CN104330398B - 一种多模式非线性光学显微成像方法及装置 - Google Patents

Abstract

本发明涉及一种多模式非线性光学显微成像方法及装置，该装置主要由激光器系统、光学扫描显微镜、非线性光学信号探测与获取系统等构成，能够分别在单激光束和双激光束两种模式下工作，可以在离体的生物组织和活细胞上实现双光子激发荧光（TPEF）成像、多光子高次谐波（如二次谐波SHG，三次谐波THG等）散射成像以及相干拉曼散射（如反斯托克斯CARS）显微成像等多种模式的非线性光学显微成像，从而可以原位获得生物组织样本的各种非线性特异性光学信号，为对样本的光学诊断与深入分析提供了重要的基础。此外，本发明的反射测量方式还可以直接应用于活体小动物的以上各种非线性光学信号的获取与显微成像。

Description

一种多模式非线性光学显微成像方法及装置

技术领域

本发明涉及一种多模式非线性光学显微成像方法及装置。

背景技术

显微镜的出现改变了人们认识世界的方法和观点，是人类科学发展史的重要发明之一。光学显微镜由于其具有无损伤、非侵入性等优点，已发展成当前自然科学特别是生命科学研究的一种重要工具。特别地，十九世纪未期新出现的激光共焦扫描显微成像和各种非线性光学显微成像技术如双光子激发荧光成像、二次谐波散射成像和相干拉曼成像等，由于它们具有较高的空间分辨能力和厚组织的三维光学层析能力，使得光学显微成像技术在生物学、医学及其相关交叉学科等的基础研究和临床应用研究中获得了广泛的应用。然而，由于各种非线性光学成像技术自从其开始在实验室被应用于研究以来，都只有10来年发展历史，尚处于自身发展过程。至今为止，尚未见过将具有共性技术的若干种非线性光学显微成像技术耦合在一个平台或系统中，即在同一个平台或系统上，对靶目标实现多模式的非线性光学显微成像，从而实现靶目标上多种特异性信息的原位表征与获取。

发明内容

为了克服现有技术的不足，本发明的目的在于提供一种多模式非线性光学显微成像方法及装置。

为了实现上述目的，本发明的技术方案一是：一种多模式非线性光学显微成像装置，包括激光器系统，所述激光器系统的输出方向沿第一光路依次设置有第一脉冲激光功率调节单元和时间延迟单元，所述激光器系统的输出方向沿第二光路设置有第二脉冲激光功率调节单元，所述时间延迟单元和第二脉冲激光功率调节单元的输出方向共同依次设置有第一二向色镜、激光束扫描单元、物镜以及用于放置待测样品的载物台。

进一步的，所述第一脉冲激光功率调节单元包含沿第一光路依次设置的第一半波片和第一偏振分光片，所述第二脉冲激光功率调节单元包含沿第二光路依次设置的第二半波片和第二偏振分光片。

进一步的，所述第一脉冲激光功率调节单元的输出端与时间延迟单元的输入端之间设置有第一反射镜。

进一步的，所述激光器系统的输出端与第二脉冲激光功率调节单元的输入端之间设置有光开关。

进一步的，所述激光束扫描单元的输出端与物镜的输入端之间沿出光方向依次设置有第二反射镜和第二二向色镜，所述第二二向色镜的输出端沿其反射方向依次设置有第一会聚透镜、第一光学滤光片以及第一光电探测器。

进一步的，所述载物台下方从上往下依次设置有第二会聚透镜、第二光学滤光片以及第二光电探测器。

进一步的，所述第一光电探测器和第二光电探测器分别电性连接至数据处理中心。

为了实现上述目的，本发明的技术方案二是：一种多模式非线性光学显微成像方法，采用上述的多模式非线性光学显微成像装置，将待测样品放置于载物台上，包括以下工作模式：

（1）单光束激光工作模式：从激光器系统仅出射一束的超短脉冲激发光束，激发光束先经过第一脉冲激光功率调节单元，接着经过时间延迟单元，再经过第一二向色镜耦合后进入激光束扫描单元，最后经过物镜会聚作用在待测样品上，超短脉冲激发光与待测样品相互作用时，产生相应的非线性光学效应；

（2）双光束激光工作模式：从激光器系统出射两束超短脉冲激光，分别为泵浦光和探测光；探测光先经过第一脉冲激光功率调节单元，接着经过时间延迟单元后形成探测光束；泵浦光先经过第二脉冲激光功率调节单元，并与探测光束在第一二向色镜处实现时间和空间上的耦合与共线，耦合后的光束入射进入激光束扫描单元，最后经过物镜会聚作用在待测样品上，两束超短脉冲激光在它们的波长差满足待测样品中相关分子化学键振动光谱的拉曼位移时，获得相应的相干拉曼散射非线性光学效应。

进一步的，在单光束激光工作模式下，所述非线性光学效应是多光子的TPEF、高阶谐波或和频效应。

进一步的，在双光束激光工作模式下，所述相干拉曼散射非线性光学效应是反斯托克斯拉曼散射CARS非线性光学效应。

与现有技术相比，本发明具有以下优点：该装置主要由激光器系统、光学扫描显微镜、非线性光学信号探测与获取系统等构成，能够分别在单激光束和双激光束两种模式下工作，可以在离体的生物组织和活细胞上实现双光子激发荧光（TPEF）成像、多光子高次谐波（如二次谐波SHG，三次谐波THG等）散射成像以及相干拉曼散射（反斯托克斯CARS）显微成像等多种模式的非线性光学显微成像，从而可以原位获得生物组织样本的各种非线性特异性光学信号，为对样本的光学诊断与深入分析提供了重要的基础。此外，本发明的反射测量方式还可以直接应用于活体小动物的以上各种非线性光学信号的获取与显微成像。

下面结合附图和具体实施方式对本发明做进一步详细的阐述。

附图说明

图1为本发明实施例的结构原理图。

图中：1-激光器系统，2-第一半波片，3-第一偏振分光片，4-第一反射镜，5-时间延迟单元，6-光开关，7-第二半波片，8-第二偏振分光片，9-第一二向色镜，10-激光束扫描单元，11-第二反射镜，12-第一光电探测器，13-第一光学滤光片，14-第一会聚透镜，15-第二二向色镜，16-物镜，17-待测样品，18-数据处理中心，19-载物台，20-第二会聚透镜，21-第二光学滤光片，22-第二光电探测器。

具体实施方式

如图1所示，一种多模式非线性光学显微成像装置，包括激光器系统1，所述激光器系统1的输出方向沿第一光路依次设置有第一脉冲激光功率调节单元和时间延迟单元5，所述激光器系统1的输出方向沿第二光路设置有第二脉冲激光功率调节单元，所述时间延迟单元5和第二脉冲激光功率调节单元的输出方向共同依次设置有第一二向色镜9、激光束扫描单元10、物镜16以及用于放置待测样品17的载物台19。

在本实施例中，所述第一脉冲激光功率调节单元包含沿第一光路依次设置的第一半波片2和第一偏振分光片3，所述第二脉冲激光功率调节单元包含沿第二光路依次设置的第二半波片7和第二偏振分光片8。所述第一脉冲激光功率调节单元的输出端与时间延迟单元5的输入端之间设置有第一反射镜4。所述激光器系统1的输出端与第二脉冲激光功率调节单元的输入端之间设置有光开关6。

在本实施例中，所述激光束扫描单元10的输出端与物镜16的输入端之间沿出光方向依次设置有第二反射镜11和第二二向色镜15，所述第二二向色镜15的输出端沿其反射方向依次设置有第一会聚透镜14、第一光学滤光片13以及第一光电探测器12。所述载物台19下方从上往下依次设置有第二会聚透镜20、第二光学滤光片21以及第二光电探测器22。所述第一光电探测器12和第二光电探测器22分别电性连接至数据处理中心18，即计算机。

如图1所示，一种多模式非线性光学显微成像方法，采用上述的多模式非线性光学显微成像装置，将待测样品17放置于载物台19上，包括以下工作模式：

（1）单光束激光工作模式：从激光器系统1仅出射一束的超短脉冲（fs）激发光束，激发光束先经过第一脉冲激光功率调节单元，接着经过时间延迟单元5，再经过第一二向色镜9耦合后进入激光束扫描单元10，最后经过物镜16会聚作用在待测样品17上，超短脉冲激发光与待测样品17相互作用时，产生相应的非线性光学效应；

（2）双光束激光工作模式：从激光器系统1出射两束超短脉冲激光，分别为泵浦光和探测光；探测光先经过第一脉冲激光功率调节单元，接着经过时间延迟单元5后形成探测光束；泵浦光先经过第二脉冲激光功率调节单元，并与探测光束在第一二向色镜9处实现时间和空间上的耦合与共线，耦合后的光束入射进入激光束扫描单元10，最后经过物镜16会聚作用在待测样品17上，两束超短脉冲激光在它们的波长差满足待测样品17中相关分子化学键振动光谱的拉曼位移时，获得相应的相干拉曼散射非线性光学效应。

在单光束激光工作模式下，该装置可以实现常用的双光子吸收激发荧光显微成像TPEF和/或多光子散射显微成像（包括二次谐波SHG、三次谐波THG等）的同步显微成像。由于是fs激光，因此当它与生物样品相互作用时，会产生相应的非线性光学效应。在当前的实验条件情况下，主要的非线性光学效应是多光子的TPEF、高阶谐波或和频效应。考虑到多光子高次谐波呈现较明显的前向性散射特征，因此探测信号（即第一光电探测器12）放置在样品的正前方（即上方），即前向性探测方式，配合合适的窄带滤光片（即第一光学滤光片13）便能够获得比较强的SHG或THG信号；而双光子吸收激发产生的荧光信号TPEF，在空间各方向的信号是随机的，即没有明显的方向性，且带宽较大，需要配合宽带滤波片进行信号获取。因此，为了测量方便与装置简单，在同步获取不同非线性光学信号时，可以同时采用前向方式获取SHG或THG散射光信号，而采用后向方式测量TPEF荧光信号。此外，此测量方法与装置不仅适用于生物组织的切片或活细胞的实验测量；对于活体小动物，由于只能在小动物的后向采集信号，即只能采用后向测量方式，但在增加第二二向色镜15后，仍然可以同步获取。

在双光束激光工作模式下，该装置可以实现反斯托克斯CARS相干拉曼散射显微成像。由于是双光束fs激光，因此当它们的波长差满足生物样品中相关分子化学键振动光谱的拉曼位移时，会产生相应的相干拉曼散射非线性光学效应。在当前的实验条件情况下，两束fs激光光束在它们的波长差满足生物样品中相关分子化键振动光谱的拉曼位移时，可以获得相应的相干反斯托克斯拉曼散射CARS非线性光学效应。当待测样品17为组织切片或活细胞时，可以选择在样品的正前方探测信号，即前向性探测方式，配合合适的带通滤光片便能够获得比较强CARS信号；当待测样品17为活体小动物或厚的组织样品时，可以采用后向测量方式，即在样品的后方，测量经样品散射CARS信号。

以上所述仅为本发明的较佳实施例，凡依本发明申请专利范围所做的均等变化与修饰，皆应属本发明的涵盖范围。

Claims (7)

1.一种多模式非线性光学显微成像装置，包括激光器系统，其特征在于：所述激光器系统的输出方向沿第一光路依次设置有第一脉冲激光功率调节单元和时间延迟单元，所述激光器系统的输出方向沿第二光路设置有第二脉冲激光功率调节单元，所述时间延迟单元和第二脉冲激光功率调节单元的输出方向共同依次设置有第一二向色镜、激光束扫描单元、物镜以及用于放置待测样品的载物台；

所述激光束扫描单元的输出端与物镜的输入端之间沿出光方向依次设置有第二反射镜和第二二向色镜，所述第二二向色镜的输出端沿其反射方向依次设置有第一会聚透镜、第一光学滤光片以及第一光电探测器；

所述载物台下方从上往下依次设置有第二会聚透镜、第二光学滤光片以及第二光电探测器；

所述第一光电探测器和第二光电探测器分别电性连接至数据处理中心。

2.根据权利要求1所述的多模式非线性光学显微成像装置，其特征在于：所述第一脉冲激光功率调节单元包含沿第一光路依次设置的第一半波片和第一偏振分光片，所述第二脉冲激光功率调节单元包含沿第二光路依次设置的第二半波片和第二偏振分光片。

3.根据权利要求1或2所述的多模式非线性光学显微成像装置，其特征在于：所述第一脉冲激光功率调节单元的输出端与时间延迟单元的输入端之间设置有第一反射镜。

4.根据权利要求1或2所述的多模式非线性光学显微成像装置，其特征在于：所述激光器系统的输出端与第二脉冲激光功率调节单元的输入端之间设置有光开关。

5.一种多模式非线性光学显微成像方法，其特征在于：采用权利要求1至4中任一项所述的多模式非线性光学显微成像装置，将待测样品放置于载物台上，包括以下工作模式：

（1）单光束激光工作模式：从激光器系统仅出射一束的超短脉冲激发光束，激发光束先经过第一脉冲激光功率调节单元，接着经过时间延迟单元，再经过第一二向色镜耦合后进入激光束扫描单元，最后经过物镜会聚作用在待测样品上，超短脉冲激发光与待测样品相互作用时，产生相应的非线性光学效应；

（2）双光束激光工作模式：从激光器系统出射两束超短脉冲激光，分别为泵浦光和探测光；探测光先经过第一脉冲激光功率调节单元，接着经过时间延迟单元后形成探测光束；泵浦光先经过第二脉冲激光功率调节单元，并与探测光束在第一二向色镜处实现时间和空间上的耦合与共线，耦合后的光束入射进入激光束扫描单元，最后经过物镜会聚作用在待测样品上，两束超短脉冲激光在它们的波长差满足待测样品中相关分子化学键振动光谱的拉曼位移时，获得相应的相干拉曼散射非线性光学效应。

6.根据权利要求5所述的多模式非线性光学显微成像方法，其特征在于：在单光束激光工作模式下，所述非线性光学效应是多光子的TPEF、高阶谐波或和频效应。

7.根据权利要求5所述的多模式非线性光学显微成像方法，其特征在于：在双光束激光工作模式下，所述相干拉曼散射非线性光学效应是反斯托克斯拉曼散射CARS非线性光学效应。