CN111665229B - 一种多色多光子及谐波多模态显微成像系统 - Google Patents

Abstract

本发明涉及一种多色多光子及谐波多模态显微成像系统。脉冲整形器将入射的宽带脉冲激光进行脉冲整形，按照不同级次谐波成像要求或者不同荧光分子的多光子吸收波长要求，输出傅里叶变换极限的多色脉冲；消偏器将由脉冲整形器输出的偏振光变为无偏或者圆偏振光；然后经过显微成像模块对样品进行探测；最后信号光根据测量的需要分别引入谐波检测模块或多光子检测模块进行测量。采用本发明所提供的多色多光子及谐波多模态显微成像系统能够在同一个光路下同时实现多光子和谐波成像测量。

Description

一种多色多光子及谐波多模态显微成像系统

技术领域

本发明涉及激光成像领域，特别是涉及一种多色多光子及谐波多模态显微成像系统。

背景技术

多光子显微成像技术是激光成像领域的一个重要分支。其基本原理是在高光子密度的条件下，荧光分子可以吸收两个或两个以上的光子，并发射荧光。相比于单光子激发荧光，多光子激发荧光具有显著的局域激发特征，近红外的激发波长能有效减弱组织散射和吸收的影响。因此，多光子荧光显微成像具有光毒性小，穿透能力强等诸多优点。可以对活体生物进行无损探测的潜力使得多光子显微成像技术成为了一个研究的热点，在生物医学领域有着广阔的应用前景。加入偏振信息的多光子技术还可以进一步探测荧光分子的取向及寿命等信息。目前常用的多光子成像技术一次只能进行一种荧光分子标记，对于需要多种荧光标记才能构建完整图像的样品来说需要进行多次荧光成像测量，这不仅使得耗时成倍的递增，且不利于活体样品成像。

谐波成像技术是通过非线性光学的原理，使用强激光与物质相互作用生成谐波，通过谐波成像来探测物质特性的一门技术。目前广泛应用于凝聚态物质特性的探测。通过偏振依赖的谐波成像更可以测量晶体的晶轴取向等信息，可以完整的呈现待测物质的真实图像。在进行偏振相关的显微成像测量时，多光子显微成像和谐波成像都面临着改变光束偏振的难题，目前常用的改变偏振手段如半波片，会不可避免的导致探测光路的微小变化，这样的变化在显微成像时容易导致视场丢失，在高倍显微成像时这个问题尤为严重。

同时，这两种成像技术的入射光通常来自光参量放大器产生的窄带激光，因此，在对同一个样品进行不同荧光分子标记成像或者不同级次的谐波成像时，需要调整入射波长以适应要求，然而波长的改变通常会导致光束指向的变化，所以每次调整波长都需要重新优化光路，耗费许多额外的时间，并且在活体样品成像中很难保证更换波长前后测量到的是同一个样品区域或过程。

尽管两种技术有着相似的光路设计，但由于测量信息上的差异，难以在一个光路系统中同时对多种标记分子实现多光子显微成像和谐波显微成像的同时测量。

发明内容

本发明的目的是提供一种多色多光子及谐波多模态显微成像系统，以解决常用的多光子成像技术以及谐波成像技术无法同时进行多种荧光分子标记或多级谐波测量；且无法常用的多光子成像技术以及谐波成像技术在一个光路系统中实现多光子显微成像和谐波显微成像的同时测量的问题。

为实现上述目的，本发明提供了如下方案：

一种多色多光子及谐波多模态显微成像系统，包括：脉冲整形器，消偏器，显微成像模块，谐波检测模块以及多光子荧光检测模块；

所述脉冲整形器用于将入射的宽带脉冲激光进行脉冲整形，按照不同级次谐波成像要求或者不同荧光分子的多光子吸收波长要求，输出傅里叶变换极限的多色脉冲；

所述消偏器用于将所述傅里叶变换极限的多色脉冲转变为无偏振光或者圆偏振光；

所述显微成像模型用于利用所述无偏振光或所述圆偏振光激发待测样品，生成待测样品图像；所述待测样品为荧光蛋白或非线性晶体；

在同一光路系统下，所述谐波检测模块用于根据所述待测样品图像检测所述非线性晶体的谐波信号；所述多光子荧光检测模块包括多条不同的探测光路，所述多光子荧光检测模块用于根据所述待测样品图像检测所述荧光蛋白不同荧光的多光子信号。

可选的，所述显微成像模块具体包括：聚焦物镜、三轴微驱载物台以及收集物镜；

所述聚焦物镜以及所述收集物镜共焦放置，所述三轴微驱载物台设于焦点处；

在空间直角坐标系下，在XY平面内移动所述三轴微驱载物台获取待测样品图像，在Z方向上调整聚焦位置。

可选的，所述多光子荧光检测模块具体包括：二向色转轮、第一格兰泰勒棱镜、第二格兰泰勒棱镜、第一多光子荧光探测器以及第二多光子荧光探测器；

所述第一格兰泰勒棱镜以及所述第一多光子荧光探测器设于同一第一探测光路上；

所述第二格兰泰勒棱镜以及所述第二多光子荧光探测器设于同一第二探测光路上；

所述二向色转轮用于分开不同种类荧光分子的荧光，通过所述第一格兰泰勒棱镜进入所述第一光路，或者通过所述第二格兰泰勒棱镜进入所述第二光路。

可选的，所述二向色转轮与所述第一格兰泰勒棱镜之间设有第一滤光片；所述第一格兰泰勒棱镜与所述第一多光子荧光探测器之间设有第一耦合透镜；

所述二向色转轮与所述第二格兰泰勒棱镜之间设有第二滤光片；所述第二格兰泰勒棱镜与所述第二多光子荧光探测器之间设有第二耦合透镜。

可选的，所述所述的谐波检测模块具体包括：第三格兰泰勒棱镜、单色仪以及光电探测器；

所述第三格兰泰勒棱镜、所述单色仪以及所述光电探测器依次设置在第三探测光路上；

所述第三格兰泰勒棱镜用于选择需探测的偏振方向的谐波信号；所述单色仪用于选择所述谐波信号的级次；所述光电探测器用于探测谐波信号。

可选的，所述消偏器为消色差退偏镜或消色差四分之一波片；

所述消色差退偏镜用于产生无偏振光；所述消色差四分之一波片用于产生圆偏振光。

可选的，所述光电探测器为光电倍增管。

可选的，还包括：光路保护管；

所述光路保护管用于保护所述脉冲整形器，所述消偏器，所述谐波检测模块以及所述多光子荧光检测模块之间的光路。

可选的，所述多光子荧光检测模块具体包括多条探测光路；每条探测光路上至少包括一个格兰泰勒棱镜以及一个多光子荧光探测器；

所述多条探测光路同时对多个不同的多光子信号进行探测。

根据本发明提供的具体实施例，本发明公开了以下技术效果：本发明提供了一种多色多光子及谐波多模态显微成像系统，在同一个光路下同时实现多光子和谐波成像测量；同时进行多种荧光分子标记或多级谐波测量；具备偏振测量能力且在进行偏振测量时可以保持探测光路不变，不会导致视场丢失；使用宽带傅里叶变换极限脉冲进行测量，在提高信噪比的同时可以在同一个光束下进行多个不同波长的测量，减少了改变波长导致的系统优化时间；采用本发明所提供的多色多光子及谐波多模态显微成像系统解决了传统多光子荧光显微成像和谐波显微成像中不能共用成像光路，偏振测量容易导致视场丢失，切换光谱困难耗时，无法同时测量多种荧光物质的问题。

附图说明

为了更清楚地说明本发明实施例或现有技术中的技术方案，下面将对实施例中所需要使用的附图作简单地介绍，显而易见地，下面描述中的附图仅仅是本发明的一些实施例，对于本领域普通技术人员来讲，在不付出创造性劳动性的前提下，还可以根据这些附图获得其他的附图。

图1为本发明所提供的多色多光子及谐波多模态显微成像系统光路示意图；

图2为本发明实施例所提供的多色多光子及谐波多模态显微成像系统光路示意图；

图3为本发明实施实例一所提供的所用荧光蛋白的吸收和荧光光谱曲线图；

图4为本发明实例二所提供的所用荧光蛋白的吸收和荧光光谱曲线图；

图5为本发明实例三所提供的所用荧光蛋白的吸收和荧光光谱曲线图。

符号说明：

1是宽带脉冲激光，2是脉冲整形器，3是消偏器，4是短波通二向色镜，5是聚焦物镜，6是三轴微驱载物台，7是收集物镜，8是第二格兰泰勒棱镜，9是单色仪，10是谐波成像光电探测器，11是二向色转轮，12是第二多光子荧光探测器，13是偏振控制器，14是第二耦合透镜，15是第一滤光片转轮，16是第二滤光片转轮，17是第一多光子荧光探测器，18是第一格兰泰勒棱镜，19是第三格兰泰勒棱镜，20是第一耦合透镜，λ是入射宽带脉冲中心波长，λ₁是第一色脉冲的中心波长，λ₂是第二色脉冲的中心波长。

具体实施方式

下面将结合本发明实施例中的附图，对本发明实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述，显然，所描述的实施例仅仅是本发明一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都属于本发明保护的范围。

本发明的目的是提供一种多色多光子及谐波多模态显微成像系统，能够在同一个光路下同时实现多光子和谐波成像测量。

为使本发明的上述目的、特征和优点能够更加明显易懂，下面结合附图和具体实施方式对本发明作进一步详细的说明。

图1为本发明所提供的多色多光子及谐波多模态显微成像系统光路示意图，如图1所示，一种多色多光子及谐波多模态显微成像系统(以下简称成像系统)，包括：脉冲整形器2，消偏器3，显微成像模块，谐波检测模块以及多光子荧光检测模块；所述脉冲整形器2用于将入射的宽带脉冲激光1进行脉冲整形，按照不同级次谐波成像要求或者不同荧光分子的多光子吸收波长要求，输出傅里叶变换极限的多色脉冲；所述消偏器3用于将所述傅里叶变换极限的多色脉冲转变为无偏振光或者圆偏振光；所述显微成像模型用于利用所述无偏振光或所述圆偏振光激发待测样品，生成待测样品图像；所述待测样品为荧光蛋白或非线性晶体；在同一光路系统下，所述谐波检测模块用于根据所述待测样品图像检测所述非线性晶体的谐波信号；所述多光子荧光检测模块包括多条不同的探测光路，所述多光子荧光检测模块用于根据所述待测样品图像检测所述荧光蛋白不同荧光的多光子信号。

作为本发明可选的一个实施方式，所述的显微成像模块，由两个共焦的显微镜头和一个三轴微驱样品台组成；两个显微镜头做共焦放置，三轴微驱样品台则放置于焦点处，形成双物镜共焦构型，通过在XY平面内移动样品台可以获取样品图像，Z方向微调聚焦位置。

作为本发明可选的一个实施方式，所述谐波检测模块由一个格兰泰勒棱镜，一个单色仪9，一个光电探测器组成；格兰泰勒棱镜选择想要探测的偏振方向的谐波信号，然后通过单色仪9分光，可以调节单色仪9选择由狭缝出射的谐波信号级次，在狭缝后面放置光电探测器用于探测谐波信号。

所述光电探测器使用光电倍增管，从而增强探测灵敏度，可以探测极弱的信号

作为本发明可选的一个实施方式，所述的多光子荧光检测模块由一个二向色转轮11，两个格兰泰勒棱镜，两个光电探测器组成；通过调节二向色转轮11选择合适的短波通二向色镜4用于分开不同种类荧光分子的荧光，分开后的分子荧光分别通过格兰泰勒棱镜选择想要的偏振方向后入射到光电探测器上探测多光子信号。

所述的多光子荧光检测模块不止探测两种不同的分子荧光，可以根据需要拓展探测器激光路，同时探测多个分子的荧光。因此，所述的多光子荧光检测模块同时对多个具备不同荧光发光波长的荧光物质进行探测，可以通过增加探测光路分支的方式进行扩展。

可以用一块合适的短波通二向色镜4代替，构成半永久光路，增加光路的稳定性。

作为本发明可选的一个实施方式，可以使用消色差退偏镜作为消偏器3，产生随机偏振光；

或者，使用消色差四分之一波片作为消偏器3，产生圆偏振光。

作为本发明可选的一个实施方式，可以将消偏器3用半波片和偏振片代替，同时移除检测模块中的格兰泰勒棱镜，构成普通的多光子显微和谐波显微系统，增强信号。

作为本发明可选的一个实施方式，除了所述显微成像模块中的三轴微驱样品台处，其余光路均可以用光路保护管保护起来，在避免激光射到实验人员，增强实验安全的同时，密封光路可以防止环境的影响，增强系统的稳定性和信噪比。

作为本发明可选的一个实施方式，所属的多光子荧光检测模块和谐波检测模块中的格兰泰勒棱镜可以用其他具有高偏振消光比的器件代替，比如格兰棱镜。

作为本发明可选的一个实施方式，对于多光子荧光成像，如果选择的荧光物质具有同样的吸收，但是荧光发射不同，则只需要设置脉冲整形器2产生一个傅里叶变换极限的脉冲。

如果选择的荧光物质具有相似的发射波长，但是吸收波长不同，则可以设置脉冲整形器2分别产生对应单个吸收波长的傅里叶变换极限脉冲进行循环，每次采集仅对一种荧光物质成像。

使用脉冲整形器2对输入的宽带激光进行调制，根据后续测量的需要同时输出单色或多色的傅里叶变换极限的脉冲，或者在多个不同色的傅里叶变换极限的脉冲之间进行循环。

当使用脉冲整形器2在多个不同色的傅里叶变换极限的脉冲之间进行循环时，可以设置多光子荧光检测模块中的探测器与脉冲整形器2进行同步采集。

当进行偏振相关的多光子或谐波测量时，可以保持探测光路不变，仅在检测模块中旋转格兰泰勒棱镜实现偏振相关测量。

本发明可以在同一个显微光路中同时实现多种不同波长的多光子荧光显微成像和多级谐波成像。

将本发明所提供的成像系统应用到实际中，通过以下具体的实施例进一步理解本发明所提供的成像系统：

本具体实施实例编写时认为操作人员已经具备了基础的激光物理实验技能，包括光路搭建，光束准直，Labview程序编写等，能够理解基础的光学实验术语如截止波长，短波通二向色镜4，吸收，发射，傅里叶变换极限脉冲等。

实例一：

以荧光蛋白dKeima和Clover为例，同时对两种蛋白分子进行双光子荧光显微成像，或者对非线性晶体BBO进行二次谐波成像。光路结构如图2所示。

具体方法如下：

选择宽带脉冲激光1为中心波长920nm，半高全宽为200nm的宽带激光，通过偏振控制器13选择合适脉冲整形器2的偏振方向后入射到脉冲整形器2。

如图3所示，dKeima和Clover具有不同的吸收和荧光发射波长，可以使用脉冲整形器2同时产生两个傅里叶变换极限的不同颜色的脉冲，第一个脉冲中心波长为840nm，半高全宽40nm，持续时间26fs；第二个脉冲中心波长为1000nm，半高全宽40nm，持续时间37fs。

选择短波通二向色镜4截止波长为750nm，选择二向色转轮11中使用的二向色镜为长波通二向色镜，截止波长570nm。在第一多光子荧光探测器17中收集Clover的荧光信号，在第二多光子荧光探测器12中收集dKeima的荧光信号。

选择第一滤光片15转轮为中心波长520nm的带通滤光片,选择第二滤光片转轮16为中心波长620nm的带通滤光片，进一步纯化荧光。

将三轴微驱载物台6上的样品替换为BBO晶体，调节单色仪9出射狭缝波长为420nm或500nm，用收集谐波成像光电探测器10收集二次谐波信号。

对于单独优化的谐波成像测量，可以重新编程脉冲整形器产生一个单色的傅里叶变换极限的脉冲，调整单色仪9的出射窗口为二次谐波窗口，用谐波成像光电探测器10采集高质量的二次谐波信号。

对于偏振相关的多光子荧光或谐波实验，在光路中放入消偏器3，第一格兰泰勒棱镜18，第二格兰泰勒棱镜8，第三格兰泰勒棱镜19；通过消偏器3产生随机偏振光或圆偏振光；转动第三格兰泰勒棱镜19，可采集偏振相关的谐波信号；转动第一格兰泰勒棱镜18或第二格兰泰勒棱镜8，可采集偏振相关的多光子荧光信号。

实例二：

以荧光蛋白EGFP和T-Sapphire为例，同时对两种蛋白分子进行双光子荧光显微成像。光路结构如图2所示。

具体方法如下：

如图4所示，由于EGFP和T-Sapphire具有相似的荧光发射波长，但是完全不同的吸收波长。宽带脉冲激光1使用中心波长880nm，半高全宽为200nm的宽带激光。调节脉冲整形器2循环产生两个傅里叶极限的脉冲：中心波长800nm,半高全宽40nm，持续时间25fs的脉冲和中心波长960nm,半高全宽30nm，持续时间45fs。

选择短波通二向色镜4截止波长为650nm，选择二向色转轮11中使用的二向色镜为长波通二向色镜，截止波长450nm。将第二多光子荧光探测器12与脉冲整形器2的循环同步以收集两种荧光蛋白产生的荧光信号。

可选择第二滤光片16转轮为中心波长510nm的带通滤光片，进一步纯化荧光。也可以去除第二滤光片转轮16的带通滤光片，直接收集信号。

实例三：

以荧光蛋白dKeima和mTFP1为例，同时对两种蛋白分子进行双光子荧光显微成像。光路结构如图2所示。

具体方法如下：

如图5所示，由于dKeima和mTFP1具有相似的吸收波长，但是完全不同的荧光发射波长。使用宽带脉冲激光1为中心波长880nm，半高全宽为200nm的宽带激光。调节脉冲整形器2产生傅里叶极限的脉冲：中心波长900nm,半高全宽100nm，持续时间12fs的脉冲.

选择短波通二向色镜4截止波长为750nm，选择二向色转轮11中使用的二向色镜为长波通二向色镜，截止波长560nm。在第一多光子荧光探测器17中收集mTFP1的荧光信号，在第二多光子荧光探测器12中收集dKeima的荧光信号。

选择第一滤光片转轮15用中心波长500nm的带通滤光片,选择第二滤光片转轮16用中心波长620nm的带通滤光片，进一步纯化荧光。

根据上述实施例可知，采用本发明所提供的成像系统可以在同一个光路下同时实现多光子和谐波成像测量；可以同时进行多种荧光分子标记或多级谐波测量；具备偏振测量能力且在进行偏振测量时可以保持探测光路不变，不会导致视场丢失；使用宽带傅里叶变换极限脉冲进行测量，在提高信噪比的同时可以在同一个光束下进行多个不同波长的测量，减少了改变波长导致的系统优化时间。

本说明书中各个实施例采用递进的方式描述，每个实施例重点说明的都是与其他实施例的不同之处，各个实施例之间相同相似部分互相参见即可。

本文中应用了具体个例对本发明的原理及实施方式进行了阐述，以上实施例的说明只是用于帮助理解本发明的方法及其核心思想；同时，对于本领域的一般技术人员，依据本发明的思想，在具体实施方式及应用范围上均会有改变之处。综上所述，本说明书内容不应理解为对本发明的限制。

Claims (8)

1.一种多色多光子及谐波多模态显微成像系统，其特征在于，包括：脉冲整形器，消偏器，显微成像模块，谐波检测模块以及多光子荧光检测模块；

所述脉冲整形器用于将入射的宽带脉冲激光进行脉冲整形，按照不同级次谐波成像要求或者不同荧光分子的多光子吸收波长要求，输出傅里叶变换极限的多色脉冲；

所述消偏器用于将所述傅里叶变换极限的多色脉冲转变为无偏振光或者圆偏振光；

所述显微成像模块用于利用所述无偏振光或所述圆偏振光激发待测样品，生成待测样品图像；所述待测样品为荧光蛋白或非线性晶体；

在同一光路系统下，所述谐波检测模块用于根据所述待测样品图像检测所述非线性晶体的谐波信号；所述多光子荧光检测模块包括多条不同的探测光路，所述多光子荧光检测模块用于根据所述待测样品图像检测所述荧光蛋白不同荧光的多光子信号；所述多光子荧光检测模块具体包括：二向色转轮、第一格兰泰勒棱镜、第二格兰泰勒棱镜、第一多光子荧光探测器以及第二多光子荧光探测器；

所述第一格兰泰勒棱镜以及所述第一多光子荧光探测器设于同一第一探测光路上；

所述第二格兰泰勒棱镜以及所述第二多光子荧光探测器设于同一第二探测光路上；

所述二向色转轮用于分开不同种类荧光分子的荧光，通过所述第一格兰泰勒棱镜进入所述第一探测光路，或者通过所述第二格兰泰勒棱镜进入所述第二探测光路。

2.根据权利要求1所述的多色多光子及谐波多模态显微成像系统，其特征在于，所述显微成像模块具体包括：聚焦物镜、三轴微驱载物台以及收集物镜；

所述聚焦物镜以及所述收集物镜共焦放置，所述三轴微驱载物台设于焦点处；

在空间直角坐标系下，在XY平面内移动所述三轴微驱载物台获取待测样品图像，在Z方向上调整聚焦位置。

3.根据权利要求2所述的多色多光子及谐波多模态显微成像系统，其特征在于，所述二向色转轮与所述第一格兰泰勒棱镜之间设有第一滤光片；所述第一格兰泰勒棱镜与所述第一多光子荧光探测器之间设有第一耦合透镜；

所述二向色转轮与所述第二格兰泰勒棱镜之间设有第二滤光片；所述第二格兰泰勒棱镜与所述第二多光子荧光探测器之间设有第二耦合透镜。

4.根据权利要求3所述的多色多光子及谐波多模态显微成像系统，其特征在于，所述谐波检测模块具体包括：第三格兰泰勒棱镜、单色仪以及光电探测器；

所述第三格兰泰勒棱镜、所述单色仪以及所述光电探测器依次设置在第三探测光路上；

所述第三格兰泰勒棱镜用于选择需探测的偏振方向的谐波信号；所述单色仪用于选择所述谐波信号的级次；所述光电探测器用于探测谐波信号。

5.根据权利要求1-4任一项所述的多色多光子及谐波多模态显微成像系统，其特征在于，所述消偏器为消色差退偏镜或消色差四分之一波片；

所述消色差退偏镜用于产生无偏振光；所述消色差四分之一波片用于产生圆偏振光。

6.根据权利要求4所述的多色多光子及谐波多模态显微成像系统，其特征在于，所述光电探测器为光电倍增管。

7.根据权利要求6所述的多色多光子及谐波多模态显微成像系统，其特征在于，还包括：光路保护管；

所述光路保护管用于保护所述脉冲整形器，所述消偏器，所述谐波检测模块以及所述多光子荧光检测模块之间的光路。

8.根据权利要求2所述的多色多光子及谐波多模态显微成像系统，其特征在于，所述多光子荧光检测模块具体包括多条探测光路；每条探测光路上至少包括一个格兰泰勒棱镜以及一个多光子荧光探测器；

所述多条探测光路同时对多个不同的多光子信号进行探测。

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