JP2002520612A

JP2002520612A - 非線形振動顕微鏡法

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Publication number: JP2002520612A
Application number: JP2000560422A
Authority: JP
Inventors: ハルトム，ゲイリー・アール; シィエ，シィアオリアン・スンニー; ツムブッシュ，アンドレーアス
Original assignee: バッテル・メモリアル・インスティチュート
Priority date: 1998-07-20
Filing date: 1999-07-20
Publication date: 2002-07-09
Also published as: US6108081A; WO2000004352A1; EP1099100A1; CA2338291A1

Abstract

(57)【要約】本発明はコヒーレント反ストークスラマン散乱又は総周波数発生を使用する顕微鏡振動作像のための方法及び装置である。空間解像度はサンプル上の光学尋問ビームのスポット寸法を最小にすることにより達成される。スポット寸法の最小化は、ａ）サンプル上に焦点スポットを提供する顕微鏡対物レンズを通して少なくとも２つの実質上同軸のレーザービーム（尋問ビーム）を導くこと；ｂ）サンプルを通過した後の少なくとも２つの同軸のレーザービームから残留ビームと一緒に信号ビームを収集すること；ｃ）残留ビームを除去すること；ｄ）信号ビームを検出して、画素を生じさせること；に頼る。方法は、一層小さな平均励起パワーで、ＩＲ顕微鏡法よりも顕著に高い空間解像度及び自然ラマン顕微鏡法よりも一層高い感度を有する。

Description

【発明の詳細な説明】

【０００１】発明の分野本発明は非線形振動顕微鏡法による画像画素の取得に関する。

【０００２】発明の背景三次元光学作像のための２光子蛍光顕微鏡法（米国特許第５，０３４，６１３
号）及び共焦点顕微鏡法（原本及び特許としてバリー・マスター(Barry Master)
により編集された１９９６年発行の「共焦点顕微鏡法」なる名称のＳＰＩＥマイ
ルストーン・シリーズ(SPIE Milestone Series) ＩＳＢＮ０−８１９４−２３
７２−６参照）は、多くの専門分野、特に細胞生物学に顕著な影響を及ぼすよう
になっている。蛍光顕微鏡法は固有の蛍光発光又は蛍光染料での着色のいずれか
を必要とする。これら両方の方法は普遍性に乏しく、染料の付加は生物学的試料
の特性に影響を及ぼす。共焦点顕微鏡法においては、光学経路内のピンホールが
小さな焦点容積素子に対する検出を制限し、信号背景を有効に減少させ、画像の
コントラストを改善する。２光子顕微鏡法においては、パルスレーザー源からの
２つの光子が同時に吸収されるような非線形プロセスのために、励起容積が制限
される。これら両方の技術は三次元画像の再構築を許容する。

【０００３】蛍光を発光しないか又はラベル分類(labeling)を許容できないかのいずれかで
ある化学種又は細胞素子に対しては、赤外（ＩＲ）顕微鏡法又は自然ラマン顕微
鏡法を使用できる。これらの場合において、振動分光学がコントラストメカニズ
ムを提供する。顕微鏡においてＩＲ光の吸収を使用する直接作像が使用されてい
る。しかし、この技術の空間解像度は、使用する光の波長が長いため、低い（〜
１０μｍ）。生物学的サンプルの三次元自然ラマン顕微鏡法は、「共焦点ラマン
顕微分光学による生きた細胞及び染色体の研究」（Ｎａｔｕｒｅ３４７，３０１
−３０３（１９９０年））としてＰｕｐｐｅｌｓ，Ｇ．Ｊ．、ｄｅＭｕｌ，Ｆ
．Ｆ．Ｍ．、Ｏｔｔｏ，Ｃ．、Ｇｒｅｖｅ，Ｊ．、Ｒｏｂｅｒｔ−Ｎｉｃｏｕｄ
，Ｍ．、Ａｒｎｄｔ−Ｊｏｖｉｎ，Ｄ．Ｊ．及びＪｏｖｉｎ，Ｔ．Ｍ．により報
告され、「共焦点直接作像ラマン顕微鏡：生物学における設計及び応用」（Ｓｐ
ｅｃｔｒｏｓｃ．，５２，３４８−３５５（１９９８年））としてＳｉｊｔｓｅ
ｍａ，Ｎ．Ｍ．、Ｗｏｕｔｅｒｓ，Ｓ．Ｄ．、ＤｅＧｒａｕｗ，Ｃ．Ｊ．、
Ｏｔｔｏ，Ｃ．及びＧｒｅｖｅ，Ｊ．により報告されたような共焦点顕微鏡によ
り論証された。本質的に弱いラマン信号は大きなレーザーパワー（典型的には１
０ｍＷ以上）を必要とし、サンプルの蛍光背景にしばしば飲み込まれる。

【０００４】振動分光学について２つの非線形技術が論証されている。第１の技術は、例え
ば、ＳＨｅｎ，Ｙ．Ｒ．による「非線形光学の原理（ニューヨークのジョンウイ
リー・アンド・サンズ社(John Wiley & Sons Inc.)、１９８４年）（２６７−
２７５）に記載されたコヒーレント反ストークスラマン散乱（ＣＡＲＳ）であり
、振動分光情報を含んだ非線形４波混合プロセスである。このプロセスを図１Ａ
（従来技術）に略示する。ＣＡＲＳ分光学に対しては、ωｐ及びωｓの中心周波
数をそれぞれ有するポンプレーザー及びストークスレーザービームが空間的に重
ねられる。周波数差Ｖ_p−Ｖ_sがサンプルの振動遷移の周波数と一致したとき、Ｖ _as ＝２Ｖ_p−Ｖ_sでの強力なＣＡＲＳ信号が位相整合条件（図１Ａ）により決定さ
れた方向において発生する。感知された信号Ｉ_ASの強度は、分子項χ⁽³⁾の二乗
係数×ポンプ強度Ｉ_Pの二乗×ストークス波強度Ｉ_Sに比例する。

【０００５】Ｉ_AS＝Ｉ_P ²・Ｉ_S・｜χ⁽³⁾｜² χ⁽³⁾はある分子振動周波数での共振増強のための項を含む。プロセスがレーザ
ーパワーにおいては三次であるから、信号は高励起強度でのみ有効に発生する。
それ故、１０^-15秒（フェムト秒）又は１０^-12秒（ピコ秒）の光パルスから容易
に入手できる高ピークパワーを使用するのが有利である。

【０００６】米国特許第４，４０５，２３７号明細書は生きたサンプル内の細胞成分を顕微
鏡作像又は観察するためのコヒーレント反ストークスラマン分光装置を述べてい
る。その提案された体系においては、２つの平行だが重ならないレーザービーム
は共通の焦点スポットに合焦される。２つのレーザービームはＭＤＤｕｎｃａ
ｎ，ＪＲｅｉｎｔｊｅｓ，ＴＪＭａｎｕｃｃａｉａによる光学書簡「コ
ヒーレント反ストークスラマン顕微鏡の走査」（第７巻、Ｎｏ．８、１９８２年
８月）に報告されているような５６５−６２０ｎｍ及び６２０−７００ｎｍの波
長にそれぞれ調整できる２つのレーザーにより提供される。これらは位相整合状
態で信号ビームを収集し、検出する。しかし、この場合、２つのビームの円錐角
は小さく、これは、焦点スポットの寸法が大きく（１９８２年のＤｕｎｃａｎ等
によると１０ミクロン）、空間解像度が小さいことを意味する。これは共焦点構
成ではなく、それ故、高解像度の三次元断面切り(sectioning)能力を達成できな
かった。更に、ＣＡＲＳ顕微鏡法の感度は非共振背景信号により制限された。非
共振背景信号の大きさは励起レーザーの波長に依存する。可視波長レーザーでは
、ＣＡＲＳ信号は非共振背景信号により支配される。これらの固有の困難性はこ
の提案された体系の実験的な論証及び応用を制限していた。

【０００７】Ｚｈａｏ等による論説「波混合近視野光学増幅器：生物学、化学及び物質科学
における非線形ＮＦＯのための理論的な可能性の研究」（Ｅｌｓｅｖｉｅｒ，Ｕ
ｌｔｒａｍｉｃｒｏｓｃｏｐｙ６１（１９９５年）６９−８０）は、コヒーレン
ト反ストークスラマン分光学を含む非線形分光学を取り扱うために近視野光学を
使用する方法を述べている。ＺＨａｏ等は、両者共にサンプル板に衝突する第１
の周波数での第１のレーザー光及び第２の周波数での第２のレーザー光との波混
合を提案した。第１のレーザー光がアパーチュアプローブから出現し、第２のレ
ーザー光が非垂直角で入射するような状況に対して可能性が検討された。回折限
界を越える高空間解像度のために意図された近視野ＣＡＲＳのためのこの形状は
プローブサンプル距離を規制するフィードバック装置を必要とし、いまだ実験的
に論証されていない。

【０００８】第２の非線形振動分光技術は、例えば、Ｓｈｅｎ，Ｙ．Ｒ．による「非線形光
学の原理」（ニューヨークのジョンウイリー・アンド・サンズ社(John Wiley &
Sons Inc.)、１９８４年）（６７−８５）に記載されたような和周波数発生（Ｓ
ＦＧ）である。和周波数発生は、共通の地点に合焦されるＶ_s及びＶ_pの周波数を
有する２つの入射レーザービームを必要とし、Ｖ_sf＝Ｖ_s＋Ｖ_pの新たな周波数を
発生させ、Ｖ_sが分子振動と共振したときに振動コントラストを提供する非線形
プロセスである。エネルギ図式(diagram) 及び位相整合図式を図１Ｂに示す。Ｃ
ＡＲＳからのＳＦＧの区別は、（１）ＳＦＧプロセスがχ⁽²⁾効果であり、各入
射ビームの強度に線形的に依存すること、（２）振動に対するＳＦＧの感度は、
その周波数（Ｖ₁）がサンプルの振動遷移の周波数と共振するように、レーザー
の１つが赤外（ＩＲ）であることを必要とすること、（３）ＩＲビームがサンプ
ルにより吸収されること、及び（４）他の手段によっては一般に得られない表面
特殊情報にとって極めて有用である信号ビームがその表面でのみ発生すること、
を含む。ＳＦＧでの顕微鏡法は論証されていない。

【０００９】他のコヒーレント４波混合プロセスである第３調波発生での作像は、Ｂａｒａ
ｄ，Ｙ．、Ｅｉｓｅｎｂｅｒｇ，Ｈ．、Ｈｏｒｏｗｉｔｚ，Ｍ．及びＳｉｌｂｅ
ｒｂｅｒｇ，Ｙ．による「第３調波発生による非線形走査レーザー顕微鏡法」（
Ａｐｐｌ．Ｐｈｙｓ．Ｌｅｔｔ．７０，９２２−９２４（１９９７年））、及び
、Ｍｕｌｌｅｒ，Ｍ．、Ｓｑｕｉｅｒ，Ｊ．、Ｗｉｌｓｏｎ，Ｋ．Ｒ．及びＢｒ
ａｋｅｎｈｏｆｆＧ．Ｊ．による「第３調波発生を使用する透明物体の三次元
顕微鏡法」（Ｊ．Ｍｉｃｒｏｓｃ．，１９１，２６６（１９９８年））により論
証されている。この技術は、信号が三次分極率χ⁽³⁾に依存する点で、ＣＡＲＳ
顕微鏡法に類似するが、これが振動特性に特に敏感でないχ⁽³⁾への電子的な寄
与を探る点で、異なる。χ⁽³⁾への電子的な寄与はＣＡＲＳ顕微鏡法での弱い非
共振背景信号として表される。

【００１０】これ故、当分野において、振動特性に対して敏感で、高感度及び高空間解像度
を有し、簡単に実行できる、非線形振動顕微鏡法のための方法及び装置の要求が
ある。

【００１１】発明の概要本発明は非線形顕微鏡振動作像のための方法及び装置である。振動分光情報を
組み込んだ顕微鏡作像は一度に１画素の検出信号の空間解像度により達成される
。空間解像度はサンプル上の光尋問ビーム(optical interogation beam)のスポ
ット寸法を最小にすることにより達成される。非線形顕微鏡法は次のものに依存
する。

【００１２】ａ．サンプル上に共通の焦点スポットを提供する顕微鏡対物レンズを通して
第１及び第２の周波数（異なる色又は波長）を有する少なくとも２つの実質上同
軸のレーザービーム（尋問ビーム）を導くこと；ｂ．サンプルを通過した後の少なくとも２つの同軸のレーザービームから、
少なくとも２つの残留ビームと一緒に信号ビーム（例えば、ＣＡＲＳ又はＳＦＧ
）を収集すること；ｃ．少なくとも２つの残留ビームを除去すること；及びｄ．信号ビームを検出し、画素を生じさせること。

【００１３】各レーザービームが残留ビームを生じさせるので、すべての残留ビームを除去
するのが好ましい。除去は信号ビームからの残留ビーム（単数又は複数）の分光
的分離として特に定義される。

【００１４】本発明の別の実施の形態は、第１及び第２の周波数を有する少なくとも２つの
レーザービームから画素即ち空間的に解像された画像素子を生じさせる工程の改
良であり、少なくとも２つのレーザービームは新たな周波数の信号ビームを生成
するサンプル上で空間的に一致し、方法は、ａ．サンプル上に共通の焦点スポットを提供するレンズを通して少なくとも
２つのレーザービームを導く工程と；ｂ．サンプルを通った後の少なくとも２つのレーザービームから少なくとも
２つの残留ビームと一緒に信号ビームを収集する工程と；ｃ．少なくとも２つの残留ビームを除去する工程と；ｄ．信号ビームを検出して、画素を生じさせる工程と；を有し、改良点は、少なくとも２つのレーザービームのうちの少なくとも１つが
深赤色（０．７ミクロン以上）から近赤外（２ミクロン）までの範囲の波長を有
することである。

【００１５】好ましい装置は（ａ）ポンプビームを発生させるために２５０ｋＨｚで作動す
る再生増幅器で増幅されたＴｉ：Ｓモードロックレーザーであるポンプ波レーザ
ーと、（ｂ）再生増幅器によりポンピングされた光学パラメトリック増幅器で増
幅される光学パラメトリック発振器により提供される第２のビームと、（ｃ）ビ
ームをコリメートし、拡張するための望遠鏡及びビームを同軸にするためのダイ
クロイックミラーと、（ｄ）上記ポンプ波レーザー及び上記第２の波レーザーを
サンプル上に合焦させるための顕微鏡対物レンズと、（ｅ）信号ビームを検出器
へ通過させるブロッキングフィルタと、（ｆ）信号ビームを検出するための検出
器とを有する。

【００１６】本発明によれば、入射レーザービームは対物レンズの裏面アパーチュア(back
aperture)を満たすように拡張される。対物レンズはサンプル上又はサンプル内
に小さな焦点スポットを得るように大きな開口数を有する。小さな励起容積を生
じさせると、有効な背景信号排除及びサンプルに対する小さな光損傷が得られ、
異なる焦点面での断面切りにより三次元顕微鏡法を可能にする。非線形強度依存
性は、２光子蛍光顕微鏡法と同様、レーザー焦点で小さな容積に励起を制限する
。焦点での有効な励起容積は普通に定義されるような回折限界よりも幾分小さい
。

【００１７】検流計スキャナーを使用してサンプルにわたって焦点スポットをラスター走査
するか、又は、ｘｙ遷移ステージで固定の焦点スポットを通してサンプルをラス
ター走査するかのいずれかにより、画像を発生させることができる。この方法に
おいては、二次元画像を形成するために一連の画素が発生される。焦点スポット
に関してｚ軸に沿ってサンプルを移動させることにより、異なる深さでの面画像
を生じさせることができ、三次元画像の構築を許容する。

【００１８】ＣＡＲＳ顕微鏡法に対しては、可視から近赤外（０．４−１．５μｍの波長）
を使用することができる。しかし、近赤外から深赤色（０．７−１．５μｍの波
長よりも大きい）の励起ビームが好ましい。その理由は、これらのビームが通常
サンプル内に電子励起を生じさせず、それ故、光漂白による光化学的な損傷を回
避するからである。長い励起波長はまた、不均質サンプル内でのレイリー散乱を
最少にし、その結果、生医学応用を含む（ただし、これに限定されない）多くの
応用にとって望ましい厚いサンプルのための大きな侵入深さを提供する。

【００１９】本発明のＣＡＲＳ顕微鏡法は、信号が顕微鏡対物レンズの焦点スポットにおい
てのみ発生する点で、共焦点２光子蛍光顕微鏡法に類似し、三次元作像を許容す
る。ＣＡＲＳ顕微鏡法は、ＣＡＲＳが振動コントラストを提供し、蛍光孔(fluor
opores)を必要としない点で、共焦点２光子蛍光顕微鏡法とは異なる。

【００２０】ＣＡＲＳ顕微鏡法と自然ラマン顕微鏡法との間の主な違いは、ＣＡＲＳが励起
容積内での分子振動が位相となって振動し、構造的に干渉するようなコヒーレン
トプロセスであることである。それ故、ＣＡＲＳ信号は振動モードの密度の二乗
に比例する。これに反し、自然ラマン即ち蛍光信号がコヒーレントではなく、線
形密度依存性を有する。自然ラマン顕微鏡法より秀れたＣＡＲＳ顕微鏡法の主な
利点は、ＣＡＲＳ顕微鏡法が一層敏感で、平均励起パワーが一層少なくて済むこ
とである。

【００２１】本発明のＣＡＲＳ顕微鏡法は、２つの入来ビームが一層小さなスポットを形成
するように密に合焦され、高感度及高空間解像度を生じさせる点で、ＣＡＲＳ作
像のための先の体系とは異なる。位相整合条件は波ベクトルの大きな円錐及び短
い相互作用長さ故に緩和され、（空間的ではなく）分光的にポンプ及びストーク
スビームから分離される信号ビームの大きな円錐を発生させる。

【００２２】本発明は種々の応用にとって有用である。ＣＡＲＳ及びＳＦＧ顕微鏡法は、少
しの例を挙げれば生科学、物質科学、医療診断又は食品処理の如き種々の異なる
分野で使用できることが分かる。例えば、生物学的な応用は多くの新しい可能性
を広げる。大半の生物学的なサンプルはかなりの水を含有し、水性媒体である。
これは２つの理由で幸運である。水は弱いラマン信号を有し、水はレーザービー
ムにより与えれれることのある熱を除去するための秀れた媒体である。更に、１
０^-15秒のＴｉ：Ｓレーザーを使用する生きた細胞培養での実験に基づき、作像
プロセスが使用する平均パワーレベルにおいて生きた細胞に害を及ぼさないこと
を期待できる。表面感応性であるため、ＳＦＧ顕微鏡法は生物学的な膜に対して
幅広く応用できることが分かる。同様に、ポリマー又はセラミック材料はＣＡＲ
Ｓ及びＳＦＧ顕微鏡法により尋問することができる。有機又は無機サンプルは化
学的な特定のためにＣＡＲＳ及びＳＦＧ顕微鏡法により分析でき、多位相即ち多
重素子を特徴づけるために作像される。

【００２３】本発明の要旨は本明細書の結論部分において特に指摘され、明確に主張される
。しかし、構成及び作動方法の双方は、その更なる利点及び目的と共に、同じ符
号が同じ素子を示す添付図面に関連しての以下の説明を参照することにより、良
好に理解できよう。

【００２４】好ましい実施の形態の説明本発明は非線形顕微鏡振動作像のための方法及び装置である。振動分光情報を
組み込んだ顕微鏡作像は、サンプル上の光尋問ビームのスポット寸法を最小にす
ることにより最適化された検出信号の空間解像度により達成される。各スポット
は位置に相関する画像画素を生じさせ、複数のスポット即ち画素を収集すること
により、二次元又は三次元画像を提供することができる。画像の取得は以下に頼
る。

【００２５】ａ．サンプル上に共通の焦点スポットを提供する顕微鏡対物レンズを通して
第１及び第２の周波数（異なる色又は波長）を有する少なくとも２つの実質上同
軸のレーザービームを導くこと；ｂ．サンプルを通過した後の少なくとも２つの同軸のレーザービームから残
留ビームと一緒に信号ビームを収集すること；ｃ．残留ビームを除去すること；及びｄ．信号ビームを検出して、画素を生じさせること。「実質上同軸」は、ビームの半径以内で離れている２つのビームの長手軸線とし
て定義される。ビーム半径内の軸線の場合は、２つのビームは重なる。同軸の長
手軸線が１００％重なるのが好ましい。「実質上同軸」は出発点の一端又は他端
或いはビームの運行の端部から見てビームの運行の全長に沿って少なくとも一部
の重なりが存在するような実質的な平行を含む。これらのビームは対物レンズの
同じ側又は両側から対物レンズに近づくことができる。

【００２６】各レーザービームが残留ビームを生じさせるので、すべての残留ビームを除去
するのが好ましい。「除去」は信号ビームからの残留ビーム（単数又は複数）の
分光的な分離として定義される。

【００２７】非拡張ビームセットよりも一層大なる対物レンズの裏面アパーチュアの領域を
満たすために、ビームを拡張及びコリメートできる。対物レンズは、ビームを約
０．４ミクロンの直径に合焦するように、例えば油浸１．４ＮＡの如き高開口数
のものとすることができる。油浸及び水浸レンズはサンプルを取り巻く媒体に応
じて使用される。厳密な焦点により、波ベクトルの大きな円錐及び短い相互作用
長さのために、位相整合条件が緩和される。非線形強度依存性は励起をレーザー
焦点での小さな容積に制限する。これは、有効な背景信号排除を与え、サンプル
の光損傷を減少させ、異なる焦点面での断面切りにより三次元顕微鏡法を可能に
する。従来の顕微鏡法に比べて横方向解像度の僅かな改善も得られる。

【００２８】当業者なら、レーザービームの寸法が対物レンズの裏面アパーチュアに実質上
適合するように対物レンズと組み合わせてレーザービームの寸法を選択すること
により、レーザービームの拡張を不必要にすることができることを認識できよう
。更に、当業者なら、レンズを簡単なレンズにすることができることを認識でき
よう。ビームの寸法、レンズの型式及び開口数の種々の組み合わせが種々の解像
度を提供する。もちろん、所望の解像度は観察又は作像すべき特徴の寸法に依存
する。

【００２９】サンプルにわたって焦点スポットをラスター走査し、検流計スキャナーを使用
してレーザービームを操縦するか又はｘｙ遷移ステージで固定の焦点スポットを
通してサンプルをラスター走査するかのいずれかにより、画像を発生させること
ができる。このようにして、二次元画像を形成するために一連の画素を発生させ
る。

【００３０】代わりに、又はこれに加えて、サンプルの振動特性を得るために、２つのレー
ザービームの周波数差（ｖｐ−ｖｓ）により与えられる観察されたラマンシフト
の変更を行うことができる。

【００３１】ラマンシフトは４０００ｃｍ^-1（４０００波長数）よりも小さく、アクセス可
能な範囲が使用されるレーザー装置によってのみ決定されるのが好ましい。方法は好ましくは、少なくとも２つのレーザービームのためのパルス幅を選択
する更なる工程を含み、パルス幅は無限（連続波励起）、好ましくは、無限より
も短いが、１×１０^-9秒よりも長く、一層好ましくは、１×１０^-9秒と１×１０ ^-12 秒との間であり、最も好ましくは、１×１０^-12秒よりも短い。光学遅延ライ
ン（図示せず）は少なくとも２つのレーザービームのパルス列を一時的に重ねる
ために使用される。一層短いパルスはサンプルでの同じ量の平均パワーに対して
一層大きな信号強度を与え、サンプル内で拡張される同じ量のエネルギに対して
、サンプルからの増大した検出信号を提供する。

【００３２】本発明の別の実施の形態は、第１及び第２の周波数を有し、新たな周波数の信
号ビームを生成するサンプル上で空間的に一致する少なくとも２つのレーザービ
ームから画素即ち空間的に解像された画像素子を生じさせる方法を改善し、その
方法は、ａ．サンプル上に共通の焦点スポットを提供するレンズを通して少なくとも
２つのレーザービームを導く工程と；ｂ．サンプルを通った後の少なくとも２つのレーザービームから少なくとも
２つの残留ビームと一緒に信号ビームを収集する工程と；ｃ．少なくとも２つの残留ビームを除去する工程と；ｄ．信号ビームを検出して、画素を生じさせる工程と；を有し、改良点は、少なくとも２つのレーザービームのうちの少なくとも１つが深赤色（０．７ミ
クロン以上）から近赤外（２ミクロン）までの範囲の波長を有することである。

【００３３】少なくとも２つのレーザービームが深赤色から近赤外までの範囲の波長を有す
る場合に、更なる改善が実現される。好ましい実施の形態においては、深赤色な
いし近赤外の波長の使用は、少なくとも２つのレーザービームが同軸で、好まし
くはレンズの裏面アパーチュアを満たし、１０ミクロンよりも小さな寸法の共通
焦点スポットを提供するような第１の実施の形態と組み合わされる。

【００３４】本発明の装置は第１及び第２の周波数を有し、第３の周波数の信号ビームを生
成するサンプル上で空間的に一致する少なくとも２つのレーザービームから画素
を生じさせる。この装置は、ａ．実質上同軸関係で少なくとも２つのレーザービームを通過させて導くた
めの光学ビーム合波器及びディレクターと；ｂ．サンプル上に焦点スポットを提供する顕微鏡対物レンズと；ｃ．サンプルを通った後の少なくとも２つのレーザービームから少なくとも
２つの残留ビームと一緒に信号ビームを収集するための収集レンズと；ｄ．少なくとも２つの残留ビームを除去するためのブロッキングフィルタと
；ｅ．信号ビームを検出して、画素を生じさせるための検出器と；を有する。

【００３５】少なくとも２つの平行なパルスレーザービームは好ましくは、サンプル上で最
小の可能な共通の焦点スポットを得るために、実質上同軸である。装置は更に、焦点スポットに関してサンプルを幾何学的に走査すること、デー
タに関して既知の幾何学的な空間関係の複数の画素を得ること、及び、そこから
画像を発生させること、を有する。

【００３６】装置は好ましくは、また、サンプルの振動特性のスペクトル情報を得るために
、少なくとも２つのパルスレーザービームの少なくとも２つのラマン振動周波数
分離を変化させるためのセパレータ制御を含む。

【００３７】信号ビームの生成は、（１）間接共振方法及び（２）直接共振方法の２つの方
法のうちの１つにより達成できる。間接共振方法（ＣＡＲＳ）は少なくとも２つ
のレーザーを有し、この方法では、２つのレーザービーム間の周波数差はサンプ
ルの分子振動、好ましくは分子振動共振に対応する。直接共振方法（ＡＦＧ）も
また少なくとも２つのレーザーを有し、この方法では、一方のビームの周波数は
サンプルの分子振動に対応する。間接共振方法及び装置ＣＡＲＳで顕微鏡作像を得るために、２つのレーザービームは、−ＯＨ、−Ｃ
Ｈ及び−ＮＨ含有分子の基本的なＩＲ吸収区域をカバーする２６００ないし３５
００ｃｍ^-1のラマン振動周波数により分離される。また、サンプルを通しての伝
達を可能にし、サンプルの電子状態での強い吸収及び共振効果を回避するため、
レーザービームを深赤色ないし近ＩＲ（赤外）内にするのが有用である。補助的
には、実質的なピークパワーを有するために亜ピコ秒(sub-picosecond)（ｐｓ）
［ピコ秒＝１０^-12秒］のパルス幅を有することが有益であることが判明した。
顕微鏡作像のための装置（図２）は、（ａ）ポンプ波Ｐ₁を発生させるために再
生増幅器で増幅されるＴｉ：Ｓモードロックレーザーであるポンプ波レーザー（
図示せず）と；（ｂ）ストークス波Ｓを発生させるためにポンプ波の一部により
増幅されるＫＮｂＯ３の結晶を有する光学パラメトリック発振器である第２波レ
ーザー（図示せず）と；（ｃ）ビームをコリメート及び合波するための望遠鏡／
ミラー（図示せず）と；（ｄ）ポンプ波レーザー及び第２波レーザーをサンプル
２０２上に合焦するための顕微鏡対物レンズ２００と；（ｅ）検出器２０８へ検
出信号を通過させるブロッキングフィルタ２０６の手前の収集レンズ２０４とを
有する。ストークスビームＳ及びポンプビームＰ₁はビーム合波ダイクロイック
光学素子２１０内で合波され、これらを実質上同軸に伝播する。実質上同軸のビ
ームをサンプル２０２へ導き、作像ビームを受け取るために、ビーム分割ダイク
ロイック２１２を使用することができる。サンプルは一連の画素の位置を得るた
めに可動ステージ２１４を介して走査される。ポンプ波レーザーとしてＴｉ：Ｓ
モードロックレーザーを使用する場合、第２波レーザーは１０００ｎｍよりも長
い波長で作動しなければならず、この波長は、ＫＮｂＯ３結晶を使用する光学パ
ラメトリック発振器／増幅器（ＯＰＯ／ＯＰＡ）により便宜的に発生され、安定
していて調整可能である。

【００３８】更に、Ｔｉ：Ｓレーザー及びＯＰＯビームの双方は、２５０ｋＨｚの減少反復
率で一層大きな次元のパルスエネルギを提供するように、再生増幅器を使用して
増幅される。高い平均パワーからサンプルの損傷無しに強い信号を発生させるた
めには、一層大きなピークパワー及び一層小さな反復率の双方が必要である。光
の短いパルスの結果は実質的な周波数帯域幅である。１００ｆｓパルスの帯域幅
に対するフーリエ変換限界は約１５０ｃｍ^-1であり、これは大半の振動帯域に匹
敵するか又はそれよりも広い。このスペクトル幅は一層長いパルス幅を使用する
ことにより又はフィルタを使用することにより減少することができる。（パルス
エネルギ及びピークパワーを犠牲にして）スペクトル帯域幅を減少させると、一
層高いスペクトル解像度の画像が生成される。

【００３９】代わりに、一層大きな反復率の装置は十分なパルスエネルギを提供できるが、
あるサンプルに対するある平均パワーでの高いピークパワーを得るためには、反
復率を減少させる体系が必要になるかもしれない。音響光学シャッターは、少な
い損失で、任意の反復率でのパルスを生成できる。更に、ｆｓパルスではなくて
ピコ秒（ｐｓ）パルスを使用すると、スペクトル解像度において利点が得られる
が、信号強度において欠点が生じる。２５０ｋＨｚでのフェムト秒（１０^-15秒
）体系におけるＣＡＲＳ顕微鏡法は適度な励起平均パワー（〜０．１ｍＷ）のみ
を必要とする。フェムト秒体系又は同様の検出レベルでの連続波レーザーにおけ
るものよりも一層長いパルスに対しては、１ｍＷ以上が必要になることがある。

【００４０】例えばモノクロメーターで信号ビームのスペクトル特性を分析する場合に、詳
細なスペクトル情報を生み出すために、短いそれ故大きな帯域幅のパルスを利用
できる。例１本発明を論証するために実験を行った。図２に示す上述のような装置を使用し
た。特に、オンアクシス(on-axis) 構成を必要とした。干渉フィルタ及び（又は
）フィルタガラスで構成されたブロッキングフィルタを使用して、反ストークス
ビームを伝達しながら、ポンプ及びストークスビームを排除させた。対物レンズ
を静止させ、ｘｙ（ｚ）ステージの可動の内側部分によりサンプルを支持し、サ
ンプルをラスター走査することにより作像を許容した。

【００４１】試験サンプルはガラスカバースリップ(glass cover slip)上のポリスチレンビ
ードの部分単層とした。これらは種々の厳密に制御された寸法として入手でき、
この論証のために使用した寸法は９１０ｎｍであった。これらのビードは、光学
的に不活性であるがカバースリップに対して改善された接着性を有するカルボキ
シル化した表面を有していた。これらのビードは２９００ｃｍ^-1シフト区域内の
強いラマン信号を有していたが、レーザービームとの電子的な１光子又は２光子
共振を生じるようないかなる染料(dyes)をも有しなかった。ビードの表面が波形
とされ、顕微鏡対物レンズが普通１７０ミクロン厚のカバーガラスと共に機能す
るように設計されたので、サンプルの製造では、屈折率整合流体でコーティング
し、ビードの頂部に第２のカバースリップを置いた。このサンドイッチ構造は安
定しており、容易に取り扱えた。普通の屈折率整合油内の−ＣＨ基からの信号を
回避するために、フッ素化した油を使用してビードを包囲した。この油は透明で
あり、この区域内でラマン共振を有しなかった。

【００４２】８５５ｎｍでのＴｉ：サファイア（Ｔｉ：Ｓ）レーザー（ポンプビーム）及び
一層長い波長でのパラメトリック的に発生されたビーム（ストークスビーム）を
サンプル上に入射した。大きな反復率（２５０ｋＨｚ）での２つの同期されたフ
ェムト秒のパルス列が、８５５ｎｍの中心波長で作動するＴｉ：サファイア再生
増幅器、及び、１．１μｍないし１．２μｍで作動する国産の光学パラメトリッ
ク発振器及び光学パラメトリック増幅器から発生された。レーザー装置はＣ−Ｈ
及びＮ−Ｈ振動にとって典型的な区域であるラマンシフトに対する２６００ｃｍ ^-1 ないし３３００ｃｍ^-1の周波数範囲に限定する。しかし、１０００ｃｍ^-1ない
し２０００ｃｍ^-1での指紋区域(fingerprint region)の如き他のスペクトル区域
への拡張はいかなる顕著な問題をも生じさせない。２つのパルス列は帯域幅（各
ビームに対して５０ｃｍ^-1）のために個々に調整され、光学遅延ラインにより一
時的に重ねられ、光学顕微鏡内へ共線形的に結合され、油浸対物レンズ（ニコン
製のＰｌａｎＡｐｏ、６０×、１．４ＮＡ（開口数））によりサンプルの同じ
スポット上に合焦される。サンプルはコンピュータ作動のｘｙステージ（フィジ
ック・インストラメンテ社(Physik Instrumente)のＥ−５００）によりラスター
走査され、独立圧電気素子によりｚ方向の位置決めを行う。ＣＡＲＳ信号は別の
同形の対物レンズで前方方向に収集され、６６５−７００ｎｍでの放射のために
濾波され、光子計数により検出される。

【００４３】共振させるべき分子グループに応じて、ビーム間の周波数差は約２９００ｃｍ ^-1 の分子共振に対応する。このプロセスにおいては、約６７０ｎｍでの新たな反
ストークス光子と一緒にストークスビーム内に付加的な光子を生じさせるために
、２つのポンプ光子を使用した。２５０ｋＨｚの反復率での約１００フェムト秒
（ｆｓ）の極めて短い光パルスを発生させ、強い信号及びサンプルに入射する損
傷させない低い平均パワーでのデータ収集を許容した。更に、異なる振動周波数
の選択を許容して、振動スペクトル解像度での作像方法を提供するために、スト
ークス波の周波数（約１１５０ｎｍ）を調整可能とした。

【００４４】強力に合焦され、１．４の開口数（ＮＡ）を有する油浸顕微鏡対物レンズによ
り達成されるビームでは、０．５ミクロンよりも小さな直径及び約１．５ミクロ
ンの高さを有する楕円焦点区域から、全体の信号が発生された。１０×１０ミク
ロンの寸法をカバーする５１２×５１２の画素のラスター走査を約１０分間行い
、図３に示す顕微鏡画像を生成した。

【００４５】図４の実線は焦点にセンタリングされたガラスカバースリップ上の直径９１０
ｎｍの単一のカルボキシル化されたポリスチレンビードのＣＡＲＳスペクトルを
示す。スペクトルを記録するために、ポンプ波長を一定（λ_p＝８５４ｎｍ）に
保持し、その間、２７８１ｃｍ^-1から３１６３ｃｍ^-1までのラマンシフトに対応
して、ストークス波長をλ_s＝１．１２μｍから１．１７μｍまで２ｎｍ段階で
調整した。共振ＣＡＲＳ信号と同じ方法で強度により目盛りづけされた弱い非共
振ＣＡＲＳ背景が現れた。ストークスビームの波長変化に関連する強度変化を補
償するため、この背景信号により共振ＣＡＲＳ信号を正規化した。２つの励起レ
ーザービームのスペクトル幅のコンボリューションにより与えられるスペクトル
解像度が５０ｃｍ^-1のまわりに生じる。一層狭いスペクトルを有する一層長いレ
ーザーパルスを使用すると、一層鮮明なスペクトル特性の区別が可能になる。比
較のために、同じビードの自然ラマンスペクトルをも破線即ち点線として図４に
示す。２８５１ｃｍ^-1及び２９０２ｃｍ^-1でのピークは脂肪族Ｃ−Ｈ伸縮振動(s
tretching vibration)に割り当てられ、一方、３０５４ｃｍ^-1での帯域は芳香族
Ｃ−Ｈ伸縮振動のためのものである。脂肪族及び芳香族Ｃ−Ｈ振動のためのピー
クはまた、ＣＡＲＳスペクトルにより再生され、これは、ポリスチレン内のこれ
らのスペクトル特性間に差異を生じさせるＣＡＲＳ顕微鏡法の能力を証明する。
３１１０ｃｍ^-1でのＣＡＲＳスペクトル内のディップは再生可能であり、非共振背景を有する共振ＣＡＲＳ信
号の弱め合い干渉により生じる。

【００４６】三次元ＣＡＲＳ作像は図５に示され、直径９１０ｎｍのポリスチレンビードに
より囲まれ、ガラスカバースリップの表面から１．２μｍの増分での５つの連続
する高さにより記録された直径４．３μｍのポリスチレンビードの画像を表示す
る。画像面に対して出入りする一層小さなビードの運動及び画像面内の大きなビ
ードの増大する直径が明確に分かる。

【００４７】感度及び横方向の解像度の決定において、ビードの寸法を減少させた。直径１
１０ｎｍのポリスチレンビードを容易に作像できた。図６に示すように、１１０
ｎｍのビードに対する既知の横断面はまた、励起波長のためのλ／２よりも良好
である３０２ｎｍのＦＷＨＭでの横方向地点拡張機能(lateral point spread fu
nction)を決定することができる。３．２×１０⁶の芳香リングに含まれたこれら
のビードの１つは使用される適度なパワーレベル及び遂行されるべき実験条件の
下でＣＡＲＳ検出感度のための上限を与える。小さなサンプルの作像における制
限因子は基体により発生される非共振信号及び取り巻き媒体である。例２生きた細胞を作像するための本発明を論証するために実験を行った。シェワネ
ラ・プトレファシエンス(Shewanella putrefaciens) 種族ＣＮ−３２はグラム(G
ram)陰性バクテリアである。図７及び図８は、レーザー周波数が脂肪族Ｃ−Ｈ伸
縮振動の周波数である２８７８ｃｍ^-1へのラマンシフトに調整された場合の、個
々のシェワネラ・プトレファシエンス細胞のＣＡＲＳ画像を示す。脂肪族Ｃ−Ｈ
は細胞膜の脂質二重層内で豊富であると予期された。バクテリアはＤ₂Ｏで含浸
され、別のカバースリップで覆われたガラスカバースリップ上で成長した。Ｈ₂
Ｏが１．１５μｍ付近で攻撃(onset) を伴う弱い倍音(overtone)吸収を有する場
合にサンプルの加熱を回避するために、Ｄ₂Ｏを使用した。もし有った場合の加
熱の問題は両方のレーザービームの波長を僅かにシフトさせることにより容易に
克服できた。しかし、他の装置に対しては、なんらの加熱効果をも観察すること
なく、Ｈ₂Ｏを溶剤として使用できることが判明した。脂肪族Ｃ−Ｈ伸縮周波数
から離れるようにラマンシフトを調整したとき、すべての画像コントラストが失
われた。図７における小さなバクテリア細胞内の詳細な特徴は、２光子顕微鏡法
（細胞幅が５００ｎｍよりも小さい）に比べて横方向の解像度が不十分であるた
め、解像できなかった。しかし、ＣＡＲＳ画像は未着色の生きたバクテリア細胞
の作像を可能にする高い感度を示す。

【００４８】生物学的な試片上でのＣＡＲＳのための空間分解能はまた、真核生物の細胞の
ために図８で論証される。図８は、再度脂肪族Ｃ−Ｈ伸縮区域へ調整されたラマ
ンシフトでの、水成ＨＥＰＥＳバッファ溶液内の生きたヘラ(HeLa)細胞の画像を
示す。脂肪族Ｃ−Ｈ内で豊富なミトコンドリアは細胞内でほぼ１μｍの寸法の明
るい特徴として現れる。脂肪族Ｃ−Ｈ伸縮振動の周波数から離れるようにラマン
シフトを調整すると、コントラストが完全に失われる。図８に示す画像を記録す
るために使用される平均パワーレベルは８５３ｎｍで５０μＷであり、１．１３
５μｍで５０μＷであった。画像取得（４３分間）中、生きた細胞の光損傷は観
察されなかった。

【００４９】直接共振方法及び装置ＳＦＧプロセスはＣＡＲＳに使用される周波数差と同じである分子振動周波数
での赤外ビームを必要とする。サンプルを通してのＩＲビームの伝達は実質上極
めて制限される。その理由は、分子振動とのビームの共振が極めて強い吸収を伴
うからである。これは表面特徴の特定に対しては問題とならないが、もちろん、
容積即ち三次元情報の取得を妨害する。例３ＳＦＧを使用する本発明を論証するために実験を行った。

【００５０】炭化水素化合物と共振する３．５ミクロンの波長でのＯＰＯ／ＯＰＡからのＩ
Ｒビームを使用した。Ｔｉ：サファイアレーザー（約８５０ｎｍ）からの近ＩＲ
ビームを使用して、赤色（約６７０ｎｍ）内で和周波数即ち信号ビームを生成し
た。ＩＲビームのエネルギは他の分子との共振を達成するために大幅に変化でき
るが、これは光を発生させるために使用されるＯＰＯ／ＯＰＡへの変化を必要と
することがある。

【００５１】和周波数ビームは顕微鏡を使用して明確に確認され、χ⁽²⁾効果としてのその
原点は、図９に示すように、周波数測定により及び線形パワー依存性により立証
された。例４スペクトル選択力を論証するために実験を行った。２つのレーザー間の波長差
を変化させることにより、異なる種類が選択された。数個の周波数分離で得られ
たポリスチレンビードの画像の区分を図１０に示す。異なる周波数シフトでのデ
ータセットに対して同じになるようにレーザーパワーを調整した。最も強い信号
は３０５４ｃｍ^-1でのポリスチレンの−ＣＨ共振周波数に等しいストークスビー
ムの周波数差を有した。強度はビード間の背景レベル近くまで下がり、画像内で
観察される空間解像度を論証する。

【００５２】結び本発明の好ましい実施の形態を図示し、説明したが、当業者なら、最も広い態
様において本発明から逸脱することなく多くの変更及び修正が可能であること明
らかである。それ故、特許請求の範囲は本発明の真の精神及び範囲内に入るよう
なすべてのこのような変更及び修正をカバーすることを意図する。

【図面の簡単な説明】

【図１】図１ａはＣＡＲＳ（従来技術）に使用されるレーザービームのエネルギレベル
及び位相整合を示す線図であり、図１ｂはＳＦＧ（従来技術）に使用されるレー
ザービームのエネルギレベル及び位相整合を示す線図である。

【図２】本発明の装置の概略線図である。

【図３】９１０ｎｍ直径のポリスチレンビードのＣＡＲＳ顕微鏡作像を示す図である。

【図４】脂肪族ＣＨ（２８５１ｃｍ^-1及び２９０２ｃｍ^-1）及び芳香族ＣＨ（３０５４
ｃｍ^-1）振動を有する９１０ｎｍ直径のポリスチレンビードの自然ラマンスペク
トル（点線）と比較したＣＡＲＳスペクトル（十字と実線）を示す図である。

【図５】焦点面に対して出入りする一層小さなビードの運動が明確に見えるような１．
２μｍのサンプル高さ増分での一連の二次元画像を示す図である。ここで、これ
らのデータから軸方向における１．６１μｍのＦＷＨＭでの機能の地点拡張を推
論する。

【図６】適しているガウス関数（実線）での直径１１０ｎｍのポリスチレンビードのＣ
ＡＲＳ画像からの強度プロフィールを示す図である。ここで、各画素のための収
集時間を１３ｍｓとした。

【図７】水成ＨＥＰＥＳバッファ溶液内の３つの生きた着色されていないヘラ細胞のＣ
ＡＲＳ画像を示す図である。ここで、サンプルに入射する平均パワーを８５３ｎ
ｍで５０μＷ及び１．１３５μｍで５０μＷとした。脂肪族ＣＨ振動のスペクト
ル区域におけるラマンシフトは２９１３ｃｍ^-1である。取得時間を４３分とし、
走査寸法を３０μｍとし、縦線の目盛りを５μｍとした。明るい特性はミトコン
ドリアの如き脂肪族ＣＨ内で細胞成分が豊富であることを示す。

【図８】重水素化された水内でのシェワネラ・プトレファシエンス種族ＣＮ−３２型式
の６つの生きた着色されていないバクテリアのＣＡＲＳ画像を示す図である。こ
こで、サンプルに入射する平均パワーを８５５ｎｍで１００μＷ及び１．１３４
μｍで１００μＷとした。脂肪族ＣＨ振動のスペクトル区域におけるラマンシフ
トは２８７８ｃｍ^-1である。取得時間を８５分とし、走査寸法を６μｍとし、縦
線の目盛りを１μｍとした。図である。

【図９】それぞれ８５５ｎｍ及び３．４２μｍでの２つのレーザービームでのガラスカ
バースリップの励起の結果のＳＦＧスペクトルを示す図である。

【図１０】数個の周波数分離での作られたポリスチレンビード画像の部分の強度を示す図
である。

───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (81)指定国ＥＰ(ＡＴ，ＢＥ，ＣＨ，ＣＹ，ＤＥ，ＤＫ，ＥＳ，ＦＩ，ＦＲ，ＧＢ，ＧＲ，ＩＥ，ＩＴ，ＬＵ，ＭＣ，ＮＬ，ＰＴ，ＳＥ)，ＣＡ，ＪＰ (72)発明者シィエ，シィアオリアン・スンニーアメリカ合衆国マサチューセッツ州01238，ケンブリッジ，オックスフォード・ストリート 12，ハーバード・ユニバーシティ，デパートメント・オブ・ケミストリー・アンド・ケミカルバイオロジー (72)発明者ツムブッシュ，アンドレーアスドイツ連邦共和国デー−80333 ミュンヘン，ゾフィーンシュトラーセ 11，ルートヴィヒ−マクシミーリアン・ウニヴェルズィテート・ミュンヘン，インスティトゥート・フューア・フュズィカーリッシュ・ヒュミーＦターム(参考） 2G020 AA03 AA04 BA20 CA04 CB23 CB42 CC26 CC31 CC47 2G043 AA03 BA16 BA17 CA03 DA06 EA03 FA02 GA01 GA02 GA07 GB01 GB19 HA01 HA09 JA02 JA03 KA01 KA02 KA09 LA03 LA05 NA05 2G059 AA05 BB04 CC16 DD13 EE03 FF03 GG01 HH01 HH02 JJ02 JJ03 JJ11 JJ15 JJ22 KK04 KK07 MM09

Claims

【特許請求の範囲】

【請求項１】第１及び第２の周波数を有し、新たな周波数の信号ビームを
生成するサンプル上で空間的に一致する少なくとも２つのレーザービームから画
素即ち空間的に解像された画像素子を生じさせる方法において、ａ．上記サンプル上に共通の焦点スポットを提供するレンズを通して実質上
同軸関係で上記少なくとも２つのレーザービームを導く工程と；ｂ．上記サンプルを通った後の上記少なくとも２つのレーザービームから少
なくとも２つの残留ビームと一緒に上記信号ビームを収集する工程と；ｃ．上記少なくとも２つの残留ビームを除去する工程と；ｄ．上記信号ビームを検出して、上記画素を生じさせる工程と；を有することを特徴とする方法。
【請求項２】上記レンズが対物レンズであることを特徴とする請求項１に
記載の方法。
【請求項３】上記対物レンズの裏面アパーチュアを満たすために上記少な
くとも２つのレーザービームを拡張する工程を更に有することを特徴とする請求
項２に記載の方法。
【請求項４】上記生成は、上記少なくとも２つのレーザービーム間の周波
数差が上記サンプルの振動周波数と共振するようなコヒーレント反ストークスラ
マン散乱で行われることを特徴とする請求項１に記載の方法。
【請求項５】上記少なくとも２つのレーザービームが近赤外内の波長を有
することを特徴とする請求項４に記載の方法。
【請求項６】上記生成は、上記少なくとも２つのレーザービームのうちの
１つの周波数が上記サンプルの分子振動と共振するような和周波数発生で行われ
ることを特徴とする請求項１に記載の方法。
【請求項７】上記共通の焦点スポットに関して上記サンプルを幾何学的に
走査し、複数の画素を得て、そこから画像を発生させる工程を更に有することを
特徴とする請求項１に記載の方法。
【請求項８】上記少なくとも２つのレーザービームを操縦することにより
、上記サンプルにわたって上記共通の焦点スポットを走査する工程を更に有する
ことを特徴とする請求項１に記載の方法。
【請求項９】上記サンプルの振動特性を得るために上記少なくとも２つの
パルスレーザービームの少なくとも２つのラマン振動周波数分離を変化させる工
程を更に有することを特徴とする請求項１に記載の方法。
【請求項１０】上記振動周波数分離が４０００ｃｍ^-1よりも小さいことを
特徴とする請求項１に記載の方法。
【請求項１１】上記少なくとも２つのレーザービームのためのパルス幅を
選択する工程を更に有し、上記パルス幅が無限（連続波）であることを特徴とす
る請求項１に記載の方法。
【請求項１２】ａ．上記少なくとも２つのレーザービームの少なくとも
１つを有限パルス幅でパルス発信させ、有限であるパルス幅を選択する工程と；ｂ．上記少なくとも２つのレーザービームを一時的に重ねるように当該少な
くとも２つのレーザービームの少なくとも１つを遅延させる工程と；を更に有することを特徴とする請求項１に記載の方法。
【請求項１３】上記パルス幅が無限よりも小さいが、１０×１０^-15秒よ
りも長いことを特徴とする請求項１２に記載の方法。
【請求項１４】上記パルス幅が１×１０^-12秒よりも短いことを特徴とす
る請求項１２に記載の方法。
【請求項１５】第１及び第２の周波数を有し、第３の周波数の信号ビーム
を生成するサンプル上で空間的に一致する少なくとも２つのレーザービームから
画素を生じさせる装置において、ａ．実質上同軸関係で上記少なくとも２つのレーザービームを通過させて導
くための光学ディレクターと；ｂ．上記サンプル上に焦点スポットを提供する顕微鏡対物レンズと；ｃ．上記サンプルを通った後の上記少なくとも２つのレーザービームから少
なくとも２つの残留ビームと一緒に上記信号ビームを収集するためのレンズと；ｄ．上記少なくとも２つの残留ビームを除去するためのブロッキングフィル
タと；ｅ．上記信号ビームを検出して、上記画素を生じさせるための検出器と；を有することを特徴とする装置。
【請求項１６】上記レンズが対物レンズであることを特徴とする請求項１
５に記載の装置。
【請求項１７】上記対物レンズの裏面アパーチュアを満たすために上記少
なくとも２つのレーザービームを拡張する望遠鏡を更に有することを特徴とする
請求項１６に記載の装置。
【請求項１８】上記信号ビームが周波数差又は和周波数から得られること
を特徴とする請求項１５に記載の装置。
【請求項１９】上記パルス信号ビームに関して上記サンプルを幾何学的に
走査し、複数の画素を得て、そこから画像を発生させるスキャナーを更に有する
ことを特徴とする請求項１５に記載の装置。
【請求項２０】上記少なくとも２つのレーザービームを操縦することによ
り、上記サンプルにわたって上記共通の焦点スポットを走査することを更に有す
ることを特徴とする請求項１５に記載の装置。
【請求項２１】上記サンプルの振動特性を得るために上記少なくとも２つ
のパルスレーザービームの少なくとも２つの振動周波数分離を変化させるための
セパレータ制御を更に有することを特徴とする請求項１５に記載の装置。
【請求項２２】上記振動周波数分離が４０００ｃｍ^-1よりも小さいことを
特徴とする請求項１５に記載の装置。
【請求項２３】上記パルス幅が無限よりも小さいが、１×１０^-9秒よりも
長いことを特徴とする請求項１５に記載の装置。
【請求項２４】上記パルス幅が約１×１０^-9秒から約１×１０^-12秒まで
であることを特徴とする請求項２３に記載の装置。
【請求項２５】上記パルス幅が１×１０^-12秒よりも短いことを特徴とす
る請求項２３に記載の装置。
【請求項２６】コヒーレント反ストークスラマン拡散顕微鏡作像のための
装置において、ａ．ポンプ波を発生させるために再生増幅器で増幅されたＴｉ：Ｓモードロ
ックレーザーであるポンプ波レーザーと；ｂ．ポンプ波の一部で増幅されるＫＮｂＯ３の結晶を有する光学パラメトリ
ック発振器である第２波レーザーと；ｃ．レーザービームの寸法及びコリメーションを調整するための少なくとも
１つの望遠鏡、及びこれらのレーザービームを実質上同軸にするためのダイクロ
イックビーム合波器と；ｄ．サンプル上に上記ポンプ波レーザー及び上記第２波レーザーを合焦させ
るための顕微鏡対物レンズと；ｅ．検出信号を検出器へ通過させるブロッキングフィルタと；を有することを特徴とする装置。
【請求項２７】サンプル上で一致するラマン振動周波数により分離された
少なくとも２つの実質上同軸のパルスレーザービームであって、当該少なくとも
２つの同軸のパルスレーザービーム間の周波数差が上記サンプルの振動分子共振
に対応するような少なくとも２つの同軸のパルスレーザービームを有するコヒー
レント反ストークスラマン散乱により画素を生じさせる方法において、ａ．上記サンプル上に焦点スポットを提供する顕微鏡対物レンズを通して上
記少なくとも２つの同軸のパルスレーザービームを導く工程と；ｂ．上記サンプルを通った後の上記少なくとも２つの同軸のパルスレーザー
ビームから残留ビームと一緒にパルス信号ビームを収集する工程と；ｃ．上記残留ビームを除去する工程と；ｄ．上記パルス信号ビームを検出して、上記画素を生じさせる工程と；を有することを特徴とする方法。
【請求項２８】上記パルス信号ビームに関して上記サンプルを幾何学的に
走査し、複数の画素を得て、そこから画像を発生させる工程を更に有することを
特徴とする請求項２７に記載の方法。
【請求項２９】上記共通の焦点スポットに関して上記サンプルを幾何学的
に走査し、複数の画素を得て、そこから画像を発生させる工程を更に有すること
を特徴とする請求項２７に記載の方法。
【請求項３０】上記少なくとも２つのレーザービームを操縦することによ
り、上記サンプルにわたって上記共通の焦点スポットを走査する工程を更に有す
ることを特徴とする請求項２７に記載の方法。
【請求項３１】上記サンプルの振動特性を得るために上記少なくとも２つ
のパルスレーザービームの少なくとも２つのラマン振動周波数分離を変化させる
工程を更に有することを特徴とする請求項２７に記載の方法。
【請求項３２】サンプル上で一致するラマン振動周波数により分離された
少なくとも２つの平行なパルスレーザービームであって、当該少なくとも２つの
平行なパルスレーザービーム間の周波数差が上記サンプルの振動分子共振に対応
するような少なくとも２つの平行なパルスレーザービームを有するコヒーレント
反ストークスラマン散乱により画素を生じさせる装置において、ａ．上記少なくとも２つの平行なパルスレーザービームを通過させるように
導く光学ディレクターと；ｂ．上記サンプル上に焦点スポットを提供する顕微鏡対物レンズを通して上
記サンプル上に焦点スポットを提供する顕微鏡対物レンズと；ｃ．上記サンプルを通った後の上記少なくとも２つの平行なパルスレーザー
ビームから残留ビームと一緒にパルス信号ビームを収集するための収集レンズと
；ｄ．上記残留ビームを除去するためのブロッキングフィルタと；ｅ．上記パルス信号ビームを検出して、上記画素を生じさせる検出器と；を有することを特徴とする装置。
【請求項３３】上記パルス信号ビームに関して上記サンプルを幾何学的に
走査し、複数の画素を得て、そこから画像を発生させるスキャナーを更に有する
ことを特徴とする請求項３２に記載の装置。
【請求項３４】上記共通の焦点スポットに関して上記サンプルを幾何学的
に走査し、複数の画素を得て、そこから画像を発生させることを更に有すること
を特徴とする請求項３２に記載の装置。
【請求項３５】上記少なくとも２つのレーザービームを操縦することによ
り、上記サンプルにわたって上記共通の焦点スポットを走査することを更に有す
ることを特徴とする請求項３２に記載の装置。
【請求項３６】上記サンプルの振動特性を得るために上記少なくとも２つ
のパルスレーザービームの少なくとも２つのラマン振動周波数分離を変化させる
ためのセパレータ制御を更に有することを特徴とする請求項３２に記載の装置。
【請求項３７】第１及び第２の周波数を有し、新たな周波数の信号ビーム
を生成するサンプル上で空間的に一致する少なくとも２つのレーザービームから
画素即ち空間的に解像された画像素子を生じさせる方法において、ａ．上記サンプル上に共通の焦点スポットを提供するレンズを通して少なく
とも２つのレーザービームを導く工程と；ｂ．上記サンプルを通った後の上記少なくとも２つのレーザービームから少
なくとも２つの残留ビームと一緒に上記信号ビームを収集する工程と；ｃ．上記少なくとも２つの残留ビームを除去する工程と；ｄ．上記信号ビームを検出して、上記画素を生じさせる工程と；を有し、上記少なくとも２つのレーザービームの少なくとも１つが深赤色（０．７ミク
ロン）から近赤外（２ミクロン）までの範囲の波長を有することを特徴とする方
法。
【請求項３８】上記少なくとも２つのレーザービームが深赤色から近赤外
までの範囲の波長を有することを特徴とする請求項３７に記載の方法。
【請求項３９】上記少なくとも２つのレーザービームが同軸であることを
特徴とする請求項３７に記載の方法。
【請求項４０】上記少なくとも２つのレーザービームが上記レンズの裏面
アパーチュアを満たして、１０ミクロンよりも小さな寸法の上記共通の焦点スポ
ットを提供することを特徴とする請求項３９に記載の方法。