WO2010140614A1 - 光学顕微鏡、および光学計測 - Google Patents

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WO2010140614A1
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WO
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optical
pulse train
optical pulse
light source
frequency
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PCT/JP2010/059327
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English (en)
French (fr)
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小関泰之
伊東一良
嶽文宏
福井希一
梶山慎一郎
北川雄真
西澤典彦
住村和彦
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国立大学法人大阪大学
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    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01J—MEASUREMENT OF INTENSITY, VELOCITY, SPECTRAL CONTENT, POLARISATION, PHASE OR PULSE CHARACTERISTICS OF INFRARED, VISIBLE OR ULTRAVIOLET LIGHT; COLORIMETRY; RADIATION PYROMETRY
    • G01J3/00—Spectrometry; Spectrophotometry; Monochromators; Measuring colours
    • G01J3/28—Investigating the spectrum
    • G01J3/44—Raman spectrometry; Scattering spectrometry ; Fluorescence spectrometry
    • G01J3/4412—Scattering spectrometry
    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N21/00—Investigating or analysing materials by the use of optical means, i.e. using sub-millimetre waves, infrared, visible or ultraviolet light
    • G01N21/62—Systems in which the material investigated is excited whereby it emits light or causes a change in wavelength of the incident light
    • G01N21/63—Systems in which the material investigated is excited whereby it emits light or causes a change in wavelength of the incident light optically excited
    • G01N21/65—Raman scattering
    • G—PHYSICS
    • G02—OPTICS
    • G02B—OPTICAL ELEMENTS, SYSTEMS OR APPARATUS
    • G02B21/00—Microscopes
    • G02B21/06—Means for illuminating specimens
    • G—PHYSICS
    • G02—OPTICS
    • G02B—OPTICAL ELEMENTS, SYSTEMS OR APPARATUS
    • G02B21/00—Microscopes
    • G02B21/36—Microscopes arranged for photographic purposes or projection purposes or digital imaging or video purposes including associated control and data processing arrangements
    • G02B21/365—Control or image processing arrangements for digital or video microscopes

Definitions

  • the present invention relates to an optical microscope that can be applied to a molecular vibration imaging technique using stimulated Raman scattering, and optical measurement.
  • the microscope using the Raman scattering principle is expected to be applied to biological cell observation as a molecular vibration imaging technique reflecting molecular vibration information.
  • the spectral information of the sample is acquired by utilizing the frequency change of the excitation light by the molecular vibration frequency of the sample.
  • the signal-to-noise (S / N) ratio is obtained. It was a big problem to improve.
  • CARS light is generated at a frequency (2 ⁇ AS ⁇ S ) different from that of the pump light by using light pulses of two colors ( ⁇ AS , ⁇ S ).
  • CARS has a feature that a signal with a high S / N ratio can be obtained in order to force the molecules to vibrate.
  • Non-Patent Document 1 a stimulated Raman scattering (SRS) microscope is used by the inventors (see Non-Patent Document 1) and Sunny Xie et al. (See Patent Document 2).
  • SRS stimulated Raman scattering
  • the principle of the stimulated Raman scattering microscope is as follows.
  • the frequency difference between the two colors is the molecular vibration frequency of the sample at the focal point. If they match, a phenomenon called stimulated Raman scattering occurs at the focal point. At this time, intensity modulation occurs in the excitation light pulse that is not intensity modulated, and the intensity modulation due to stimulated Raman scattering can be detected by optically detecting the excitation light emitted from the sample. Therefore, molecular vibration imaging of the sample can be performed from the intensity modulation generated by the stimulated Raman scattering.
  • FIG. 12 shows a block configuration diagram when the principle of a conventional stimulated Raman scattering microscope is confirmed.
  • the conventional stimulated Raman scattering microscope 500 has an anti-Stokes light ( ⁇ AS ) irradiated from a titanium sapphire laser 501, an optical parametric oscillator 502, and intensity modulation by an acousto-optic device (AOM) 503.
  • the produced Stokes light ( ⁇ S ) is coaxially combined using a dichroic mirror 505, and condensed onto the sample 507 via the objective lens 506.
  • the scattered light at this time was detected using a photodiode (PD) 511 and a lock-in amplifier 512 via an objective lens 508, a short pass filter 509, and a condenser lens 510.
  • Reference numeral 504 denotes a mirror.
  • the anti-Stokes light ( ⁇ AS ) has a repetition frequency of 76 MHz, a center wavelength of 765 nm, and a pulse width of 100 fs.
  • the repetition frequency of the Stokes light ( ⁇ S ) is 76 MHz, and the center wavelength is 985. ⁇ 1005 nm and the pulse width was 200 fs.
  • the frequency of the high frequency signal source 513 was 2 MHz.
  • the above-described conventional stimulated Raman scattering microscope has a problem that the S / N ratio is lowered due to the influence of intensity noise of the laser as a light source.
  • an acousto-optic element for intensity-modulating the Stokes light is required, resulting in a problem that the system becomes complicated.
  • the intensity noise of the laser decreases as the frequency increases, it is effective to increase the modulation frequency in order to reduce the intensity noise of the laser.
  • the modulation frequency increases, the requirements for acousto-optic elements that perform intensity modulation become stricter, and the problems related to the complexity of the system become more prominent. Further, if there is a restriction on increasing the modulation frequency due to restrictions on intensity modulation, it is difficult to obtain a high-quality moving image.
  • the present invention provides an optical system that can easily cope with a case where the modulation frequency is increased in order to solve the above-described conventional problems, to suppress the complexity of the light source system, and to reduce the influence of laser intensity noise. It aims at obtaining the optical microscope provided.
  • an optical microscope of the present invention includes a first optical pulse train having a first optical frequency generated by a first light source, and temporally synchronized with the first optical pulse train.
  • the repetition frequency of the optical pulse train is an integral fraction of the repetition frequency of the optical pulse train generated by the second light source.
  • the element for intensity modulation used in the conventional optical microscope becomes unnecessary, the optical microscope system can be simplified, and the modulation frequency of the optical pulse train is set high.
  • the modulation frequency of the optical pulse train is set high.
  • FIGS. 3A and 3B are diagrams showing molecular vibration images of polystyrene beads in water
  • FIGS. 3C and 3D are views showing molecular vibration images of plant cells, respectively.
  • FIG. 8A is a molecular vibration image of polystyrene beads when the lock-in frequency is 2 MHz
  • FIG. 8B is a molecular vibration image of polystyrene beads when the lock-in frequency is 10 MHz.
  • FIG. 9A is a molecular vibration image of a plant cell when the lock-in frequency is 2 MHz
  • FIG. 9B is a molecular vibration image of the plant cell when the lock-in frequency is 10 MHz.
  • FIG. 9A shows the relationship between the lock-in frequency in the molecular vibration image obtained with the optical microscope concerning the 2nd Embodiment of this invention, and the magnitude
  • the optical microscope of the present invention includes a first optical pulse train having a first optical frequency generated by a first light source, and a second light source generated in time synchronization with the first optical pulse train.
  • stimulated Raman scattering occurs when the frequency difference between the first optical frequency and the second optical frequency matches the molecular vibration frequency of the sample.
  • the scattered light from the sample is intensity-modulated, and molecular vibration imaging of the sample can be performed by detecting this intensity-modulated component.
  • an optical microscope using stimulated Raman scattering that has a simple optical microscope system and can easily set the modulation frequency of the optical pulse train to be high without using a conventional element for intensity modulation. Obtainable.
  • the repetition frequency of the optical pulse train generated by the first light source is one half of the repetition frequency of the optical pulse train generated by the second light source.
  • the first optical source, the second optical source, the irradiation optical system that irradiates the sample with the first optical pulse train and the second optical pulse train simultaneously, and the scattered light from the sample A condensing optical system that removes the first optical pulse train and condenses the other, a light receiving element that converts scattered light collected by the condensing optical system into an electrical signal, and outputs the electric light, and the light receiving element And an electronic circuit for synchronously detecting the output signal.
  • At least one of the first light source and the second light source is a fiber laser, and a timing difference detection optical system for detecting a timing difference between the first optical pulse train and the second optical pulse train is provided. And driving the optical path length modulation means disposed in the resonator of the fiber laser based on the output signal from the timing difference detection optical system, and the timing of the first optical pulse train and the second light It is preferable to match the timing of the pulse train. By doing so, an optical microscope capable of aligning the timing of the first optical pulse train and the timing of the second optical pulse train with high accuracy and obtaining a clear molecular vibration image with a high S / N ratio can be obtained. Can be realized.
  • timing difference detection optical system it is preferable to detect a two-photon absorption current generated when the laser light of the first optical pulse train and the laser light of the second optical pulse train are condensed and irradiated. By doing so, it is possible to detect the timing shift of the two-color ultrashort optical pulse laser beam with high accuracy.
  • the optical path length modulation means is a variable delay line and a phase modulator.
  • a variable delay line that can mechanically adjust the optical path length over a long distance, and a phase modulator that can adjust the optical path length at high speed by changing the refractive index of the crystal by the applied voltage Can be used to achieve more accurate and stable timing synchronization for a long time.
  • the repetition frequency of the optical pulse train generated by the first light source is preferably 10 MHz or more, and the repetition frequency of the optical pulse train generated by the first light source is more preferably 38 MHz or more.
  • a first optical pulse train having a first optical frequency As an optical microscope of the present invention, a first optical pulse train having a first optical frequency, and a second optical pulse train having a second optical frequency synchronized in time with the first optical pulse train.
  • the present invention is an optical measurement that performs lock-in detection using a first optical pulse train generated from a first light source and a second optical pulse train generated from a second light source, It can be grasped as an optical measurement characterized in that the repetition frequency of the optical pulse train generated by the first light source is an integral fraction of the repetition frequency of the optical pulse train generated by the second light source.
  • the first optical pulse train and the second optical pulse train having different repetition frequencies for performing lock-in detection are generated from the light sources that generate light having different repetition frequencies, so that the S / N ratio can be increased.
  • Optical measurement that performs lock-in detection at a high frequency is possible with a simple configuration.
  • FIG. 1 is a block diagram showing a schematic configuration of an optical microscope using the stimulated Raman scattering (SRS) effect according to the first embodiment of the present invention.
  • SRS stimulated Raman scattering
  • the stimulated Raman scattering microscope 100 of the present embodiment includes a first light source 1 that generates a first optical pulse train, a second light source 2 that generates a second optical pulse train, and a mirror 3.
  • An irradiation optical system 21 composed of the half mirror 4 and the first objective lens 5, a condensing optical system 22 composed of the second objective lens 7, the filter 8 and the condensing lens 9, and a photodiode 10, which is a light receiving element, It has a lock-in amplifier 11 which is an electronic circuit for synchronously detecting the output signal of the photodiode 10.
  • a sample 6 to be measured is disposed between the first objective lens 5 and the second objective lens 7.
  • a titanium sapphire laser light source is used as the first light source 1 that generates the first optical pulse train of Stokes light ( ⁇ S ).
  • the optical frequency of the laser light is 1000 nm at the center frequency, the pulse width is 200 fs (femtosecond), and the repetition frequency is set to 38 MHz.
  • the second light source 2 that generates the second optical pulse train that is anti-Stokes light ( ⁇ AS ) uses a titanium sapphire laser light source, similar to the first light source, and has an optical frequency up to about 770 nm. It is an appropriate value, the pulse width is 100 fs, and the repetition frequency is 76 MHz.
  • the optical frequency of the second optical pulse train is appropriately adjusted according to the sample to be measured so that the frequency difference with the optical frequency of the first optical pulse train matches the molecular vibration frequency of the sample to be measured. It is.
  • first light source and the second light source are electrically connected. Connected to.
  • first light source and the second light source of the present invention are not limited to this.
  • one light source may be a pulse laser light source and the other may be a parametric oscillator.
  • the repetition frequency of the first optical pulse train generated by the first light source is set to the repetition frequency of the second optical pulse train generated by the second light source.
  • the repetition frequency of the first optical pulse train is f
  • the repetition frequency of the second optical pulse train is 2f.
  • the first optical pulse train generated by the first light source is generated at a timing synchronized with one of the two second optical pulse trains generated by the second light source.
  • the repetition frequency of the first optical pulse train generated by the first light source is set to one third or one quarter of the second optical pulse train repetition frequency generated by the second light source. This is because the number of times of causing the stimulated Raman scattering effect can be maximized, and the molecular vibration image of the sample can be acquired with higher accuracy.
  • the repetition frequency of the first optical pulse train is one half of the repetition frequency of the second optical pulse train.
  • the repetition frequency of the first optical pulse train is set to an integral fraction of the repetition frequency of the second optical pulse train, such as a quarter, it is possible to obtain a molecular vibration image of the sample by the stimulated Raman scattering effect.
  • the present invention is not limited to this, and the repetition frequency is not limited to this.
  • the first optical pulse train having a low value can be used as the anti-Stokes light.
  • the second light pulse train having the repetition frequency 2f generated by the second light source 2 whose direction is changed by the mirror 3 of the irradiation optical system 21 is generated by the first light source 1 by the half mirror 4 of the irradiation optical system 21. It is multiplexed coaxially with the generated first optical pulse train of repetition frequency f.
  • the combined optical pulse train is focused and irradiated on the sample 6 by the first objective lens 5 of the irradiation optical system 21.
  • the first objective lens 5 having a magnification of 40 and a numerical aperture (NA) of 0.6 is used.
  • the repetition frequency of the first optical pulse train having the first optical frequency (first color) is f
  • the repetition frequency of the second optical pulse train having the second optical frequency (second color) is
  • both two-color pulses and only one of the second-color pulses appear alternately every time 1 / 2f.
  • the frequency difference between the first optical frequency and the second optical frequency matches the molecular frequency of the molecule to be measured of the measurement sample 6, stimulated Raman scattering occurs, and both two-color optical pulses are detected. Only when irradiated, intensity modulation of frequency f occurs in the excitation light pulse of the second optical pulse train.
  • the scattered light from the sample 6 is collected by the second objective lens 7 of the condensing optical system 22.
  • the second objective lens 7 in the present embodiment, as in the first objective lens 5, a lens with a magnification of ⁇ 40 and a numerical aperture (NA) of 0.6 is used. Only the second optical pulse train is transmitted from the scattered light collected by the second objective lens 7 by the short pass filter 8 of the condensing optical system 22, and is condensed by the condensing lens 9 of the condensing optical system 22. To do.
  • the light condensed by the condenser lens 9 is photoelectrically converted by the photodiode 10 which is a light receiving element and output as an electric signal.
  • the photodiode 10 which is a light receiving element and output as an electric signal.
  • FIG. 2 shows an example of the output signal of the lock-in amplifier in the stimulated Raman scattering microscope.
  • the horizontal axis indicates the position of the condensing focal point of the combined light of the first optical pulse train and the second optical pulse train
  • the vertical axis is obtained from the lock-in amplifier obtained at the focal position. Indicates the strength of the output signal.
  • a Raman shift that is a frequency difference ( ⁇ AS ⁇ S ) obtained by subtracting the value of the first optical frequency of the first optical pulse train from the value of the second optical frequency of the second optical pulse train. The amount was 3247 cm ⁇ 1 .
  • the left side of FIG. 2 shows the transition of the output signal when only the glass is placed as a sample. As is clear from FIG. 2, the focus is in the air and the focus is in the glass. There is no difference in the output signal when it is located.
  • the right side of FIG. 2 shows an output signal when using a sample in which water is sandwiched between glasses, as compared with the case where the focal point is in the glass part, in the part where water is present in the focal point. It can be seen that the output signal voltage at a certain time increases. This indicates that the non-resonant signal is not generated in the glass, but the stimulated Raman scattering effect due to the OH vibration mode of water can be detected.
  • FIG. 3 shows an example of a molecular vibration image obtained by the stimulated Raman scattering effect by the stimulated Raman scattering microscope.
  • FIG. 3 (a) is a molecular vibration image when the Raman shift amount, which is the frequency difference ( ⁇ AS ⁇ S ), is 3023 cm ⁇ 1, and only polystyrene shines white, and the surrounding water A high-contrast image with a suppressed signal is obtained.
  • the scan size at this time is 10 ⁇ m in length and 10 ⁇ m in width.
  • FIG. 3B is a molecular vibration image when the Raman shift amount, which is the frequency difference ( ⁇ AS ⁇ S ), is 3228 cm ⁇ 1 in the same sample as FIG. In this case, the signal level of the polystyrene beads is lowered, and a signal from water derived from OH vibration appears slightly to lower the overall contrast.
  • the Raman shift amount which is the frequency difference ( ⁇ AS ⁇ S )
  • ⁇ AS ⁇ S the frequency difference
  • FIG. 3C visualizes the CH vibration mode of the plant cell (BY2).
  • FIG. 3C is a two-dimensional molecular vibration image obtained by scanning a range of 40 ⁇ m in length and 40 ⁇ m in width, and the Raman shift amount is set to 3023 cm ⁇ 1 . It can be understood that the signal from the water around the cell is suppressed and the nucleus and the cell wall are clearly visualized.
  • FIG. 3 (d) is a three-dimensional molecular vibration image obtained from the result of acquiring the two-dimensional molecular vibration image shown in FIG. 3 (c) over 40 ⁇ m at intervals of 4 ⁇ m in the optical axis direction.
  • the position of the focal point of the irradiated beam is shifted in the optical axis direction to obtain a plurality of two-dimensional molecular vibration images, so that the molecular structure of the measurement sample can be obtained.
  • a three-dimensional molecular vibration image can be obtained.
  • the molecular state can be detected as a molecular vibration image in real time, so that the state of changes in living cells can be grasped as a moving image.
  • FIG. 4 is a block diagram showing a schematic configuration of an optical microscope 200 according to the second embodiment of the present invention.
  • the optical microscope 200 using the stimulated Raman scattering effect generates a fiber laser 101 as a first light source that generates a first optical pulse train, and a second optical pulse train.
  • a titanium sapphire laser 102 is provided as a second light source.
  • the optical microscope 200 of the present embodiment has a timing difference detection optical system that detects a timing difference between the laser light of the first optical pulse train and the laser light of the second optical pulse train. 1 is different from the optical microscope 100 according to the first embodiment described with reference to FIG.
  • the ultra-short optical pulse laser beam which is the second optical pulse train emitted from the titanium sapphire laser 102 as the second light source, is measured by the half mirror 104 to obtain a measurement light 131 for obtaining a molecular vibration image of the sample 123 to be measured.
  • the timing difference detection light 132 for detecting the timing difference with the ultrashort optical pulse laser beam which is the first optical pulse train emitted from the first light source.
  • the ultrashort optical pulse laser beam emitted from the fiber laser 101 as the first light source also obtains a molecular vibration image of the sample 123 by the half mirror 111. Therefore, the measurement light 141 is separated into a timing difference detection light 142 for detecting a timing difference between the second light pulse train emitted from the second light source.
  • the timing difference detection light 142 of the first optical pulse train emitted from the fiber laser 101 and the timing difference detection light 132 of the second optical pulse train emitted from the titanium sapphire laser 102 are coaxially combined by the dichroic mirror 115. Then, the light is condensed and irradiated to the photodiode 118 through the lens 117.
  • this photodiode 118 in order to detect two-photon absorption of the combined laser beam, for example, there is no light absorption in the near-infrared region, absorption is only in the visible region, and excellent in high-frequency characteristics. It is preferable to use a GaAsP photodiode.
  • the timing difference detection light 142 of the first optical pulse train and the timing difference detection light 132 of the second optical pulse train are collected and irradiated by the lens 117 and the two irradiated laser beams.
  • the photodiode 118 that detects the two-photon absorption current forms a timing difference detection optical system.
  • the measurement light 141 of the first optical pulse train emitted from the fiber laser 101 and the measurement light 131 of the second optical pulse train emitted from the titanium sapphire laser 102 are also coaxially multiplexed by the half mirror 115, After the beam diameter is expanded by the beam expander 121, the light is incident on the entire pupil of the first objective lens 122, collected by the objective lens, and irradiated onto the sample 123 to be measured. Scattered light from the sample 123 passes through the second objective lens 124 and the short pass filter 125, is converted into an electric signal by the photodiode 126 as a light receiving element, and the output signal of the photodiode 126 is synchronously detected by the lock-in amplifier 127. Is done.
  • the laser beam of the first optical pulse train generated by the fiber laser 101 is Stokes light ( ⁇ S ), an appropriate value with a center wavelength of about 1030 nm, and a pulse width of 300 fs.
  • the repetition frequency is set to 38 MHz.
  • the laser light of the second optical pulse train generated by the titanium sapphire laser 102 is anti-Stokes light ( ⁇ AS ), the center wavelength is an appropriate value of about 780 nm, the pulse width is 300 fs, and the repetition frequency is 76 MHz. is there.
  • the wavelengths of the first optical pulse train and the second optical pulse train are matched to the measurement target sample so that the optical frequency difference matches the molecular vibration frequency of the measurement target sample. Adjust as appropriate.
  • the titanium sapphire laser is used as the second light source that generates the laser light of the second optical pulse train having a high repetition frequency.
  • the titanium sapphire laser is set to have a low repetition frequency. This is because it is difficult compared to a fiber laser. Therefore, this is not an essential requirement in the present invention, and a titanium sapphire laser can be used as the first light source and a fiber laser can be used as the second light source as appropriate according to the set repetition frequency. Further, both the first light source and the second light source can be fiber lasers.
  • the repetition frequency of the first optical pulse train generated by the first light source is not a half of the repetition frequency of the second optical pulse train generated by the second light source, but an integral fraction.
  • a good point is that either of the two optical pulse trains may be used as Stokes light and anti-Stokes light, as in the case of the stimulated Raman scattering microscope 100 of the first embodiment.
  • the specification of the optical member may be the same as that of the stimulated Raman scattering microscope 100 of the first embodiment.
  • magnification ⁇ 40 numerical aperture (NA) 0.6 can be used as the first objective lens 122 and the second objective lens 124.
  • NA numerical aperture
  • higher spatial resolution can be obtained by using an objective lens with a magnification of x100 and NA of 1.4.
  • 103, 105, 106, 107, 108, 109, 110, 112, 113, 114, 116, and 120 all indicate mirrors. Needless to say, the specific paths of the first and second ultrashort optical pulse laser beams using these mirrors can be changed as appropriate.
  • FIG. 5 is a block diagram showing a specific configuration example of the fiber laser 101 used in the optical microscope 200 of the present embodiment.
  • the fiber laser 101 used as the first light source in the optical microscope 200 of this embodiment includes an ytterbium-doped fiber 151, a plurality of wave plates 152, a polarization beam splitter 153, a dispersion compensator 154, a variable delay. It consists of a line 155, a phase modulator 156, and an isolator 157.
  • the fiber laser 101 has a configuration in which a variable delay line 155 and a phase modulator 156 as optical path length conversion means are inserted in a resonator of a general mode-locked fiber laser.
  • the ytterbium-doped fiber 151 amplifies an optical pulse having a wavelength of 1.03 ⁇ m.
  • the plurality of wave plates 152 adjust the polarization of incident light and outgoing light of the ytterbium-doped fiber 151.
  • the polarization beam splitter 153 extracts a part of the light pulse inside the fiber laser 101 and outputs it as emission light 158, and performs mode-locking operation by the nonlinear polarization rotation effect in the ytterbium-doped fiber 151.
  • the dispersion compensator 154 is inserted to adjust the group velocity dispersion in the fiber laser 101.
  • the variable delay line 155 and the phase modulator 156 are inserted to adjust the optical path length of the laser resonator and control the repetition frequency.
  • the variable delay line 155 can mechanically adjust the optical path length.
  • the phase modulator 156 is a waveguide device using an electro-optic crystal, and the optical path length can be adjusted by changing the refractive index of the crystal according to the applied voltage. Although the maximum optical path length that can be adjusted is as small as several microns, the phase modulator 156 does not require a mechanical operation, and thus can control the optical path length with high speed of MHz or more.
  • the isolator 157 defines the traveling direction of the optical pulse in the resonator.
  • an optical pulse is generated by a mode-locking operation and circulates to output an optical pulse at a time interval depending on the optical path length in the laser resonator, and the repetition frequency is controlled.
  • An optical pulse train can be obtained.
  • the photocurrent can be detected with a band of 1 MHz or more by detecting it as a voltage value with a load resistance of 300 ⁇ , for example. At this time, it is necessary to obtain a sufficiently large two-photon absorption current in order to suppress the influence of fluctuations such as thermal noise included in the detected signal.
  • the voltage signal indicating the detected timing difference was introduced into the variable delay line 155 and the phase modulator 156 in the resonator of the fiber laser 101 via the loop filter 119. Then, the loop band of the variable delay line 155 was controlled to about 1 Hz and the loop band of the phase modulator 156 was controlled to about 140 kHz so that the voltage signal was constant.
  • variable delay line 155 and the phase modulator 156 are used as the optical path length modulation means.
  • high-speed optical path length control means so that the loop band can be set to 100 kHz or higher.
  • the optical pulse train output from the fiber laser originally has a large jitter, when the timing is controlled using a low-speed element such as a piezo element, a large jitter of about 2 picoseconds remains.
  • FIG. 6 shows the state of the output signal from the photodiode 118 used in the timing difference detection optical system for detecting the synchronization shift of the first and second laser beam pulses in the optical microscope 200 of the present embodiment. ing.
  • the vertical axis represents the output voltage value at the photodiode 118 by two-photon absorption
  • the horizontal axis represents the timing deviation amount of the two laser beam pulses. It can be seen that the highest voltage is obtained when the timings of the two pulses coincide, and that the voltage drops when the timing deviates by more than the pulse time width. This makes it possible to detect timing with high accuracy using two-photon absorption.
  • the laser beam of the first optical pulse train generated by the fiber laser 101 and the second optical pulse train are immediately generated from the change in the output voltage value from the photodiode 118.
  • the timing difference with the laser beam can be detected and used to control the repetition frequency of the fiber laser.
  • the influence of the jitter of an ultrashort optical pulse laser beam can be avoided, and the timing of the ultrashort optical pulse laser beam of two colors can be synchronized with high precision.
  • the two-photon absorption current and the repetition frequency control band are widened, and the loop band is widened, so that the two optical pulse trains can be very easily synchronized. This can be understood as follows.
  • the two-photon absorption current change occurs only when the timings of the two optical pulse trains are close to the pulse time ⁇ T.
  • the optical pulse trains are not synchronized, that is, there is a difference of ⁇ f between twice the repetition frequency f of the first optical pulse train and the repetition frequency 2f of the second optical pulse train.
  • the uncontrolled laser repetition frequency has fluctuations on the order of 1 Hz, which can be considered that ⁇ f changes within about 1 Hz with time.
  • the timing of the two pulse trains is aligned at a time interval of 1 / ⁇ f, and the two-photon absorption current changes accordingly.
  • the time when the two-photon absorption current change occurs is the time when the timings of the two pulses overlap, that is, ⁇ T / T ⁇ f. In order to realize the synchronization, it is necessary to perform timing control within this time.
  • the timing control frequency band is B
  • the time required for timing synchronization is expressed by about 1 / B, so that the inequality 1 / B ⁇ T / T ⁇ f, that is, ⁇ f ⁇ B ⁇ T / T needs to be satisfied.
  • ⁇ T 300 fs
  • T 12 ns
  • B 140 kHz
  • ⁇ f ⁇ 3.5 Hz is obtained. Therefore, by increasing the timing control frequency band B in this way, synchronization by two-photon absorption can be achieved even if there is fluctuation of the order of 1 Hz.
  • B is small
  • the requirement for ⁇ f becomes strict and it is virtually impossible to synchronize the uncontrolled laser. In such a case, it is necessary to perform synchronization by two-photon absorption after performing low-accuracy synchronization in combination with other synchronization methods, which complicates the system.
  • FIG. 7 is a diagram showing a synchronization state of two-color ultrashort optical pulse laser beams in the optical microscope 200 according to the present embodiment.
  • the timing jitter obtained as the deviation of the two-color ultrashort optical pulse laser beam can be about 6.0 fs.
  • the timing jitter when a molecular vibration image is observed with an SRS microscope, it is considered preferable to set the timing jitter to 1/10 or less of the time width of the irradiation light pulse, whereas the optical microscope of the present embodiment.
  • the magnitude of the timing jitter is about 1/100 of the time width of the irradiation light pulse.
  • the optical microscope 200 of the present embodiment detects two-photon absorption with a simple configuration without complicating the measurement system as in the case of detecting a timing difference with a high-speed photodetector,
  • a phase modulator By controlling the repetition frequency of the fiber laser at high speed with a phase modulator, it is possible to obtain a molecular vibration image with a high sensitivity and a high S / N ratio while suppressing the influence of timing jitter.
  • the timing difference detection optical system detects a two-photon absorption current generated by the laser light of the first optical pulse train and the laser light of the second optical pulse train.
  • this does not limit the timing difference detection optical system of the optical microscope of the present invention.
  • a timing difference detection optical system it is possible to detect the timing difference between two colors of ultrashort optical pulse laser beams using sum frequency generation.
  • an optical pulse train of two colors (optical frequencies: ⁇ AS , ⁇ S ) in which the repetition frequency of one optical pulse train is a fraction of the other is collected on a sample.
  • the intensity modulation component of the excitation light pulse having a high repetition frequency is detected by the stimulated Raman scattering phenomenon that occurs when the frequency difference between the two colors coincides with the molecular vibration frequency of the sample at the focal point. Since this stimulated Raman scattering is not affected by the nonlinearity of electrons, the output signal obtained by this microscope does not have a background signal, and a high-contrast molecular vibration image can be obtained.
  • the repetition frequency of the two color light pulse trains is set to one integer, so that the intensity is modulated into one light pulse train as used in the conventional stimulated Raman scattering microscope. Therefore, it is possible to simplify the optical microscope system, and it is possible to perform high-frequency modulation of the irradiation beam, which is advantageous for reducing laser intensity noise and acquiring images with moving images. As a result, an optical microscope capable of obtaining a high-quality moving image with a high S / N ratio, which is a signal-to-noise ratio, can be realized with a simple system.
  • FIG. 8 shows a sample using polystyrene beads in water as a sample.
  • FIG. 8A is a molecular vibration image when the lock-in frequency is 2 MHz
  • FIG. 8B is a molecular vibration image when the lock-in frequency is 10 MHz.
  • the optical power when the molecular vibration image of FIG. 8A was obtained was 5 mW, and the integration time required to obtain the molecular vibration image was 50 ms.
  • the optical power when the molecular vibration image of FIG. 8B was obtained was 0.6 mW, and the integration time required to obtain the molecular vibration image was 2 ms.
  • the molecular vibration image of FIG. 8 (a) having a low lock-in frequency is clearly lower in resolution than the molecular vibration image of FIG. 8 (b) having a high lock-in frequency.
  • the diameter looks large. Further, when the lock-in frequency is increased, the beam irradiation power necessary for obtaining a molecular vibration image is reduced, and the burden on the beam irradiation system is reduced. Furthermore, the time required to obtain a molecular vibration image is shortened, and it can be seen that it is more suitable for acquiring moving images.
  • FIG. 9 shows a plant cell (BY2) used as a sample.
  • FIG. 9A is a molecular vibration image when the lock-in frequency is 2 MHz
  • FIG. 9B is a molecular vibration image when the lock-in frequency is 10 MHz.
  • the optical power when obtaining the molecular vibration image of FIG. 9A is 4.5 mW
  • the integration time required for obtaining the molecular vibration image is 100 ms
  • the light when obtaining the molecular vibration image of FIG. 9B The power was 1 mW
  • the integration time required to obtain a molecular vibration image was 3 ms.
  • the lock-in frequency is 10 MHz or more in order to obtain a molecular vibration image having a certain resolution or higher.
  • the repetition frequency of the optical pulse train having a low repetition frequency may be set to 10 MHz
  • the repetition frequency of the optical pulse train having a high repetition frequency may be set to 20 MHz.
  • the optical power required to obtain a molecular vibration image is about 1 mW. With this level of optical power, no significant burden is placed on the beam irradiation system.
  • the lock-in frequency is 10 MHz or more, the integration time for obtaining the molecular vibration image is about several ms, which is a preferable condition in consideration of acquisition of moving images.
  • FIG. 10 shows the result of measuring the noise component in the lock-in signal in the optical microscope 200 shown as the second embodiment. “Black circles” in FIG. 10 are plots of the measurement result data.
  • the result of measuring the output noise of the lock-in amplifier 127 while changing the intensity of light input to the photodiode 126 is a plot in FIG.
  • the integration time of the lock-in amplifier 127 was set to 0.1 ms.
  • the horizontal axis represents the direct current component of the photocurrent obtained from the photodiode 126.
  • the noise level of the light receiving circuit of the photodiode 126 is indicated by a dotted line a, and the shot noise of the photodiode 126 calculated from the photocurrent is indicated by a solid line b.
  • FIG. 10 shows that the circuit noise is dominant in the region where the photocurrent value is smaller than 10 ⁇ 1 mA shown on the left side in FIG. 10, but the noise increases as the photocurrent increases.
  • the noise voltage of the lock-in signal is proportional to the photocurrent
  • the noise voltage of the lock-in signal is proportional to the square root of the photocurrent.
  • the noise voltage of the lock-in signal is proportional to the square root of the photocurrent in the region where the photocurrent value is larger than 0.2 mA, suggesting that the low noise property of the shot noise limit was obtained.
  • this is presumed to be due to the loss of the bandpass filter circuit included in the photodetection circuit.
  • the result of converting the noise of the above into the experimental conditions of this time is shown as x (B) in the figure.
  • the higher the lock-in frequency the clearer the molecular vibration image can be acquired in a shorter time. it can.
  • This is particularly advantageous for acquiring a moving image that is a molecular vibration image in a moving image, but in order to acquire a molecular vibration image with a photodiode, the limit from the average level of the optical power irradiated to the sample is limited. If the lock-in frequency is too high, the sample may be damaged by the input light energy. For this reason, when setting the lock-in frequency, it is preferable to set an upper limit value as appropriate in consideration of the capability of the light receiving circuit system within a limit that does not cause damage to the sample.
  • the light receiving circuit shown in FIG. 11 was used as the light receiving circuit of the photodiode 126 in order to reduce the noise level of the light receiving circuit (dotted line a in FIG. 10).
  • an inductance L is connected in parallel with the photodiode PD in order to suppress a decrease in frequency characteristics due to the parasitic capacitance of the photodiode PD.
  • the value of the load resistance R connected in parallel was made higher than the load resistance value of 50 ⁇ generally used for high frequency circuits.
  • the parasitic capacitance of the photodiode PD is 20 pF
  • the inductance L is 820 nH
  • the resistance value of the load resistor R is 500 ⁇ .
  • the photodiode PD used in the stimulated Raman scattering microscope tends to have a large light receiving area and a large parasitic capacitance. Therefore, by applying the above countermeasure to the light receiving circuit, The noise level can be reduced.
  • the value of the load resistance R at this time is preferably 100 ⁇ or more. Therefore, it is preferable to set the load resistance value to an appropriate value of 100 ohms or more while taking into account the value of the parasitic capacitance of the photodiode PD and the value of the inductance L to be used.
  • the effect of suppressing the deterioration of the frequency characteristics of the photodiode PD due to the use of the light receiving circuit shown in FIG. 11 as the light receiving circuit of the photodiode PD is not related to the generation process of the optical pulse train irradiated to the sample. is there.
  • the light receiving circuit of the photodiode PD shown in FIG. 11 generates the optical pulse train of the first repetition frequency and the optical pulse train of the second repetition frequency shown in the embodiment of the present invention with different light sources. It can be used not only for an optical microscope but also for a conventional optical microscope shown in Non-Patent Document 1 and Non-Patent Document 2 that modulates one optical pulse train to generate the other optical pulse train, and has a good effect. Can play.
  • the optical microscope of the present invention can simplify the system of the optical microscope and reduce the intensity noise of the laser as compared with the conventional stimulated Raman scattering microscope in which a modulator including an acousto-optic element is indispensable.
  • the molecular vibration image can be reduced and a high S / N ratio can be obtained, and furthermore, it has an excellent practical feature that it is more advantageous to acquire a moving image.
  • the optical microscope of the present invention has been described for detecting stimulated Raman scattering.
  • what can be detected using the configuration of the present invention is not limited to the above stimulated Raman scattering. Absent. For example, by selecting the wavelength of the light pulse so that ⁇ AS + ⁇ S that is the sum frequency of the light pulses of two colors matches the two-photon absorption frequency of the sample, a high-contrast two-photon absorption image can be obtained. Obtainable.
  • the application target of the present invention is limited to the optical microscope.
  • one of the two optical pulse trains having the same repetition frequency is modulated to set the repetition frequency to an integer.
  • Lock-in detection at a high frequency can be performed with a simple configuration.
  • the technical idea of the present invention is not limited to the application to an optical microscope.
  • the noise component of the measurement result is reduced, and the measurement result having a high S / N ratio is obtained.
  • it can be applied to various optical measurements to obtain good results.
  • pump probe measurement etc. can be assumed as such an optical measurement which should apply the technical idea of this invention.
  • the optical microscope of the present invention can be expected to be used in a wide range of fields as an optical microscope capable of forming images of living cells and the like.
  • the present invention can be applied to various optical measurements.

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Abstract

　光源系の複雑化を抑え、レーザーの強度雑音の影響を低減するためなどに変調周波数を高くした場合にも容易に対応できる光学系を備えた光学顕微鏡を得ること。第１の光源により生成された第１の光周波数を有する第１の光パルス列と、前記第１の光パルス列と時間的に同期した、第２の光源により生成された第２の光周波数を有する第２の光パルス列とを試料６に照射し、前記試料６からの散乱光を検出する光学顕微鏡１００であって、前記第１の光源が生成する光パルス列の繰り返し周波数が、前記第２の光源が生成する光パルス列の繰り返し周波数の整数分の一である。

Description

光学顕微鏡、および光学計測
　本発明は、誘導ラマン散乱を用いた分子振動イメージング手法などに適用できる光学顕微鏡、ならびに光学計測に関する。
　ラマン散乱原理を利用した顕微鏡は、分子の振動情報を反映した分子振動イメージング手法として、生体の細胞観察などへの応用が期待されている。
　従来、ラマン散乱を用いた顕微鏡として、自発ラマン散乱顕微鏡とコヒーレント反ストークスラマン散乱（coherent anti-Stokes Raman scattering, ＣＡＲＳ）顕微鏡が知られていた。
　前者では，試料の分子振動周波数だけ励起光が周波数変化することを利用して試料の分光情報を取得するが、得られる信号光が非常に微弱であるため、信号対雑音（Ｓ／Ｎ）比を向上させることが大きな課題であった。一方、後者では、２色（ωＡＳ、ωＳ）の光パルスを用いて励起光と異なる周波数（２ωＡＳ－ωＳ）にＣＡＲＳ光を発生させる。ＣＡＲＳでは分子を強制的に振動させるために、高Ｓ／Ｎ比の信号が得られるという特長がある。しかし、試料の電子の非線形応答に起因する、いわゆる非共鳴信号というものが存在し、これがバックグラウンドとなってしまうため、得られる分子振動イメージのコントラストが低下するという課題があった。
　このように相反する従来のラマン散乱顕微鏡の課題を解決する方法として、誘導ラマン散乱（stimulated Raman scattering、ＳＲＳ）顕微鏡が、発明者ら（非特許文献１参照）およびハーバード大学のSunny Xie ら（非特許文献２参照）から、独立して提案された。
　誘導ラマン散乱顕微鏡の原理は、以下の通りである。
　すなわち、２色（ωＡＳ、ωＳ）の光パルスのうち、一方に強度変調を施した状態で試料に集光照射したとき、２色の周波数差が集光点の試料の分子振動周波数と一致すると、集光点で誘導ラマン散乱という現象が生じる。このとき、強度変調されていない方の励起光パルスに強度変調が生じ、試料から射出される励起光を光検出することにより、誘導ラマン散乱による強度変調分を検出できる。したがって、この誘導ラマン散乱によって生じた強度変調分から、試料の分子振動イメージングが可能となる。
　図１２に、従来の誘導ラマン散乱顕微鏡の、原理確認を行った際のブロック構成図を示す。
　図１２に示すように従来の誘導ラマン散乱顕微鏡５００は、チタンサファイヤレーザー５０１から照射された反ストークス光（ωＡＳ）と、光パラメトリック発振器５０２から照射され、音響光学素子（ＡＯＭ）５０３で強度変調されたストークス光（ωＳ）とを、ダイクロイックミラー５０５を用いて同軸に合波して、対物レンズ５０６を介して試料５０７に集光照射する。このときの散乱光を、対物レンズ５０８，ショートパスフィルタ５０９，集光レンズ５１０を介してフォトダイオード（ＰＤ）５１１とロックインアンプ５１２を用いて検出した。なお、５０４はミラーであり、反ストークス光（ωＡＳ）は、繰り返し周波数が７６ＭＨｚ、中心波長が７６５ｎｍ、パルス幅が１００ｆｓであり、ストークス光（ωＳ）の繰り返し周波数は７６ＭＨｚ、中心波長が９８５～１００５ｎｍ、パルス幅は２００ｆｓであった。また、高周波信号源５１３の周波数は２ＭＨｚとした。
誘導ラマン散乱顕微鏡の原理確認；嶽　文宏、小関泰之、伊東一良、Optics &Photonics Japan 2008，5pC12，2008年11月5日 Chiristian W. Freudiger, Wei Min, Brian G. Saar, Sijia Lu, Gary R. Holtom, Chengwei He, Jason C. Tsai, Jing X. Kang, X. Sunney Xie, "Label-Free Biomedical Imaging with High Sensitivity by Stimulated Raman Scattering Microscopy (誘導ラマン散乱を用いた顕微鏡による非標識の高感度生物医学的画像解析)" SCIENCE VOL322 19 DECEMBER 2008 pp. 1857-1861
　しかしながら、上記従来の誘導ラマン散乱顕微鏡では、光源であるレーザーの強度雑音の影響で、Ｓ／Ｎ比が低下するという問題があった。また、ストークス光を強度変調するための音響光学素子が必要となり、系が複雑化するという問題があった。
　レーザーの強度雑音は高周波ほど少なくなるため、レーザーの強度雑音を低下させるためには、変調周波数を高くすることが有効である。しかし、変調周波数が高くなれば、強度変調を行う音響光学素子への要求が厳しくなり、系の複雑化に関する課題がさらに顕著となってしまう。また、強度変調を行う上での制約から、変調周波数を高くすることに制限があると、高品質の動画のイメージング画像を得ることが困難となる。
　そこで本発明は、上記した従来の課題を解決して、光源系の複雑化を抑え、レーザーの強度雑音の影響を低減するためなどに変調周波数を高くした場合にも容易に対応できる光学系を備えた光学顕微鏡を得ることを目的とする。
　上記課題を解決するために、本発明の光学顕微鏡は、第１の光源により生成された第１の光周波数を有する第１の光パルス列と、前記第１の光パルス列と時間的に同期した、第２の光源により生成された第２の光周波数を有する第２の光パルス列とを試料に照射し、前記試料からの散乱光を検出する光学顕微鏡であって、前記第１の光源が生成する光パルス列の繰り返し周波数が、前記第２の光源が生成する光パルス列の繰り返し周波数の整数分の一であることを特徴とする。
　本発明の光学顕微鏡によれば、従来の光学顕微鏡に用いられていた強度変調のための素子が不要となり、光学顕微鏡の系を簡易化することができ、また、光パルス列の変調周波数を高く設定して、Ｓ／Ｎ比の高いイメージ画像を得ることができる。
本発明の第１の実施形態にかかる光学顕微鏡の概略構成を示すブロック構成図である。 誘導ラマン散乱顕微鏡で得られる誘導ラマン散乱信号の例を示す図である。 誘導ラマン散乱顕微鏡で得られる分子振動イメージの例を示す。図３（ａ）（ｂ）は水の中のポリスチレンビーズの分子振動イメージを、図３（ｃ）（ｄ）は植物細胞の分子振動イメージを、それぞれ示す図である。 本発明の第２の実施形態にかかる光学顕微鏡の概略構成を示すブロック構成図である。 本発明の第２の実施形態にかかる光学顕微鏡で用いられるファイバーレーザーの概略構成を示すブロック図である。 本発明の第２の実施形態にかかる光学顕微鏡での、タイミング差検出光学系に用いられたフォトダイオードからの出力信号の状態を示す図である。 本発明の第２の実施形態にかかる光学顕微鏡での、２色の超短光パルスレーザービームの同期状態を示す図である。 ロックイン周波数が異なる場合に、誘導ラマン散乱顕微鏡で得られる分子振動イメージの違いを示す図である。図８（ａ）は、ロックイン周波数が２ＭＨｚの場合のポリスチレンビーズの分子振動イメージであり、図８（ｂ）は、ロックイン周波数が１０ＭＨｚの場合のポリスチレンビーズの分子振動イメージである。 ロックイン周波数が異なる場合に、誘導ラマン散乱顕微鏡で得られる分子振動イメージの違いを示す図である。図９（ａ）は、ロックイン周波数が２ＭＨｚの場合の植物細胞の分子振動イメージであり、図９（ｂ）は、ロックイン周波数が１０ＭＨｚの場合の植物細胞の分子振動イメージである。 本発明の第２の実施形態にかかる光学顕微鏡で得られる分子振動イメージにおけるロックイン周波数とノイズの大きさとの関係を示す図である。 本発明の第２の実施形態にかかる光学顕微鏡でのフォトダイオード駆動回路の回路構成を示すブロック図である。 従来の誘導ラマン散乱顕微鏡の概略構成を示すブロック構成図である。
　本発明の光学顕微鏡は、第１の光源が生成する第１の光周波数を有する第１の光パルス列と、前記第１の光パルス列と時間的に同期した、第２の光源が生成する第２の光周波数を有する第２の光パルス列とを試料に照射し、前記試料からの散乱光を検出する光学顕微鏡であって、前記第１の光源が生成する光パルス列の繰り返し周波数が、前記第２の光源が生成する光パルス列の繰り返し周波数の整数分の一である。
　このようにすることで、例えば、誘導ラマン散乱顕微鏡に用いた場合には、第１の光周波数と第２の光周波数との周波数差が試料の分子振動周波数に一致した際に、誘導ラマン散乱が生じて試料からの散乱光が強度変調され、この強度変調成分を検出することで試料の分子振動イメージングが可能となる。このため、従来のような強度変調のための素子を用いることなく、簡易な光学顕微鏡の系を有し、光パルス列の変調周波数を高く設定することが容易な誘導ラマン散乱を用いた光学顕微鏡を得ることができる。
　また、本発明の光学顕微鏡において、前記第１の光源が生成する光パルス列の繰り返し周波数が、前記第２の光源が生成する光パルス列の繰り返し周波数の二分の一であることが好ましい。このようにすることで、第１の光パルス列と第２の光パルス列とから、誘導ラマン散乱を最も効果的に生成させることができ、より良好に試料の分子振動イメージが作成できる光学顕微鏡を得ることができる。
　さらに、前記第１の光源と、前記第２の光源と、前記第１の光パルス列と前記第２の光パルス列とを同時に前記試料に照射する照射光学系と、前記試料からの散乱光のうち、前記第１の光パルス列を除去して他を集光する集光光学系と、前記集光光学系で集光された散乱光を電気信号に変換して出力する受光素子と、前記受光素子の出力信号を同期検波する電子回路とを備えることが好ましい。このようにすることで、簡易な系の光学顕微鏡を容易に実現することができる。
　さらにまた、前記第１の光源および前記第２の光源の少なくともいずれか一方がファイバーレーザーであり、前記第１の光パルス列と前記第２の光パルス列のタイミング差を検出するタイミング差検出光学系を備え、前記タイミング差検出光学系からの出力信号に基づいて、前記ファイバーレーザーの共振器内に配置された光路長変調手段を駆動して、前記第１の光パルス列のタイミングと前記第２の光パルス列のタイミングとを整合させることが好ましい。このようにすることで、高精度に、第１の光パルス列のタイミングと第２の光パルス列のタイミングを整合させることができ、Ｓ／Ｎ比の高いクリアな分子振動イメージが得られる光学顕微鏡を実現することができる。
　また、前記タイミング差検出光学系において、前記第１の光パルス列のレーザー光と前記第２の光パルス列のレーザー光が集光照射されて生じる二光子吸収電流を検出することが好ましい。このようにすることで、高い精度で２色の超短光パルスレーザービームのタイミングずれを検出することができる。
　さらに、前記光路長変調手段が、可変遅延線、および、位相変調器であることが好ましい。このようにすることで、光路長を長距離にわたって機械的に調節することができる可変遅延線と、印加される電圧によって結晶の屈折率を変化させることで高速に光路長を調節できる位相変調器を用いて、より高精度かつ長時間安定なタイミング同期を実現できる。
　さらにまた、前記第１の光源が生成する光パルス列の繰り返し周波数が、１０ＭＨｚ以上であることが好ましく、前記第１の光源が生成する光パルス列の繰り返し周波数が、３８ＭＨｚ以上であることがより好ましい。
　また、本発明の光学顕微鏡として、第１の光周波数を有する第１の光パルス列と、前記第１の光パルス列と時間的に同期した、第２の光周波数を有する第２の光パルス列とを試料に照射し、前記試料からの散乱光をフォトダイオードで検出する光学顕微鏡であって、前記フォトダイオードからの出力信号を取得するフォトダイオード駆動回路が、前記フォトダイオードと並列に接続されたインダクタンスと、前記インダクタンスに並列に接続された抵抗値が１００Ω以上の負荷抵抗とを有していることを特徴とする。
　このような構成とすることで、高いロックイン周波数でのイメージ画像の検出において、フォトダイオードの寄生容量による周波数特性の低下を効果的に防止することができる。
　さらに本発明は、第１の光源から生成された第１の光パルス列と、第２の光源から生成された第２の光パルス列とを用いて、ロックイン検出を行う光学計測であって、前記第１の光源が生成する光パルス列の繰り返し周波数が、前記第２の光源が生成する光パルス列の繰り返し周波数の整数分の一であることを特徴とする光学計測として把握することができる。
　このように、ロックイン検出を行う繰り返し周波数が異なる第１の光パルス列および第２の光パルス列が、異なる繰り返し周波数の光を生成する光源から生成されていることで、Ｓ／Ｎ比を高くできる高い周波数でロックイン検出を行う光学計測が、簡易な構成で可能になる。
　以下、本発明の実施形態について図面を参照しながら説明する。
　（第１の実施形態）
　図１は、本発明の第１の実施形態にかかる誘導ラマン散乱（ＳＲＳ）効果を用いた光学顕微鏡の概略構成を示すブロック図である。
　図１に示すように、本実施形態の誘導ラマン散乱顕微鏡１００は、第１の光パルス列を生成する第１の光源１と、第２の光パルス列を生成する第２の光源２と，ミラー３，ハーフミラー４と第１の対物レンズ５からなる照射光学系２１と、第２の対物レンズ７，フィルタ８および集光レンズ９からなる集光光学系２２と、受光素子であるフォトダイオード１０，フォトダイオード１０の出力信号を同期検波する電子回路であるロックインアンプ１１とを有している。
　また、図１に示すように、第１の対物レンズ５と第２の対物レンズ７との間に、測定対象の試料６が配置されている。
　本実施形態の誘導ラマン散乱顕微鏡１００では、ストークス光（ωＳ）の第１の光パルス列を生成する第１の光源１として、チタンサファイヤレーザー光源が用いられている。レーザー光の光周波数は中心周波数が１０００ｎｍ、パルス幅は２００ｆｓ（フェムト秒）で、繰り返し周波数は３８ＭＨｚに設定されている。
　また、反ストークス光（ωＡＳ）である第２の光パルス列を生成する第２の光源２は、第１の光源と同様、チタンサファイヤレーザー光源が用いられていて、光周波数は７７０ｎｍ程度までの適宜の値であり、パルス幅は１００ｆｓで、繰り返し周波数は７６ＭＨｚである。この、第２の光パルス列の光周波数は、第１の光パルス列の光周波数との周波数差が、測定対象試料の分子振動周波数と一致するように、測定対象試料に合わせて適宜調整されるものである。
　なお、本実施形態の誘導ラマン散乱顕微鏡１００では、第１の光源と第２の光源とに、それぞれ別々のパルスレーザー光源を用い、これらのレーザーパルス光源の同期を取るために、両者を電気的に接続している。しかし、本発明の第１の光源および第２の光源はこれに限らず、例えば、一方の光源をパルスレーザー光源、他方をパラメトリック発振器とすることもできる。
　また、本実施形態の誘導ラマン散乱顕微鏡１００では、上記のように、第１の光源で生成される第１の光パルス列の繰り返し周波数を、第２の光源で生成される第２の光パルス列の繰り返し周波数の二分の一としている。以下、本実施形態では、この第１の光パルス列の繰り返し周波数をｆと、また、第２の光パルス列の繰り返し周波数を２ｆとする。このようにすることで、第１の光源で生成される第１の光パルス列は、第２の光源で生成される第２の光パルス列の二つに一つと同期したタイミングで生成されるために、例えば、第１の光源で生成される第１の光パルス列の繰り返し周波数を、第２の光源で生成される第２の光パルス列繰り返し周波数の三分の一や四分の一とする場合と比較して、誘導ラマン散乱効果を引き起こす回数を最も多くすることができて、より高い精度で試料の分子振動イメージの取得が可能となるからである。
　しかし、本発明の誘導ラマン散乱顕微鏡において、第１の光パルス列の繰り返し周波数は、第２の光パルス列の繰り返し周波数の二分の一とすることは、必ずしも必須の要件ではなく、三分の一や四分の一など、第１の光パルス列の繰り返し周波数を第２の光パルス列の繰り返し周波数の整数分の一とすることで、誘導ラマン散乱効果による試料の分子振動イメージの取得が可能となる。
　また、上記本実施の形態では、２つの光パルス列のうち、繰り返し周波数の低い第１の光パルス列を、ストークス光として用いる場合について説明したが、本発明はこれに限られるものではなく、繰り返し周波数の低い第１の光パルス列を、反ストークス光として用いることもできる。
　照射光学系２１のミラー３で向きを変えられた、第２の光源２で生成された繰り返し周波数２ｆの第２の光パルス列は、照射光学系２１のハーフミラー４によって、第１の光源１で生成された繰り返し周波数ｆの第１の光パルス列と同軸に合波される。合波された光パルス列は、照射光学系２１の第１の対物レンズ５によって、試料６に集光照射される。なお、本実施形態では第１の対物レンズ５として、倍率×４０、開口数（ＮＡ）０．６のものを用いた。
　このように、第１の光周波数（１色目の色）を持つ第１の光パルス列の繰り返し周波数をｆ、第２の光周波数（２色目の色）を持つ第２の光パルス列の繰り返し周波数を２ｆとしたとき、時間１／２ｆごとに、２色のパルスの両方と、２色目のパルスの一方のみとが、交互に現れる。このとき、第１の光周波数と第２の光周波数との周波数差が、測定試料６の被測定分子の分子振動数と一致した場合に誘導ラマン散乱が生じ、２色の光パルスの両方が照射された場合にのみ、第２の光パルス列の励起光パルスに周波数ｆの強度変調が生じる。
　この試料６からの散乱光は、集光光学系２２の第２の対物レンズ７で集光される。この第２の対物レンズ７として、本実施形態では第１の対物レンズ５と同様に、倍率×４０、開口数（ＮＡ）０．６のものを用いた。第２の対物レンズ７で集光された散乱光から、集光光学系２２のショートパスフィルタ８によって、第２の光パルス列のみを透過させ、集光光学系２２の集光レンズ９で集光する。
　集光レンズ９で集光された光は、受光素子であるフォトダイオード１０で光電変換され電気信号として出力される。このフォトダイオード１０の出力信号を、電子回路であるロックインアンプ１１によってロックイン周波数をｆとして同期検波することで、誘導ラマン散乱によって生じた光のみを検出することができる。
　図２は、誘導ラマン散乱顕微鏡での、ロックインアンプの出力信号の例を示すものである。
　図２において、横軸は第１の光パルス列と第２の光パルス列とが合波された光の、集光焦点の位置を示し、縦軸はその焦点位置において得られた、ロックインアンプからの出力信号の強さを示している。なお、第２の光パルス列の第２の光周波数の値から、第１の光パルス列の第１の光周波数の値を差し引いた周波数差（ωＡＳ－ωＳ）であるラマンシフト（Raman shift）量は、３２４７ｃｍ－１とした。
　図２中の左側では、試料としてガラスのみをおいた場合の出力信号の推移を示していて、図２から明らかなように、空気中に焦点が位置している場合と、ガラス内に焦点が位置している場合での出力信号の差は生じていない。これに対し、試料としてガラスで水を挟んだものを用いた場合の出力信号を示す、図２の右側では、焦点がガラス部分に有る場合に比べて、焦点に水が存在している部分にあるときの出力信号電圧が大きくなっていることが分かる。これは、ガラス内では非共鳴信号が生じていないが、水のＯＨ振動モードによる誘導ラマン散乱効果が検出できていることを示す。
　ここで、誘導ラマン散乱顕微鏡による、誘導ラマン散乱効果により得られる分子振動イメージの例を図３に示す。
　図３（ａ）は、周波数差（ωＡＳ－ωＳ）であるラマンシフト（Raman shift）量を３０２３ｃｍ－１とした場合の分子振動イメージであり、ポリスチレンのみが白く光っており、周囲の水からの信号は抑制された高コントラストな像が得られる。このときのスキャンサイズは、縦１０μｍ、横１０μｍである。
　図３（ｂ）は、図３（ａ）と同じ試料において、周波数差（ωＡＳ－ωＳ）であるラマンシフト（Raman shift）量を３２２８ｃｍ－１とした場合の分子振動イメージであり、この場合には、ポリスチレンビーズの信号レベルが下がるとともに、ＯＨ振動に由来する水からの信号が若干現れて全体のコントラストが低下する。
　図３（ｃ）は、植物細胞（ＢＹ２）のＣＨ振動モードを可視化したものである。図３（ｃ）は、縦４０μｍ、横４０μｍの範囲をスキャンした二次元の分子振動イメージであり、ラマンシフト（Raman shift）量は３０２３ｃｍ－１とした。細胞の周囲の水からの信号が抑制され、核や細胞壁が明確に可視化されていることが理解できる。
　図３（ｄ）は、図３（ｃ）で示した二次元の分子振動イメージを、光軸方向に４μｍ間隔で４０μｍにわたって取得した結果から得られた三次元の分子振動イメージである。本実施形態の誘導ラマン散乱顕微鏡によれば、このように照射されるビームの焦点の位置を光軸方向にシフトさせて複数の二次元の分子振動イメージを得ることで、測定試料の分子構造の三次元の分子振動イメージを得ることができる。
　また、本実施形態の誘導ラマン散乱顕微鏡では、分子状態をリアルタイムで分子振動イメージとして検出することができるので、生体の細胞の変化する状況を動画像として把握することができる。
　（第２の実施形態）
　次に、本発明の第２の実施形態にかかる誘導ラマン散乱（ＳＲＳ）効果を用いた光学顕微鏡として、２つの光パルス列のタイミングを高精度に整合させて、高いＳ／Ｎ比で分子振動イメージを取得することができる光学顕微鏡の構成例について説明する。
　図４は、本発明の第２の実施形態にかかる光学顕微鏡２００の概略構成を示すブロック図である。
　図４に示すように、本実施形態の誘導ラマン散乱効果を用いた光学顕微鏡２００は、第１の光パルス列を生成する第１の光源としてのファイバーレーザー１０１と、第２の光パルス列を生成する第２の光源としてのチタンサファイヤレーザー１０２を備えている。また、本実施形態の光学顕微鏡２００は、第１の光パルス列のレーザー光と、第２の光パルス列のレーザー光のタイミング差を検出するタイミング差検出光学系を有している点が、上記図１を用いて説明した第１の実施形態にかかる光学顕微鏡１００とは異なっている。
　第２の光源であるチタンサファイヤレーザー１０２から射出された第２の光パルス列である超短光パルスレーザービームは、ハーフミラー１０４によって、測定対象の試料１２３の分子振動イメージを得るための測定光１３１と、第１の光源から射出される第１の光パルス列である超短光パルスレーザービームとのタイミング差を検出するためのタイミング差検出光１３２に分離される。なお、タイミング差を検出する場合に、タイミング差検出光学系に導入されるタイミング差検出光１３２と、試料１２３の分子振動イメージを得るために試料に照射される測定光１３１との時間差を調整するために、測定光１３１の光路長を調整することができるよう、ミラー１０５とミラー１０６の位置が図中矢印Ｐで示す方向に調整可能となっている。
　第１の光源であるファイバーレーザー１０１から射出された第１の光パルス列である超短光パルスレーザービームも、第２の光パルス列と同様に、ハーフミラー１１１によって、試料１２３の分子振動イメージを得るための測定光１４１と、第２の光源から射出される第２の光パルス列とのタイミング差を検出するためのタイミング差検出光１４２に分離される。
　ファイバーレーザー１０１から射出された第１の光パルス列のタイミング差検出光１４２と、チタンサファイヤレーザー１０２から射出された第２の光パルス列のタイミング差検出光１３２とは、ダイクロイックミラー１１５で同軸に合波されて、レンズ１１７を経てフォトダイオード１１８に集光照射される。このフォトダイオード１１８としては、合波されたレーザービームの二光子吸収を検出するために、例えば近赤外領域での光吸収が無く、可視域のみに吸収を有し、また、高周波特性に優れたＧａＡｓＰフォトダイオードを用いることが好ましい。なお、本実施形態では、第１の光パルス列のタイミング差検出光１４２と、第２の光パルス列のタイミング差検出光１３２とを集光照射するレンズ１１７と、照射された２つのレーザー光によって生じる二光子吸収電流を検出するフォトダイオード１１８とが、タイミング差検出光学系を形成する。
　一方、ファイバーレーザー１０１から射出された第１の光パルス列の測定光１４１と、チタンサファイヤレーザー１０２から射出された第２の光パルス列の測定光１３１も、ハーフミラー１１５で同軸に合波されて、ビーム拡張器１２１でビーム径が拡大された後、第１の対物レンズ１２２の瞳全体に入射され、同対物レンズにより集光されて測定対象の試料１２３に照射される。試料１２３からの散乱光は、第２の対物レンズ１２４とショートパスフィルタ１２５を経て、受光素子であるフォトダイオード１２６で電気信号に変換され、フォトダイオード１２６の出力信号をロックインアンプ１２７で同期検波される。
　本実施形態の光学顕微鏡２００では、ファイバーレーザー１０１で生成される第１の光パルス列のレーザー光が、ストークス光（ωＳ）であり、中心波長が１０３０ｎｍ程度の適宜の値、パルス幅が３００ｆｓで、繰り返し周波数が３８ＭＨｚに設定されている。また、チタンサファイヤレーザー１０２で生成される第２の光パルス列のレーザー光が反ストークス光（ωAＳ）であり、中心波長が７８０ｎｍ程度の適宜の値、パルス幅が３００ｆｓで、繰り返し周波数が７６ＭＨｚである。第１の実施形態の光学顕微鏡と同様、第１の光パルス列および第２の光パルス列の波長は、その光周波数差が測定対象試料の分子振動周波数と一致するように、測定対象試料に合わせて適宜調整される。
　本実施形態の光学顕微鏡２００において、チタンサファイヤレーザーを繰り返し周波数の高い第２の光パルス列のレーザー光を生成する第２の光源としたのは、チタンサファイヤレーザーは、繰り返し周波数を低く設定するのがファイバーレーザーと比較して困難であるためである。したがって、このことは本発明における必須の要件ではなく、設定される繰り返し周波数に応じて適宜、第１の光源としてチタンサファイヤレーザーを用い、第２の光源としてファイバーレーザーを用いることができる。また、第１の光源、第２の光源の双方を、ファイバーレーザーとすることもできる。
　なお、第１の光源で生成される第１の光パルス列の繰り返し周波数は、第２の光源で生成される第２の光パルス列の繰り返し周波数の二分の一でなく、整数分の一であればよい点、２つの光パルス列のうち、いずれをストークス光および反ストークス光として用いてもよいことは、上記第１の実施形態の誘導ラマン散乱顕微鏡１００の場合と同様である。
　さらに、光学部材の仕様なども第１の実施形態の誘導ラマン散乱顕微鏡１００と同様でよく、例えば、第１の対物レンズ１２２および第２の対物レンズ１２４として、倍率×４０、開口数（ＮＡ）０．６のものを用いることができる。また、倍率×１００、ＮＡ１．４の対物レンズを用いればより高い空間分解能を得ることができる。
　図４において、１０３，１０５，１０６，１０７，１０８，１０９，１１０，１１２，１１３，１１４，１１６，１２０はいずれもミラーを示している。これらミラーを用いた第１および第２の超短光パルスレーザービーム光の具体的な経路が、適宜変更可能であることは言うまでもない。
　図５は、本実施形態の光学顕微鏡２００で用いられるファイバーレーザー１０１の具体的な構成例を示すブロック図である。
　図５に示すように、本実施形態の光学顕微鏡２００で第１の光源として用いられるファイバーレーザー１０１は、イッテルビウム添加ファイバー１５１，複数の波長板１５２、偏光ビームスプリッター１５３、分散補償器１５４、可変遅延線１５５、位相変調器１５６、アイソレーター１５７から構成されている。このファイバーレーザー１０１の構成は、一般的なモード同期ファイバーレーザーの共振器内に光路長変換手段である可変遅延線１５５および位相変調器１５６を挿入したものである。
　イッテルビウム添加ファイバー１５１は、波長１．０３μｍの光パルスを増幅する。複数個の波長板１５２は、イッテルビウム添加ファイバー１５１の入射光および射出光の偏光を調節する。偏光ビームスプリッター１５３は、ファイバーレーザー１０１内部の光パルスの一部を取り出して射出光１５８とするとともに、イッテルビウム添加ファイバー１５１内の非線形偏波回転効果によるモード同期動作を行う。分散補償器１５４は、ファイバーレーザー１０１内の群速度分散を調節するために挿入される。
　可変遅延線１５５と位相変調器１５６とは、レーザー共振器の光路長を調節し、繰り返し周波数を制御するために挿入されている。可変遅延線１５５は、光路長を機械的に調節することができる。また、位相変調器１５６は、電気光学結晶を用いた導波路型デバイスであり、印加される電圧によって結晶の屈折率を変化させることで光路長を調節できる。位相変調器１５６は、調節可能な最大の光路長が数ミクロンと小さいものの、機械的な動作が不要なため、光路長をＭＨｚ以上の高速性をもって制御することができる。アイソレーター１５７は、共振器内の光パルスの進行方向を規定する。
　このような構成のファイバーレーザー１０１内において、モード同期動作により光パルスが生成され、周回することによって、レーザー共振器内の光路長に依存した時間間隔で光パルスを出力させ、繰り返し周波数の制御された光パルス列を得ることができる。
　図４に示した、同軸に合波された第１の光パルス列のタイミング差検出光１４２と第２の光パルス列のタイミング差検出光１３２とが入射されたフォトダイオード１１８の二光子吸収電流としての光電流は、例えば３００Ωの負荷抵抗で電圧値として検出することで、１ＭＨｚ以上の帯域をもって検出することができる。このとき、検出された信号に含まれる熱雑音等の揺らぎの影響を抑制するために、十分大きな二光子吸収電流を得る必要がある。このためには、２つのパルス列を同軸で合波し、開口数の大きなレンズ、例えば開口数０．５５、倍率５０倍のレンズでフォトダイオードに絞り込むことが有効である。
　この検出されたタイミング差を示す電圧信号を、ループフィルター１１９を介して、ファイバーレーザー１０１の共振器内の可変遅延線１５５と位相変調器１５６に導入した。そして、上記電圧信号が一定となるよう、可変遅延線１５５のループ帯域を１Ｈｚ程度、位相変調器１５６のループ帯域を１４０ｋＨｚ程度として制御した。
　なお、図５で示した本実施形態の光学顕微鏡２００で用いられるファイバーレーザーでは、光路長変調手段として可変遅延線１５５と位相変調器１５６との２つを用いたが、本発明においてこのことは必須の事項ではなく、ファイバーストレッチャーなど、ファイバーレーザー共振器内の光路長を変化させることができる部材であれば、これを光路長変調手段として用いることを排除するものではない。但し、ループ帯域を１００ｋＨｚ以上に設定できるよう、高速な光路長制御手段を用いることが必要となる。例えば、光路長変調手段としてピエゾ素子のみを用いた場合、ループ帯域を１ｋＨｚ以上に高めることは困難である。ファイバーレーザーが出力する光パルス列は元来大きなジッターを有しているため、ピエゾ素子のように低速な素子を用いてタイミング制御する場合は、２ピコ秒程度の大きなジッターが残留する。
　図６は、本実施形態の光学顕微鏡２００における、第１および第２のレーザービームパルスの同期ずれを検出するためのタイミング差検出光学系に用いられたフォトダイオード１１８からの出力信号の状態を示している。
　図６において、縦軸が二光子吸収によるフォトダイオード１１８での出力電圧値を示し、横軸が２つのレーザービームパルスのタイミングずれ量を示したものである。２つのパルスのタイミングが一致したときに最も高い電圧が得られ、また、タイミングがパルス時間幅以上ずれると、電圧が低下する様子が見て取れる。このことから、二光子吸収を用いて高精度なタイミング検出が可能になる。
　本実施形態の光学顕微鏡２００では、２色のレーザービームパルスのタイミングのずれを、そのピーク位置である図６に示すＤｅｌａｙ＝０で検出するのではなく、約７Ｖ／ｐｓの傾きを有する図６中「Ａ」で示した部分で検出することにより、フォトダイオード１１８からの出力電圧値の変化から、直ちに、ファイバーレーザー１０１で生成される第１の光パルス列のレーザービームと第２の光パルス列のレーザービームとのタイミング差を検出し、ファイバーレーザーの繰り返し周波数制御に使用することができる。
　このようにすることで、本実施形態の光学顕微鏡２００では、超短光パルスレーザービームのジッターの影響を回避し、高い精度で２色の超短光パルスレーザービームのタイミングを同期させることができる。
　また、本実施形態の光学顕微鏡では、二光子吸収電流と繰り返し周波数制御の帯域を広くとり、ループ帯域を広くすることで、２つの光パルス列の同期が極めて容易となっている。このことは以下のように理解できる。
　二光子吸収電流変化は、２つの光パルス列のタイミングがパルス時間ΔＴ程度まで近接した場合しか生じない。ここで、光パルス列が同期していない、すなわち、第１の光パルス列の繰り返し周波数ｆの２倍と、第２の光パルス列の繰り返し周波数２ｆの間にΔｆの差がある場合について考える。実際、未制御時のレーザーの繰り返し周波数は１Ｈｚのオーダーの揺らぎを有しており、このことはΔｆが時間とともに約１Ｈｚ以内で変化すると考えることができる。
　このとき、１／Δｆの時間間隔で２つのパルス列のタイミングが揃い、それに伴って二光子吸収電流が変化する。しかし、その二光子吸収電流変化の生じる時間は、２つのパルスのタイミングが重なる時間、すなわちΔＴ／ＴΔｆである。同期を実現するためには、この時間内にタイミング制御を行う必要がある。
　ここで、タイミング制御周波数帯域をＢとすると、タイミング同期に要する時間は約１／Ｂで表されるから、不等式　１／Ｂ＜ΔＴ／ＴΔｆ、すなわちΔｆ＜ＢΔＴ／Ｔが成立する必要がある。ここで、ΔＴを３００ｆｓ、Ｔを１２ｎｓ、Ｂを１４０ｋＨｚとすると、Δｆ＜３．５Ｈｚを得る。従って、このようにタイミング制御周波数帯域Ｂを大きくすることで、１Ｈｚオーダーの揺らぎがあったとしても、二光子吸収による同期が達成できる。一方、Ｂが小さい場合には、Δｆに対する要求条件は厳しくなり、未制御時のレーザーを同期させることは事実上不可能である。このような場合、他の同期手法を併用して低精度な同期を行った上で二光子吸収による同期を行う必要があり、系が複雑化する。
　図７は、本実施形態にかかる光学顕微鏡２００での２色の超短光パルスレーザービームの同期状態を示す図である。
　図７に示すように、本実施形態の光学顕微鏡２００では、２色の超短光パルスレーザービームの偏差として得られるタイミングジッターを、約６．０ｆｓにすることができる。一般的に、ＳＲＳ顕微鏡で分子振動イメージを観察する場合には、タイミングジッターを照射光パルスの時間幅の１０分の１以下とすることが好ましいと考えられるのに対し、本実施形態の光学顕微鏡２００では、タイミングジッターの大きさは、照射光パルスの時間幅の１００分の１程度が実現できている。
　以上説明したように、本実施形態の光学顕微鏡２００では、高速光検出器でタイミング差を検出する場合のように測定系を複雑化させることなく、簡素な構成で２光子吸収を検出するとともに、ファイバーレーザーの繰り返し周波数を位相変調器で高速制御することにより、タイミングジッターの影響を抑えた高感度でかつ高いＳ／Ｎ比での分子振動イメージを得ることができる。
　なお、上記本発明の第２の実施形態では、タイミング差検出光学系で、第１の光パルス列のレーザー光と第２の光パルス列のレーザー光とによって生じる二光子吸収電流を検出する場合について説明したが、これは、本発明の光学顕微鏡のタイミング差検出光学系を限定するものではない。例えば、タイミング差検出光学系として、和周波発生を用いて２色の超短光パルスレーザービームのタイミング差を検出することもできる。
　以上のように、本発明の光学顕微鏡によれば、一方の光パルス列の繰り返し周波数をもう一方の整数分の一とした２色（光周波数：ωＡＳ，ωＳ）の光パルス列を試料に集光照射した時に、２色の周波数差が、集光点の試料の分子振動周波数と一致したときに生じる誘導ラマン散乱現象によって、繰り返し周波数の高い励起光パルスの強度変調成分を検出する。この、誘導ラマン散乱は電子の非線形性の影響を受けないため、本顕微鏡で得られる出力信号には、バックグラウンド信号が存在せず、高コントラストな分子振動イメージを得ることができる。
　そして、本顕微鏡では、２色の光パルス列の繰り返し周波数を、一方が他方の整数分の一とすることによって、従来の誘導ラマン散乱顕微鏡で用いられていたような、一方の光パルス列に強度変調を与える音響光学素子などが不要となり、光学顕微鏡の系を簡易化でき、かつ、レーザーの強度雑音低減や動画でのイメージ取得により有利な、照射ビームの高周波変調が可能となる。この結果、簡易な系でありながら、信号対雑音の比率であるＳ／Ｎ比の高い、かつ、高品質の動画像を得ることができる光学顕微鏡を実現することができる。
　ここで、誘導ラマン散乱顕微鏡において、ロックイン周波数と、得られる分子振動イメージとの関係について説明する。
　図８、および、図９は、いずれも誘導ラマン散乱顕微鏡により得られた、試料の分子振動イメージである。
　図８は、試料として水中のポリスチレンビーズを用いたものである。図８（ａ）が、ロックイン周波数が２ＭＨｚの場合の分子振動イメージであり、図８（ｂ）が、ロックイン周波数が１０ＭＨｚの場合の分子振動イメージである。なお、図８（ａ）の分子振動イメージを得たときの光パワーは５ｍＷ、分子振動イメージを得るために要した積算時間は５０ｍｓであった。また、図８（ｂ）の分子振動イメージを得たときの光パワーは０．６ｍＷ、分子振動イメージを得るために要した積算時間は２ｍｓであった。
　ロックイン周波数の低い図８（ａ）の分子振動イメージは、ロックイン周波数の高い図８（ｂ）の分子振動イメージよりも明らかに解像度が低く、得られたイメージ画像の周囲がぼやけてビーズの直径が大きく見えてしまっている。また、ロックイン周波数が高くなると、分子振動イメージを得るために必要なビーム照射パワーが小さくなり、ビーム照射系に対する負担が少なくなる。さらに、分子振動イメージを得るために要する時間も短くなり、動画像の取得にもより適していることがわかる。
　図９は、試料として植物細胞（ＢＹ２）を用いたものである。図９（ａ）が、ロックイン周波数が２ＭＨｚの場合の分子振動イメージであり、図９（ｂ）が、ロックイン周波数が１０ＭＨｚの場合の分子振動イメージである。図９（ａ）の分子振動イメージを得たときの光パワーは４．５ｍＷ、分子振動イメージを得るために要した積算時間は１００ｍｓ、図９（ｂ）の分子振動イメージを得たときの光パワーは１ｍＷ、分子振動イメージを得るために要した積算時間は３ｍｓであった。
　図８と同様に、図９（ａ）および図９（ｂ）の分子振動イメージからも、ロックイン周波数が高いほど得られる分子振動イメージの信号対雑音比が高く、また、画像のコントラストも良好であり、植物細胞の詳細な様子が把握できることが分かる。また、図９（ａ）および図９（ｂ）を得るためのデータから、ロックイン周波数が高いほど、分子振動イメージを得るための光パワーや積算時間が少なくてすむことが分かる。
　以上より、本実施形態として示した誘導ラマン散乱顕微鏡において、一定以上の解像度の分子振動イメージを得るためには、ロックイン周波数が１０ＭＨｚ以上あることが好ましいことが分かる。ロックイン周波数を１０ＭＨｚとするためには、繰り返し周波数の低い光パルス列の繰り返し周波数を１０ＭＨｚ、繰り返し周波数の高い光パルス列の繰り返し周波数を２０ＭＨｚとすればよい。また、ロックイン周波数を１０ＭＨｚ以上とすると、分子振動イメージを得るために必要な光パワーが１ｍＷ程度で済み、この程度の光パワーであれば、ビーム照射系に大きな負担がかからない。さらに、ロックイン周波数を１０ＭＨｚ以上とすると、分子振動イメージを得るための積算時間が数ｍｓ程度となることから、動画像の取得を考慮する意味でも好ましい条件といえる。
　次に、本実施形態として示した誘導ラマン散乱顕微鏡で得られたロックイン信号に含まれるノイズレベルと、イメージ受光部としてのフォトダイオードで得られる出力電流の大きさとの関係について、図１０を用いて説明する。
　図１０は、上記第２の実施形態として示した光学顕微鏡２００における、ロックイン信号中のノイズ成分を測定した結果を示すものである。図１０中の「黒丸」が、測定結果データのプロットである。
　図４に示した光学顕微鏡２００において、チタンサファイヤレーザー１０２とファイバーレーザー１０１を同期させた状態で、チタンサファイヤレーザー光のみをフォトダイオード１２６に導入した。このとき、ファイバーレーザー光は、光フィルタ１２５により除去されている。フォトダイオード１２６の出力信号を、ロックインアンプ１２７に入力し、ファイバーレーザー１０１から得られる繰り返し周波数３８ＭＨｚの電気信号を、ロックインアンプ１２７の参照信号として用いた。
　そして、フォトダイオード１２６に入力する光の強度を変化させながら、ロックインアンプ１２７の出力雑音を測定した結果が、図１０中のプロットである。なお、ロックインアンプ１２７の積分時間は０．１ｍｓとした。
　図１０において、横軸はフォトダイオード１２６から得られた光電流の直流成分を表している。また、フォトダイオード１２６の受光回路の雑音レベルを点線ａで、光電流から計算されるフォトダイオード１２６のショット雑音を実線ｂで示した。
　図１０より、図１０中左側に示す、光電流値が１０－１ｍＡよりも小さい領域では回路の雑音が支配的であるが、光電流が大きくなるにつれて雑音が増大することがわかる。ここで、チタンサファイヤレーザー光がショット雑音以上の過剰雑音を有する場合、ロックイン信号の雑音電圧は光電流に比例すること、また、チタンサファイヤレーザー光がショット雑音限界の低雑音性を有する場合、ロックイン信号の雑音電圧は光電流の平方根に比例することが知られている。
　実験では、ロックイン信号の雑音電圧は、光電流値が０．２ｍＡより大きい領域において、光電流の平方根に比例しており、ショット雑音限界の低雑音性が得られたことを示唆している。なお、この光電流値が０．２ｍＡより大きい領域のプロットを結ぶ実線ｃと、ショット雑音の理論値を示す実線ｂとの間には、図中ｙとして示した約１．６ｄＢの差があるが、これは光検出回路に含まれるバンドパスフィルタ回路の損失に起因すると推察される。
　また、チタンサファイヤレーザーと光パラメトリック発振器により繰り返し周波数７６ＭＨｚの光パルスを得て、後者に対して光変調器を用いて１０．７ＭＨｚの光変調を行い、ロックイン検出を行ったシステムにおけるロックイン信号の雑音を、今回の実験条件に換算した結果を図中×（Ｂ）として示した。
　図１０より、従来の雑音レベルＢと比較して、ロックイン周波数を３８ＭＨｚと高周波化したことにより、雑音レベルを図中ｘとして示すように１２ｄＢ以上抑制することができた。この結果からも、ロックイン周波数の高周波化による低雑音化の有効性が確認できた。図１０の実験データから明らかなように、ロックイン周波数を３８ＭＨｚとすることで、ロックイン信号のノイズレベルを受光素子であるフォトダイオード１２６のショット雑音レベルにまで低減できることから、ロックイン周波数を３８ＭＨｚ以上とすることで、極めてノイズレベルの小さな分子振動イメージが取得できることが分かる。
　なお、実際に取得された分子振動イメージと、ノイズレベルについての実験データから確認できたように、ロックイン周波数が高くなるほど、より短時間でより鮮明な分子振動イメージを取得することができることが理解できる。このことは、特に、動画での分子振動イメージである動画像の取得にとって有利なものとなるが、フォトダイオードで分子振動イメージを取得するにはサンプルに照射される光パワーの平均レベルからの限界があり、ロックイン周波数を高くしすぎると投入された光エネルギーによるサンプルの損傷を引き起こす可能性がある。このため、ロックイン周波数の設定に当たっては、サンプルの損傷を起こさない限度において、受光回路系の能力を勘案した上で、適宜上限値を設定することが好ましい。
　なお、図１０のデータを得るに当たっては、受光回路の雑音レベル（図１０における点線ａ）を低減するために、フォトダイオード１２６の受光回路として、図１１に示すものを用いた。
　図１１に示すように、雑音レベルを低減する受光回路としては、フォトダイオードＰＤの寄生容量による周波数特性の低下を抑えるために、フォトダイオードＰＤと並列にインダクタンスＬを接続し、かつ、インダクタンスＬと並列に接続される負荷抵抗Ｒの値を、高周波回路に一般的に用いられる負荷抵抗値５０Ωよりも高くした。
　図１０のデータを取得するための具体的な回路の一例としては、フォトダイオードＰＤの寄生容量が２０ｐＦ、インダクタンスＬが８２０ｎＨ、負荷抵抗Ｒの抵抗値を５００Ωとした。本実施形態の光学顕微鏡２００のように、誘導ラマン散乱顕微鏡に用いられるフォトダイオードＰＤは、受光面積が大きく寄生容量が大きくなりがちであるため、上記のような対策を受光回路に施すことで、雑音レベルを低減することができる。なお、このときの負荷抵抗Ｒの値としては、１００Ω以上であることが好ましいと考えられる。したがって、フォトダイオードＰＤの寄生容量の数値と用いるインダクタンスＬの値とを勘案しながら、負荷抵抗の値を１００オーム以上の適宜な値とすることが好ましい。
　また、フォトダイオードＰＤの受光回路として、図１１に示したものを用いることによるフォトダイオードＰＤの周波数特性の低下を抑える効果は、試料に照射される光パルス列の生成経緯には関係のないものである。このため、図１１に示したフォトダイオードＰＤの受光回路は、上記本発明の実施形態として示した、第１の繰り返し周波数の光パルス列と第２の繰り返し周波数の光パルス列とを異なる光源で生成する光学顕微鏡のみならず、非特許文献１および非特許文献２に示された、一方の光パルス列を変調して他方の光パルス列を生成する従来の光学顕微鏡にも用いることができ、良好な効果を奏することができる。
　上記検討したように、本実施形態の光学顕微鏡においてより高い解像度の分子振動イメージを得る上では、ロックイン周波数を高くすることが極めて有利であることが理解できる。本発明の光学顕微鏡によれば、２色の光パルス列の繰り返し周波数を、一方が他方の整数分の一の繰り返し周波数を持つ２つの光源により生成することで、ロックイン周波数の高周波化に容易に対応することができる。このため、本発明の光学顕微鏡は、音響光学素子をはじめとする変調器が不可欠な、従来の誘導ラマン散乱顕微鏡と比較して、光学顕微鏡の系を簡易化でき、かつ、レーザーの強度雑音が低減できてＳ／Ｎ比の高い分子振動イメージを得ることができ、さらに、動画像の取得がより有利となるという、実用面での優れた特徴を有している。
　以上、上記実施の形態では、本発明の光学顕微鏡として、誘導ラマン散乱を検出するものについて説明したが、本発明の構成を用いて検出できるのは、上記の誘導ラマン散乱に限られたものではない。例えば、他にも、２色の光パルスの和周波数であるωＡＳ＋ωＳが試料の２光子吸収周波数と一致するように光パルスの波長を選択することにより、高コントラストな２光子吸収像を得ることができる。
　また、上記実施形態では、本発明の適用対象を光学顕微鏡に限定して説明してきた。しかし、第２の光パルス列の繰り返し周波数の整数分の１の繰り返し周波数を有する第１の光パルス列を生成するに当たり、同じ繰り返し周波数の２つの光パルス列のうちの一方を変調して繰り返し周波数を整数分の１とする方法に比べ、一方の生成する光パルス列の繰り返し周波数が、他方の生成する光パルス列の繰り返し周波数の整数分の１である２つの光源を用いる本願発明の方法によれば、より高い周波数でのロックイン検出を簡易な構成で行うことができる。
　したがって、本発明の技術思想は、光学顕微鏡への適用に留まるものではなく、高い周波数でのロックイン検出を行うことで、測定結果のノイズ成分が低減され、Ｓ／Ｎ比の高い測定結果が得られる点で、各種の光学計測に適用して良好な結果を得ることができるものである。なお、このような、本発明の技術思想を適用すべき光学計測として、たとえばポンププローブ計測などが想定できる。
　以上説明したように、本発明の光学顕微鏡は、生体細胞などの画像イメージ化ができる光学顕微鏡として、幅広い分野での用途が期待できる。また、本発明は、さまざまな光学計測に応用展開ができる。

Claims (10)

  1. 　第１の光源により生成された第１の光周波数を有する第１の光パルス列と、
    　前記第１の光パルス列と時間的に同期した、第２の光源により生成された第２の光周波数を有する第２の光パルス列とを試料に照射し、
    　前記試料からの散乱光を検出する光学顕微鏡であって、
    　前記第１の光源が生成する光パルス列の繰り返し周波数が、前記第２の光源が生成する光パルス列の繰り返し周波数の整数分の一であることを特徴とする光学顕微鏡。
  2. 　前記第１の光源が生成する光パルス列の繰り返し周波数が、前記第２の光源が生成する光パルス列の繰り返し周波数の二分の一である請求項１に記載の光学顕微鏡。
  3. 　前記第１の光源と、前記第２の光源と、
    　前記第１の光パルス列と前記第２の光パルス列とを同時に前記試料に照射する照射光学系と、
    　前記試料からの散乱光のうち、前記第１の光パルス列を除去して他を集光する集光光学系と、
    　前記集光光学系で集光された散乱光を電気信号に変換して出力する受光素子と、
    　前記受光素子の出力信号を同期検波する電子回路とを備えた請求項１または２に記載の光学顕微鏡。
  4. 　前記第１の光源および前記第２の光源の少なくともいずれか一方がファイバーレーザーであり、
    　前記第１の光パルス列と前記第２の光パルス列のタイミング差を検出するタイミング差検出光学系を備え、
    　前記タイミング差検出光学系からの出力信号に基づいて、前記ファイバーレーザーの共振器内に配置された光路長変調手段を駆動して、前記第１の光パルス列のタイミングと前記第２の光パルス列のタイミングとを整合させる請求項３に記載の光学顕微鏡。
  5. 　前記タイミング差検出光学系において、前記第１の光パルス列のレーザー光と、前記第２の光パルス列のレーザー光が集光照射されて生じる二光子吸収電流を検出する請求項４に記載の光学顕微鏡。
  6. 　前記光路長変調手段が、可変遅延線、および、位相変調器である請求項４または５に記載の光学顕微鏡。
  7. 　前記第１の光パルス列の繰り返し周波数が、１０ＭＨｚ以上である請求項１～６のいずれか１項に記載の光学顕微鏡。
  8. 　前記第１の光パルス列の繰り返し周波数が、３８ＭＨｚ以上である請求項７に記載の光学顕微鏡。
  9. 　第１の光周波数を有する第１の光パルス列と、前記第１の光パルス列と時間的に同期した、第２の光周波数を有する第２の光パルス列とを試料に照射し、前記試料からの散乱光をフォトダイオードで検出する光学顕微鏡であって、
    　前記フォトダイオードからの出力信号を取得するフォトダイオード駆動回路が、前記フォトダイオードと並列に接続されたインダクタンスと、前記インダクタンスに並列に接続された抵抗値が１００Ω以上の負荷抵抗とを有していることを特徴とする光学顕微鏡。
  10. 　第１の光源から生成された第１の光パルス列と、第２の光源から生成された第２の光パルス列とを用いてロックイン検出を行う光学計測であって、
    　前記第１の光源が生成する光パルス列の繰り返し周波数が、前記第２の光源が生成する光パルス列の繰り返し周波数の整数分の一であることを特徴とする光学計測。
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