周波数成分に亘る積分強度を求めることができるよう、一方のビームを除去する光フィルタ２２２及びそれを介し他方のビームを受光する光検知器２２０を設けている。即ち、合焦用光学系２２４によって合焦空間に送られた二種類のレーザパルス列は、その空間に存するサンプル２２６上に合焦する。そのパルス列の一部は、ラマン散乱に続きサンプル２２６内の他の分子によって反射され、エピ方向に進んでいく。そのパルス列は光学系２２４を遡行しフィルタ２２２を介して光検知器２２０に到達する。光検知器２２０はその結果を示す画像信号２２８を信号プロセッサ４４に供給する。そのプロセッサ４４は、その接続先の顕微鏡制御用コンピュータ４８と共に、図１を参照して説明した要領で稼働する。
また、信号と励起用のレーザビームとが同一周波数であることに鑑み、このシステムでは、それらを互いに分離させるため１／４波長板２３０及び偏向ビームスプリッタを用いている。即ち、合焦用光学系２２４に１／４波長板２３０を前置する一方、その光学系２２４から見て光検知器２２０側のビームスプリッタを偏向ビームスプリッタとし、ＯＰＯ１４からストークスビームとして供給されるレーザパルス列（そのＯＰＯ１４にてある方向に偏向されているもの）をほぼ全て反射し合焦空間に送るようその偏向ビームスプリッタを設けている。合焦空間にて反射されこの偏向ビームスプリッタに戻ってくるポンプビーム及びストークスビームは１／４波長板２３０を通過しているので、そのストークスビームはＯＰＯ１４から入射してきた直後のストークスビームに比べ偏向方向が９０°変化しており、従ってその偏向ビームスプリッタを透過することができる。透過したストークスビームはフィルタ２２２を経て光検知器２２０に到達する。前掲の諸実施形態と同じく、このシステムでも、ビームに対し振幅、偏向、位相又は周波数の変調が速度ｆで施されているので、信号プロセッサ４４では、合焦空間内でのストークスビーム・ポンプビーム間非線形相互作用に伴い生じた信号、即ちストークスビームたるパルス列を組成するほぼ全ての周波数成分に亘る積分強度を示す信号から、振幅、位相又はその双方の変調分を検知することができる。
図１２に、本発明の更に他の実施形態に係る顕微撮像システムの一部分を示す。図中、図１に示した実施形態のそれと共通する部材には同一の符号を付してある。また、図示していないシステム構成部分は図１のそれと同様の構成でよい。変調方式としては、振幅変調に限らず、上述の通り偏光変調、位相変調、周波数変調等も使用することができる。
この図のシステムでは、合焦空間にて反射されたストークスビームの諸周波数成分に亘る積分強度を求めることができるよう、ポンプビームを除去する光フィルタ２４２及びそれを介しストークスビームを受光する光検知器２４０を設けている。また、それらと合焦用光学系２４４の間には光ファイバシステム２４８が介在している。即ち、二種類のレーザパルス列は光ファイバシステム２４８を介し合焦用光学系２４４に届けられ、その光学系２４４によって合焦空間に送られその空間に存するサンプル２４６上に合焦する。そのパルス列の一部は、ラマン散乱に続きサンプル２４６内の他の分子によって反射され、エピ方向に進んでいく。そのパルス列は光学系２４４及び光ファイバシステム２４８を遡行しフィルタ２４２を介して光検知器２４０に到達する。光検知器２４０はその結果を示す画像信号２５０を信号プロセッサ４４に供給する。そのプロセッサ４４は、その接続先の顕微鏡制御用コンピュータ４８と共に、図１を参照して説明した要領で稼働する。
また、この図のシステムでは、合焦空間にて反射して戻ってきたストークスビームが図１中のＯＰＯ１４に戻っていかないよう、図１０の実施形態と同じ要領で５０／５０又は２０／８０のビームスプリッタ２５２及び放熱器２５４を設けるか、或いは図１１の実施形態と同じ要領で１／４波長板２５６を設け且つそのビームスプリッタ２５２を偏向ビームスプリッタにするようにしている。前掲の諸実施形態と同じく、このシステムでも、ビームに対し振幅、偏向、位相又は周波数の変調が速度ｆで施されているので、信号プロセッサ４４では、合焦空間内でのストークスビーム・ポンプビーム間非線形相互作用に伴い生じた信号、即ちストークスビームたるパルス列を組成するほぼ全ての周波数成分に亘る積分強度を示す信号から、振幅、位相又はその双方の変調分を検知することができる。
図１３に、図１２に示した光ファイバシステム２４８の一例構成を示す。この例では、複数本の光ファイバを束ねることでシステム２４８を形成している。光源１２，１４に発するレーザパルス列即ちポンプビーム及びストークスビームはそれらの光ファイバのうちの１本（２６０）を介し合焦用光学系２４４に供給される。サンプル２４６によって反射されたポンプビーム及びストークスビームはそのシステム２４８を構成する別の光ファイバ（例えば２６２をはじめとする複数本）を介し光検知器２４０側に戻ってくる。上述の通り、図１０の実施形態と同じ要領で５０／５０又は２０／８０のビームスプリッタ２５２及び放熱器２５４を設けるか、或いは図１１の実施形態と同じ要領で１／４波長板２５６を設け且つそのビームスプリッタ２５２を偏向ビームスプリッタにしてあるので、合焦空間にて反射して戻ってきたストークスビームが図１中のＯＰＯ１４に戻るようなことはない。前掲の諸実施形態と同じく、こうしたシステム２４８を用いた場合でも、ビームに対し振幅、偏向、位相又は周波数の変調が速度ｆで施されているので、信号プロセッサ４４では、合焦空間内でのストークスビーム・ポンプビーム間非線形相互作用に伴い生じた信号、即ちストークスビームたるパルス列を組成するほぼ全ての周波数成分に亘る積分強度を示す信号から、振幅、位相又はその双方の変調分を検知することができる。
図１４に、図１２に示した光ファイバシステム２４８の別例構成を示す。この例では、ポンプビーム入射用、ストークスビーム入射用及び反射光集光用の光ファイバによってシステム２４８が構成されている。即ち、ポンプビームを合焦用光学系２４４に届ける光ファイバ２６４、変調されているストークスビームを合焦用光学系２４４に届ける光ファイバ２６６、並びに合焦空間における反射光例えばポンプビームを集めて運ぶ複数本の光ファイバ２６８を、互いに分けてある。上述の通り、図１０の実施形態と同じ要領で５０／５０又は２０／８０のビームスプリッタ２５２及び放熱器２５４を設けるか、或いは図１１の実施形態と同じ要領で１／４波長板２５６を設け且つそのビームスプリッタ２５２を偏向ビームスプリッタにしてあるので、合焦空間にて反射して戻ってきたストークスビームが図１中のＯＰＯ１４に戻るようなことはない。前掲の諸実施形態と同じく、こうしたシステム２４８を用いた場合でも、ビームに対し振幅、偏向、位相又は周波数の変調が速度ｆで施されているので、信号プロセッサ４４では、合焦空間内でのストークスビーム・ポンプビーム間非線形相互作用に伴い生じた信号、即ちストークスビームたるパルス列を組成するほぼ全ての周波数成分に亘る積分強度を示す信号から、振幅、位相又はその双方の変調分を検知することができる。
図１５に、図１２に示した光ファイバシステム２４８の変形例２４８’を示す。この例では、複数本の光ファイバを束ねることで光ファイバシステム２４８’が形成されている。また、光源１２，１４に発するポンプビーム及びストークスビームは同じ１本の光ファイバ２７０を介し合焦用光学系２４４に送られており、サンプルによって反射されたポンプビーム及びストークスビームはそのシステム２４８’を構成する別の複数本の光ファイバ２７２を介し戻ってくる。更に、この図のシステムには、レーザ光源１２及びＯＰＯ１４から到来するポンプビーム及びストークスビームをシステム２４８’の先端に入射させるよう、ビームスプリッタ２７４が設けられている。このスプリッタ２７４のうち、互いにコリニアなポンプビーム及びストークスビームが接触する中央部２７５は光透過性となっており、その中央部２７５を囲む周辺部２７７はとみに光反射性となっている。従って、サンプルによって反射されたポンプビーム及びストークスビームは、このシステム２４８’を構成する光ファイバ２７２を通ってスプリッタ２７４まで戻り、そのスプリッタ２７４によってレンズ２７８越しに光検知器２７６に送られることとなる。前掲の諸実施形態と同じく、こうしたシステム２４８’を用いた場合でも、ビームに対し振幅、偏向、位相又は周波数の変調が速度ｆで施されているので、信号プロセッサ４４では、合焦空間内でのストークスビーム・ポンプビーム間非線形相互作用に伴い生じた信号、即ちストークスビームたるパルス列を組成するほぼ全ての周波数成分に亘る積分強度を示す信号から、振幅、位相又はその双方の変調分を検知することができる。
図１６に、図１２に示した光ファイバシステム２４８の更なる変形例２４８”を示す。この例でも、複数本の光ファイバを束ねることで光ファイバシステム２４８”が形成されている。また、光源１２，１４に発するポンプビーム及びストークスビームは同じ１本の光ファイバ２８０を介し合焦用光学系２４４に送られており、サンプルによって反射されたポンプビーム及びストークスビームはそのシステム２４８”を構成する別の複数本の光ファイバ２８２を介し戻ってくる。但し、この図のシステムの場合、光ファイバ２８０がシステム２４８”の根本部で、このシステム２４８”を構成する他の光ファイバ２８２の束から分離している。サンプルによって反射されたポンプビーム及びストークスビームは、それらの光ファイバ２８２を通りレンズ２８８越しに光検知器２８６へと送られることとなる。前掲の諸実施形態と同じく、こうしたシステム２４８”を用いた場合でも、ビームに対し振幅、偏向、位相又は周波数の変調が速度ｆで施されているので、信号プロセッサ４４では、合焦空間内でのストークスビーム・ポンプビーム間非線形相互作用に伴い生じた信号、即ちストークスビームたるパルス列を組成するほぼ全ての周波数成分に亘る積分強度を示す信号から、振幅、位相又はその双方の変調分を検知することができる。
これらのように光ファイバを使用する実施形態では、特許文献５に記載の通り、その根本又は先端に走査システムを設け、その光ファイバに対するポンプビーム、ストークスビーム又はその双方の照射位置をその走査システムによって可制御的に調整する構成を採ることができる（この参照を以て特許文献５の全内容を本願に繰り入れることとする）。即ち、ポンプビームやストークスビームを別の光ファイバで送り込む構成でもそうでない構成でもよいが、互いにコリニアなポンプビーム及びストークスビームのサンプルに対する位置をファイバ先端の走査システム等で可制御的に調整し、それらのビームをｘ，ｙ，ｚの各軸に沿ってサンプル上の任意の部位に向けることができる。
図１７に、本発明のその種の実施形態に係る顕微撮像システムの一部分を示す。この図のシステムでは、ポンプビーム及びストークスビームを合焦させてサンプル上を走査することができるよう、その光ファイバシステム３１２の先端に走査システムが設けられている。この先端部走査システムは、図示の通り、ハウジング３０２、そのハウジング３０２に設けられた固定部３０４及び可動部３０６、ｘｙ平面内での動きを担う圧電モータ３０８、並びにｚ方向の動きを担う円環状の圧電モータ３１０を備えている。光ファイバの先端はハウジング３０２内に引き込まれており、そのハウジング３０２から引き出された制御信号線３１４は患者の体外まで延設されている。
図１８Ａ及び図１８Ｂに、本発明の一実施形態に係る顕微撮像システムで乳ガン細胞を調べたときに得られる撮像結果３２０，３２２を示す。これらのうち、図１８Ａに示した画像３２０は、本システムを乳ガン細胞のＣＨ2伸縮振動に対し共振（同調）させて撮像した結果を示すものであり、細胞内脂質分布が鮮明に現れている。これに対し、図１８Ｂに示した画像３２２はその共振を外して撮像した結果を示すものであり、物質の違いによるコントラストが現れない。従って、共振を外した後も共振時の画像がある程度は残ってしまう顕微ＣＡＲＳ撮像システムに比べ、本システムの方が、変調によるコンラストを好適に読み取ることができる。
本件技術分野で習熟を積まれた方々（いわゆる当業者）であれば、本発明の実施形態に関する以上の記載に基づき本発明を実施することや、それらを改変乃至改良することができよう。
１０ 顕微撮像システム、１２，９０ 二周波数レーザ光源、１４，９２，９４，１４０ 光パラメトリック発振器（ＯＰＯ）、１６〜２０，２３〜２３”，９６〜１０２，１１２，１８１，１８３ レーザパルス列（ビーム）、２２，１２４，２０６，２２６，２４６ サンプル、２４，１１４ トランスレーションステージ、２５，１１６ 結合器、２６，１１８ 走査ヘッド、２８，１２０ 顕微鏡、３０，１２２，１８４，２０４，２２４，２４４ 合焦用光学系、３２ ミラー、３３，１２７ 集光器、３４，１２６，２０２，２２２，２４２ 光フィルタ、３６，１２８，２００，２２０，２４０，２７６，２８６ 光検知器、３８，１０６ 変調器、４０ コントローラ、４１，１０８ 変調制御信号源、４２ 変調制御信号、４４，１３２ 信号プロセッサ、４６，１３０，２０８，２２８，２５０ 画像信号、４８，１３４ 顕微鏡制御用コンピュータ、５０，１３６ ユーザ指令、６２〜６６，６８ 対比パルス、６７ 共振信号、６９ 背景ノイズ、１０３，１０４ 半波長板、１１０ 偏向検光器、１５０ 直流成分、１５２ １／ｆノイズ、１５４ 信号、１６０，１７０ ラマン損失スペクトラム、１６２，１６４，１７２，１７４ ピーク、１８０ 検知結果、１８２，３２０，３２２ 撮像結果、１８６ レーザパルス入射方向、１８８ 分子、１９０ レーザパルス反射方向、２１０，２５２，２７４ ビームスプリッタ、２１２，２５４ 放熱器、２３０，２５６ １／４波長板、２４８〜２４８”，３１２ 光ファイバシステム、２６０〜２７２，２８０，２８２ 光ファイバ、２７５ 透過性中央部、２７７ 高反射性周辺部、２７８，２８８ レンズ、３０２ ハウジング、３０４ 固定部、３０６ 可動部、３０８，３１０ 圧電モータ、３１４ 制御信号線、Ａ，Ｂ トランスレーションステージの可調範囲、Ｔint 積分時定数、ｘ，ｙ，ｚ，Ｘ，Ｙ 走査方向、Δω 周波数差、ω1，ω2，ω2’ ビーム中心周波数、ωmod 変調速度。

Claims (36)

  1. その中心周波数がω１の第１光パルス列及びその中心周波数がω２の第２光パルス列を、共通の合焦空間にて互いに時間的に同期することとなるよう、また両者の間の周波数差が合焦空間内サンプル振動と共鳴する周波数になるよう生成する１個又は複数個の光源と、
    １００ｋＨｚ以上の速度ｆで変化するよう第２光パルス列の特性を変調する変調システムと、
    第１及び第２光パルス列を合焦空間に送り合焦させる合焦用光学系と、
    合焦空間から順行又は遡行出射された光のうち第２光パルス列を除く光から、ほぼ全ての周波数成分に亘る積分強度を第１光パルス列の積分強度として検知し、前記積分強度はストークスビーム強度の増大あるいはポンプビーム強度の低下のいずれかを示す、光検知器と、
    合焦空間における第１第２光パルス列間非線形相互作用によってその積分強度に生じた振幅、位相又はその双方の変調分を速度ｆに基づきその積分強度から検知することによって、撮像結果となる画像を画素単位で取得する信号プロセッサと、
    を備える顕微撮像システム。
  2. 請求項１記載の顕微撮像システムであって、第１光パルス列をポンプビーム、変調システムにて速度ｆでの変調が施された第２光パルス列をストークスビーム、誘導ラマン分光を対比機構として用いて検知を行い、それにより得られた積分強度及び速度ｆに基づき、信号プロセッサがラマン損失を求める顕微撮像システム。
  3. 請求項１記載の顕微撮像システムであって、第１光パルス列をストークスビーム、変調システムにて速度ｆで変調されている第２光パルス列をポンプビーム、誘導ラマン分光を対比機構として用いて検知を行い、それにより得られた積分強度及び速度ｆに基づき、信号プロセッサがラマン利得を求める顕微撮像システム。
  4. 請求項１記載の顕微撮像システムであって、その変調システムで変調される特性が第２光パルス列の振幅である顕微撮像システム。
  5. 請求項１記載の顕微撮像システムであって、その変調システムで変調される特性が第２光パルス列の偏向である顕微撮像システム。
  6. 請求項１記載の顕微撮像システムであって、その変調システムで変調される特性が第２光パルス列の位相乃至タイミングである顕微撮像システム。
  7. 請求項１記載の顕微撮像システムであって、その変調システムで変調される特性が第２光パルス列の周波数である顕微撮像システム。
  8. 請求項１記載の顕微撮像システムであって、その変調システムが第２光パルス列を二次変調又は相互変調する顕微撮像システム。
  9. 請求項１記載の顕微撮像システムであって、その光検知器が、合焦空間への第１及び第２光パルス列入射方向に沿い順行配置されている顕微撮像システム。
  10. 請求項１記載の顕微撮像システムであって、その光検知器が、合焦空間への第１及び第２光パルス列入射方向に沿い遡行配置されている顕微撮像システム。
  11. 請求項１記載の顕微撮像システムであって、更に、合焦空間からの光を光検知器に届ける集光器を備え、その集光器が合焦用光学系以上の開口率を有する顕微撮像システム。
  12. 請求項１記載の顕微撮像システムであって、更に、合焦空間からの光を光検知器に届ける集光器を備え、その集光器が非結像性光学系である顕微撮像システム。
  13. 請求項１記載の顕微撮像システムであって、更に、第１光パルス列を合焦空間に届ける光ファイバ又はその束を備える顕微撮像システム。
  14. 請求項１記載の顕微撮像システムであって、更に、第１光パルス列を合焦空間から光検知器に届ける光ファイバ又はその束を備える顕微撮像システム。
  15. 請求項１記載の顕微撮像システムであって、更に、第１及び第２光パルス列を合焦空間に届ける第１光ファイバシステムと、第１光パルス列を合焦空間から光検知器に届ける第２光ファイバシステムと、を備える顕微撮像システム。
  16. 請求項１記載の顕微撮像システムであって、速度ｆが１ＭＨｚ以上である顕微撮像システム。
  17. 請求項１記載の顕微撮像システムであって、その変調システムが、電気−光式又は音響−光式の変調器を有する顕微撮像システム。
  18. 請求項１記載の顕微撮像システムであって、更に、複数個の画素を有する画像が撮像結果として得られるよう合焦空間及びその中のサンプルを三次元的に相対移動させる走査機構を備える顕微撮像システム。
  19. 請求項１記載の顕微撮像システムであって、第１光源、第２光源又はその双方が同期励起型の光パラメトリック発振器を有する顕微撮像システム。
  20. 請求項１記載の顕微撮像システムであって、第１光源、第２光源又はその双方がレーザ光源を有し、そのレーザ光源が電子ロック型のモードロックレーザ例えばチタンサファイアレーザである顕微撮像システム。
  21. 請求項１記載の顕微撮像システムであって、第１光源、第２光源又はその双方が、広帯域光源に発する光を複数個の小帯域に分けて出射する顕微撮像システム。
  22. 請求項１記載の顕微撮像システムであって、第１光源、第２光源又はその双方が、光ファイバを使用し光パルス列を発生させ、その光パルス列が、ピコ秒域のパルス幅を有する狭帯域光又はフェムト秒域のパルス幅を有する広帯域光である顕微撮像システム。
  23. 請求項１記載の顕微撮像システムであって、その変調システムが、変調光パラメトリック発振器又は変調チタンサファイアレーザ等の変調モードロックレーザを有する顕微撮像システム。
  24. 請求項１記載の顕微撮像システムであって、その変調システムが、電子ロック型のモードロックレーザ例えばチタンサファイアレーザを有する顕微撮像システム。
  25. 請求項１記載の顕微撮像システムであって、その信号プロセッサが、周波数領域で作動する受動的なフィルタ回路を有する顕微撮像システム。
  26. 請求項１記載の顕微撮像システムであって、その信号プロセッサがロックイン増幅器を有する顕微撮像システム。
  27. 請求項１記載の顕微撮像システムであって、その信号プロセッサが時間領域解析用ボックスカー検知器を有する顕微撮像システム。
  28. 請求項１記載の顕微撮像システムであって、第１及び第２光パルス列双方のパルス幅が約０．２〜１０ピコ秒の範囲内である顕微撮像システム。
  29. その中心周波数がω１の第１光パルス列及びその中心周波数がω２の第２光パルス列を、共通の合焦空間にて互いに時間的に同期することとなるよう、また両者の間の周波数差が合焦空間内サンプル振動と共鳴する周波数になるよう生成するステップと、
    １００ｋＨｚ以上の速度ｆで変化するよう第２光パルス列の特性を変調するステップと、
    第１及び第２光パルス列を合焦空間に送り合焦させるステップと、
    合焦空間から順行又は遡行出射された光のうち第２光パルス列の成分を除去し、残った第１光パルス列のほぼ全ての周波数成分に亘る積分強度を検知し、前記積分強度はストークスビーム強度の増大あるいはポンプビーム強度の低下のいずれかを示すものである、ステップと、
    合焦空間における第１第２光パルス列間非線形相互作用によってその積分強度に生じた振幅、位相又はその双方の変調分を速度ｆに基づきその積分強度から検知することによって、撮像結果となる画像を画素単位で取得するステップと、
    を有する顕微撮像方法。
  30. 請求項２９記載の顕微撮像方法であって、第１光パルス列をポンプビーム、変調が施されている第２光パルス列をストークスビーム、誘導ラマン分光を対比機構として用い、変調速度ｆ及び積分強度に基づきラマン損失を求める顕微撮像方法。
  31. 請求項２９記載の顕微撮像方法であって、第１光パルス列をストークスビーム、変調が施されている第２光パルス列をポンプビーム、誘導ラマン分光を対比機構として用い、変調速度ｆ及び積分強度に基づきラマン利得を求める顕微撮像方法。
  32. 請求項２９記載の顕微撮像方法であって、上記変調ステップで変調される特性が第２光パルス列の振幅である顕微撮像方法。
  33. 請求項２９記載の顕微撮像方法であって、上記変調ステップで変調される特性が第２光パルス列の偏向状態である顕微撮像方法。
  34. 請求項２９記載の顕微撮像方法であって、上記変調ステップで変調される特性が第２光パルス列の位相乃至タイミングである顕微撮像方法。
  35. 請求項２９記載の顕微撮像方法であって、上記変調ステップで変調される特性が第２光パルス列の周波数である顕微撮像方法。
  36. 請求項２９記載の顕微撮像方法であって、第１及び第２光パルス列を第１光ファイバシステムを介し合焦空間に届け、第１光パルス列を第２光ファイバシステムを介し合焦空間から検知する顕微撮像方法。
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